TW202237070A - 使用非水性膜乳化之持續釋放調配物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於產生聚合及經聚合物塗佈之微粒的非水性膜乳液方法。一個實施例提供一種用於藉由以下產生持續釋放或控制釋放微粒之方法：將微粉化蛋白質粉末與聚合物組合至烴溶劑中，以形成非水性第一溶液，攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液，將該懸浮液饋入至分散泵中，其中該懸浮液經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及氟界面活性劑之連續相中以形成氟碳化合物包烴乳液。移除該烴溶劑、該氟碳化合物液體及該氟界面活性劑，且收集該等微粒。
Description
本申請案主張於2020年11月25日申請之美國申請案序列號63/118,264之優先權，其以引用的方式併入本文中。
本發明之範疇大體上係關於藥物微球體調配物及使用由膜乳化方法產生之非水性乳液系統製備該等藥物微球體調配物之方法。
治療性蛋白質向生物學相關目標之緩釋遞送對於治療醫學病狀為合乎需要的，諸如癌症、心血管疾病、血管病狀、矯形外科病症、牙科病症、傷口、自體免疫疾病、腸胃疾病及眼部疾病。數十年來，已使用生物相容及生物可降解之聚合物及用於藥物之控制遞送及緩釋遞送的其他可植入遞送裝置。舉例而言，在一些基於聚合物之遞送裝置中，隨著聚合物隨時間而降解，治療藥物被緩慢釋放。
延長釋放可為針對患者順應性所需。特定言之，減少注射數目可能為有益的，尤其在需要醫師以執行注射之情況下，諸如在眼內治療劑之情況下。存在對用以隨時間推移有效地遞送藥物，以儘可能少地注射之延長釋放調配物之未滿足的醫療需求。在其他疾病，例如癌症及發炎疾病之情況下，需要改進之含有穩定及有效的蛋白質治療劑之可植入延長釋放調配物。
治療性大分子，諸如抗體、受體Fc融合蛋白質、捕獲蛋白質及微型捕獲蛋白質必須以不僅使該等分子適用於向患者投與，且亦在儲存期間及在投與部位時維持其穩定性的方式調配。舉例而言，水性溶液中之治療性蛋白質（例如，抗體及融合蛋白質）易於發生降解、聚集及/或非所需化學改質，除非該溶液經適當調配。蛋白質治療劑在液體調配物中之穩定性不僅取決於用於調配物中之賦形劑的類型及彼等賦形劑相對於彼此之量及比例，且亦取決於可溶性蛋白質之濃度。當製備治療性蛋白質調配物時，除穩定性之外，亦必須考慮其他考慮因素。此類額外考慮因素之實例包括可藉由給定調配物調節之溶液之黏度及治療性蛋白質之濃度。當調配用於延長釋放之治療性蛋白質時，必須極小心地獲得如下調配物，該調配物隨時間推移且在儲存及生理溫度下保持穩定、含有足夠濃度之抗體且具有使該調配物能夠方便地向患者投與之其他特性。
一些延長釋放調配物係使用包括以下之多種封裝方法產生：內相分離、界面聚合、多重乳液之形成、聚電解質之逐層吸附及軟模板化技術。水包油包水（W/O/W）多重乳液為最常見之多重乳液類型，且能夠將水性/親水性核心直接封裝於水性懸浮液中。不幸地，當用於將生物活性劑包封至延長釋放調配物中時，水性乳液系統具有特定問題。舉例而言，蛋白質沈澱發生在水性有機界面處，同時伴隨其免疫反應性降低（Raghuvanshi, R.,等人, Pharm Dev Technol, 3(2):269-76（1998））。在一些水性乳液系統中，水可擴散至有機相中，且水解蛋白質。在水解之後，蛋白質液滴開始合併且逃逸至水性環境中且聚集或沈澱。硬化之後，空隙及水通道出現在微粒中，其中蛋白質曾存在但逃逸至水性環境中。
在不希望存在水之處，非水性乳液可替代常規水性乳液。然而，文獻或先前技術中幾乎沒有關於非水性乳液之報導。已知兩種類型之基於烴之非水性乳液系統：（1）藉由嵌段共聚物（例如，己烷/二甲基甲醯胺）穩定之兩個不可混溶的有機溶劑；及（2）使用現有界面活性劑替代水之不可與油混溶的極性溶劑（例如，甲醯胺、乙腈）。先前，已研究全氟化油包水（W/F）乳液且將其廣泛應用於針對單細胞或單分子生物分析之液滴為主的微流控中。在此等研究中，PFPE-PEG-PFPE已用作氟界面活性劑（FS）用於穩定氟碳化合物溶劑中之水滴。
儘管可獲得許多不可混溶的溶劑對（immiscible-solvent-pair），通常一個極性及一個非極性，但挑戰在於找出適用於聚合物微球體之合成的溶劑對。典型生物可降解聚合物，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚(原酸酯)（POE），大多可溶於具有中度極性之溶劑中，諸如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等。此限制連續相之選擇。另外，與製程之相容性、毒性、安全性及殘餘溶劑為使用彼等有機溶劑之問題，且對於用作醫藥產品需要被考慮。
氟碳化合物可以非水性乳液系統中之連續相形式使用，此係因為以下通用特性：
1. 氟碳化合物既非「疏水性」、亦非「親水性」的，其不可與大部分有機（烴）溶劑混溶，使其成為烴液滴乳液之連續相的理想選擇。
2. 氟碳化合物為蛋白質及其他親水性分子、基於烴之聚合物及有機賦形劑的非溶劑，亦即此等類型之分子將不可溶於氟碳化合物。
3. 氟碳化合物具有低黏度。
4. 氟碳化合物為化學上惰性的，且與通常使用之烴溶劑相比可具有相對更低的毒性或腐蝕性。
5. 氟碳化合物具有揮發性且可回收。
先前文獻報導，已經由微流控方法製造含有氟碳化合物之各種乳液系統，諸如氟碳化合物包水（W/F）、水包氟碳化合物包水（W/F/W）雙重乳液、水/氟碳化合物/油/水（W/F/O/W）三重乳液、氟碳化合物/烴/水（F/H/W）雙重乳液及烴/氟碳化合物/水（H/F/W）雙重乳液。此等乳液中之部分已用於聚合微球體之合成。然而，此等乳液中之全部仍為使用水作為分散相或連續相之基於水性之乳液系統。
無論所用之乳液類型如何，微球體或微粒粒度分佈通常為廣泛的，且在不具有廣泛製程最佳化及控制策略下無法輕易控制尺寸以符合目標。因此，仍需要研發在不具有廣泛製程最佳化及控制策略下控制微球體或微粒尺寸以符合目標之新穎方法。
因此，本發明之一目標為提供用於產生藥物調配物之非水性膜乳液系統和方法及其使用方法。
本發明之另一目標為提供具有改進之蛋白質穩定性及穩定之延長釋放及受控之尺寸分佈的延長釋放調配物。
本發明提供用於產生聚合及經聚合物塗佈之微粒的非水性膜乳液方法。一個實施例提供一種用於藉由以下產生持續釋放或控制釋放微粒之方法：將微粉化蛋白質粉末與聚合物組合至烴溶劑中，以形成非水性第一溶液，攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液，將該懸浮液饋入至分散單元中，其中該懸浮液在連續相之切向流下經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及氟界面活性劑之連續相中以形成氟碳化合物包烴（hydrocarbon-in-fluorocarbon）乳液（膜乳化）。該方法進一步包括以下步驟：將氫氟酯（hydrofluoroester）添加至該氟碳化合物包烴乳液中且自烴相中移除該烴溶劑以提供經硬化微粒。在一些實施例中，將氫氟酯與氟碳化合物之混合物添加至乳液以幫助移除烴。在一些實施例中，該方法包括隨後向該乳液中添加額外純氫氟酯。該方法進一步包括移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒含有封裝於聚合物基質內之蛋白質。該方法視情況包括於該氟碳化合物液體中洗滌該等微粒以移除殘餘氟界面活性劑，移除該氟碳化合物液體且例如藉由真空過濾來收穫該等微粒。在一個實施例中，真空過濾使用聚醚碸過濾膜。在一個實施例中，蛋白質粉末係由抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質或重組蛋白質產生。在一個實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白質，例如阿柏西普（aflibercept）。在一些實施例中，乳液係藉由整體乳化形成。
在一些實施例中，該烴溶劑選自由以下組成之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。
在一些實施例中，該氟碳化合物溶液包含1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺。
在一些實施例中，該氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。一些實施例具有0.1至5.0% w/v氟界面活性劑，通常約0.5% w/v氟界面活性劑。
在一些實施例中，該氫氟酯為2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
在一個實施例中，蛋白質粉末與聚合物比率為0%-30%。
在一些實施例中，多孔膜為不鏽鋼膜，視情況親氟塗佈之不鏽鋼膜。
氟碳化合物及烴液體可藉由在環境大氣壓力下或在真空下蒸發氟碳化合物及烴液體移除。在一些實施例中，該氟碳化合物液體含有氫氟醚（hydrofluoroether，HFE）。在一些實施例中，將HFE添加至非水性乳液以將烴迅速萃取至氟碳化合物液體中，以加速微球體硬化。在一些實施例中，該蛋白質粉末為微粉化蛋白質粉末。在一些實施例中，洗滌該等微粒以移除殘留於該等微粒上之任何殘餘烴溶劑、氟碳化合物液體、氟界面活性劑或其組合。例示性氟碳化合物液體包括全氟C5-C18化合物，包括（但不限於）1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺。例示性烴溶劑包括（但不限於）二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯及其組合。例示性氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚（PFPE-PEG-PFPE）三嵌段共聚物。例示性生物可侵蝕聚合物為聚原酸酯（POE）。在一些實施例中，蛋白質為抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質或重組蛋白質。在一個實施例中，蛋白質為噴霧乾燥之VEGF捕獲蛋白質。在一些實施例中，該等微粒之直徑為1.0至100 µm、1.0至200 µm或30至60 µm。在一個實施例中，由所揭示之非水性乳液方法形成之該等微粒為可流動微粒組合物。所揭示之可流動微粒組合物可懸浮於醫藥學上可接受之賦形劑，例如pH緩衝鹽水中，或懸浮於油性媒劑，諸如中鏈三酸甘油酯中。可流動微粒組合物可非經腸投與，例如使用具有27G針之注射器。在一些實施例中，微球體或微粒尺寸分佈係低於10CV%。在一些實施例中，微球體尺寸分佈為10至20CV%。
另一實施例提供一種產生聚合物或經聚合物塗佈之微粒之方法，其藉由在烴溶液中組合1.0至30.0% w/w之總固體噴霧乾燥之蛋白質，以形成非水性第一溶液，攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液，將該懸浮液饋入至分散單元中，其中該懸浮液在連續相之切向流下經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及0.1至5.0% w/v氟界面活性劑之該連續相中，以形成氟碳化合物包烴乳液，移除該烴溶劑以提供經硬化聚合物或經聚合物塗佈之微球體及移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒包含封裝於聚合物基質內之蛋白質。在一些實施例中，該懸浮液之饋入速率為0.1至1.0 ml/min。在一些實施例中，該方法進一步包括以下步驟：將氫氟酯作為共溶劑添加至該氟碳化合物包烴乳液之該氟碳化合物液體中，以將該烴溶劑自分散相中萃取至該連續相且幫助加速該等微粒之硬化。
在一些實施例中，由膜乳液產生之該等微粒在該等微粒之聚合物表面或內部基質中具有極少孔或通道，或沒有孔或通道。
又另一實施例提供一種醫藥組合物，其含有使用本文所揭示之非水性膜乳液方法產生的經聚合物塗佈之微粒。
在一些實施例中，可藉由改變調配物組合物及製程參數將微粒之尺寸調節至所需直徑或尺寸。
I. 定義應瞭解，本發明不限於本文所描述之組合物及方法以及所描述之實驗條件，因此可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅出於描述某些實施例之目的，且不意欲為限制性的，因為本發明之範圍將僅受隨附申請專利範圍限制。
除非另外規定，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同之含義。儘管類似於或等效於本文所描述之組合物、方法及材料的任何組合物、方法及材料可用於本發明之實踐或測試。本文所提及所有公開案均以全文引用之方式併入。
除非本文另外指明或上下文中明顯矛盾，否則在描述當前所主張之本發明的上下文中（尤其在申請專利範圍之上下文中）使用之術語「一（a）」、「一（an）」及「該」及相似指示物均應解釋為涵蓋單數及複數。
本文所闡述之所有數值限制及範圍包括範圍或限制之數值周圍或其間的所有數值或值。本文所描述之範圍及限制明確地命名且闡述了由範圍或限制定義且涵蓋之所有整數、小數及分數值。因此，除非本文另外指出，否則本文對值範圍之敍述僅意欲用作個別地提及屬於該範圍內之各個別值的簡寫方法，且各個別值係併入本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。
使用術語「約」意欲描述高於或低於在約+/- 10%範圍內之所陳述值的值；在其他實施例中，該等值可在高於或低於在約+/- 5%範圍內之所陳述值的值之範圍內；在其他實施例中，該等值可在高於或低於在約+/- 2%範圍內之所陳述值的值之範圍內；在其他實施例中，該等值可在高於或低於在約+/- 1%範圍內之所陳述值的值之範圍內。前述範圍意欲由上下文闡明，且不暗示進一步限制。除非本文另外指明或上下文中明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合之順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言（例如，「諸如（such as）」）之使用僅意欲更好地闡明本發明且並不對本發明之範圍形成限制。本說明書中之語言不應視作指示任一未主張之要素對於實踐本發明必不可少。
「混合(blending)」提供混合力，其包括壓縮剪切力及空蝕(cavitation)。技術及方法包括（但不限於）均質化、渦旋、音波處理、攪拌（stirring）、攪動（churning）、攪泡（whisking）、振盪、乳化、攪拌（agitating）及/或其組合。混合力之應用可為恆定或週期性的。
術語「微球體（microsphere）」及「微粒（microparticle）」可互換地使用。
「蛋白質」係指包含藉由肽鍵將兩個或更多個胺基酸殘基彼此接合之分子。蛋白質包括多肽及肽，且亦可包括改質，諸如醣基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、烷化、羥基化及ADP核糖基化。蛋白質可具有科學或商業價值，包括基於蛋白質之藥物，且蛋白質尤其包括酶類、配位體、受體、抗體及嵌合或融合蛋白質。蛋白質係使用熟知細胞培養方法由各種類型之重組細胞產生，且通常藉由遺傳工程技術（例如，編碼嵌合蛋白之序列、密碼子最佳化序列、無內含子序列等）引入至細胞中，其中其可以游離基因體形式存在或整合至細胞之基因體中。
「抗體」係指由四個多肽鏈，亦即藉由二硫鍵互連之兩個重（H）鏈及兩個輕（L）鏈，組成的免疫球蛋白分子。各重鏈具有重鏈可變區（HCVR或VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個域，CH1、CH2及CH3。各輕鏈具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個域（CL）組成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區（CDR），穿插有稱為構架區（FR）之更保守區。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語「抗體」包括對屬於任何同型或子類之醣基化及非醣基化免疫球蛋白兩者的參考。術語「抗體」包括藉由重組手段製備、表現、形成或分離之抗體分子，諸如自經轉染以表現抗體之宿主細胞分離的抗體。術語抗體亦包括雙特異性抗體，該雙特異性抗體包括可結合至超過一個不同抗原決定基之異源四聚體免疫球蛋白。雙特異性抗體通常描述於美國專利第8,586,713號中，其以引用的方式併入本申請案中。
「Fc融合蛋白質」包含未另外共同發現於自然界中之兩種或更多種蛋白質的部分或全部，所述蛋白質中之一者為免疫球蛋白分子之Fc部分。包含融合至抗體衍生之多肽之各種部分（包括Fc域）的某些異源多肽之融合蛋白質的製備已由例如Ashkenazi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535, 1991；Byrn等人, Nature 344:677, 1990；及Hollenbaugh等人,在Current Protocols in Immunology增刊4, 第10.19.1至10.19.11頁, 1992中之「免疫球蛋白融合蛋白質之構築（Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins）」予以描述。「受體Fc融合蛋白質」包含偶聯至Fc部分之受體之一個或多個胞外域，其在一些實施例中包含鉸鏈區，繼之為免疫球蛋白之CH2及CH3域。在一些實施例中，Fc融合蛋白質包含結合至一個或多個配位體之兩個或更多個不同受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白質為捕獲，諸如IL-1捕獲或VEGF捕獲。
缺乏Fc部分之蛋白質，諸如以重組方式產生之酶類及微型捕獲，亦可根據發明製得。微型捕獲為使用多聚化組分（MC）而非Fc部分之捕獲蛋白質，且揭示於美國專利第7,279,159號及第7,087,411號中。
「微粉化蛋白質粒子」或「蛋白質粒子」意謂含有多個蛋白質分子之粒子，該等蛋白質分子具有較低、極低或接近於零之量的水（例如，＜3重量%之水）。如本文中所用，微粉化蛋白質粒子之形狀通常為球狀且ECD在2微米至約35微米範圍內。微粉化蛋白質粒子不限於任何特定蛋白質實體，且適合於製備且遞送治療性蛋白質。常見治療性蛋白質包括尤其抗原結合蛋白質，諸如可溶性受體片段、抗體（包括IgG）及抗體之衍生物或片段、其他含有Fc之蛋白質（包括Fc融合蛋白質）及受體-Fc融合蛋白質（包括捕獲型蛋白質）（Huang, C., Curr. Opin. Biotechnol. 20: 692-99（2009）），諸如VEGF捕獲。
II. 使用烴 - 氟碳化合物膜乳液產生微球體調配物本發明提供使用無水或非水性膜乳液系統調配醫藥組合物之系統及方法。當封裝親水性藥物分子時，所揭示之無水膜乳液方法解決現有水性乳液系統之若干問題。舉例而言，所揭示之無水乳液系統與本文所提供之現有水性乳液系統之間的比較研究展示使用水性乳液系統產生之調配物在產生期間將藥物（例如蛋白質藥物）自乳液液滴中滲漏至水性連續相中。藥物自乳液液滴中之滲漏導致較低封裝功效。本文所描述之所揭示之基於非水性之膜乳液方法封裝藥物分子，包括（但不限於）親水性藥物（諸如蛋白質），其中封裝功效相對於水性乳液系統增加，保留原始蛋白質微粒結構或其組合。所揭示之無水膜乳液系統及方法可藉由整體方法（例如，攪拌、均質化、音波處理）及其他習知方法產生封裝之藥物調配物。系統及方法亦可應用於廣泛範圍之聚合物材料、固態有效負載及乳化方法。以下概述展示不同乳液之比較結果，證實非水性乳液系統與水性乳液系統相比在微粒封裝方面具有顯著改進。
方法及結果之概述
| 溶劑系統 | 乳液方法 | 分散相 | 連續相 | 關鍵結果 |
| S/O/W | 整體（攪拌或均質化） | DCM | 水，1% PVA | 中空或空球，封裝較差 |
| S/H/F | 整體（攪拌） | 乙酸乙酯 | FC-40，0.2 - 2% Pico-surf™ 1 | 微球體為可流動、可再懸浮的，且封裝多達30% w/w之蛋白質。微粉化蛋白質保留其原始微粒尺寸及形態。封裝之蛋白質已保留較高純度。微球體具有不存在孔或通道之光滑表面。 |
A. 氟碳化合物包烴包固體 （ S / H / F ） 膜乳液一般而言，膜乳化（ME）為用於允許良好的尺寸控制及較窄尺寸分佈之高度受控之微粒產生的相對新穎技術（G. T. Vladisavljević及R. A. Williams, Adv. Colloid Interface Sci., 第113(1): 1-20卷,（2005））。迄今為止，已針對ME開發出許多不同類型之膜，包括Shirasu多孔玻璃（SPG）、醋酸纖維素、聚合物、陽極多孔氧化鋁及矽微通道。對於所揭示之ME方法，具有經雷射鑽孔之孔的不鏽鋼膜運作良好，且Micropore Technologies（Redcar，UK）之可商購的設備實現了實驗室研究方法，且亦擴大至GMP製造。在其他實施例中，膜選自由以下組成之群：包括Shirasu多孔玻璃（SPG）、醋酸纖維素、聚合物、陽極多孔氧化鋁及矽微通道。不鏽鋼膜之嚴格控制的膜孔徑允許所有低於限制之SDP粒子穿過該膜。不具有曲折路徑之直管通道降低了SDP阻塞通道之傾向。在一個實施例中，膜具有親氟塗層，從而提供與氟碳化合物包烴（H/F）乳液之產生的良好相容性。另外，不鏽鋼膜為穩固的、易於清潔且可滅菌的。在一些實施例中，孔之直徑為3 µm至300 µm。在一些實施例中，孔之直徑為10、15、20、25、30、35、40、45或50 µm。
一個實施例提供一種用於藉由以下產生持續釋放或控制釋放微粒之方法：將微粉化蛋白質粉末與聚合物組合至烴溶劑中，以形成非水性第一溶液，攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液，將該懸浮液饋入至分散泵中，其中該懸浮液經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及氟界面活性劑之連續相中以形成氟碳化合物包烴乳液。在一些實施例中，該懸浮液之饋入速率為0.1至1.0 ml/min。該方法進一步包括以下步驟：將氫氟酯添加至該氟碳化合物包烴乳液中且移除該烴溶劑以提供經硬化微粒。在一些實施例中，將該氫氟酯與氟碳化合物之混合物添加至乳液中。在一些實施例中，該方法包括將額外純氫氟酯添加至乳液。該方法進一步包括移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒含有封裝於聚合物基質內之蛋白質。該方法視情況包括用該氟碳化合物液體洗滌該等微粒以移除殘餘氟界面活性劑，移除該氟碳化合物液體且例如藉由真空過濾來收穫該等微粒。在一個實施例中，真空過濾使用聚醚碸過濾膜。在一個實施例中，蛋白質粉末係由抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質或重組蛋白質產生。在一個實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白質，例如阿柏西普。在一些實施例中，該乳液係藉由整體乳液形成。在一些實施例中，微粒在24小時之後具有低於15%之爆發，接著線性持續釋放藥物。
在一個實施例中，蛋白質粉末與聚合物比率為0%至30%。
在一些實施例中，該烴溶劑選自由以下組成之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。
在一些實施例中，該氟碳化合物溶液包含1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺。
在一些實施例中，該氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。
在一些實施例中，該氫氟酯為2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
在一些實施例中，多孔膜為不鏽鋼膜，視情況親氟塗佈之不鏽鋼膜。
氟碳化合物及烴液體可藉由在環境大氣壓力下或在真空下蒸發氟碳化合物及烴液體移除。在一些實施例中，該氟碳化合物液體含有氫氟醚（HFE）。在一些實施例中，將HFE添加至非水性乳液以將烴迅速萃取至氟碳化合物液體中，以加速微球體硬化。在一些實施例中，該蛋白質粉末為微粉化蛋白質粉末。在一些實施例中，洗滌該等微粒以移除殘留於該等微粒上之任何殘餘烴溶劑、氟碳化合物液體、氟界面活性劑或其組合。例示性氟碳化合物液體包括全氟C5-C18化合物，包括（但不限於）1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺。例示性烴溶劑包括（但不限於）二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯及其組合。例示性氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚（PFPE-PEG-PFPE）三嵌段共聚物。例示性生物可侵蝕聚合物為聚原酸酯（POE）。在一些實施例中，蛋白質為抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質或重組蛋白質。在一個實施例中，蛋白質為噴霧乾燥之VEGF捕獲蛋白質。在一些實施例中，該等微粒之直徑為1.0至100 µm、1.0至200 µm或30至60 µm。在一個實施例中，由所揭示之非水性乳液方法形成之該等微粒為可流動微粒組合物。所揭示之可流動微粒組合物可懸浮於醫藥學上可接受之賦形劑，例如pH緩衝鹽水中，或懸浮於油性媒劑，諸如中鏈三酸甘油酯中。可流動微粒組合物可非經腸投與，例如使用具有27G針之注射器。在一些實施例中，微球體或微粒尺寸分佈係低於10CV%%。在一個實施例中，微球體尺寸分佈為10-20CV%。
另一實施例提供一種產生聚合物或經聚合物塗佈之微粒之方法，其藉由在烴溶液中組合1.0至30.0% w/w之總固體噴霧乾燥之蛋白質，以形成非水性第一溶液，攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液，將該懸浮液饋入至分散泵中，其中該懸浮液在連續相之切向流下經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及0.1至5.0% w/v氟界面活性劑之該連續相中，以形成氟碳化合物包烴乳液，移除該烴溶劑以提供經硬化聚合物或經聚合物塗佈之微球體及移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒包含封裝於聚合物基質內之蛋白質。在一些實施例中，該方法進一步包括以下步驟：在移除該烴溶劑之前將氫氟酯添加至該氟碳化合物包烴乳液之該氟碳化合物液體中以幫助移除該烴溶劑。
在一些實施例中，由膜乳液產生之該等微粒在該等微粒之聚合物表面或內部基質中具有極少孔或通道，或沒有孔或通道。
又另一實施例提供一種醫藥組合物，其含有使用本文所揭示之非水性膜乳液方法產生的經聚合物塗佈之微粒。
在一些實施例中，可藉由改變調配物組合物及製程參數將微粒之尺寸調節至所需直徑或尺寸。
烴及蛋白質溶液可藉由施加混合力，諸如壓縮剪切力及空蝕來形成。技術包括（但不限於）均質化、渦旋、音波處理、攪拌、攪動、攪泡、振盪、乳化、攪拌及/或其組合。該方法進一步包括在攪拌該乳液的同時移除該烴溶劑及該氟碳化合物液體之步驟。烴及氟碳化合物液體可視情況藉由在真空下蒸發來移除。在其他實施例中，微粒可藉由過濾收穫。移除烴及氟碳化合物液體硬化可隨後收穫之微粒。在一些實施例中，HFE可添加至氟碳化合物以幫助自分散相中萃取烴至氟碳化合物連續相中，以用於更快硬化製程。HFE可與氟碳化合物及烴二者混溶，且因此可充當共溶劑以增強烴在氟碳化合物相中之溶解度。由非水性乳液方法產生之持續釋放微粒含有封裝於生物可降解或生物可侵蝕聚合物之基質內之蛋白質。在一些實施例中，該等微粒具有單個核殼（core-shell）結構。在其他實施例中，該等微粒具有分散於該聚合物內之多個核心。在另其他實施例中，微粒群體包括具有由聚合物皮質封裝之單個核心結構的微粒及具有在聚合物皮質中之多個核心結構的微粒。氟碳化合物液體可為全氟C5-C18化合物，包括（但不限於）FC-40，且烴溶液選自乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃及二氯甲烷或其組合之群。在一個實施例中，氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，可作為Pico-Surf™ 1商購。在一些實施例中，該生物可侵蝕聚合物為POE。在其他實施例中，該聚合物選自由聚乳酸及聚(乳酸-共-乙醇酸)組成之群。通常，該蛋白質為抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質、重組蛋白質或其片段或截短型。通常，蛋白質例如藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化（microtemplating）或其組合微粉化。在一個實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白質或其截短型。可用於所揭示之方法中之其他蛋白質描述於下文中。由所揭示之方法產生之微粒具有大部分不含孔或通道之聚合物皮質。該聚合物皮質未經穿孔。在一些實施例中，該等微粒之直徑為1至200 µm。
1. 烴溶劑在一些實施例中，選擇該烴溶劑（亦稱為烴液體）以使得聚合材料，例如生物可降解或生物可侵蝕聚合物可溶於烴中。在一些實施例中，該烴溶劑選自由以下組成之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。在一些實施例中，該烴溶劑可含有乙腈、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、丙酮、乙醇、甲醇、戊烷、丙醇、己烷或其組合。
2. 氟液體 （ fluoroliquid ）例示性氟液體為包括（但不限於）以下之氟碳化合物液體：Flourinert™ FC-40（平均MW = 650 g/mol）1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺（圖1B）、Fluorinert™ FC-70（平均MW = 821 g/mol）或其組合。在一些實施例中，氟碳化合物液體為或含有氫氟醚（HFE）。例示性HFE包括（但不限於）NOVEC™ 7000（1-甲氧基七氟丙烷）、NOVEC™ 7100（甲氧基-九氟丁烷）、NOVEC™ 7200（乙氧基-九氟丁烷）、NOVEC™ 7500（2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷）。在另其他實施例中，氟碳化合物液體含有FC-40、FC-70、Novec™ 7500、Novec™ 7100、Novec™ 7000或其組合。在某些實施例中，除氟液體之外，第二溶液亦含有氟界面活性劑（FS）。例示性FS為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚（PFPE-PEG-PFPE）三嵌段共聚物，其可作為Pico-Surf™ 1商購。在一個實施例中，氟碳化合物液體或第二溶液含有FC-40及Pico-Surf™ 1。
在一些實施例中，FS為
其中：n ~ 37，x + z ~ 6.0，y ~ 12.5。或其中n = 3.7，x + z ~ 3.6，y ~ 9.0。（Lee, M.等人,
Lab Chip ., 7:14(3): 509-13（2014））。
在一個實施例中，HFE具有以下化學結構：
2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
適用於該方法之其他HFE為其中所有氫原子均位於不含氟取代之碳上且由醚氧與氟化碳分離之分子類別，亦即RfORh。HFE具有可為直鏈、分支鏈或環狀或其組合（諸如烷基環脂族）之分子結構，且較佳不含烯系不飽和性，具有總計約4至約20個碳原子。此類HFE為已知的且可容易地作為基本上純化合物或作為混合物獲得。由於HFE之親脂性及親氟性，其可與氟碳化合物及烴二者混溶。當添加至烴/氟碳化合物乳液時，其可充當共溶劑以將烴萃取至氟碳化合物相且加速硬化製程。
在一些實施例中，烴溶劑、氟碳化合物或兩者視情況藉由在真空下蒸發，視情況同時攪拌乳液來移除。在一些實施例中，藉由過濾，視情況真空過濾收穫該等微粒。
在氟碳化合物相中，HFE之百分比可為0%至20% v/v，而增加HFE之百分比則增加烴萃取速率。然而，HFE之百分比不能過高，因為微球體之尺寸及形態可能變得更難以控制。
3. 可侵蝕或生物可降解聚合物在一個實施例中，該聚合物為生物可降解或生物可侵蝕聚合物。在一些實施例中，該聚合物選自由以下組成之群：支化或線性聚乙二醇（PEG）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯（PLGA）、PLGA-環氧乙烷反丁烯二酸酯、酯化至聚乙二醇1000之PLGA-α-生育酚丁二酸酯（PLGA-TGPS）、聚酸酐聚[1,6-雙(對羧基苯氧基)己烷]（pCPH）、聚(羥基丁酸-共羥基戊酸)（PHB-PVA）、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物（PEG-PLA）、聚-ε-己內酯（PCL）、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯（PAC）、聚(乙基)氰基丙烯酸酯（PEC）、氰基丙烯酸聚異丁酯、聚-
N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺（聚(HPMA)）、聚-β-R-羥基丁酸酯（PHB）、聚-β-R-羥基烷酸酯（PHA）、聚-β-R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-磷脂醯膽鹼/聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺（DOPC/PEG-DSPE）/膽固醇、多醣、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、海藻酸鹽、聚葡萄糖及聚葡萄糖水凝膠聚合物、直鏈澱粉、菊寡糖、果膠及瓜爾豆膠、聚葡萄胺糖、幾丁質、肝素、玻尿酸、基於環糊精（CD）之聚輪烷（polyrotaxane）及聚準輪烷（polypseudorotaxane）、聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚白胺酸、白胺酸-麩胺酸共聚物、聚丁二酸丁二醇酯、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白（fibrin）、絲蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、併有潛酸之聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二酯)共聚物及其組合及共聚物。在一個實施例中，該聚合物為聚-ε-己內酯（PCL）或其衍生物或共聚物。在一個實施例中，該聚合物為PLGA或其衍生物或共聚物。在一個實施例中，該聚合物為乙基纖維素或其衍生物或共聚物。在一個實施例中，該聚合物為聚原酸酯或其衍生物或共聚物。在一個實施例中，該聚合物為聚酯醯胺。
如本文所使用，術語「聚合物」係指包含由共價化學鍵連接之重複單體的大分子。聚合物為生物相容的及生物可降解侵蝕的。生物相容及生物可降解聚合物可為天然或合成的。天然聚合物包括聚核苷酸、多肽（諸如天然存在之蛋白質、重組蛋白質、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、絲蛋白、聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚離胺酸、白胺酸-麩胺酸共聚物）；及多醣（諸如纖維素海藻酸鹽、聚葡萄糖及聚葡萄糖水凝膠聚合物、直鏈澱粉、菊寡糖、果膠及瓜爾豆膠、聚葡萄胺糖、幾丁質、肝素及玻尿酸）。合成性生物相容或生物可降解聚合物包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯（PLGA）、PLGA-環氧乙烷反丁烯二酸酯、酯化至聚乙二醇1000之PLGA-α-生育酚丁二酸酯（PLGA-TGPS）、聚酸酐聚[1,6-雙(對羧基苯氧基)己烷]（pCPH）、聚(羥基丁酸-共羥基戊酸)（PHB-PVA）、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物（PEG-PLA）、聚-ε-己內酯（PCL）、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯（PAC）、聚(乙基)氰基丙烯酸酯（PEC）、氰基丙烯酸聚異丁酯、聚-
N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺（聚(HPMA)）、聚-β-R-羥基丁酸酯（PHB）、聚-β-R-羥基烷酸酯（PHA）、聚-β-R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-磷脂醯膽鹼/聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺（DOPC/PEG-DSPE）/膽固醇、乙基纖維素、基於環糊精（CD）之聚輪烷及聚準輪烷、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、併有潛酸以控制降解速率之聚原酸酯及尤其聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二酯)共聚物。
乙基纖維素（EC）為醫藥及食品科學中所用之熟知且可容易獲得之生物材料。其為纖維素衍生物，其中葡糖羥基中之部分經乙基醚置換。參見Martinac等人, J. Microencapsulation, 22(5): 549-561（2005）及其中之參考文獻，其描述在微球體之製造中使用乙基纖維素作為生物相容聚合物之方法。關於乙基纖維素之詳細描述及製備乙基纖維素之衍生物之方法，亦參見US 4,210,529（1980）及其中的參考文獻。
聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯（PLGA）亦為用於組織工程及醫藥遞送系統中之熟知美國食品藥物管理局（FDA）核准之生物相容及生物可降解的聚合物。PLGA為包含乙醇酸及乳酸單體之聚酯。對於PLGA之合成及PLGA奈米粒子之製造的描述，參見Astete及Sabliov, Biomater. Sci. Polym. Ed., 17(3): 247-89（2006）及其中之參考文獻。
聚-ε-己內酯（PCL）為由FDA核准作為藥物遞送裝置適用於人類之另一生物相容及生物可降解聚合物。PCL為ε-己內酯之聚酯，其在身體內迅速水解以形成無毒性或較低毒性羥基羧酸。對於PCL之製造的描述，參見Labet及Thielemans, Chemical Society Reviews 38: 3484-3504（2009）及其中之參考文獻。對於製造及使用基於PCL之微球體及奈米球作為遞送系統之描述，參見Sinha等人, Int. J. Pharm., 278(1): 1-23（2004）及其中之參考文獻。
聚原酸酯（POE）為經設計用於藥物遞送之生物可侵蝕聚合物。其通常為乙烯酮縮醛之聚合物，乙烯酮縮醛較佳為環狀二乙烯酮縮醛，諸如3,9-二亞甲基-2,4,8,10-四氧雜螺[5.5]-十一烷，其經由二醇縮合來聚合以形成原酸酯鍵。聚原酸酯合成及各種類型之描述可見於例如US 4,304,767中。聚原酸酯可經改質以藉由換入或換出各種疏水性二醇及多元醇，諸如用癸三醇代替己三醇；以及向主鏈中添加潛酸，諸如乙交酯、辛二酸或其類似物，以增加pH敏感性來控制其藥物釋放概況及降解速率。POE之定製形式可在POE主鏈中包括乙醇酸以調節質量損失及藥物釋放。對聚原酸酯之其他改質包括整合胺以增加官能性。聚原酸酯之形成、描述及使用描述於US 5,968,543；US 4,764,364；Heller及Barr, Biomacromolecules, 5(5): 1625-32（2004)；及Heller, Adv. Drug. Deliv. Rev., 57: 2053-62（2005）中。
4. 蛋白質藥物在一些實施例中，由所揭示之無水乳液方法及系統產生之微粒調配物包括藥物。例示性藥物包括（但不限於）蛋白質、融合蛋白質及其片段、抗體及其抗原結合片段及配位體結合域及蛋白質。在一個實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白質（例如，阿柏西普），其含有與VEGF受體Flk1之Ig域3融合之VEGF受體Flt1之Ig域2，該VEGF受體Flk1之Ig域3與hIgG1之Fc融合，例如如美國專利第7,087,411及7,279,159號中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，VEGF捕獲蛋白質為如美國專利第7,396,664號中所描述之VEGF捕獲之截短型，該專利以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，微粒調配物中之蛋白質為抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、雙特異性四價類免疫球蛋白G分子（稱為雙向可變域免疫球蛋白（DVD-IG））、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。在一個實施例中，抗體為IgG1抗體。在一個實施例中，抗體為IgG2抗體。在一個實施例中，抗體為IgG4抗體。在另一實施例中，抗體包含嵌合鉸鏈。在另其他實施例中，抗體包含嵌合Fc。在一個實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG4抗體。在一個實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG1抗體。在一個實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗體。
在一些實施例中，該抗體選自由以下組成之群：抗計劃性細胞死亡1抗體（例如，如美國專利第9,987,500號中所描述之抗PD1抗體、抗計劃性細胞死亡配位體1（例如，如美國專利第9,938,345號中所描述之抗PD-L1抗體）、抗Dll4抗體、抗血管生成素2抗體（例如，如美國專利第9,402,898號中所描述之抗ANG2抗體）、抗類血管生成素3抗體（例如，如美國專利第9,018,356號中所描述之抗AngPtl3抗體）、抗血小板衍生生長因子受體抗體（例如，如美國專利第9,265,827號中所描述之抗PDGFR抗體）、抗Erb3抗體、抗促乳素受體抗體（例如，如美國專利第9,302,015號中所描述之抗PRLR抗體）、抗補體5抗體（例如，如美國專利第9,795,121號中所描述之抗C5抗體）、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體（例如，如美國專利第9,132,192號中所描述之抗EGFR抗體或如美國專利第9,475,875號中所描述之抗EGFRvIII抗體）、抗前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9抗體（例如，如美國專利第8,062,640號或美國專利第9,540,449號中所描述之抗PCSK9抗體）、抗生長及分化因子-8抗體（例如抗GDF8抗體，亦稱為抗肌肉抑制素抗體，如美國專利第8,871,209或9,260,515號中所描述）、抗升糖素受體（例如，如美國專利第9,587,029或9,657,099號中所描述之抗GCGR抗體）、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、介白素4受體抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2014/0271681A1號、美國專利第8,735,095或8,945,559號中所描述之抗IL4R抗體）、抗介白素6受體抗體（例如，如美國專利第7,582,298、8,043,617或9,173,880號中所描述之抗IL6R抗體）、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33（例如，如美國專利第9,453,072或9,637,535號中所描述之抗IL33抗體）、抗呼吸道融合性病毒抗體（例如，如美國專利第9,447,173及10,125,188號，及美國專利申請公開案第US2019/0031741A1號中所描述之抗RSV抗體）、抗分化叢集3（例如，如美國專利第9,657,102號中所描述之抗CD3抗體）、抗分化叢集20（例如，如美國專利第9,657,102及US20150266966A1號，及美國專利第7,879,984號中所描述之抗CD20抗體）、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化叢集48（例如，如美國專利第9,228,014號中所描述之抗CD48抗體）、抗Fel d1抗體（例如，如美國專利第9,079,948號中所描述）、抗中東呼吸道症候群病毒（例如，如美國專利第9,718,872號中所描述之抗MERS抗體）、抗伊波拉病毒抗體（例如，如美國專利第9,771,414號中所描述）、抗茲卡病毒抗體、抗淋巴球活化基因3抗體（例如，抗LAG3抗體或抗CD223抗體）、抗神經生長因子抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2016/0017029號（廢棄）及美國專利第8,309,088及9,353,176號中所描述之抗NGF抗體）及抗蛋白質Y抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體選自由以下組成之群：抗CD3×抗CD20雙特異性抗體（如美國專利第9,657,102號及US20150266966A1中所描述）、抗CD3×抗黏蛋白16雙特異性抗體（例如，抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體）及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體（例如，抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體）。在一些實施例中，所關注蛋白質選自由以下組成之群：阿昔單抗（abciximab）、阿達木單抗（adalimumab）、阿達木單抗-atto（adalimumab-atto）、阿多曲妥珠單抗（ado-trastuzumab）、阿侖單抗（alemtuzumab）、阿利庫單抗（alirocumab）、阿特珠單抗（atezolizumab）、阿維魯單抗（avelumab）、巴利昔單抗（basiliximab）、貝利單抗（belimumab）、苯拉組單抗（benralizumab）、貝伐單抗（bevacizumab）、貝佐洛單抗（bezlotoxumab）、布林莫單抗（blinatumomab）、本妥昔單抗維多汀（brentuximab vedotin）、布羅達單抗（brodalumab）、布羅盧西珠單抗（brolucizumab）、卡那單抗（canakinumab）、卡羅單抗噴地肽（capromab pendetide）、聚乙二醇化賽妥珠單抗（certolizumab pegol）、西普利單抗（cemiplimab）、西妥昔單抗（cetuximab）、德諾單抗（denosumab）、迪奴圖單抗（dinutuximab）、度匹魯單抗（dupilumab）、德瓦魯單抗（durvalumab）、艾庫組單抗（eculizumab）、埃羅妥珠單抗（elotuzumab）、艾美賽珠單抗-kxwh（emicizumab-kxwh）、阿利人單抗艾坦辛（emtansinealirocumab）、恩維納單抗（evinacumab）、依伏庫單抗（evolocumab）、法神單抗（fasinumab）、戈利木單抗（golimumab）、古賽庫單抗（guselkumab）、替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan）、依達賽珠單抗（idarucizumab）、英利昔單抗（infliximab）、英利昔單抗-abda（infliximab-abda）、英利昔單抗-dyyb（infliximab-dyyb）、伊匹單抗（ipilimumab）、伊科奇單抗（ixekizumab）、美泊利單抗（mepolizumab）、萊西單抗（necitumumab）、內斯瓦庫單抗（nesvacumab）、納武單抗（nivolumab）、奧托昔單抗（obiltoxaximab）、阿托珠單抗（obinutuzumab）、奧克珠單抗（ocrelizumab）、奧伐木單抗（ofatumumab）、奧拉單抗（olaratumab）、奧馬珠單抗（omalizumab）、帕尼單抗（panitumumab）、帕博利珠單抗（pembrolizumab）、帕妥珠單抗（pertuzumab）、雷莫蘆單抗（ramucirumab）、蘭比珠單抗（ranibizumab）、蘭希班單抗（raxibacumab）、瑞利珠單抗（reslizumab）、利奴單抗（rinucumab）、利妥昔單抗（rituximab）、賽瑞單抗（sarilumab）、塞庫金單抗（secukinumab）、司妥昔單抗（siltuximab）、托西利單抗（tocilizumab）、托西利單抗（tocilizumab）、曲妥珠單抗（trastuzumab）、特里沃單抗（trevogrumab）、烏司奴單抗（ustekinumab）及維多珠單抗（vedolizumab）。
在一些實施例中，複合物中之蛋白質為含有Fc部分及另一域之重組蛋白質（例如Fc融合蛋白質）。在一些實施例中，Fc融合蛋白質為受體Fc融合蛋白質，其含有偶合至Fc部分之受體的一個或多個胞外域。在一些實施例中，Fc部分包含鉸鏈區，隨後為IgG之CH2及CH3域。在一些實施例中，受體Fc融合蛋白質含有結合至單一配位體或多個配體之兩個或更多個相異受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白質為捕獲蛋白質，諸如IL-1捕獲（例如利納西普（rilonacept），其含有融合至Il-1R1胞外區之IL-1RAcP配位體結合區，該Il-1R1胞外區融合至hIgG1之Fc；參見美國專利第6,927,044號，其以全文引用的方式併入本文中）或VEGF捕獲（例如阿柏西普或塞維-阿柏西普（ziv-aflibercept），其包含融合至VEGF受體Flk1之Ig域3的VEGF受體Flt1之Ig域2，該VEGF受體Flk1之Ig域3融合至hIgG10之Fc）。在其他實施例中，Fc融合蛋白質為ScFv-Fc融合蛋白質，其含有一個或多個抗原結合域中之一者或多者，諸如偶合至Fc部分之抗體的可變重鏈片段及可變輕鏈片段。
在一些實施例中，缺乏Fc部分之蛋白質，諸如以重組方式產生之酶類及微型捕獲，亦可根據發明製得。微型捕獲為使用多聚化組分（MC）而非Fc部分之捕獲蛋白質，且揭示於美國專利第7,279,159號及第7,087,411號中。
在一些實施例中，初始蛋白質呈乾粉形式，例如微粉化乾粉。在一些實施例中，蛋白質為噴霧乾燥之粉末（SDP）。使用噴霧乾燥之蛋白質代替蛋白質溶液具有在微粒中之更高的蛋白質負載及在封裝製程期間更佳的蛋白質穩定性之益處。在一些實施例中，乾燥蛋白質分子在整個封裝製程及儲存條件期間保持呈固態且由穩定劑包圍。在一些實施例中，封裝之噴霧乾燥蛋白質展現出較高回收及較低聚集，此可能由於僅一小部分表面蛋白質暴露於界面而使表面相互作用降至最低。在一些實施例中，蛋白質在封裝之前經微粉化。
B. 微粒一個實施例提供一種使用所揭示之非水性膜乳液系統產生之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物含有具有聚合物皮質之微粒及微粉化蛋白質核心。在一些實施例中，該等微粒之形狀大致為球形。一些微粒及蛋白質核心將接近球形，而其他微粒及蛋白質核心則形狀將更不規則。因此，如本文所使用，術語「直徑」意謂以下中之各者及任一者：（a）包圍微粒或蛋白質核心之球體的直徑，（b）適合微粒或蛋白質核心之限制內之最大球體之直徑，（c）（a）之外接球體與（b）之限制球體之間的任何量度，包括兩者之間的平均值，（d）微粒或蛋白質核心之最長軸的長度，（e）微粒或蛋白質核心之最短軸的長度，（f）長軸（d）之長度與短軸（e）之長度之間的任何量度，包括兩者之間的平均值，及/或（g）等效圓直徑（「ECD」），如由微流成像（MFI）、奈米粒子追蹤分析（NTA），或藉由光散射方法，諸如靜態光散射（SLS）、動態光散射（DLS）或雷射繞射分析之體積或數量平均後直徑所確定。直徑通常以微米（µm或微米）表示。直徑可藉由光學量測或掃描電子顯微法量測來確定。
由所揭示之非水性乳液方法產生之微粒含有具有較低、極低或接近於零之量的水（例如，＜或=3重量%之水）之多個蛋白質分子。如本文中所用，微粉化蛋白質粒子之ECD範圍為2微米至約35微米、或2.0至50 µm、或5.0至15.0 µm、30至60 µm或約10 µm。微粉化蛋白質粒子不限於任何特定蛋白質實體，且適合於製備及遞送包括上文所描述之蛋白質的治療性蛋白質。
舉例而言，蛋白質粒子可藉由噴霧乾燥、凍乾及碾磨、噴射研磨、非溶劑中之可逆沈澱、造粒、逐步沈澱（US 7,998,477（2011））、超臨界流體沈澱（US 6,063,910（2000））或高壓二氧化碳誘導之粒子形成（Bustami等人, Pharma. Res. 17: 1360-66（2000））微粉化。如本文中所用，片語「噴霧乾燥」意謂一種藉由使用噴霧乾燥器自漿料或懸浮液產生包含微米級粒子之乾粉的方法。噴霧乾燥器採用霧化器或噴嘴將懸浮液或漿料分散至受控之液滴尺寸的噴霧中。10至500 µm之液滴尺寸可由噴霧乾燥產生。隨著溶劑（水或有機溶劑）乾燥，蛋白質物質乾燥成微米級粒子，形成粉末狀物質；或在蛋白質-聚合物懸浮液之情況下，在乾燥期間，該聚合物在蛋白質負載周圍硬化殼層。
在一些實施例中，微粉化蛋白質為VEGF捕獲蛋白質。用於形成微粉化VEGF捕獲蛋白質粒子之醫藥調配物可含有約10 mg/mL至約100 mg/mL VEGF捕獲蛋白質、約1.0至約50 mg/mL蛋白質、約10 mg/mL、約15 mg/mL、約20 mg/mL、約25 mg/mL、約30 mg/mL、約35 mg/mL、約40 mg/mL、約45 mg/mL、約50 mg/mL、約55 mg/mL、約60 mg/mL、約65 mg/mL、約70 mg/mL、約75 mg/mL、約80 mg/mL、約85 mg/mL、約90 mg/mL、約95 mg/mL或約100 mg/mL VEGF捕獲蛋白質。
在一些實施例中，使用所揭示之非水性膜乳液系統產生之微粒含有在聚合物皮質內之蛋白質粒子核心，具有以下範圍之直徑：約2 µm至約70 µm、約5 µm至約65 µm、約10 µm至約60 µm、約15 µm至約55 µm、約10 µm至約50 µm、約1.0至15 µm、約20 µm、約25 µm或約30 µm。尺寸變化在很大程度上反映了該聚合物皮質之厚度，儘管蛋白質核心之直徑可在一定程度上引起尺寸變化。
在一個實施例中，由所揭示之非水性乳液方法形成之該等微粒為可流動微粒組合物。所揭示之可流動微粒組合物可懸浮於醫藥學上可接受之賦形劑，例如pH緩衝鹽水中。可流動微粒組合物可非經腸投與，例如使用注射器，諸如具有27G針之注射器。
微粒適用於蛋白質治療劑之限時釋放或延長釋放。在一些實施例中，微球體調配物係玻璃體內、脈絡膜上或皮下注射。舉例而言，設想VEGF捕獲微粒適用於VEGF捕獲治療性蛋白質在例如玻璃體或脈絡膜上腔中之延長釋放以治療血管性眼部病症，或皮下植入以用於VEGF捕獲之延長釋放以治療其他病症。
本發明之微粒在生理水性環境中在約37℃下以相對恆定速率在延長的時間段內釋放蛋白質，至少60、90、120或150天。在一些實施例中，微粒在24小時之後具有低於15%之爆發，接著線性持續釋放藥物。
一個實施例提供一種使用本文所揭示之非水性膜乳液方法產生之微球體的組合物，其中該組合物含有＞100 mg之噴霧乾燥之蛋白質。在一個實施例中，非水性膜乳液方法具有＞90%產率，且產生具有＞99%之純度且具有＞10% w/w負載及＜10%爆發之微粒。
實例 實例 1 ： 經由基於 H / F 之整體乳液的空白微球體合成材料及方法
基於油及基於水性之乳液系統通常用於聚合微粒或奈米粒子合成，其中疏水性聚合物材料溶解於有機相中且分散於水性連續相中。然而，對於可溶於水之聚合物，例如PEG、羧甲基纖維素（CMC）及在水存在下容易地水解之聚合物包括聚酸酐、具有較短中間嵌段之脂族聚酯（如聚乳酸）及某些聚(胺基酸)（如聚(麩胺酸)），習知基於水性之乳液系統並不理想。以下實例證實所揭示之H/F乳液系統用於產生上述可水解或可水降解聚合微粒之效用。在一些實施例中，首先將彼等聚合物溶解於烴溶劑中，包括極性溶劑，例如乙腈、四氫呋喃及更低極性溶劑，例如DCM、氯仿。隨後將此聚合物溶液添加至連續相，氟碳化合物液體，例如具有FS之FC-40，例如Picosurf 1。經由攪拌、渦旋或其他混合方法製備乳液。乳液液滴最終經由蒸發或萃取烴溶劑而硬化成聚合物球體。
在一特定實施例中，對於經由H/F整體乳液之空白POE微球體合成，如
流程 1 （ 圖 1A ）中所說明，將含200 µL約10%、20%、30%及40% w/v POE之DCM添加至含有0.5 % w/w FS Pico-Surf™ 1（Sphere Fluidics）之2 mL FC-40。乳化係經由渦旋實現。乳液液滴比FC-40更輕且漂浮於溶液頂部。取出等分試樣且滴落在載玻片上用於顯微鏡成像。微球體在攪拌下在真空下硬化3小時。FC-40中之經硬化聚合物球體首先經由0.22微米PES膜真空過濾。FC-40穿過過濾器且保留微球體。隨後微球體用額外FC-40洗滌且在真空下完全乾燥。在具有相同製程之另一實例中，在烴相中使用含約30% w/v POE之DCM，且在氟碳化合物相中使用含約0.01%、0.1%及0.5% FS之FC40，以評估FS濃度之作用。
結果
在FS存在下，烴及氟碳化合物混合物能夠形成H/F乳液。在一個實例中，DCM以H/F乳液形式分散於FC-40（參見
圖 1B中之FC-40結構），且PFPE-PEG-PFPE用作FS（參見
圖 1C中之FS結構）。將增加濃度之FS添加至FC-40氟碳化合物相中。測試顯示，需要0.1-5% w/w FS以防止DCM液滴聚結（
圖 2A）。若添加低於0.1% w/w SF，則觀測到更寬尺寸分佈。若不使用SF，則DCM液滴為不穩定的。分散的DCM液滴將快速合併在一起，且兩個相將很快分離。結果顯示，使用足夠量之FS以產生穩定的H/F乳液且在硬化製程期間連續地攪拌以成功地產生聚合物微球體之必要性。（
圖 2B）。
在DCM中添加POE且在FC-40中渦旋引起含有POE之液滴的形成。在敞開容器中在環境條件下或在真空下之DCM的蒸發引起液滴硬化成POE微球體（
圖 2A 及 2B）。微球體之尺寸係與液滴尺寸及有機相中之POE含量相關。更高POE濃度引起更大微球體尺寸（
表 1）。
表 1. 使用不同濃度之含POE之DCM產生的POE球體之微球體尺寸。
| 直 徑 | 10% w/v POE | 20% w/v POE | 30% w/v POE | 40% w/v POE |
| Dv(10)（μm） | 0.9 | 1.3 | 3.1 | 7.1 |
| Dv(50)（μm） | 2.7 | 7.2 | 17 | 34.8 |
| Dv(90)（μm） | 6.5 | 13.4 | 30.1 | 67.4 |
實例 2 ： 均質化速度之影響 。材料及方法
將一（1）mL DCM中之30%或40% w/v POE添加至具有0.5%（w/w）FS FC-40之9 mL FC-40，且用具有VWR 7mm×95mm鋸齒發生器探針之VWR手持型均質器200在三種均質化速度，較低（約50%全功率）、中等（約60%全功率）及較高（約70%全功率）中之一者下乳化。在真空下攪拌所形成之乳液。洗滌所形成之微球體，且在真空下乾燥。
結果
如圖3A-C所繪示，對於30% POE，較低均質化速度產生較大微球體尺寸，而較高均質化速度產生較小尺寸（
表 2）。40% POE展現出相同傾向。此等結果顯示，調節均質化速度可控制微球體尺寸。
表 2. 在不同均質化速度下產生之POE球體的微球體尺寸。
| 直 徑 | 較低速度 | 中等速度 | 較高速度 |
| Dv(10)（μm） | 2.8 | 2.0 | 1.1 |
| Dv(50)（μm） | 16.1 | 13.5 | 5.4 |
| Dv(90)（μm） | 31.5 | 31.6 | 12.0 |
實例 3 ： 經由基於 S / H / F 之整體乳液方法將蛋白質 SDP 封裝於 POE 微球體中之一般程序 。材料及方法
如圖4中所繪示，整體乳液合成可分成三個步驟：調配、乳化、硬化。由於用於此等三個步驟中之參數不同，因此產物之特性將不同。通用程序描述為以下：
為進行調配，將10%-30% w/w總固體重量VEGF捕獲SDP（或經螢光標記之SDP（F-SDP）用於螢光成像）藉由渦旋及後續音波處理5 min分散於含有10-35% w/v POE之500 µL乙酸乙酯中。隨後將此等懸浮液添加至具有0.1-0.5% w/w FS之9.5 mL FC-40中。可經由攪拌、渦旋或使用實驗台均質器進行之均質化來實現乳化。乳液之結構繪示於圖5中。緊接地在乳化之後，取出製程內等分試樣且將其滴在載玻片上用於顯微鏡成像。經由在環境條件下蒸發來使液滴在載玻片上硬化。為硬化微球體，應用以下三種方法中之一者：（a）在環境條件下將溶液在敞開容器中攪拌隔夜且允許蒸發乙酸乙酯；（b）在真空下攪拌溶液至少2小時以便更快溶劑蒸發；（c）在攪拌下向乳液中添加NOVEC 7500，或FC-40與NOVEC7500之混合物。HFE充當幫助將乙酸乙酯自烴相中萃取至氟碳化合物相中，且實現快速硬化製程（通常在數分鐘內）之共溶劑。
最後，FC-40中之經硬化聚合物球體首先經由0.22 µm PES膜真空過濾。FC-40穿過過濾器且保留微球體。隨後微球體用額外FC-40洗滌且在真空下完全乾燥。
微球體之尺寸係藉由使用Malvern粒度分析儀3000之雷射繞射分析來量測，藉由將產物粉末分散於0.01% w/v PVA溶液中來進行液體取樣。產物之形態係使用掃描電子顯微法（SEM）來量測。
為了量測微球體之蛋白質含量，首先將預定量之微球體溶解於200 µL乙酸乙酯中，且隨後用1純水萃取，收集水相且離心以移除渾濁懸浮液。蛋白質純度及濃度係藉由SEC-UPLC來量測。
為了量測爆發釋放，將預定量之微球體在37℃下在1 mL之PBS中培育1小時。將混合物離心，且使上清液接受SEC-UPLC以測定蛋白質濃度。
結果
以上結果顯示，若存在足夠的SF，則形成穩定的H/F乳液。此非水性乳液可成功地產生空白POE球體。此無水方法再次用於將SDP併入至POE微球體中。在一個實例中，將VEGF捕獲F-SDP 10% w/w之總固體重量以懸浮液形式引入乙酸乙酯（包括20% w/v POE）中，且含此懸浮液之FC-40（含有0.5% w/w FS）經由攪拌及渦旋進行混合。在乳化之後立即將等分試樣轉移於載玻片上用於顯微法成像。如
圖 6A 及 6B中所示，乙酸乙酯分散於FC-40中之液滴中，SDP粒子明顯地限制在乙酸乙酯液滴內部。與S/O/W系統（資料未展示）相反，無蛋白質滲漏至氟碳化合物連續相中之跡象。重要的是在此H/F系統中，液滴中之SDP粒子維持其在粉末狀態下之原始凹陷形狀。由於H/F系統中不存在水以復原SDP，且因此SDP保持在其原始固體微粒形式下。硬化之後，含有單個或多個SDP粒子之POE微球體可經由明場及螢光顯微鏡影像清楚地觀測到（
圖 7A 、 7B 及 7C）。在載玻片上之烴及氟碳化合物溶劑蒸發之後，添加水以測試爆發釋放及封裝品質。如
圖 8A - D中所示，在將微球體產物置放於水中之後，經SDP封裝之POE微球體保留其完整性。未觀測到蛋白質之立即釋放，且SDP粒子之形狀保持相同，此指示SDP粒子受到聚合物基質良好保護且與水性環境隔絕。此等結果表明，H/F乳液為將蛋白質及其他親水性藥物封裝於聚合基質中之有效解決方案，且具有實現較高封裝效率、較高產率，同時使爆發釋放降至最低之潛力——其所有為使用基於水性之W/O/W或S/O/W方法之主要挑戰。
此處所揭示之程序為使用基於S/H/F非水性之整體乳液方法用於POE微球體中之蛋白質SDP封裝的實例。該方法為可再現、可調式且可調節的。藉由改變調配物及製程中之參數，可調節且控制產物特性。彼等參數中之部分的作用揭示於實例4中。
實例 4 ： 烴溶劑之作用材料及方法
如實例2中所描述使用二氯甲烷或乙酸乙酯作為烴產生微粒。製備含35% w/v POE之DCM及含35% w/v POE之乙酸乙酯。將百分之十（10%）w/w之總固體重量的蛋白質粉末懸浮於0.5 mL POE的DCM或乙酸乙酯溶液中。將此等懸浮液轉移至20 mL閃爍瓶中之含有0.5% w/w FS之9.5 mL FC-40中。使此等混合物均質化以產生乳液且在室內真空下攪拌1.5小時。藉由過濾分離所形成之微球體，用FC-40洗滌，且在真空下乾燥。
結果
圖9顯示使用除烴溶劑，二氯甲烷或乙酸乙酯之類型之外的相同調配及製程條件產生之微粒的尺寸分佈。使用烴產生之微粒展示經噴霧乾燥之蛋白質的封裝。使用二氯甲烷產生較大微粒。參見下表3。結果表明在相同調配及製程條件下，使用不同烴溶劑產生不同尺寸之微球體。DCM產生比乙酸乙酯更大的微球體尺寸。因此，可有意地選擇烴溶劑以控制微球體尺寸。
表 3.用DCM或乙酸乙酯產生之SDP負載之POE球體的微粒尺寸。
| 直 徑 | DCM | EtAc |
| Dv(10)（μm） | 5.2 | 3.2 |
| Dv(50)（μm） | 30.7 | 21.2 |
| Dv(90)（μm） | 64.9 | 42.3 |
實例 5 ： 蛋白質負載量之影響材料及方法
如實例2中所描述產生微粒，僅改變蛋白質負載量。製備含百分之三十五（35%）w/v POE之DCM。將5%、10%及30% w/w總固體重量之蛋白質粉末懸浮於含0.5 mL POE之DCM溶液中。將此等懸浮液轉移至20 mL閃爍瓶中之含有0.5% w/w FS之9.5 mL FC-40中。使此等混合物均質化約1 min以產生乳液，且隨後在一分鐘內將6 mL之Novec7500與FC-40之1:1 v:v混合物添加至乳液中。隨後在再攪拌一分鐘之後，藉由過濾分離所形成之微球體，用FC-40洗滌，且在真空下乾燥。
結果
如表4中所示，增加調配物中之蛋白質粉末之量產生藉由雷射繞射分析量測之更大POE微粒尺寸，且亦引起經由蛋白質萃取實驗、明場及共焦螢光顯微法觀測到之最終POE微球體產物中增加之蛋白質負載。30% w/w蛋白質粉末負載之明場影像展現出比10% w/w蛋白質粉末更暗且更不透明的微球體，指示更多藥物封裝於微球體產物中（圖10A及圖10B）。代表性共焦影像確認，自微球體之橫截面視圖來看，SDP以其原始形式封裝於POE基質中（圖11A及11B）。在30% w/w負載微球體中觀測到更多SDP粒子。同樣，經封裝之SDP維持其原始凹陷形狀，指示其在整個製造過程期間為完整的。
表 4. 在不同SDP負載下產生之SDP負載之POE球體的微粒尺寸。
| 直 徑 | 5% w/w SDP 負載 | 10% w/w SDP 負載 | 30% w/w SDP 負載 |
| Dv(10)（μm） | 4.9 | 5.2 | 17.1 |
| Dv(50)（μm） | 20.6 | 30.7 | 40.7 |
| Dv(90)（μm） | 43.0 | 64.9 | 81.3 |
實例 6 ： 使用 H / F 整體乳化將 SDP 封裝至 POE 微球體中之實驗設計 （ DOE ） 。材料及方法
進行DOE研究以評估經設計空間中之合成的關鍵因素對最終產物之特性的影響。遵循實例2中所描述之通用程序在所設計之實驗中進行十次操作。蛋白質粉末負載、蛋白質粉末粒度（Dv（50）粒度為2.2 um及5.6 um，分別參見圖13A及13B中之SEM影像）、聚合物濃度及HFE濃度變化，同時使以下調配及製程條件保持恆定，例如烴及氟碳化合物相之體積、均質化速度、FS濃度（
表 5.）。所量測之反應包括微球體尺寸（Dv50，雷射繞射跨度）、封裝效率、在37℃下1小時之爆發釋放、SEM影像。
結果
DOE之結果概述於表5中。
表 5.SDP封裝DOE研究之實驗設計及所量測之反應。
*將微球體溶解於乙酸乙酯中，且使用水萃取蛋白質，且使用SEC-UPLC進行定量。
**在PBS中在37℃下培育微球體1小時。使用SEC-UPLC定量所釋放之蛋白質。
| 實驗設計 | 所量測之反應 | |||||||
| 操作編號 | 目標蛋白質粉末負載 （ % ） | [POE ] （ % ；w /v ） | [HFE ] （ % ；w /v ） | 蛋白質粒度 （Dv50 ；um ） | 微球體尺寸 （Dv50 ，um ） | 跨度 | 產物SDP 負載 （% ）* | 蛋白質爆發 ** 釋放 （% ） |
| 1 | 25 | 25 | 25 | 5.6 | 23.3 | 1.2 | 25.3 | 103 |
| 2 | 25 | 35 | 25 | 2.2 | 27.4 | 1.4 | 26.7 | 99 |
| 3 | 5 | 35 | 25 | 2.2 | 20.6 | 1.8 | 6.1 | 10 |
| 4 | 5 | 25 | 25 | 5.6 | 17.9 | 1.48 | 5.3 | 29 |
| 5 | 15 | 25 | 25 | 2.2 | 18.1 | 1.50 | 15.4 | 52 |
| 6 | 5 | 35 | 35 | 5.6 | 21.6 | 1.74 | 3.9 | 15 |
| 7 | 5 | 25 | 35 | 2.2 | 19.4 | 1.55 | 4.1 | 9 |
| 8 | 15 | 35 | 35 | 5.6 | 25.3 | 1.39 | 13.8 | 78 |
| 9 | 25 | 25 | 35 | 2.2 | 21.5 | 1.30 | 20.8 | 116 |
| 10 | 25 | 35 | 35 | 5.6 | 35.2 | 1.517 | 23.8 | 91 |
定製設計之DOE對微球體尺寸之擬合（其中R
2=0.76）揭示了蛋白質粉末負載及POE濃度之主要影響（其中p值＜0.05，參見
表 6.中之相關結果）。另外，對爆發釋放之擬合（R
2=0.92）顯示僅蛋白質粉末負載顯著影響爆發釋放（其中p值＜0.05，參見
表 7中之相關結果）。結果表明，增加調配物中之蛋白質粉末量將在最終產物中產生更高有效負載，但其亦增加爆發釋放百分比。爆發釋放可能由表面吸附之蛋白質粒子引起。藉由對於指定微球體尺寸之物理空間來確定在聚合物微球體中內化之蛋白質粉末的最大量。簡單地增加調配物懸浮液中之蛋白質粉末濃度將不會增加藥物封裝超過某一臨界值，其在此實例中為約30% w/w。
表 6.因子與微球體尺寸之相關性。
表 7.SDP負載與爆發釋放之正相關性。
| 項目 | 評估值 | 標準誤差 | T 比率 | 機率＞|t| | VIF |
| 截距 | 23.03 | 0.924421 | 24.91 | ＜.0001* | |
| SDP負載（%）（5，25） | 3.4875 | 1.033534 | 3.37 | 0.0118* | 1 |
| [聚合物]（%；w/v）（25，35） | 2.99 | 0.924421 | 3.23 | 0.0144* | 1 |
| 項目 | 評估值 | 標準誤差 | T 比率 | 機率＞|t| | VIF |
| 截距 | 63.190484 | 4.008836 | 15.76 | ＜.0001* | |
| SDP負載（%）（5，25） | 43.17019 | 4.482015 | 9.63 | ＜.0001* | 1 |
實例 7.
將基於 S / H / F 乳液之封裝方法應用於不同蛋白質 。所揭示之基於H/F之乳液系統及製程可為適用於不同聚合物及治療性蛋白質之平台技術。在本發明之特定實例中，將重組IgG4（MW ~145 kDa）之蛋白質粉末、重組IgG1（MW ~146 kDa）之蛋白質粉末或重組融合蛋白質（MW ~64 kDa）之蛋白質粉末分別經由如實例2中之相同製程封裝於POE微球體中。結果概述於表8中。微球體產物中之經封裝蛋白質粉末的量係經由萃取分析確定且匹配目標值。在封裝製程之後，重組融合蛋白質、IgG1之蛋白質純度保持不變，IgG4之蛋白質純度略微下降（低於2%）指示良好的製程相容性。
表 8.經由S/H/F乳液封裝於POE微球體中之不同類型之蛋白質的SDP結果。
*將微球體溶解於乙酸乙酯中，且使用水萃取蛋白質，且使用SEC-UPLC進行定量。
**在PBS中在37℃下培育微球體1小時。使用SEC-UPLC定量所釋放之蛋白質。
| 蛋白質類型 | 藉由SEC-UPLC 測定之SDP 中之 蛋白質純度 | 調配物 之 目標固體負載% w/w | 藉由萃取之經封裝蛋白質粉末% w/w | 經封裝蛋白質%w/w* | 蛋白質爆發釋放百分比** | 藉由SEC-UPLC 測定 之經封裝蛋白質純度 |
| 重組融合蛋白質 | 97.8% | 15 | 13.7 | 8.6 | 44% | 98.2% |
| IgG4 | 99.4% | 15 | 15.0 | 12.0 | 24% | 97.6% |
| IgG1 | 98.4% | 15 | 16.5 | 11.7 | 22% | 98.9% |
| IgG1 （ 替代性調配物 ） | 96.8% | 15 | 13.7 | 8.9 | 44% | 97.4% |
其他生物可降解聚合物，例如PLGA及PLA，亦用於基於H/F之乳液。在本發明之特定實例中，經由實例2中所揭示之類似方法，將經螢光標記之VEGF捕獲F-SDP分別封裝於PLGA（丙交酯:乙交酯50:50，Mw 42-65 kDa，Sigma Aldrich）及PLA（烷基醚封端，Mw 18,000-28,000，Sigma Aldrich）微球體中。亦可使用其他聚合物比率及分子量。明場及螢光顯微鏡影像指示，蛋白質粉末成功地封裝於該聚合物微球體內（針對PLA為圖14A-C，針對PLGA為圖15A-B）。
實例 8 ： 膜非水性乳液使用膜乳液，使用表9中所描述之材料產生微粒。
表 9 ：
| 材料 | 描述 | 製造 | 批次/項目編號 |
| 噴霧乾燥之經螢光標記的Alexa-488 VEGF捕獲 | 進料溶液，其含有1%之Alexa-488標記之VEGF捕獲 | Regeneron，NY | |
| 二氯甲烷 | 有機溶劑，無水≥99.8 | Sigma Aldrich | 270997-1L |
| FC-40 | Fluorinert™ FC-40 | Sigma Aldrich | F9755 |
| PVA | 聚乙烯醇，146K-186K 87-89%水解 | Sigma Aldrich | 363103-500G |
| Pico-Surf 1 | 氟界面活性劑 | Sphere Fluidics | C014 |
膜乳化（ME）為允許良好尺寸控制及較窄尺寸分佈之微粒的高度控制產生的相對新穎技術。迄今為止，已針對ME開發出許多不同類型之膜，包括Shirasu多孔玻璃（SPG）、醋酸纖維素、聚合物、陽極多孔氧化鋁及矽微通道。對於所揭示之方法，發現具有經雷射鑽孔之孔的不鏽鋼膜最適合目的，且Micropore Technologies（Redcar，UK）之可商購的設備實現了實驗室研究方法，且亦擴大至GMP製造。膜技術之若干重要特徵包括：1.嚴格控制的膜孔徑允許所有低於限制之SDP粒子穿過該膜；2.不具有曲折路徑之直管通道降低了SDP阻塞通道之傾向；3.親氟膜塗層提供與氟碳化合物包烴（H/F）乳液之產生的良好相容性。另外，不鏽鋼膜為穩固的、易於清潔且可滅菌的。
對於一個實驗，使用習知基於水性之乳液系統經由膜乳化產生空白POE微球體（RS001-批次1）或蛋白質封裝之POE微球體（RS001-批次2）。產生參數列於
表 10中。在批次1中，10% w/w POE之DCM溶液用作分散相且1%聚乙烯醇（PVA）用作連續相，以產生空白POE微球體。在批次2中，對VEGF捕獲SDP（含有1%經Alex488標記之VEGF捕獲）進行微封裝，其中尺寸D50=2.2（D10=1.0，D90=3.8，跨度=1.24）。將SDP添加至10% w/w POE之DCM溶液中，其中按重量計SDP:POE=9:1。使混合物渦旋且在音波浴中經音波處理5 min，以產生均質懸浮液。立即將SDP懸浮液負載至10 mL BD注射器中，且以由注射泵驅動之0.8 mL/min速率饋入至LDC-1分散單元。當有機相在使用10V DC功率攪拌（約1,015 rpm，視黏度而定）下通過30 μm孔之膜時，產生乳液。將所形成之乳液轉移至未加蓋燒杯，且在不攪拌之情況下在環境條件下硬化成微球體隔夜。微球體產物最終在真空過濾器上用MilliQ水洗滌，且在真空下乾燥隔夜。
表 10. 批次 1 及批次 2 中所用之 參數 ， 使用習知水性乳液系統進行之膜乳化 。
| 批次1 （ 僅POE ，O /W ） | 批次2 （POE +SDP ，S /O /W ） | |
| 膜 | 親水性，未經塗佈膜，30 μm孔徑 | |
| 連續相 | 1% PVA水溶液，100 mL | |
| 分散相 | POE 10% w/w於DCM中，3 mL | POE 10% w/w於DCM + SDP中，SDP:POE=9:1 w/w，3 mL |
| 饋入速率 | 1 mL/min | 0.8 mL/min |
| 攪拌速率 | 6V DC（~552 rpm） | 10V DC（~ 1015 rpm） |
| 硬化條件 | 環境，非攪拌。 | |
| 洗滌及乾燥 | 用MQ水洗滌，且在室內真空下乾燥 |
對於另一實驗，使用新穎非水性氟碳化合物包烴乳液系統經由膜乳化產生空白POE微球體（批次3）或蛋白質封裝之POE微球體（批次4）。產生參數列於表11中。在批次4a中，將上述VEGF捕獲SDP（含有1% Alexa488標記之VEGF捕獲）添加至烴溶劑，DCM中，其含有生物可降解或生物可侵蝕的聚合物POE。使混合物渦旋且經音波處理，以形成均質懸浮液。SDP懸浮液立即負載至注射器且藉由注射泵被饋入至LDC-1分散單元中。將懸浮液經由孔徑大於蛋白質粉末粒子之多孔膜輸注至含有氟界面活性劑（例如Pico-Surf 1）之氟碳化合物（例如FC-40）連續相中，以形成氟碳化合物包烴乳液（圖16中所繪示）。後續微球體硬化係經由將氫氟酯，NOVEC 7500，作為共溶劑添加至氟碳化合物中而自所形成之乳液液滴中移除烴溶劑來實現。收集經硬化微球體且用FC-40洗滌以移除額外氟界面活性劑，且使用含有PES過濾器之真空過濾來乾燥。最終，將產物在真空下乾燥以移除殘餘溶劑。整個方法之流程圖繪示於圖17中。
表 11 用於研究使用無水氟碳化合物包烴乳液系統進行之 RS002 膜乳化的參數。
| 批次 3 （ POE ， H/F） | 批次 4 （ SDP + POE ， S/H/F） | |
| 膜 | 親氟塗佈膜，30 μm孔徑 | |
| 連續相 | FC-40，0.5%w PicoSurf，50 mL | |
| 分散相 | POE 20% w/w於DCM中，3 mL | POE 20% w/w於DCM中，SDP:POE=9:1w/w，3 mL |
| 饋入速率 | 0.8 mL/min | 0.5 mL/min |
| 攪拌速率 | 8V DC | 550 8V DC（~ rpm） |
| 硬化條件 | 在形成乳液之後，添加HFE/FC-40=1:1 v/v，40 mL。隨後添加純HFE 10 mL。 | |
| 洗滌及乾燥 | 在真空過濾器上用FC-40洗滌且在室內真空下乾燥 |
結果
如圖18中所顯示，經由習知基於水性之乳液系統（批次1）且經由基於非水性之乳液系統（批次3）製造之空白POE微球體的SEM影像展示兩種方法提供球形微粒，但具有不同表面形態。基於水性之方法由於方法中存在水而產生高度多孔的表面，而基於非水性之方法由於完全無水方法而產生不具有明顯孔之光滑的微球體表面。
對於將VEGF捕獲SDP微封裝於POE微球體中，兩種方法之結果的比較展示於圖19中。基於水之膜乳化（批次3）提供良好單分散微球體，但表面為高度多孔且具有水通道。來自非水性膜乳化之微球體的單分散性比水性型式更差，但可藉由調節製程參數進一步改進。另外，觀測到嵌入POE微球體之表面上的許多SDP。此等位於表面之SDP可有助於在緩衝劑中培育微球體之後的蛋白質之爆發釋放（表11及12）。
螢光顯微鏡影像顯示POE微球體內部之蛋白質SDP的形態及分佈（圖20）。對於批次3而言，在封裝製程期間藉由水復原SDP且合併至微球體內部之較大液滴中。相反地，對於批次4，封裝於微球體內部之SDP保持其原始葡萄乾形狀結構，此表明SDP在製程之後保持其完整性，此係由於無水復原蛋白質。
批次3及批次4之封裝效率（產物中之所量測蛋白質負載/理論蛋白質負載）分別確定為35.0%及80.7%（表12.）。非水性系統之大於二倍之封裝效率表明，相比於水性系統，SDP較佳保留於烴液滴中且向連續相之擴散更少。封裝於POE微球體中之蛋白質純度（單體之百分比）係藉由尺寸排阻層析法（SEC）來量測。批次4在整個封裝製程之後展現出蛋白質純度之良好保留。
表12. 封裝於POE微球體中之蛋白質的定量及純度。
*原始SDP含有60% wt蛋白質及藉由SEC測定之97.3%純度。
| 樣品 | 乳液系統 | 來自進料溶液之理論蛋白質負載 * | 產物中所量測之蛋白質負載 | 封裝效率 | 爆發 / 總蛋白質 | 藉由SEC 測定 之VEGF 捕獲純度 * |
| 批次3 | S/O/W | 6% | 2.10% | 35.0% | 0.7% | 96.4 |
| 批次 4 | S/H/F | 6% | 4.84% | 80.7% | 11.6% | 96.7 |
儘管在前述說明書中，已關於本發明之某些實施例描述本發明，且已出於說明之目的闡述許多細節，但熟習此項技術者將顯而易見，本發明易受其他實施例影響，且本文所描述之某些細節可在不背離本發明之基本原理的情況下顯著變化。
所有在本文中引用之參考文獻以全文引用的方式併入。本發明可在不脫離本發明精神和基本特質的情況下以其他特定形式實施，且因此，應參考隨附申請專利範圍而非前文說明書來指定本發明的範圍。
圖1A為展示經由基於H/F之整體乳液的空白POE微球體產生之方法-流程1的圖式。圖1B展示FC-40之化學結構。圖1C展示氟界面活性劑PFPE-PEG-PFPE（Pico-Surf™ 1），全氟聚醚/聚(乙二醇)三嵌段共聚物之化學結構。Pico-Surf™ 1為可商購的，例如作為FC-40中之5%（w/w）。
圖2A為經由H/F乳液形成之空白POE微球體的顯微圖。圖2B為展示在較低FS含量下發現的POE聚集之顯微圖。
圖3A、3B及3C為經由具有較低、中等及較高均質化速度之H/F乳液形成之空白POE微球體的顯微圖。
圖4（流程2）為展示經由基於S/H/F之整體乳液的POE微球體中之SDP封裝方法之圖式。
圖5（流程3）為展示用於封裝蛋白質SDP之氟碳化合物包烴乳液系統的圖式。
圖6A及6B為分散於FC-40中之含有POE及經螢光標記之噴霧乾燥之蛋白質（F-SDP）的乙酸乙酯液滴之螢光影像。應注意，F-SDP在液滴內保留其原始尺寸及形態。綠色螢光影像以灰階描繪。
圖7A為VEGF捕獲F-SDP封裝之微球體的明場顯微圖。圖7B為VEGF捕獲F-SDP封裝之微球體的螢光影像（尺=20 μm）。圖7C為VEGF捕獲F-SDP封裝之微球體的螢光影像（尺=10 μm）。綠色螢光影像以灰階描繪於圖7B及7C中。
圖8A至圖8D為置放於水性環境中之VEGF捕獲F-SDP封裝之POE微球體的螢光影像。應注意，F-SDP在液滴內保留其原始尺寸及形態。綠色螢光影像以灰階描繪。
圖9為在非水性乳液方法中使用二氯甲烷（DCM）或乙酸乙酯（EtAc）產生之微粒的體積密度（%）相較於尺寸（µm）之曲線圖。
圖10A及圖10B為分別負載有10%及30% w/w VEGF捕獲SDP之微粒的顯微圖。
圖11A及11B為分別負載有10%及30% w/w SDP之VEGF捕獲F-SDP封裝之POE微球體的代表性螢光影像。應注意，F-SDP在液滴內保留其原始尺寸及形態。綠色螢光影像以灰階描繪。
圖12A及12B為負載有5%、10%之微粒的掃描電子顯微鏡（SEM）影像。
圖13A及13B為具有2.18 µm及5.63 µm之Dv50的噴霧乾燥之蛋白質的SEM影像。
圖14A、14B及14C為封裝於PLA微球體中之VEGF捕獲F-SDP的明場、螢光及SEM影像。綠色螢光影像以灰階描繪於圖14B中。
圖15A及15B為封裝於PLGA微球體中之VEGF捕獲F-SDP的明場及螢光影像。綠色螢光影像以灰階描繪於圖15B中。
圖16為展示當懸浮液經由多孔膜輸注至烴連續相中時SDP懸浮液乳液液滴之形成的圖式。
圖17為用於使用膜乳液產生微粒之例示性方法的圖式。用星形標記之步驟指示防止微粒產物之凝聚及聚集的步驟。
圖18含有使用水性及非水性乳液方法產生之微球體的SEM影像，且展示該等微球體具有使用水性方法之孔及水通道，同時具有使用非水性方法之光滑表面。
圖19含有使用水性及非水性乳液方法產生之蛋白質封裝之微球體的SEM影像。
圖20含有使用水性及非水性乳液方法產生之蛋白質封裝之微球體的螢光顯微法影像，且展示SDP使用水性乳液方法重組且合併成更大的液滴，同時使用非水性乳液方法保留其原始葡萄乾形狀（raisin-shape）。綠色螢光影像以灰階描繪。
Claims (45)
- 一種製備經聚合物塗佈之微粒之方法，其包含： 將微粉化蛋白質粉末與聚合物組合至烴溶劑中，以形成非水性第一溶液； 攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液； 將該懸浮液饋入分散單元，其中該懸浮液在連續相之切向流下經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及氟界面活性劑之該連續相中，以形成氟碳化合物包烴（hydrocarbon-in-fluorocarbon）乳液； 將氫氟酯（hydrofluoroester）添加至該氟碳化合物包烴乳液中； 移除該烴溶劑以提供經硬化微粒；及 移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒包含封裝於聚合物基質內之蛋白質。
- 如請求項1之方法，其進一步包含以下步驟：藉由於該氟碳化合物液體中洗滌該等微粒自該等微粒中移除殘餘氟界面活性劑，且藉由真空移除該氟碳化合物且使用聚醚碸過濾膜收集該等微粒。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其中該氟碳化合物液體包含全氟C5-C18化合物。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該烴溶劑選自由以下組成之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該氟碳化合物溶液包含1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁烷-1-胺。
- 如請求項1至1中任一項之方法，其中該氟界面活性劑包含全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中該聚合物包含聚原酸酯（POE）。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中該聚合物選自由聚乳酸及聚(乳酸-共-乙醇酸)組成之群。
- 如請求項1至8中任一項之方法，其中該氫氟酯為2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。
- 如請求項1至9中任一項之方法，其中該膜為親氟塗佈（fluorophilic-coated）之不鏽鋼膜。
- 如請求項10之方法，其中該膜之孔的直徑為3至300 µm。
- 如請求項1至11中任一項之方法，其中該氟界面活性劑以約0.1至5% w/v存在於氟碳化合物液體中。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中該蛋白質粉末與聚合物比率為0.1%-30%。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中該微粉化粉末係由抗體或其抗原結合片段、融合蛋白質、重組蛋白質或其片段或截短型產生。
- 如請求項14之方法，其中該融合蛋白質為VEGF捕獲融合蛋白質或呈其截短型。
- 如請求項14或15之方法，其中該VEGF捕獲融合蛋白質為阿柏西普（aflibercept）。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中該懸浮液之饋入速率為0.1至1.0 ml/min。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中該懸浮液為均質懸浮液。
- 如請求項1至18中任一項之方法，其中該等微粒包含單個核殼（core-shell）結構。
- 如請求項1至19中任一項之方法，其中至少一個微粒包含分散於該聚合物內之多個核心。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中該等微粒包含含有藉由聚合物封裝之單個核心結構之組合的微粒，及含有藉由聚合物封裝之多個核心結構的微粒。
- 如請求項1至21中任一項之方法，其中該等微粒之直徑為1至200 µm。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該等微粒之中值直徑為30至60 µm。
- 如請求項1至23中任一項之方法，其中蛋白質粉末係藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化（microtemplating）或其組合微粉化。
- 如請求項1至24中任一項之方法，其中該懸浮液係使用均質化、渦旋、音波處理、空蝕、攪拌（agitation）、攪拌（stirring）、攪動（churning）、攪泡（whisking）、振盪、乳化或其組合形成。
- 如請求項1至25中任一項之方法，其中該烴溶劑係藉由蒸發移除。
- 如請求項1至25中任一項之方法，其中該氟碳化合物液體係藉由真空過濾移除。
- 一種由如請求項1至27中任一項之方法產生之微粒，其中該等微粒為持續釋放微粒。
- 一種持續釋放組合物，其包含如請求項28之微粒。
- 如請求項1至29中任一項之微粒，其中該等微粒在聚合物皮質中具有極少孔或通道，或沒有孔或通道。
- 一種產生聚合物或經聚合物塗佈之微粒之方法，其包含： 組合懸浮於烴溶液中之1至30% w/w之總固體噴霧乾燥之蛋白質，以形成非水性第一溶液； 攪拌該第一非水性溶液以形成懸浮液； 將該懸浮液饋入分散泵，其中該懸浮液在連續相之切向流下經由多孔膜輸注至包含氟碳化合物液體及0.1至5.0% w/v氟界面活性劑之該連續相中，以形成氟碳化合物包烴乳液； 移除該烴溶劑以提供經硬化聚合物或經聚合物塗佈之微球體；及 移除該氟碳化合物液體以分離該等微粒，其中該等微粒包含封裝於聚合物基質內之蛋白質。
- 如請求項31之方法，其進一步包含以下步驟：在移除該烴溶劑之前將氫氟酯添加至該氟碳化合物包烴乳液之該氟碳化合物液體中。
- 如請求項32之方法，其中該烴溶液係藉由在環境大氣壓力下或在真空下蒸發來移除。
- 如請求項33之方法，其中該經硬化聚合物或經聚合物塗佈之微球體係藉由真空過濾收穫。
- 如請求項31至32中任一項之方法，其中該噴霧乾燥之蛋白質為抗體、重組蛋白質、融合蛋白質或其片段。
- 如請求項365之方法，其中該蛋白質為VEGF捕獲蛋白質或截短VEGF捕獲蛋白質。
- 如請求項31之方法，其中該烴溶液選自由以下組成之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。
- 如請求項31至37中任一項之方法，其中該氟碳化合物液體包含三氟甲基)雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)胺。
- 如請求項38之方法，其進一步包含收穫該等經硬化微粒。
- 一種由如請求項31至39之方法中之任一者產生的微粒。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項40之微粒。
- 如請求項41之醫藥組合物，其進一步包含一個或多個賦形劑。
- 如請求項41之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為持續釋放組合物。
- 如請求項41至43中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於非經腸投與。
- 如請求項3之方法，其中該氫氟醚（hydrofluoroether）包含4-乙氧基-1,1,1,2,2,3,3,4,5,6,6,6-十二氟-5-(三氟甲基)己烷。
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