CN116940347A - 使用非水性膜乳化的持续释放调配物 - Google Patents
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Abstract
提供了用于产生聚合物微粒和经聚合物涂覆的微粒的非水性膜乳液方法。一些实施例提供了用于通过以下方式产生持续释放或控制释放微粒的方法：将微粉化的蛋白粉末和聚合物组合到烃溶剂中以形成非水性第一溶液，搅动第一非水性溶液以形成悬浮液，将悬浮液进料到分散泵中，其中将悬浮液通过多孔膜输注到包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的连续相中以形成碳氟化合物包烃乳液。去除烃溶剂、碳氟化合物液体和含氟表面活性剂，并收集微粒。
Description
本申请要求2020年11月25日提交的美国申请序列第63/118,264号的优先权，该申请以引用方式并入本文。
技术领域
本发明的方面总体上涉及药物微球调配物和使用通过膜乳化方法而生成的非水性乳液体系制备药物微球调配物的方法。
背景技术
治疗性蛋白向生物学相关靶标的缓释递送对于诸如癌症、心血管疾病、血管病状、骨科病症、牙科病症、伤口、自身免疫性疾病、胃肠道病症和眼部疾病等医学病状的治疗是期望的。用于药物的控制和延长递送的可生物相容且可生物降解的聚合物以及其他可植入递送装置已经使用了几十年。例如，在一些基于聚合物的递送装置中，随着聚合物随时间推移降解，治疗性药物会缓慢地释放。
缓释对患者的依从性来说可能是期望的。具体地，减少注射次数可能是有益的，尤其是诸如在眼内治疗的情况下需要医生进行注射时。对以尽可能少的注射而随着时间的推移有效地递送药物的缓释调配物的医疗需求尚未得到满足。在其他疾病，例如癌症和炎症疾病的情况下，需要改进的含有稳定和有效的蛋白治疗剂的可植入缓释调配物。
诸如抗体、受体Fc融合蛋白、trap蛋白及小trap蛋白等治疗性大分子必须以不仅使分子适合施用于患者，而且在储存期间和在施用部位处保持其稳定性的方式调配。例如，除非正确地调配溶液，否则水性溶液中的治疗性蛋白(例如，抗体和融合蛋白)易于降解、聚集和/或发生不期望的化学修饰。液体调配物中蛋白治疗剂的稳定性不仅取决于调配物中所使用的赋形剂的种类，以及那些赋形剂相对于彼此的量和比例，还取决于可溶性蛋白的浓度。在制备治疗性蛋白调配物时，还必须考虑稳定性以外的注意事项。此类另外的注意事项的实例包含溶液的粘度和给定调配物可以适应的治疗性蛋白的浓度。当调配用于缓释的治疗性蛋白时，必须非常小心以使调配物在一段时间内和在储存和生理温度下保持稳定，含有足够浓度的抗体，并且具有使调配物能够方便地施用于患者的其他性质。
一些缓释调配物是使用多种包封方法产生的，包封方法包含：内相分离、界面聚合、多重乳液的形成、聚电解质的逐层吸附和软模板技术。水包油包水(W/O/W)多重乳液是最常见的多重乳液类型并且能够将水性/亲水性核直接包封在水性悬浮液中。不幸的是，当用于将生物活性剂包封到缓释调配物中时，水性乳液体系存在具体的问题。例如，蛋白在水性有机界面处发生沉淀并伴随其免疫反应性降低(Raghuvanshi,R.等人，《药物开发及技术(Pharm Dev Technol)》，3(2):269-76(1998))。在一些水性乳液体系中，水可以扩散到有机相中并且水解蛋白。水解之后，蛋白液滴开始合并，并且逃逸到水性环境中并聚集或沉淀。硬化之后，在微粒中出现空隙和水通道，空隙和水通道是蛋白曾经所位于的位置，但蛋白却逃逸到水性环境中。
在不期望有水存在的任何情况下，非水性乳液可以替代常规的水性乳液。然而，文献或现有技术中关于非水性乳液的报道很少。已知两种类型的烃基非水性乳液体系：(1)两种不混溶的有机溶剂，通过嵌段共聚物(例如，己烷/二甲基甲酰胺)稳定；和(2)使用现有的表面活性剂代替水的与油不混溶的极性溶剂(例如，甲酰胺、乙腈)。先前地，全氟油包水(W/F)乳液已经被研究并且广泛应用于基于液滴的微流体中以用于单细胞或单分子生物测定。在这些研究中，PFPE-PEG-PFPE已经被用作含氟表面活性剂(FS)用于稳定碳氟化合物溶剂中的水滴。
尽管有许多不混溶的溶剂对可用，通常为一个极性和一个非极性，但找到适合合成聚合物微球的对是具有挑战性的。典型的可生物降解的聚合物，例如，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚(原酸酯)(POE)大多可溶于诸如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等具有中等极性的溶剂中。这限制了连续相的选择。另外，与过程的相容性、毒性、安全性和残留溶剂是使用那些有机溶剂的问题并且对于用作药物产品，需要考虑到这些问题。
由于以下一般性质，碳氟化合物可以用作非水性乳液体系中的连续相：
1.碳氟化合物既不是“疏水性的”也不是“亲水性的”，其与大多数有机(烃)溶剂不混溶，这使得其成为烃液滴乳液的理想连续相。
2.碳氟化合物是蛋白和其他亲水性分子、基于烃的聚合物和有机赋形剂的非溶剂，即，这些类型的分子不溶于碳氟化合物中。
3.碳氟化合物具有低粘度。
4.碳氟化合物具有化学惰性并且与常用的烃溶剂相比，碳氟化合物的毒性或腐蚀性可能相对较低。
5.碳氟化合物易挥发且可回收。
先前的文献报道了通过微流体方法制造各种含有碳氟化合物的乳液体系，诸如碳氟化合物包水(W/F)、水包碳氟化合物包水(W/F/W)双重乳液、水/碳氟化合物/油/水(W/F/O/W)三重乳液、碳氟化合物/烃/水(F/H/W)双重乳液和烃/碳氟化合物/水(H/F/W)双重乳液。这些乳液中的一些乳液已经用于合成聚合物微球。然而，所有这些乳液仍然是使用水作为分散相或连续相的基于水的乳液体系。
无论使用哪种类型的乳液，微球或微粒的尺寸分布通常是宽的，且在没有广泛的过程优化和控制策略情况下，尺寸可能不容易被控制而满足靶标。因此，仍然需要开发在没有广泛过程优化和控制策略的情况下控制微球或微粒尺寸以满足靶标的新方法。
因此，本发明的一个目的是提供用于产生药物调配物的非水性膜乳液体系和方法及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供具有改善的蛋白稳定性和稳定的缓释及受控的尺寸分布的缓释调配物。
发明内容
提供了用于产生聚合物微粒和经聚合物涂覆的微粒的非水性膜乳液方法。一些实施例提供了一种用于通过以下方式产生持续释放或控制释放微粒的方法：将微粉化的蛋白粉末和聚合物组合到烃溶剂中以形成非水性第一溶液，搅动第一非水性溶液以形成悬浮液，将悬浮液进料到分散池中，其中在包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的连续相的切线流下，将悬浮液通过多孔膜输注到连续相中以形成碳氟化合物包烃乳液(膜乳化)。方法还包含将氢氟酯添加到碳氟化合物包烃乳液中和从烃相中去除烃溶剂以提供硬化的微粒的步骤。在一些实施例中，将氢氟酯和碳氟化合物的混合物添加到乳液中，以帮助去除烃。在一些实施例中，方法包含随后将另外的纯氢氟酯添加到乳液中。方法还包含去除碳氟化合物液体以分离微粒，其中微粒含有包封在聚合物的基质内的蛋白。方法任选地包含在碳氟化合物液体中洗涤微粒以去除残留的含氟表面活性剂，去除碳氟化合物液体，和例如通过真空过滤收获微粒。在一些实施例中，真空过滤使用聚醚砜膜过滤器。在一些实施例中，蛋白粉末是由抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白产生。在一些实施例中，蛋白是VEGF trap蛋白，例如阿柏西普(aflibercept)。在一些实施例中，乳液由散装乳化形成。
在一些实施例中，烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合组成的群组。
在一些实施例中，碳氟化合物溶液包括1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺。
在一些实施例中，含氟表面活性剂是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。一些实施例具有0.1％w/v至5.0％w/v的含氟表面活性剂，通常为约0.5％w/v的含氟表面活性剂。
在一些实施例中，氢氟酯是2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
在一些实施例中，蛋白粉末与聚合物的比率为0％至30％。
在一些实施例中，多孔膜是不锈钢膜，任选地是经亲氟物质涂覆的不锈钢膜。
可以通过在环境大气压下或在真空下使碳氟化合物液体和烃液体蒸发而去除碳氟化合物液体和烃液体。在一些实施例中，碳氟化合物液体含有氢氟醚(HFE)。在一些实施例中，将HFE添加到非水性乳液中以将烃快速萃取到碳氟化合物液体中以加速微球硬化。在一些实施例中，蛋白粉末是微粉化蛋白粉末。在一些实施例中，洗涤微粒以去除在微粒上剩余的任何残留烃溶剂、碳氟化合物液体、含氟表面活性剂或其组合。示例性碳氟化合物液体包含全氟C5-C18化合物，包含但不限于1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺。示例性烃溶剂包含但不限于二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和其组合。示例性含氟表面活性剂是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚(PFPE-PEG-PFPE)三嵌段共聚物。示例性可生物溶蚀的聚合物是聚原酸酯(POE)。在一些实施例中，蛋白是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施例中，蛋白是喷雾干燥的VEGF Trap蛋白。在一些实施例中，微粒的直径为1.0μm至100μm、1.0μm至200μm或30μm至60μm。在一些实施例中，通过所公开的非水性乳液方法形成的微粒是可流动的微粒组合物。所公开的可流动的微粒组合物可以悬浮在药学上可接受的赋形剂，例如pH缓冲盐水中，或者悬浮在诸如中链甘油三酯的油性媒剂中。可流动的微粒组合物可以例如使用具有27G针头的注射器肠胃外施用。在一些实施例中，微球或微粒尺寸分布小于10CV％。在一些实施例中，微球尺寸分布为10CV％至20CV％。
另一个实施例提供了一种通过以下方式产生聚合物或经聚合物涂覆的微粒的方法：将1.0％w/w至30.0％w/w的总固体喷雾干燥的蛋白在烃溶液中组合以形成非水性第一溶液，搅动第一非水性溶液以形成悬浮液，将悬浮液进料到分散池中，其中在包括碳氟化合物液体和0.1％w/v至5.0％w/v含氟表面活性剂的连续相的切线流下，将悬浮液通过多孔膜输注到连续相中，以形成碳氟化合物包烃乳液，去除烃溶剂以提供硬化的聚合物或经聚合物涂覆的微球，和去除碳氟化合物液体以分离微粒，其中微粒包括包封在聚合物基质内的蛋白。在一些实施例中，悬浮液的进料速率为0.1ml/min至1.0ml/min。在一些实施例中，方法还包含将氢氟酯作为共溶剂添加到碳氟化合物包烃乳液的碳氟化合物液体中以将烃溶剂从分散相萃取到连续相中并有助于加速微粒的硬化的步骤。
在一些实施例中，由膜乳液产生的微粒在微粒的聚合物表面或内部基质中几乎没有或没有孔隙或通道。
又一个实施例提供了一种药物组合物，药物组合物含有使用本文所公开的非水性膜乳液方法产生的经聚合物涂覆的微粒。
在一些实施例中，可以通过改变调配物组合物和过程参数将微粒的尺寸调整到所期望的直径或尺寸。
附图说明
图1A是示出了通过基于H/F的散装乳液产生空白POE微球的过程的图-方案1。图1B示出了FC-40的化学结构。图1C示出了含氟表面活性剂PFPE-PEG-PFPE(Pico-SurfTM1)，一种全氟聚醚/聚(乙二醇)三嵌段共聚物的化学结构。Pico-SurfTM1可商购获得，例如在FC-40中的5％(w/w)。
图2A是通过H/F乳液形成的空白POE微球的显微照片。图2B是示出低FS含量时发现的POE聚集的显微照片。
图3A、3B和3C是通过H/F乳液在低、中、高均质化速度下形成的空白POE微球的显微照片。
图4(方案2)是示出了通过基于S/H/F的散装乳液将SDP包封在POE微球中的过程的图。
图5(方案3)是示出了用于包封蛋白SDP的碳氟化合物包烃乳液体系的图。
图6A和6B是分散在FC-40中的含有POE和荧光标记的喷雾干燥的蛋白(F-SDP)的乙酸乙酯液滴的荧光图像。请注意，F-SDP在液滴内保留了其原始尺寸和形态。绿色荧光图像以灰度示出。
图7A是VEGF Trap F-SDP包封的微球的明场显微照片。图7B是VEGF Trap F-SDP包封的微球的荧光图像(条形＝20μm)。图7C是VEGF Trap F-SDP包封的微球的荧光图像(条形＝10μm)。绿色荧光图像在图7B和7C中以灰度示出。
图8A-8D是放置在水性环境中的VEGF Trap F-SDP包封的POE微球的荧光图像。请注意，F-SDP在液滴内保留了其原始尺寸和形态。绿色荧光图像以灰度示出。
图9是在非水性乳液方法中使用二氯甲烷(DCM)或乙酸乙酯(EtAc)产生的微粒的体积密度(％)对尺寸(μm)的线形图。
图10A和10B是分别负载有10％w/w和30％w/w VEGF Trap SDP的微粒的显微照片。
图11A和11B是分别负载有10％w/w和30％w/w SDP的VEGF Trap F-SDP包封的POE微球的代表性荧光图像。请注意，F-SDP在液滴内保留了其原始尺寸和形态。绿色荧光图像以灰度示出。
图12A和12B是负载有5％w/w SDP和10％w/w SDP的微粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图13A和13B是Dv50为2.18μm和5.63μm的喷雾干燥的蛋白的SEM图像。
图14A、14B和14C是包封在PLA微球中的VEGF-Trap F-SDP的明场、荧光和SEM图像。绿色荧光图像在图14B中以灰度示出。
图15A和15B是包封在PLGA微球中的VEGF-Trap F-SDP的明场和荧光图像。绿色荧光图像在图15B中以灰度示出。
图16是示出当将悬浮液通过多孔膜输注到烃连续相中时，SDP悬浮液乳液液滴的形成的图。
图17是用于使用膜乳液产生微粒的示例性方法的图。标有星号的步骤指示防止微粒产物絮凝和聚集的步骤。
图18含有使用水性和非水性乳液方法产生的微球的SEM图像，并示出在使用水性方法时微球具有孔隙和水通道，而在使用非水性方法时微球具有光滑的表面。
图19含有使用水性和非水性乳液方法产生的蛋白包封的微球的SEM图像。
图20含有使用水性和非水性乳液法产生的蛋白包封的微球的荧光显微图像，并示出SDP在使用水性乳液方法时被重构并合并成更大的液滴，而在使用非水性乳液方法时保持其原始葡萄干形状。绿色荧光图像以灰度示出。
具体实施方式
I.定义
应了解，本公开不限于本文所述的组合物和方法以及所述的实验条件，因而可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述某些实施例的目的而并不旨在限制，因为本公开的范围将仅由随附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似或等效于本文所述的组合物、方法和材料的任何组合物、方法和材料可用于实践或测试本发明。所提及的所有出版物均以全文引用的方式并入本文中。
除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则在描述当前所主张的发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用术语“一(a)”、“一(an)”、“该”和相似指示物均应解释为涵盖单数和复数两者。
本文阐述的所有数值极限和范围包含范围或极限附近或者范围或极限的数字之间的所有数字或值。本文所述的范围和极限明确地指明并阐述了由范围或极限所定义和囊括的所有整数、小数和分数值。因此，除非在本文中另外指示，否则对本文中值的范围的叙述仅旨在充当个别提及落在范围内的每一单独值的速记方法，并且每一单独值被并入到本说明书中，如同在本文中单独地叙述一样。
术语“约”的使用旨在描述高于或低于所述值的约+/-10％的范围内的值；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-5％的范围内的值范围内；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-2％的范围内的值范围内；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-1％的范围内的值范围内。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不隐含进一步的限制。除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。除非另有说明，否则在本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示实践本发明所必需的任何未要求的要素。
“掺合”提供掺合力，掺合力包含压缩剪切力和空化。技术和方法包含但不限于均质化、涡旋、超声处理、搅拌、搅转、搅打、摇动、乳化、搅动和/或其组合。掺合力的施加可以是恒定的或周期性的。
术语“微球”和“微粒”可互换使用。
“蛋白”是指包括通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白包含多肽和肽，并且还可包含修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和ADP核糖基化。蛋白可具有科学或商业利益，包含基于蛋白的药物，并且蛋白还包含酶、配体、受体、抗体和嵌合或融合蛋白。蛋白由各种类型的重组细胞使用众所周知的细胞培养方法产生，并且一般通过基因工程技术(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或密码子优化的序列、无内含子序列等)将蛋白引入到细胞中，其中其可以作为附加体存在或被整合到细胞的基因组中。
“抗体”指由四条多肽链(由二硫键互连的两条重(H)链及两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。各重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个域，CH1、CH2和CH3。各轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个域(CL)组成。VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体还包含双特异性抗体，其包含可与超过一个不同表位结合的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体一般描述于美国专利第8,586,713号中，其以引用的方式并入本申请中。
“Fc融合蛋白”包括不另外在自然界中发现在一起的两种或更多种蛋白之部分或全部，蛋白中的一种为免疫球蛋白分子之Fc部分。包括与抗体衍生的多肽(包含Fc域)的不同部分融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由Ashkenazi等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:10535,1991；Byrn等人，《自然(Nature)》344:677,1990；及Hollenbaugh等人，“免疫球蛋白融合蛋白的构建(Construction ofImmunoglobulin Fusion Proteins)”，《现行免疫学方案(Current Protocols inImmunology)》增刊4，第10.19.1页-第10.19.11页，1992描述。“受体Fc融合蛋白”包括与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外域，其在一些实施例中包括铰链区，随后是免疫球蛋白的CH2和CH3域。在一些实施例中，Fc融合蛋白包括结合于一或多个配体的两条或更多条不同受体链。例如，Fc融合蛋白是trap，诸如例如IL-1trap或VEGF trap。
根据本发明，也可以制备缺乏Fc部分的蛋白，诸如重组产生的酶和微型trap。微型trap是使用多聚化组分(MC)代替Fc部分的trap蛋白，且公开在美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中。
“微粉化蛋白颗粒”或“蛋白颗粒”意指含有多个蛋白分子且水量低、极低或接近于零(例如，<3重量％的水)的颗粒。如本文所用，微粉化蛋白颗粒的形状一般为球形并且具有在2微米到约35微米范围内的ECD。微粉化蛋白颗粒不限于任何特定的蛋白实体，并且适用于治疗性蛋白的制备和递送。常见的治疗性蛋白尤其包含抗原结合蛋白，诸如例如，可溶性受体片段、抗体(包含IgG)和抗体的衍生物或片段、包含Fc融合蛋白在内的其他含有Fc的蛋白和包含诸如VEGF Trap的trap型蛋白在内的受体-Fc融合蛋白(Huang,C.，《生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.》20:692-99(2009))。
II.使用烃-碳氟化合物膜乳液来产生微球调配物
提供了用于使用无水或非水性膜乳液体系来调配药物组合物的体系和方法。当包封亲水性药物分子时，所公开的无水膜乳液方法克服了现有水性乳液体系的几个问题。例如，所公开的无水乳液体系与本文提供的现有水性乳液体系之间的比较研究表明，使用水性乳液体系产生的调配物在产生期间会将药物，例如蛋白药物，从乳液液滴中泄漏到水连续相中。药物从乳液液滴中的这种泄漏导致了低包封效力。本文所述的所公开的基于非水的膜乳液方法包封药物分子，包含但不限于亲水性药物诸如蛋白，其中相对于水性乳液体系具有增加的包封效力，保留原始蛋白颗粒结构，或其组合。所公开的无水膜乳液体系和方法可以通过散装方法(例如，搅动、均质化、超声处理)和其他常规方法产生包封的药物调配物。体系和方法还可以应用于广泛的聚合物材料、固态有效负载和乳化方法。下面的总结示出了不同乳液的比较结果，表明非水性乳液体系与水性乳液体系相比在微粒包封方面有显著的改进。
方法和结果总结
A.碳氟化合物包烃包固体(S/H/F)膜乳液
一般来说，膜乳化(ME)是一种相对新的技术，用于对颗粒的产生进行高度控制，从而允许良好的尺寸控制和窄的尺寸分布(G.T.和R.A.Williams，《胶体与界面科学进展(Adv.Colloid Interface Sci.)》，第113(1)期：1-20,(2005))。迄今为止，已经针对ME开发了许多不同类型的膜，包含白须多孔玻璃(SPG)、醋酸纤维素、聚合物、阳极多孔氧化铝和硅微通道。对于所公开的ME方法，具有激光钻孔的不锈钢膜工作良好，并且微孔技术公司(Micropore Technologies)(英国雷德卡(Redcar,UK))的市售设备使得实验室研究过程以及GMP制造的按比例增加成为可能。在其他实施例中，膜选自由以下组成的群组：包含白须多孔玻璃(SPG)、醋酸纤维素、聚合物、阳极多孔氧化铝和硅微通道。不锈钢膜的严格控制的膜孔径允许低于极限的所有SDP颗粒通过膜。没有弯曲路径的直管状通道降低了SDP阻塞通道的趋势。在一些实施例中，膜具有亲氟涂层，从而提供与碳氟化合物包烃(H/F)乳液产生的良好相容性。此外，不锈钢膜坚固耐用，易于清洗且是可消毒的。在一些实施例中，孔隙的直径为3μm至300μm。在一些实施例中，孔隙的直径为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。
一些实施例提供了用于通过以下方式产生持续释放或控制释放微粒的方法：将微粉化的蛋白粉末和聚合物组合到烃溶剂中以形成非水性第一溶液，搅动第一非水性溶液以形成悬浮液，将悬浮液进料到分散泵中，其中将悬浮液通过多孔膜输注到包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的连续相中以形成碳氟化合物包烃乳液。在一些实施例中，悬浮液的进料速率为0.1ml/min至1.0ml/min。方法还包含将氢氟酯添加到碳氟化合物包烃乳液中和去除烃溶剂以提供硬化的微粒的步骤。在一些实施例中，将氢氟酯和碳氟化合物的混合物添加到乳液中。在一些实施例中，方法包含将另外的纯氢氟酯添加到乳液中。方法还包含去除碳氟化合物液体以分离微粒，其中微粒含有包封在聚合物的基质内的蛋白。方法任选地包含在碳氟化合物液体中洗涤微粒以去除残留的含氟表面活性剂，去除碳氟化合物液体，和例如通过真空过滤收获微粒。在一些实施例中，真空过滤使用聚醚砜膜过滤器。在一些实施例中，蛋白粉末是由抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白产生。在一些实施例中，蛋白是VEGF trap蛋白，例如阿柏西普。在一些实施例中，乳液由散装乳液形成。在一些实施例中，24小时后微粒具有小于15％的突释，随后是药物的线性持续释放。
在一些实施例中，蛋白粉末与聚合物的比率为0％至30％。
在一些实施例中，烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合组成的群组。
在一些实施例中，碳氟化合物溶液包括1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺。
在一些实施例中，含氟表面活性剂是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。
在一些实施例中，氢氟酯是2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
在一些实施例中，多孔膜是不锈钢膜，任选地是经亲氟物质涂覆的不锈钢膜。
可以通过在环境大气压下或在真空下使碳氟化合物液体和烃液体蒸发而去除碳氟化合物液体和烃液体。在一些实施例中，碳氟化合物液体含有氢氟醚(HFE)。在一些实施例中，将HFE添加到非水性乳液中以将烃快速萃取到碳氟化合物液体中以加速微球硬化。在一些实施例中，蛋白粉末是微粉化蛋白粉末。在一些实施例中，洗涤微粒以去除在微粒上剩余的任何残留烃溶剂、碳氟化合物液体、含氟表面活性剂或其组合。示例性碳氟化合物液体包含全氟C5-C18化合物，包含但不限于1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-bis(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺。示例性烃溶剂包含但不限于二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和其组合。示例性含氟表面活性剂是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚(PFPE-PEG-PFPE)三嵌段共聚物。示例性可生物溶蚀的聚合物是聚原酸酯(POE)。在一些实施例中，蛋白是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施例中，蛋白是喷雾干燥的VEGF Trap蛋白。在一些实施例中，微粒的直径为1.0μm至100μm、1.0μm至200μm或30μm至60μm。在一些实施例中，通过所公开的非水性乳液方法形成的微粒是可流动的微粒组合物。所公开的可流动的微粒组合物可以悬浮在药学上可接受的赋形剂，例如pH缓冲盐水中，或者悬浮在诸如中链甘油三酯的油性媒剂中。可流动的微粒组合物可以例如使用具有27G针头的注射器肠胃外施用。在一些实施例中，微球或微粒的尺寸分布小于10CV％。在一些实施例中，微球的尺寸分布为10CV％至20CV％。
另一个实施例提供了一种通过以下方式产生聚合物或经聚合物涂覆的微粒的方法：将1.0％w/w至30.0％w/w的总固体喷雾干燥的蛋白组合在烃溶液中以形成非水性第一溶液，搅动第一非水性溶液以形成悬浮液，将悬浮液进料到分散泵中，其中在包括碳氟化合物液体和0.1％w/v至5.0％w/v含氟表面活性剂的连续相的切线流下，将悬浮液通过多孔膜输注到连续相中，以形成碳氟化合物包烃乳液，去除烃溶剂以提供硬化的聚合物或经聚合物涂覆的微球，以及去除碳氟化合物液体以分离微粒，其中微粒包括包封在聚合物基质内的蛋白。在一些实施例中，方法还包含在去除烃溶剂之前将氢氟酯添加到碳氟化合物包烃乳液的碳氟化合物液体中以帮助去除烃溶剂的步骤。
在一些实施例中，由膜乳液产生的微粒在微粒的聚合物表面或内部基质中几乎没有或没有孔隙或通道。
又一个实施例提供了一种药物组合物，药物组合物含有使用本文所公开的非水性膜乳液方法产生的经聚合物涂覆的微粒。
在一些实施例中，可以通过改变调配物组合物和过程参数将微粒的尺寸调整到所期望的直径或尺寸。
烃和蛋白溶液可以通过施加掺合力诸如压缩剪切力和空化来形成。技术包含但不限于均质化、涡旋、超声处理、搅拌、搅转、搅打、摇动、乳化、搅动和/或其组合。方法还包含在搅拌乳液的同时去除烃溶剂和碳氟化合物液体的步骤。烃液体和碳氟化合物液体可以任选地在真空下通过蒸发去除。在其他实施例中，微粒可以通过过滤来收获。去除烃液体和碳氟化合物液体会使微粒硬化，然后可以收获微粒。在一些实施例中，可以将HFE添加到碳氟化合物中，以帮助将烃从分散相萃取到碳氟化合物连续相中，用于更快的硬化过程。HFE可与碳氟化合物和烃二者混溶，且因此可充当共溶剂以增强烃在碳氟化合物相中的溶解度。通过非水性乳液方法产生的持续释放微粒含有包封在可生物降解或可生物溶蚀的聚合物基质中的蛋白。在一些实施例中，微粒具有单核-壳结构。在其他实施例中，微粒具有分散在聚合物中的多个核。在又一些实施例中，微粒群体包含具有被聚合物皮层包封的单核结构的微粒和在聚合物皮层中具有多核结构的微粒。碳氟化合物液体可以是全氟C5-C18化合物，包含但不限于FC-40，并且烃溶液选自由乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃和二氯甲烷或其组合组成的群组。在一些实施例中，含氟表面活性剂是以Pico-SurfTM1商购的全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。在一些实施例中，可生物溶蚀的聚合物是POE。在其他实施例中，聚合物选自由聚乳酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)组成的群组。一般，蛋白是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白或其片段或截短型式。通常，蛋白被微粉化，例如通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合。在一些实施例中，蛋白是VEGFTrap蛋白或其截短形式。下文描述了可用于所公开方法的其他蛋白。通过所公开的方法产生的微粒具有大部分没有孔隙或通道的聚合物皮层。聚合物皮层没有穿孔。在一些实施例中，微粒的直径为1μm至200μm
1.烃溶剂
在一些实施例中，选择烃溶剂(也称为烃液体)，使得聚合物材料，例如可生物降解或可生物溶蚀的聚合物可溶于烃中。在一些实施例中，烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合组成的群组。在一些实施例中，烃溶剂可含有乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、乙醇、甲醇、戊烷、丙醇、己烷或其组合。
2.含氟液体
示例性含氟液体是碳氟化合物液体，包含但不限于FlourinertTMFC-40(平均MW＝650g/mol)1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺(图1B)、FluorinertTMFC-70(平均MW＝821g/mol)或其组合。在一些实施例中，碳氟化合物液体是或含有氢氟醚(HFE)。示例性HFE包含但不限于NOVECTM7000(1-甲氧基七氟丙烷)、NOVECTM7100(甲氧基-九氟丁烷)、NOVECTM7200(乙氧基-九氟丁烷)、NOVECTM7500(2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。在又一些实施例中，碳氟化合物液体含有FC-40、FC-70、NovecTM7500、NovecTM7100、NovecTM7000或其组合。在某些实施例中，除了含氟液体之外，第二溶液还含有含氟表面活性剂(FS)。示例性FS是全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚(PFPE-PEG-PFPE)三嵌段共聚物，其可以Pico-SurfTM1商购获得。在一些实施例中，碳氟化合物液体或第二溶液含有FC-40和Pico-SurfTM1。
在一些实施例中，FS是
其中，
其中：n～37，x+z～6.0，y～12.5，或者其中n＝3.7，x+z～3.6，y～9.0。(Lee,M.等人，芯片实验室(Lab Chip)，7:14(3):509-13(2014))。
在一些实施例中，HFE具有以下化学结构：
2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
适用于过程的其他HFE是所有氢原子位于没有氟取代的碳上并通过醚氧(即RfORh)与氟化碳分离的一类分子。HFE的分子结构可以是直链、支链或环状或其组合(诸如烷基脂环族)，并且优选地不含烯键式不饱和基团，具有总共约4至约20个碳原子。这种HFE是已知的，并且容易获得，或者是基本上纯的化合物，或者是混合物。由于HFE的亲油性和亲氟性，它们可与碳氟化合物和烃二者混溶。当添加到烃/碳氟化合物乳液中时，它们可充当共溶剂以将烃萃取到碳氟化合物相中，并加速硬化过程。
在一些实施例中，任选地在真空下，任选地在搅拌乳液的同时，通过蒸发来去除烃溶剂、碳氟化合物或两者。在一些实施例中，通过过滤，任选地在真空下过滤收获微粒。
碳氟化合物相中HFE的百分比可以是0％v/v至20％v/v，而增加HFE的百分比会增加烃萃取速率。然而，HFE的百分比不能太高，因为微球的尺寸和形态可能变得更难以控制。
3.可溶蚀或可生物降解的聚合物
在一些实施例中，聚合物是可生物降解或可生物溶蚀的聚合物。在一些实施例中，聚合物选自由以下组成的群组：支链或直链聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷富马酸酯、PLGA-α-生育酚琥珀酸酯酯化为聚乙二醇1000(PLGA-TGPS)、聚酸酐聚(1,6-双(对羧基苯氧基)己烷)(pCPH)、聚(羟基丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚-β-R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、甲壳质、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚假轮烷、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸盐共聚物、聚丁二酸丁二醇酯、明胶、胶原、纤维蛋白、蚕丝蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物及其组合和共聚物。在一些实施例中，聚合物是聚-ε-己内酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一些实施例中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一些实施例中，聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一些实施例中，聚合物是聚原酸酯或其衍生物或共聚物。在一些实施例中，聚合物是聚酯酰胺。
如本文所用，术语“聚合物”是指包括通过共价化学键连接的重复单体的大分子。聚合物是可生物相容且可生物降解溶蚀的。可生物相容且可生物降解的聚合物可以是天然的或合成的。天然聚合物包含多核苷酸、多肽，诸如植入天然存在的蛋白、重组蛋白、明胶、胶原、纤维蛋白、蚕丝蛋白、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、聚赖氨酸、亮氨酸-谷氨酸盐共聚物；和多糖，诸如藻酸纤维素、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、甲壳质、肝素和透明质酸。合成的可生物相容或可生物降解的聚合物包含聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷富马酸酯、PLGA-α-生育酚琥珀酸酯酯化为聚乙二醇1000(PLGA-TGPS)、聚酸酐聚(1,6-双(对羧基苯氧基)己烷)(pCPH)、聚(羟基丁酸-共羟基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚-β-R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPC/PEG-DSPE)/胆固醇、乙基纤维素、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚假轮烷、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在酸以控制降解速率的聚原酸酯，以及尤其是聚(乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物。
乙基纤维素(EC)是一种众所周知且容易获得的用于药物和食品科学的生物材料。它是一种纤维素衍生物，其中一些葡萄糖羟基基团被乙醚取代。参见Martinac等人，《微囊包封杂志(J.Microencapsulation)》，22(5):549-561(2005)和其中的参考文献，其描述了在微球的制造中使用乙基纤维素作为可生物相容的聚合物的方法。也参见US 4,210,529(1980)及其中的参考文献，其中详细描述了乙基纤维素和制备乙基纤维素衍生物的方法。
聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)也是一种众所周知的美国食品药品监督管理局(FDA)批准的可生物相容且可生物降解的聚合物，用于组织工程和药物递送体系。PLGA是包括乙醇酸单体和乳酸单体的聚酯。关于PLGA的合成和PLGA纳米颗粒的制造的描述，参见Astete和Sabliov，《生物材料科学聚合物版(Biomater.Sci.Polym.Ed.)》，17(3):247-89(2006)和其中的参考文献。
聚-ε-己内酯(PCL)是FDA批准的另一种可生物相容且可生物降解的聚合物，在人类中用作药物递送装置。PCL是ε-己内酯的聚酯，它在体内迅速水解形成无毒或低毒性的羟基羧酸。关于PCL制造的描述，参见Labet和Thielemans，《化学学会评论(Chemical SocietyReviews)》38:3484-3504(2009)和其中的参考文献。关于PCL基微球和纳米球作为递送体系的制造和使用的描述，参见Sinha等人，《国际药学杂志(Int.J.Pharm.)》，278(1):1-23(2004)和其中的参考文献。
聚原酸酯(POE)是一种用于药物递送的可生物溶蚀的聚合物。它一般是烯酮缩醛的聚合物，优选环状双烯酮缩醛，诸如例如3,9-二亚甲基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]-十一烷，其通过二醇缩合聚合形成原酸酯键。聚原酸酯合成和各种类型的描述可以见于例如US4,304,767中。通过换入或换出各种疏水性二醇和多元醇，诸如用癸三醇代替己三醇；以及将潜在性酸，诸如例如乙交酯、辛二酸等添加到主链中，以增加pH敏感性可以对聚原酸酯进行改性，以控制它们的药物释放曲线和降解速率。定制形式的POE可以在POE主链中包含乙醇酸，以调谐质量损失和药物释放。对聚原酸酯的其他改性包含整合胺以增加官能性。聚原酸酯的形成、描述和使用描述在US 5,968,543；US 4,764,364；Heller和Barr，《生物大分子(Biomacromolecules)》，5(5):1625-32(2004)；和Heller，《先进药物递送评论(Adv.Drug.Deliv.Rev.)》，57:2053-62(2005)。
4.蛋白药物
在一些实施例中，通过所公开的无水乳液方法和体系产生的微粒调配物包含药物。示例性药物包含但不限于蛋白、融合蛋白及其片段、抗体及其抗原结合片段以及配体结合域和蛋白。在一些实施例中，蛋白是VEGF Trap蛋白(例如，阿柏西普，其含有与合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig域3融合的VEGF受体Flt1的Ig域2，例如如美国专利第7,087,411号和第7,279,159号中所述，这些美国专利以引用方式全文并入本文。在一些实施例中，VEGF Trap蛋白是截短形式的VEGF Trap，如美国专利第7,396,664号中所述，该美国专利以引用方式全文并入本文。
在一些实施例中，微粒调配物中的蛋白是抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体、双特异性四价免疫球蛋白G样分子(称为双可变域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一些实施例中，抗体为IgG1抗体。在一些实施例中，抗体为IgG2抗体。在一些实施例中，抗体为IgG4抗体。在一些实施例中，抗体包括嵌合铰链。在又一些实施例中，抗体包括嵌合Fc。在一些实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一些实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一些实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施例中，抗体选自由以下组成的群组：抗计划性细胞死亡1抗体(例如抗PD1抗体，如美国专利第9,987,500号中所描述)、抗计划性细胞死亡配体-1(例如抗PD-L1抗体，如美国专利第9,938,345号中所描述)、抗Dll4抗体、抗血管生成素-2抗体(例如抗ANG2抗体，如美国专利第9,402,898号中所描述)、抗血管生成素样3抗体(例如，抗AngPtl3抗体，如美国专利第9,018,356号中所描述)、抗血小板衍生的生长因子受体抗体(例如抗PDGFR抗体，如美国专利第9,265,827号中所描述)、抗Erb3抗体、抗促乳素受体抗体(例如抗PRLR抗体，如美国专利第9,302,015号中所描述)、抗补体5抗体(例如抗C5抗体，如美国专利第9,795,121号中所描述)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如抗EGFR抗体，如美国专利第9,132,192号中所描述，或抗EGFRvIII抗体，如美国专利第9,475,875号中所描述)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如抗PCSK9抗体，如美国专利第8,062,640号或美国专利第9,540,449号中所描述)、抗生长及分化因子-8抗体(例如抗GDF8抗体，亦称为抗肌肉抑制素抗体，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所描述)、抗升糖素受体(例如抗GCGR抗体，如美国专利第9,587,029号或第9,657,099号中所描述)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、介白素4受体抗体(例如抗IL4R抗体，如美国专利申请案公开第US2014/0271681A1号或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号中所描述)、抗介白素6受体抗体(例如抗IL6R抗体，如美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中所描述)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗介白素33(例如抗IL33抗体，如美国专利第9,453,072号或第9,637,535号中所描述)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如抗RSV抗体，如美国专利第9,447,173号和第10,125,188号，及美国专利申请案公开第US2019/0031741A1号中所描述)、抗分化丛集3(例如抗CD3抗体，如美国专利第9,657,102号中所描述)、抗分化丛集20(例如抗CD20抗体，如美国专利第9,657,102号及第US20150266966A1号及美国专利第7,879,984号中所描述)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化丛集48(例如抗CD48抗体，如美国专利第9,228,014号中所描述)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利第9,079,948号中所描述)、抗中东呼吸道症候群(Middle East RespiratorySyndrome)病毒(例如抗MERS抗体，如美国专利第9,718,872号中所描述)、抗埃博拉病毒(Ebola virus)抗体(例如，如美国专利第9,771,414号中所描述)、抗兹卡病毒(Zikavirus)抗体、抗淋巴球活化基因3抗体(例如抗LAG3抗体，或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如抗NGF抗体，如美国专利申请案公开第US2016/0017029号(废气的)和美国专利第8,309,088号及第9,353,176号中所描述)及抗蛋白Y抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的群组：抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利第9,657,102号及第US20150266966A1号中所描述)、抗CD3×抗黏蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)及抗CD3×抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施例中，感兴趣的蛋白选自由以下组成的群组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、阿多曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利单抗(belimumab)、苯拉组单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维多汀(brentuximabvedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、布罗珠单抗(brolucizumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、德诺单抗(denosumab)、迪奴图单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、艾库组单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾美赛珠单抗-kxwh(emicizumab-kxwh)、阿利人单抗艾坦辛(emtansinealirocumab)、恩维纳单抗(evinacumab)、依伏库单抗(evolocumab)、法神单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、古赛库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英利昔单抗(infliximab)、英利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊科奇单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莱西单抗(necitumumab)、内斯瓦库单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥托昔单抗(obiltoxaximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥克珠单抗(ocrelizumab)、奥伐木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、兰希班单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利奴单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、赛瑞单抗(sarilumab)、塞库金单抗(secukinumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托西利单抗(tocilizumab)、托西利单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特里沃单抗(trevogrumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
在一些实施例中，复合物中的蛋白是含有Fc部分和另一域的重组蛋白(例如Fc融合蛋白)。在一些实施例中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外域。在一些实施例中，Fc部分包括铰链区，随后是IgG的CH2和CH3域。在一些实施例中，受体Fc融合蛋白含有两条或更多条不同的受体链，其与单个配体或多个配体结合。例如，Fc融合蛋白为TRAP蛋白，诸如IL-1trap(例如，利纳西普(rilonacept)，其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利第6,927,044号，其以引用的方式全文并入本文)或VEGF trap(例如阿柏西普或塞维-阿柏西普(ziv-aflibercept)，其包括与融合至hIgG10的Fc的VEGF受体Flk1的Ig域3融合的VEGF受体Flt1的Ig域2)。在其他实施例中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合域中的一个或多个，诸如可变重链片段和可变轻链片段。
在一些实施例中，也可以根据本发明制备缺乏Fc部分的蛋白，诸如重组产生的酶和微型trap。微型trap是使用多聚化组分(MC)而非Fc部分的trap蛋白，且公开在美国专利第7,279,159号和第7,087,411号中。
在一些实施例中，初始蛋白呈干粉形式，例如微粉化的干粉。在一些实施例中，蛋白是喷雾干燥的粉末(SDP)。使用喷雾干燥的蛋白代替蛋白溶液的优点是微粒中的蛋白负载更高和在包封过程期间蛋白稳定性更好。在一些实施例中，在整个包封过程和储存条件期间，干蛋白分子保持固态并被稳定剂包围。在一些实施例中，包封的喷雾干燥的蛋白表现出高回收率和低聚集，这可能是由于最小化的表面相互作用，因为仅一小部分表面蛋白被暴露于界面。在一些实施例中，蛋白在包封前被微粉化。
B.微粒
一些实施例提供了使用所公开的非水性膜乳液体系产生的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物含有具有聚合物皮层和微粉化的蛋白核的微粒。在一些实施例中，微粒的形状大致为球形。一些微粒和蛋白核将接近球形，而其他微粒和蛋白核的形状将更加不规则。因此，如本文所用，术语“直径”意指下列各项中的每一项和任何一项：(a)外接微粒或蛋白核的球的直径，(b)配合在微粒或蛋白核范围内的最大球的直径，(c)在(a)的外接球与(b)的限制球之间的任何量度，包含这两者之间的平均值，(d)微粒或蛋白核的最长轴的长度，(e)微粒或蛋白核的最短轴的长度，(f)长轴长度(d)与短轴长度(e)之间的任何量度，包含这两者之间的平均值，和/或(g)等效圆直径(“ECD”)，通过微流成像(MFI)、纳米粒子追踪分析(NTA)确定，或通过光散射方法诸如静态光散射(SLS)、动态光散射(DLS)或激光衍射分析确定的体积或数均直径。直径一般用微米(μm或微米)表达。直径可以通过光学测量或扫描电子显微镜测量来确定。
通过所公开的非水性乳液方法产生的微粒含有低、非常低或接近零含量的水(例如，<或＝3重量％的水)的多个蛋白分子。如本文所用，微粉化的蛋白颗粒的ECD在2微米至约35微米，或2.0μm至50μm，或5.0μm至15.0μm，30μm至60μm，或约10μm的范围内。微粉化的蛋白颗粒不限于任何特定的蛋白实体，并且适用于包含上文所述蛋白在内的治疗性蛋白的制备和递送。
例如，可以通过喷雾干燥、冻干和研磨、气流研磨、在非溶剂中的可逆沉淀、制粒、逐步沉淀(US 7,998,477(2011))、超临界流体沉淀(US 6,063,910(2000))或高压二氧化碳诱导的颗粒形成(Bustami等人，《药理学研究(Pharma.Res.)》17:1360-66(2000))将蛋白颗粒微粉化。如本文所用，短语“喷雾干燥”意指通过使用喷雾干燥器从浆料或悬浮液中产生包括微米级颗粒的干粉的方法。喷雾干燥器采用雾化器或喷嘴将悬浮液或浆料分散成受控的液滴大小的喷雾。喷雾干燥可以生成10μm至500μm的液滴大小。随着溶剂(水或有机溶剂)的干燥，蛋白物质干燥成微米级颗粒，形成粉末状物质；或者在蛋白-聚合物悬浮液的情况下，在干燥期间中，形成围绕蛋白负载的聚合物硬化的外壳。
在一些实施例中，微粉化的蛋白是VEGF Trap蛋白。用于形成微粉化VEGF Trap蛋白颗粒的药物调配物可含有约10mg/mL至约100mg/mL VEGF Trap蛋白、约1.0mg/mL至约50mg/mL蛋白、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL,约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或约100mg/mL VEGF Trap蛋白。
在一些实施例中，使用所公开的非水性膜乳液体系产生的微粒在聚合物皮层内含有蛋白颗粒核，其直径在约2μm至约70μm、约5μm至约65μm、约10μm至约60μm、约15μm至约55μm、约10μm至约50μm、约1.0至15μm、约20μm、约25μm或约30μm的范围内。尽管蛋白核的直径在一定程度上有助于尺寸变化，但尺寸变化在很大程度上反映了聚合物皮层的厚度。
在一些实施例中，通过所公开的非水性乳液方法形成的微粒是可流动的微粒组合物。所公开的可流动的微粒组合物可以悬浮在药学上可接受的赋形剂，例如pH缓冲盐水中。可流动的微粒组合物可以例如使用诸如具有27G针头的注射器的注射器肠胃外施用。
在一些实施例中，微粒可用于蛋白治疗剂的延时释放或缓释。在一些实施例中，微球调配物经玻璃体内、脉络膜上或皮下注射。例如，设想VEGF Trap微粒可用于VEGF Trap治疗性蛋白在例如玻璃体或脉络膜上腔中的缓释以治疗血管性眼症，或用于皮下植入以进行VEGF Trap的缓释从而治疗其他病症。
本发明的微粒在生理水性环境中在约37℃以相对恒定的速率历经至少60天、90天、120天或150天的延长时间释放蛋白。在一些实施例中，24小时后微粒具有小于15％的突释，随后是药物的线性持续释放。
一些实施例提供了使用本文公开的非水性膜乳液方法产生的微球组合物，其中组合物含有>100mg喷雾干燥的蛋白。在一些实施例中，非水性膜乳液方法具有>90％的产率，并产生纯度>99％且具有>10％w/w负载和<10％突释的微粒。
实例
实例1：通过基于H/F的散装乳液合成空白微球。
材料和方法
基于油和水的乳液体系常用于聚合物微粒或纳米颗粒的合成，其中疏水性聚合物材料溶解在有机相中并分散在连续水相中。然而，对于水溶性聚合物，例如PEG、羧甲基纤维素(CMC)以及在水存在下容易水解的聚合物，包含聚酸酐、具有短中间嵌段的脂肪族聚酯如聚乳酸和某些聚(氨基酸)如聚(谷氨酸)，常规的基于水的乳液体系并不理想。以下实例证明了所公开的H/F乳液体系用于产生上述可水解或可水降解的聚合物微粒的效用。在一些实施例中，首先将那些聚合物溶解在烃溶剂中，包含极性溶剂，例如乙腈、四氢呋喃和低极性溶剂，例如DCM、氯仿。然后，将该聚合物溶液添加到连续相，碳氟化合物液体(例如具有FS的FC-40，例如Picosurf 1)中。通过搅动、涡旋或其他掺合方法制成乳液。通过蒸发或萃取烃溶剂，最终将乳液液滴硬化成聚合物球。
在特定的实施例中，对于通过H/F散装乳液合成空白POE微球，如方案1(图1A)所示，将200μL在DCM中约10％w/v、20％w/v、30％w/v和40％w/v的POE添加到2mL含有0.5％w/wFS Pico-SurfTM1(球流体公司(Sphere Fluidics))的FC-40中。通过涡旋实现乳化。乳液液滴比FC-40轻，且漂浮在溶液的顶部上。取等分试样并滴在载玻片上用于显微镜成像。在真空搅拌3小时的情况下使微球硬化。将FC-40中的硬化的聚合物球首先通过0.22微米PES膜真空过滤。使FC-40通过过滤器并保留微球。然后用额外的FC-40洗涤微球，并在真空下完全干燥。在采用相同过程的另一个实例中，在烃相中使用DCM中约30％w/v的POE，且在碳氟化合物相中使用FC40中约0.01％、0.1％和0.5％的FS，以评估FS浓度的影响。
结果
在FS存在的情况下，烃和碳氟化合物的混合物能够形成H/F乳液。在一个实例中，将DCM作为H/F乳液分散在FC-40中(参见图1B中FC-40的结构)，且使用PFPE-PEG-PFPE作为FS(参见图1C中FS的结构)。将增加浓度的FS添加到FC-40碳氟化合物相中。测试表明，需要0.1％w/w至5％w/w的FS来防止DCM液滴聚结(图2A)。如果添加少于0.1％w/w的SF，则观察到更宽的尺寸分布。如果不使用SF，则DCM液滴不稳定。分散的DCM液滴将迅速合并在一起，且两相将很快分离。结果表明，必须使用足够量的FS来产生稳定的H/F乳液，并在硬化过程中连续搅拌，以成功产生聚合物微球。(图2B)。
将POE添加在DCM中并在FC-40中涡旋导致形成含有POE的液滴。将DCM在环境条件下在敞口容器中或在真空下蒸发会导致液滴硬化成POE微球(图2A和2B)。微球尺寸与液滴的尺寸和有机相中POE的含量有关。更高的POE浓度导致更大的微球尺寸(表1)。
表1.用DCM中不同浓度的POE产生的POE球的微球尺寸。
| 直径 | 10％w/v POE | 20％w/v POE | 30％w/v POE | 40％w/v POE |
| Dv(10)(μm) | 0.9 | 1.3 | 3.1 | 7.1 |
| Dv(50)(μm) | 2.7 | 7.2 | 17 | 34.8 |
| Dv(90)(μm) | 6.5 | 13.4 | 30.1 | 67.4 |
实例2：均质化速度的影响。
材料和方法
将一(1)mL在DCM中的30％或40％w/v的POE添加到9mL具有0.5％(w/w)FS FC-40的FC-40中，并用具有VWR 7mm×95mm锯齿生成器探针的VWR手持式均质化器200以低(约全功率的50％)、中(约全功率的60％)和高(约全功率的70％)三种均质化速度中的一种乳化。在真空下搅拌形成的乳液。洗涤形成的微球并在真空下干燥。
结果
如图3A-C所示，对于30％POE，低均质化速度产生较大的微球尺寸，而高均质化速度产生较小的尺寸(表2)。40％POE显示了相同的趋势。这些结果表明，调谐均质化速度可以控制微球尺寸。
表2.用不同的均质化速度产生的POE球的微球尺寸。
| 直径 | 低速 | 中速 | 高速 |
| Dv(10)(μm) | 2.8 | 2.0 | 1.1 |
| Dv(50)(μm) | 16.1 | 13.5 | 5.4 |
| Dv(90)(μm) | 31.5 | 31.6 | 12.0 |
实例3：通过基于S/H/F的散装乳液方法将蛋白SDP包封在POE微球中的一般程序。
材料和方法
如图4所示，散装乳液合成可分为三个步骤，调配、乳化、硬化。由于在这三个步骤中使用不同的参数，产物的性质将会不同。一般程序描述如下：
为了调配，将总固体重量的10％w/w至30％w/w的VEGF Trap SDP(或用于荧光成像的荧光标记的SDP(F-SDP))通过涡旋和随后的超声处理5min分散在含有10％w/v至35％w/vPOE的500μL乙酸乙酯中。然后将这些悬浮液添加到9.5mL具有0.1％至0.5％w/w FS的FC-40中。可以通过搅动、涡旋或使用台式均质器均质化来实现乳化。乳液的结构如图5所示。乳化后，立即取出过程中的等分试样并滴在载玻片上用于显微镜成像。在环境条件下，通过蒸发在载玻片上使液滴硬化。为了硬化微球，应用了三种方法中的一种：(a)将溶液在环境条件下在敞口容器中搅拌过夜，并使乙酸乙酯蒸发；(b)在真空下搅拌溶液至少2小时，以加快溶剂蒸发；(c)在搅拌下将NOVEC 7500或FC-40和NOVEC7500的混合物添加到乳液中。HFE充当共溶剂，有助于将乙酸乙酯从烃相中萃取到碳氟化合物相中，并实现快速硬化过程(通常在几分钟内)。
最后，将FC-40中的硬化的聚合物球首先通过0.22μm PES膜真空过滤。使FC-40通过过滤器并保留微球。然后用额外的FC-40洗涤微球，并在真空下完全干燥。
使用Malvern Mastersizer 3000通过激光衍射分析测量微球的尺寸，且通过将产物粉末分散在0.01％w/v PVA溶液中进行液体取样。使用扫描电子显微镜(SEM)测量产物的形态。
为了测量微球的蛋白含量，首先将预定量的微球溶解在200μL乙酸乙酯中，然后用1纯水萃取，收集水相并离心去除混浊的悬浮液。通过SEC-UPLC测量蛋白纯度和浓度。
为了测量突释，将预定量的微球在1mL PBS中在37℃孵育1小时。将混合物离心，且对上清液进行SEC-UPLC以浓缩蛋白。
结果
上述结果表明，在足够的SF存在的情况下，形成了稳定的H/F乳液。这种非水性乳液可以成功地产生空白POE球。再次使用这种无水方法将SDP并入POE微球中。在一个实例中，将占总固体重量10％w/w的VEGF Trap F-SDP引入乙酸乙酯(包含20％w/v的POE)作为悬浮液中，且通过搅动和涡旋掺合在FC-40(含有0.5％w/w FS)中的该悬浮液。乳化后，立即将等分试样转移到载玻片上进行显微镜成像。如图6A和6B所示，乙酸乙酯在FC-40中分散成液滴，SDP颗粒明显地被限制在乙酸乙酯液滴内。与S/O/W体系(数据未显示)相反，没有蛋白渗漏到碳氟化合物连续相中的迹象。重要的是，在这种H/F体系中，液滴中的SDP颗粒在粉末状态下保留其原始的凹坑形状。因为在H/F体系中没有水对SDP进行重构，因此SDP保留其最初的固体颗粒形式。硬化之后，可以通过明场和荧光显微镜图像清楚地观察到含有单个或多个SDP颗粒的POE微球(图7A、7B和7C)。在载玻片上的烃和碳氟化合物溶剂蒸发后，添加水来测试突释和包封质量。如图8A-D所示，将微球产物放入水中后，SDP包封的POE微球保持其完整性。没有观察到蛋白的立即释放，并且SDP颗粒的形状保持不变，这表明SDP颗粒受到聚合物基质的良好保护，并与水性环境屏蔽开。这些结果表明，H/F乳液是用于将蛋白和其他亲水性药物包封到聚合物基质中的有效解决方案，且具有实现高包封效率、高产率的潜力，同时最大限度地减少突释-所有这些都是使用基于水的W/O/W或S/O/W方法时的主要挑战。
此处公开的程序是使用基于S/H/F非水的散装乳液方法将蛋白SDP包封在POE微球中的实例。方法是可再现的、可扩展的且可调谐的。通过改变调配物和过程中的参数，可以调谐和控制产物性质。在实例4中公开了其中一些参数的影响。
实例4：烃溶剂的影响
材料和方法
使用二氯甲烷或乙酸乙酯作为烃，如实例2所述制备微粒。制备在DCM中的35％w/vPOE和在乙酸乙酯中的35％w/v POE。将蛋白粉末总固体重量的百分之十(10％)w/w悬浮在0.5mL在DCM或乙酸乙酯中的POE溶液中。将这些悬浮液转移到20mL闪烁管中的9.5mL含有0.5％w/w FS的FC-40中。将这些混合物均质化以生成乳液，并在室内真空下搅拌1.5小时。通过过滤分离形成的微球，用FC-40洗涤，并在真空下干燥。
结果
图9示出了除了烃溶剂二氯甲烷或乙酸乙酯的类型外，使用相同调配物和过程条件产生的微粒的尺寸分布。使用任一种烃产生的微粒显示出喷雾干燥的蛋白的包封。使用二氯甲烷会生成更大的微粒。参见下表3。结果表明，在相同的调配物和过程条件下，使用不同的烃溶剂会得到不同尺寸的微球。DCM比乙酸乙酯产生更大的微球尺寸。因此，可以有意选择烃溶剂来控制微球尺寸。
表3.用DCM或乙酸乙酯产生的负载SDP的POE球的微粒尺寸。
| 直径 | DCM | EtAc |
| Dv(10)(μm) | 5.2 | 3.2 |
| Dv(50)(μm) | 30.7 | 21.2 |
| Dv(90)(μm) | 64.9 | 42.3 |
实例5：蛋白负载量的影响
材料和方法
仅改变蛋白负载量，如实例2所述产生微粒。制备了在DCM中百分之三十五(35％)w/v的POE。将蛋白粉末总固体重量的5％w/w、10％w/w和30％w/w悬浮在0.5mL POE在DCM中的溶液中。将这些悬浮液转移到20mL闪烁管中的9.5mL含有0.5％w/w FS的FC-40中。将这些混合物均质化约1min以生成乳液，然后在一分钟内将6mL的1:1v:v的Novec7500和FC-40混合物添加到乳液中。然后再搅拌一分钟后，通过过滤分离形成的微球，用FC-40洗涤并在真空下干燥。
结果
如表4所示，通过激光衍射分析测量，增加调配物中蛋白粉末的量会产生更大的POE微粒尺寸，并且通过蛋白萃取实验、明场和共聚焦荧光显微镜观察，也产生最终POE微球产物中的蛋白负载增加。30％w/w蛋白粉末负载的明场图像显示比10％w/w蛋白粉末更暗和更不透明的微球，表明更多的药物被包封在微球产物中(图10A和10B)。代表性的共聚焦图像证实，从微球的横截面图来看，SDP以其原始形式包封在POE基质中(图11A和11B)。在30％w/w负载的微球中观察到更多的SDP颗粒。同样，包封的SDP保留了它们最初的凹坑形状，表明它们在整个制造过程中完好无损。
表4.用不同的SDP负载产生的负载SDP的POE球的微粒尺寸。
| 直径 | 5％w/w SDP负载 | 10％w/w SDP负载 | 30％w/w SDP负载 |
| Dv(10)(μm) | 4.9 | 5.2 | 17.1 |
| Dv(50)(μm) | 20.6 | 30.7 | 40.7 |
| Dv(90)(μm) | 43.0 | 64.9 | 81.3 |
图12A和12B是负载有5％w/w SDP和10％w/w SDP的微粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。
实例6：使用H/F散装乳化将SDP包封到POE微球中的实验设计(DOE)。
材料和方法
进行DOE研究以评估在设计空间中合成的关键因素对最终产物性质的影响。按照实例2中描述的一般程序，在设计的实验中进行十次运行。改变蛋白粉末负载、蛋白粉末粒度(Dv(50)尺寸大小为2.2um和5.6um，分别参见图13A和13B中的SEM图像)、聚合物浓度和HFE浓度，同时保持下列调配物和过程条件不变，例如烃和碳氟化合物相的体积、均质化速度、FS浓度(表5)。测量的响应包含微球尺寸(Dv50，通过激光衍射的跨度)、包封效率、在37℃下1小时的突释、SEM图像。
结果
表5总结了DOE的结果。
表5.SDP包封DOE研究的实验设计和测量响应。
*将微球溶解在乙酸乙酯中，且使用水萃取蛋白，并使用SEC-UPLC来量化。
**将微球在PBS中在37℃孵育1小时。使用SEC-UPLC对所释放的蛋白进行量化。
定制设计的DOE对微球尺寸的拟合(R2＝0.76)揭示了蛋白粉末负载和POE浓度的主要影响(p值<0.05，参见表6.中的相关结果)。此外，对突释的拟合(R2＝0.92)表明，仅蛋白粉末负载显著影响突释(p值<0.05，参见表7中的相关结果)。结果表明，增加调配物中蛋白粉末的量将导致最终产物中的有效负载更高，但也会增加突释百分比。突释可能是由表面吸附的蛋白颗粒引起的。对于给定的微球尺寸，聚合物微球中内在化的蛋白粉末的最大量由物理空间决定。简单地增加调配物悬浮液中的蛋白粉末浓度不会使药物包封增加超过某一阈值，在该实例中阈值约为30％w/w。
表6.因素与微球尺寸的相关性。
| 项目 | 估计值 | 标准误差 | T比率 | Prob>|t| | VIF |
| 截距 | 23.03 | 0.924421 | 24.91 | <0.0001* | |
| SDP负载(％)(5、25) | 3.4875 | 1.033534 | 3.37 | 0.0118* | 1 |
| [聚合物](％；w/v)(25、35) | 2.99 | 0.924421 | 3.23 | 0.0144* | 1 |
表7.SDP负载与突释正相关。
| 项目 | 估计值 | 标准误差 | T比率 | Prob>|t| | VIF |
| 截距 | 63.190484 | 4.008836 | 15.76 | <0.0001* | |
| SDP负载(％)(5、25) | 43.17019 | 4.482015 | 9.63 | <0.0001* | 1 |
实例7.基于S/H/F乳化的包封方法在不同蛋白中的应用。
所公开的基于H/F的乳液体系和方法可以是适用于不同聚合物和治疗性蛋白的平台技术。在本发明的具体实例中，通过与实例2相同的过程分别将重组IgG4的蛋白粉末(MW～145kDa)、重组IgG1的蛋白粉末(MW～146kDa)或重组融合蛋白的蛋白粉末(MW～64kDa)包封到POE微球中。结果总结在表8中。微球产物中包封的蛋白粉末的量通过萃取测定来确定，并与靶标值相匹配。在包封过程之后，重组融合蛋白IgG1的蛋白纯度保持不变，或者IgG4的蛋白纯度略微降低(小于2％)，这表明了良好的过程相容性。
表8.通过S/H/F乳液将不同类型的蛋白包封在POE微球中的SDP的结果。
*将微球溶解在乙酸乙酯中，且使用水萃取蛋白，并使用SEC-UPLC来量化。
**将微球在PBS中在37℃孵育1小时。使用SEC-UPLC对所释放的蛋白进行量化。
其他可生物降解的聚合物，例如PLGA和PLA也用于基于H/F的乳液中。在本发明的具体实例中，通过实例2中公开的类似过程，将荧光标记的VEGF Trap F-SDP分别包封在PLGA(丙交酯:乙交酯50:50，Mw 42-65kDa，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))和PLA(烷基醚封端，Mw 18,000-28,000，西格玛奥德里奇公司)微球中。也可以采用其他聚合物比例和分子量。明场和荧光显微镜图像表明蛋白粉末成功地包封在聚合物微球内(PLA的图14A-C和PLGA的图15A-B)。
实例8：膜非水性乳液
使用表9中描述的材料，使用膜乳液产生微粒。
表9：
膜乳化(ME)是一种相对新的技术，用于对颗粒产生进行高度控制，从而允许良好的尺寸控制和窄的尺寸分布。迄今为止，已经针对ME开发了许多不同类型的膜，包含白须多孔玻璃(SPG)、醋酸纤维素、聚合物、阳极多孔氧化铝和硅微通道。对于所公开的过程，发现具有激光钻孔的不锈钢膜最适合目的，并且微孔技术公司(英国雷德卡)的市售设备使得实验室研究过程以及GMP制造的按比例增加成为可能。膜技术的几个重要特征包含：1.严格控制的膜孔径允许所有低于极限的SDP颗粒通过膜；2.没有弯曲路径的直管状通道降低了SDP阻塞通道的趋势；3.亲氟膜涂层为碳氟化合物包烃(H/F)乳液的产生提供了良好的相容性。此外，不锈钢膜坚固耐用，易于清洗且是可消毒的。
对于一个实验，通过使用常规基于水的乳液体系的膜乳化来产生空白POE微球(RS001-批次1)或蛋白包封的POE微球(RS001-批次2)。产生参数列于表10。在批次1中，在DCM中的10％w/w POE用作分散相，且1％聚乙烯醇(PVA)用作连续相，以产生空白POE微球。在第2批中，对尺寸D50＝2.2(D10＝1.0，D90＝3.8，跨度＝1.24)的VEGF Trap SDP(含有1％Alex488标记的VEGF Trap)进行微包封。将SDP添加到DCM中的10％w/w POE溶液中，其中按照重量，SDP:POE＝9:1。将混合物涡旋并在超声浴中超声处理5min，以制成均匀的悬浮液。将SDP悬浮液立即加载到10mL BD注射器中，并通过注射泵以0.8mL/min的速率进料到LDC-1分散池中。当有机相在使用10V DC电源(取决于粘度，约1,015rpm)的搅拌下通过具有30um孔隙的膜时，生成乳液。将形成的乳液转移到无盖烧杯中，并在环境条件下硬化成微球，而无需搅拌过夜。最后在真空过滤器上用MilliQ水洗涤微球产物，并在真空下干燥过夜。
表10.批次1和批次2中使用的参数，使用常规水性乳液体系的膜乳化。
对于另一个实验，通过使用新的非水碳氟化合物包烃乳液体系的膜乳化来产生空白POE微球(批次3)或蛋白包封的POE微球(批次4)。产生参数列于表11。在批次4a中，将上述VEGF Trap SDP(含有1％Alexa488标记的VEGF Trap)添加到含有可生物降解或可生物溶蚀的聚合物POE的烃溶剂DCM中。将混合物涡旋并超声处理以形成均匀的悬浮液。将SDP悬浮液立即加载到注射器中，并通过注射泵进料到LDC-1分散池。将悬浮液通过孔径大于蛋白粉末颗粒的多孔膜输注到含有含氟表面活性剂(例如Pico-Surf 1)的碳氟化合物(例如FC-40)连续相中，形成碳氟化合物包烃乳液(如图16所示)。通过将氢氟酯NOVEC 7500作为共溶剂添加到碳氟化合物中，从形成的乳液液滴中去除烃溶剂，从而实现随后的微球硬化。收集硬化的微球，且用FC-40洗涤以去除多余的含氟表面活性剂，并使用含有PES过滤器的真空过滤进行干燥。最后，在真空下干燥产物以去除残留的溶剂。整个过程的流程图如图17所示。
表11在使用无水碳氟化合物包烃乳液体系的研究RS002膜乳化中使用的参数。
结果
如图18所示，通过常规基于水的乳液体系(批次1)和通过基于非水的乳液体系(批次3)制造的空白POE微球的SEM图像显示，两种方法都提供了球形微粒，但具有不同的表面形态。基于水的方法由于过程中存在水而产生高度多孔的表面，而基于非水的方法由于完全无水的过程而产生没有清晰孔隙的光滑微球表面。
对于将VEGF-Trap SDP微包封到POE微球中，两种方法的结果比较如图19所示。基于水的膜乳化(批次3)提供了良好的单分散微球，但是表面是高度多孔的并且具有水通道。来自非水性膜乳化的微球的单分散性比水性型式差，但可以通过调整过程参数进一步提高。此外，观察到许多SDP嵌入POE微球的表面上。这些位于表面的SDP可能有助于微球在缓冲液中孵育后蛋白的突释(表11和12)。
荧光显微镜图像揭示了POE微球内部的蛋白SDP的形态和分布(图20)。对于批次3，SDP在包封过程中通过水重构，并在微球内合并成更大的液滴。相反，对于批次4，包封在微球内部的SDP保留其原始的葡萄干状结构，表明SDP在过程后保持其完整性，因为蛋白没有通过水重构。
批次3和批次4的包封效率(产物中测得的蛋白负载/理论蛋白负载)分别确定为35.0％和80.7％(表12)。非水体系超过两倍的包封效率表明，与水体系相比，SDP更好地保留在烃液滴中，并且更少扩散到连续相中。通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量包封在POE微球中的蛋白的纯度(单体的百分比)。批次4显示出在整个包封过程后保持良好的蛋白纯度。
表12.POE微球中包封的蛋白的量化和纯度。
*通过SEC，原始SDP含有60重量％的蛋白和97.3％的纯度。
尽管在前述说明书中，本发明已就其某些实施例进行描述，并已出于说明的目的阐述许多细节，但本领域的技术人员将显而易见，本发明易受其他实施例影响并且本文所述的某些细节可在不背离本发明的基本原理的情况下进行相当大的变化。
本发明可在不脱离本发明精神和基本特质的情况下以其他特定形式实施，且因此，应参考随附权利要求书而非前文说明书来指定本发明之范围。
Claims (45)
1.一种产生经聚合物涂覆的微粒的方法，其包括：
将微粉化的蛋白粉末和聚合物组合到烃溶剂中以形成非水性第一溶液；
搅动所述第一非水性溶液以形成悬浮液；
将所述悬浮液进料至分散池，其中在包括碳氟化合物液体和含氟表面活性剂的连续相的切线流下，将所述悬浮液通过多孔膜输注到所述连续相中，以形成碳氟化合物包烃乳液；
将氢氟酯添加到所述碳氟化合物化合物包烃乳液中；
去除所述烃溶剂以提供硬化的微粒；和
去除所述碳氟化合物液体以分离所述微粒，其中所述微粒包括包封在聚合物基质内的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过在所述碳氟化合物液体中洗涤所述微粒从所述微粒中去除残留的含氟表面活性剂并通过真空去除所述碳氟化合物以及使用聚醚砜膜过滤器收集所述微粒的步骤。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述碳氟化合物液体包括全氟C5-C18化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述烃溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合组成的群组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述碳氟化合物溶液包括1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺。
6.根据权利要求1至1中任一项所述的方法，其中所述含氟表面活性剂包括全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合物包括聚原酸酯(POE)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合物选自由聚乳酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)组成的群组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述氢氟酯是2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述膜是经亲氟物质涂覆的不锈钢膜。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述膜的孔隙的直径为3μm至300μm。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述含氟表面活性剂以约0.1％w/v至5％w/v存在于碳氟化合物液体中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白粉末与所述聚合物的比率为0.1％至30％。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微粉化的粉末由抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、重组蛋白或其片段或截短型式产生。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述融合蛋白是VEGF Trap融合蛋白或其截短型式。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述VEGF-trap融合蛋白是阿柏西普(aflibercept)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述悬浮液的进料速率为0.1ml/min至1.0ml/min。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述悬浮液是均匀悬浮液。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述微粒包括单核-壳结构。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中至少一个微粒包括分散在所述聚合物中的多个核。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述微粒包括包括有由聚合物包封的单核结构的组合的微粒和包括由聚合物包封的多核结构的微粒。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微粒的直径为1μm至200μm。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述微粒的中值直径为30μm至60μm。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中通过喷雾干燥、电喷雾干燥、可逆沉淀、喷雾冷冻、微模板或其组合将蛋白粉末微粉化。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中使用均质化、涡旋、超声处理、空化、搅动、搅拌、搅转、搅打、摇动、乳化或其组合来形成所述悬浮液。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中通过蒸发去除所述烃溶剂。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中通过真空过滤去除所述碳氟化合物液体。
28.通过根据权利要求1至27中任一项所述的方法产生的微粒，其中所述微粒是持续释放微粒。
29.一种持续释放组合物，其包括根据权利要求28所述的微粒。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的微粒，其中所述微粒在聚合物皮层中几乎没有或没有孔隙或通道。
31.一种产生聚合物或经聚合物涂覆的微粒的方法，其包括：
将悬浮在烃溶液中的1％w/w至30％w/w的总固体喷雾干燥的蛋白组合以形成非水性第一溶液；
搅动所述第一非水性溶液以形成悬浮液；
将所述悬浮液进料至分散泵，其中在包括碳氟化合物液体和0.1％w/v至5.0％w/v含氟表面活性剂的连续相的切线流下，将所述悬浮液通过多孔膜输注到所述连续相中，以形成碳氟化合物包烃乳液；
去除烃溶剂以提供硬化的聚合物或经聚合物涂覆的微球；和
去除所述碳氟化合物液体以分离所述微粒，其中所述微粒包括包封在聚合物基质内的蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其还包括在去除所述烃溶剂之前，将氢氟酯添加到所述碳氟化合物包烃乳液的所述碳氟化合物液体中的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中通过在环境大气压下或在真空下蒸发来去除所述烃溶液。
34.根据权利要求33所述的方法，其中通过真空过滤收获所述硬化的聚合物或所述经聚合物涂覆的微球。
35.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述喷雾干燥的蛋白是抗体、重组蛋白、融合蛋白或其片段。
36.根据权利要求365所述的方法，其中所述蛋白是VEGF Trap蛋白或截短的VEGF Trap蛋白。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述烃溶液选自由二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃或其组合组成的群组。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述碳氟化合物液体包括三氟甲基)双(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)胺。
39.根据权利要求38所述的方法，其还包括收获所述硬化的微粒。
40.通过根据权利要求31至39中所述的方法中的任一项产生的微粒。
41.一种药物组合物，其包括根据权利要求40所述的微粒。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其还包括一种或多种赋形剂。
43.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放组合物。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物经调配用于肠胃外施用。
45.根据权利要求3所述的方法，其中所述氢氟醚包括4-乙氧基-1,1,1,2,2,3,3,4,5,6,6,6-二癸氟-5-(三氟甲基)己烷。
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