JP6309521B2 - pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体 - Google Patents
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Description
「プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型」、「PCSK9」、「PCSK9フラグメント」などの表現は、本明細書に用いるように、非ヒト種(例えば、「マウスPCSK9」、「マウスPCSK9フラグメント」、「サルPCSK9」、「サルPCSK9フラグメント」、など)からであると明記されていなければ、ヒトPCSK9タンパク質またはフラグメントのことをいう。ヒトPCSK9(本明細書では、しばしば「hPCSK9」と略す)は、配列番号:755に示すアミノ酸を有する。
al. (1993) Molecular Immunology 30:105)。本発明は、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するために望ましいことがありうる、ヒンジ、CH2またはCH
3領域中に1つまたはそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。
本発明は、pH依存性結合特性を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本明細書に用いるように、「pH依存性結合」という表現は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが「中性pHと比較して酸性pHでPCSK9に対する低下した結合」を示すことを意味する(本開示の目的では、いずれの表現も同じ意味で用いてよい)。例えば、「pH依存性結合特性を有する」抗体は、酸性pHよりも中性pHでより高い親和性によってPCSK9を結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、酸性pHよりも中性pHで、少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍またはそれ以上のより高い親和性によってPCSK9を結合する。また、「pH依存性結合特性を有する」抗体という成句は、「中程度のpH依存性結合特性」を有する抗体を含み、その表現は本明細書の他の箇所に定義されたとおりである。
本発明は、親抗PCSK9抗体と比較して1つまたはそれ以上のアミノ酸の違いを有し、pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体を提供する。本明細書に用いるように、「親」抗PCSK9抗体は、pH依存性結合特性を示さないか、または中程度のpH依存性結合特性のみを示す抗PCSK9抗体である(例えば、ここでは、中性pHでのPCSK9に対する親抗体の結合親和性は、酸性pHでのPCSK9に対する抗体の結合親和性よりも3倍を超えることなく大きい;または親抗体は、中性pHでPCSK9に結合する抗体のt1/2よりも3倍を超えることなく短いt1/2によって酸性pHでPCSK9を結合する)。場合によっては、「親」抗PCSK9抗体は、中性pHと比較して酸性pHでPCSK9に対する増強された結合を示す抗PCSK9抗体であってもよい。いくつかの実施態様では、「親」抗PCSK9抗体は、相補性決定領域(CDR)中に人工的に導入されたなんらかのアミノ酸修飾なしに、標準抗体産生/単離方法(例えば、マウス免疫化、ファージディスプレイ、など)によって得られる抗体である。
本発明の特定の実施態様によれば、例えば、中性pHと比較して酸性pHでFcRn受容体に対する抗体結合を増強または減弱させる、1つまたはそれ以上の突然変異を含むFcドメインを含む抗PCSK9抗体が提供される。例えば、本発明は、突然変異によって酸性環境中(例えば、pHが約5.5から約6.0までの範囲にあるエンドソーム中)でFcRnに対するFcドメインの親和性が高まる、FcドメインのCH2またはCH3領域中に突然変異を含む抗PCSK9抗体を含む。このようなFc修飾の非限定的な例としては、例えば、位置250(例えば、EまたはQ);250および428(例えば、LまたはF);252(例えば、L/Y/F/WまたはT)、254(例えば、SまたはT)および256(例えば、S/R/Q/E/DまたはT)での修飾;または位置428および/または433(例えば、H/L/R/S/P/QまたはK)および/または434(例えば、H/FまたはY)での修飾;または位置250および/または428での修飾;または位置307または308(例えば、308F、V308F)および434での修飾が含まれる。一実施態様において、修飾は、428L(例えば、M428L)および434S(例えば、N434S)修飾;428L、259I(例えば、V259I)および308F(例えば、V308F)修飾;433K(例えば、H433K)および434(例えば、434Y)修飾;252、254および256(例えば、252Y、254Tおよび256E)修飾;250Qおよび428L修飾(例えば、T250QおよびM428L);ならびに307および/または308修飾(例えば、308Fまたは308P)を含む。
また、pH依存性結合特性を有することに加えて、本発明の抗PCSK9抗体は、1つまたはそれ以上のさらなる有益な生物学的性質を有してもよい。例えば、本発明は、PCSK9と低密度リポタンパク質受容体(LDLR)との間の相互作用を効果的に遮断する抗PCSK9抗体を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体は、例えば、本明細書の実施例4に示すブロッキングELISA、または実質的に類似したアッセイフォーマットを用いて測定して、約1nM未満、例えば、約900pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満または約100pM未満のIC50によって中性pHでPCSK9とLDLRとの間の相互作用を遮断する。
また、本発明は、pH依存性結合特性を有する抗体を生成する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、少なくとも中程度のpH依存性結合特性を示す抗体についてスクリーニングし、次いで、このような抗体を、その抗原に対する抗体のpH依存性を増強するさらなる突然変異誘発にかけることを含む。スクリーニングステップは、それによって中程度のpH依存性結合特性を有する抗体が、特定の抗原に特異的な抗体の集団内に特定される任意の方法または過程を含んでもよい。特定の実施態様において、最初の抗体集団は、動物を免疫化することによって、または興味の特定の抗原を特異的に結合する抗体についてファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。このような抗体は、特定の実施態様において、完全にヒト抗体、例えば、完全にヒト組換え抗体であってもよい。特定の実施態様において、スクリーニングステップは、酸性pHおよび中性pHの両方で最初の抗体集団内のそれぞれの抗体の1つまたはそれ以上の結合パラメータ(例えば、KDまたはt1/2)を測定することを含む。抗体の結合パラメータは、例えば、表面プラズモン共鳴、または特定の抗原に対する抗体の結合特性の定量的もしくは定性的評価を可能にする他のなんらかの分析方法を用いて測定してもよい。本発明のこの態様の特定の実施態様によれば、スクリーニングステップは、約3.0を超えるが約8.0未満の酸性/中性KD比によって抗原を結合する抗体を特定することを含む。あるいは、スクリーニングステップは、約1.0未満であるが0.15を超える酸性/中性t1/2比によって抗原を結合する抗体を特定することを含んでもよい。さらに他の実施態様において、スクリーニングステップは、酸性pH(例えば、pH6.0)で40分未満であるが20分を超えない(例えば、25℃で)t1/2を示す抗体を特定することを含んでもよい。本発明のこの態様の特定の実施態様によれば、酸性/中性KD比および/または酸性/中性t1/2比は、酸性pH6.0および中性pH7.4で、ならびに25℃の温度で測定した。別の実施態様によれば、酸性/中性KD比および/または酸性/中性t1/2比は、酸性pH5.75および中性pH7.2で、ならびに25℃の温度で測定した。
本明細書に記載された特定の実験に基づいて、予想外なことに、CDR中の天然のヒスチジン残基に隣接して(例えば、そこからすぐ上流または下流に)位置する残基で、抗体のCDRにヒスチジン置換を導入し、それによって、His−Hisアミノ酸配列を産生することによって、中程度のpH依存性結合特性を有する抗体をより顕著なpH依存性結合特性を有する抗体に変換できることが発見された。本明細書に用いるように、「より顕著なpH依存性結合特性」は、抗体が、ヒスチジン置換の導入後、ヒスチジン置換の導入前の抗体よりも(a)より大きな酸性/中性KD比;(b)より大きな酸性/中性kd比;および/または(c)より小さな酸性/中性t1/2比の1つまたはそれ以上を示すことを意味する。例えば、本明細書において300Nとして引用された抗体は、中程度のpH依存性結合特性を有し、LCDR1(配列番号:228を参照のこと)の5番目のアミノ酸位置で1つの天然ヒスチジンを含む。LCDR1の4番目のアミノ酸位置にヒスチジン置換を導入することによって(配列番号:802を有するLCDR1を含む「VK−L30H」抗体が得られ)、得られた抗体は、本明細書の実施例3Aおよび3Bに示すように、300Nよりも非常に顕著なpH依存性結合特性を有することが見いだされた。この「二重His」突然変異の戦略は、顕著なpH依存性結合特性を有する抗体を産生するための一般に適用できる方法論であってもよい。したがって、本発明は、中程度のpH依存性結合特性を有する抗体を選択し、既存のヒスチジン残基に隣接したアミノ酸位置で抗体の1つまたはそれ以上のCDR中にヒスチジン置換を導入し、それによって、より顕著なpH依存性結合特性を有する(例えば、ヒスチジン置換の導入前の親抗体より大きな酸性/中性KD比を有する)抗体を生成することを含む、抗体のpH依存性を増強する方法を含む。また、この方法論は、例えば、1つまたはそれ以上のCDR内の隣接するアミノ酸位置で2つまたはそれ以上のヒスチジン置換を導入することによって、通常、CDR中になんらヒスチジン残基がない抗体に適用することができる。
本発明は、PCSK9(配列番号:755のアミノ酸1〜152)のプロドメイン内に見いだされる1つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗PCSK9抗体を含む。また、本発明は、PCSK9(配列番号:755のアミノ酸153〜425)の触媒ドメイン内に見いだされる1つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗PCSK9抗体を含む。また、本発明は、PCSK9(配列番号:755のアミノ酸426〜692)のC末端ドメイン内に見いだされる1つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗PCSK9抗体を含む。特定の例において、本発明の抗PCSK9抗体は、PCSK9の2つの隣接するドメイン内に位置するアミノ酸と相互作用する。抗体が結合するエピトープは、PCSK9の1つまたはそれ以上のドメイン内に位置する3つまたはそれ以上の(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の)アミノ酸の単一の連続した配列からなってもよい。代わりに、エピトープは、PCSK9の1つまたはそれ以上のドメイン内に位置する複数の非連続アミノ酸(または、アミノ酸配列)からなってもよい。
完全なヒトモノクローナル抗体を含む、モノクローナル抗体を生成する方法は、当分野で知られている。ヒトPCSK9に特異的に結合する組換えヒト抗体を含む抗体を作製する本発明の文脈では、このようないずれかの知られている方法を用いることができる。その時、このような抗体は、ヒスチジン置換変異型抗体(例えば、pH依存性結合性質を示すヒスチジン置換変異型抗体)が誘導されうる親抗体として用いることができる。
また、本明細書に具体的に例示されたヒスチジン置換に加えて、本発明は、記載された抗体のものとは異なるが、pH依存性結合特性を有するヒトPCSK9を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗体を包含する。このような変異型抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較したときにアミノ酸の1つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗PCSK9抗体をコードするDNA配列は、開示された配列と比較したときに、ヌクレオチドの1つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗PCSK9抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗PCSK9抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。
本発明の特定の実施態様によれば、抗PCSK9抗体はヒトPCSK9に結合するが、他の種からのPCSK9には結合しない。また、本発明は、ヒトPCSK9および1つまたはそれ以上の非ヒト種からのPCSK9に結合する抗PCSK9抗体を含む。例えば、本発明の抗PCSK9抗体は、ヒトPCSK9に結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのPCSK9の1つまたはそれ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい。
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、1つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的でもあってよいし、または複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合性ドメインを含んでもよい。例えば、Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244を参照のこと。本発明の抗PCSK9抗体は、他の機能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質に結合するか、またはそれと共発現することができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、1つまたはそれ以上の他の分子単位、例えば他の抗体または抗体フラグメントに(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合またはその他によって)機能的に結合して第2の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの1つのアームが、ヒトPCSK9またはそのフラグメントに特異的であり、かつ免疫グロブリンの他のアームが第2の治療標的に特異的であるか、または治療部分に結合される、二重特異性抗体を含む。
本発明は、本発明の抗PCSK9抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適した担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤、防腐剤および改善された導入、送達、耐性などをもたらす他の薬剤を用いて製剤化される。多くの適当な製剤は、すべて薬剤師に知られている処方集:レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)、マック・パブリシング・カンパニー(Mack Publishing Company)、イーストン(Easton)、PAに見いだすことができる。これらの製剤には、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー、ロウ、オイル、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有ベシクル(例えばリポフェクチン(商標)(LIPOFECTINTM)、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)、カールズバッド(Carlsbad)、CA)、DNA複合体、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。また、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照のこと。
本発明は、薬剤に使用するための、pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体を含む、抗PCSK9抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明は、それを必要とする対象に、抗PCSK9抗体を含む治療組成物(例えば、pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体)を投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示された抗PCSK9抗体のいずれかまたはそのフラグメントを含むことができる。本明細書に用いるように、「それを必要とする対象」という表現は、高コレステロール血症の1つもしくはそれ以上の症状もしくは徴候を示す、または高コレステロール血症と診断された、または、そうでなければ、総血清コレステロール、LDL、トリグリセリドもしくはVLDLの低下から利益を得られるであろう、もしくはHDLの上昇から利益を得られるであろうヒトまたは非ヒト動物を意味する。また、本発明は、本発明の抗PCSK9抗体(例えば、pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体)を投与することによってリポタンパク質(a)[Lp(a)]レベルを低下させる方法を含む。
また、本発明は、1つまたはそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて本明細書に記載された例示的な抗PCSK9抗体のいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む治療方法を提供する。本発明の抗PCSK9抗体と組み合わせて投与されうる例示的なさらなる治療剤としては、例えば、スタチン(アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、など)、ナイアシン、フィブリン酸、胆汁酸分離剤(例えば、コレスチラミン)、コレセベラム、コレスチポール、エゼチミブ、抗高血圧剤、抗糖尿病薬、アンギオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)またはアンギオポエチン様タンパク質4(ANGPTL4)のアンタゴニスト(例えば、抗ANGPTL3抗体[例えば、WO2008/073300またはUS7,935,796中に記載された抗ANGPTL3抗体]または抗ANGPTL4抗体[例えば、WO2006/0074228またはWO2007/109307またはWO2011/079257中に記載された抗ANGPTL4抗体])、ならびに上記のさらなる治療剤のいずれかの組合せが含まれる。
本発明の方法および投与療法に従って対象に投与される抗PCSK9抗体の量は、一般に治療有効量である。本明細書に用いるように、「治療有効量」という成句は、血清LDL−Cの減少が検出可能となる抗PCSK9抗体の用量、または高コレステロール血症および/もしくは関連する状態の進行を阻害する、防止する、弱める、もしくは遅らせる抗PCSK9抗体の用量を意味する。pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体の場合、治療有効量は、抗PCSK9抗体約0.05mgから約600mgまで、例えば、約0.05mg、約0.1mg、約1.0mg、約1.5mg、約2.0mg、約10mg、約20mg、約30mg、約40mg、約50mg、約60mg、約70mg、約75mg、約80mg、約90mg、約100mg、約110mg、約120mg、約130mg、約140mg、約150mg、約160mg、約170mg、約180mg、約190mg、約200mg、約210mg、約220mg、約230mg、約240mg、約250mg、約260mg、約270mg、約280mg、約290mg、約300mg、約310mg、約320mg、約330mg、約340mg、約350mg、約360mg、約370mg、約380mg、約390mg、約400mg、約410mg、約420mg、約430mg、約440mg、約450mg、約460mg、約470mg、約480mg、約490mg、約500mg、約510mg、約520mg、約530mg、約540mg、約550mg、約560mg、約570mg、約580mg、約590mgまたは約600mgであることができる。
本発明の特定の実施態様によれば、複数の用量の本発明の抗PCSK9抗体(例えば、pH依存性結合特性を有する抗PCSK9抗体を含む医薬組成物)を定められた時間経過にわたって対象に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、対象に複数の用量の抗PCSK9抗体を順に投与すること含む。本明細書に用いるように、「順に投与すること」は、それぞれの用量の抗PCSK9抗体が、異なる時点で、例えば、予め定められた間隔(例えば、数時間、数日、数週間あるいは数ヶ月)を隔てた異なる日に対象に投与されることを意味する。本発明は、初回用量の抗PCSK9抗体を1回、続いて第2の用量の抗PCSK9抗体を1回またはそれ以上、そして場合により、続いて第3の用量の抗PCSK9抗体を1回またはそれ以上、患者に順に投与することを含む方法を含む。
米国特許第8,062,640号に記載されたようなヒト抗PCSK9抗体を生成した。表1は、選択された抗PCSK9抗体およびそれらの対応する抗体表示の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対、ならびにCDRアミノ酸配列についての配列識別子を示す。核酸配列は、表1中に偶数の配列識別子に対応する奇数の配列識別子によって表される。例えば、配列番号:1は配列番号:2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり;配列番号:3は配列番号:4のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、など。
300Nと表示された抗PCSK9抗体は、酸性pHでPCSK9に対する低下した結合親和性を有する中程度のpH依存性結合特性、および増強された薬物動態を有することが知られている(米国特許第8,062,640号を参照のこと)。さらにより大きなpH依存性結合特性(すなわち、中性pHと比較して低いpHで低下した結合)および改善されたin vivo有効性(例えば、より長い抗体血清半減期、延長されたコレステロール低下活性、など)を有する300Nの変異体を生成する試みにおいて一連の変異型抗体を作製した。特に、300Nの相補性決定領域(CDR)内の各アミノ酸がそれぞれヒスチジンに突然変異した300Nの突然変異体バージョンを作製した。表1に示すように、親300N抗体の重鎖可変領域(HCVR)は配列番号:218のアミノ酸配列を含み、そして親300N抗体の軽鎖可変領域(LCVR)は配列番号:226のアミノ酸配列を含む。親300N抗体のCDR配列を表2に示す。His置換突然変異は、300Nから誘導されたヒスチジン置換変異型抗体に対応する抗体表示とともに表3に示す(例えば、VH−G26H、VH−F27H、など)。
実施例2のヒスチジン置換変異型抗体を、ヒトPCSK9に対するpH依存性結合について試験し、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore T200)アッセイを用いて25℃で、pH5.75およびpH7.2のいずれかで実施した。本実験の目的は、どのヒスチジン置換変異型抗体が、中性pHと比較して酸性pHでヒトPCSK9に対して低下した結合を示したかを特定することであった。
本発明の抗PCSK9抗体のpH依存性結合特性をさらに評価するため、結合実験を実施し、ここでは、抗体/抗原結合段階を中性pHで観察し、そして抗体/抗原解離段階を37℃で中性または酸性pHの範囲で観察した。
2ポリクローナル抗ヒトFc抗体で誘導体化した。精製された選択ヒスチジン置換変異型抗PCSK9抗体(VH−D106H、VK−L30HおよびVH−D016H/VK−L30H)を、親抗体(316Pおよび300N)およびコンパレーター抗体(コンパレーター1−7は、表5を参照のこと)と共に抗ヒトFcセンサー表面上へ捕捉させた。3.125nMから50nMまでの範囲の異なる濃度のC末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグ(hPCSK9−mmH)を有するヒトPCSK9を、30μl/分の流速で抗PCSK9モノクローナル抗体捕捉表面上に注射した。抗体−抗原結合をpH7.4で6分間モニターし、次いで捕捉されたモノクローナル抗体からの抗原の解離をpH7.4、7.2、6.0または5.75のいずれかで5分間モニターした。スクラバーバージョン2.0(Scrubber version 2.0)曲線適合ソフトウェアを用いてデータを処理し、適合させることによって解離(kd)速度定数を決定した。解離半減期(t1/2)は、t1/2(分)=(ln2/kd)/60として解離速度定数から計算した。種々のpH条件下で抗体の結合/解離特性を示すセンサーグラムを図3A〜3Gに図示する。
最初に、ELISAベースの免疫測定法を用いて、選択されたヒスチジン置換変異型抗PCSK9抗体を、中性pHでヒトLDLR(hLDLR)に対する組換えヒトPCSK9結合を遮断する能力について試験した。
選択されたヒスチジン置換変異型抗PCSK9抗体のin vitroでのLDL取り込みを高める能力を、ヒト肝細胞性肝癌細胞系統(HepG2、ATCC#HB−8065)を用いて決定した。HepG2細胞を、DMEMの5%リポタンパク質欠損血清(LPDS、ミリポア(Millipore)、#LP4)中、2×104細胞/ウェルで96ウェルプレート上へ播種し、37℃、5%CO2で一夜インキュベートしてHepG2単層を形成した。2nM組換えヒトPCSK9(配列番号:755、C末端myc−mycヘキサヒスチジンタグおよびD374Y突然変異;「hPCSK9−D374Y−mmH」で発現)または50nM組換えカニクイザルPCSK9(C末端myc−mycヘキサヒスチジンタグ;MfPCSK9−mmHで発現;配列番号:761)を、LPDS培地中の種々の濃度(連続希釈で50nMから0.098nMまで)の抗体を加えた。一夜インキュベーション後、LPDS培地中のBODIPYLPL(インビトロゲン(Invitrogen)、L3483)を細胞に加えて0.01mg/mLの最終濃度にした。37℃で6時間インキュベーション後、390nm/520nmに設定した励起/放出フィルターを用いて蛍光プレートリーダー(モレキュラーデバイスフレックスステーションIII(Molecular Devices Flexstation III))によってBODIPYLPLの取り込みを検出した。試験した各抗PCSK9抗体のIC50値を表10に示す(IC50=LDL取り込みが50%高まる抗体濃度)。
3つのヒスチジン置換変異型抗PCSK9抗体(VH−D106H、VK−L30HおよびVH−D106H/VK−L30H)のそれらの親抗体分子(300N)に対する薬物動態クリアランス速度の比較を、野生型(WT)マウスおよびマウスPCSK9の代わりにヒトPCSK9を発現するため、すべてのマウスについて同じ系統のバックグラウンド(75%C57BL6および25%129Sv)を有するマウス同種接合(ヒト化PCSK9マウス)において行った。各抗体を、5匹のWTおよび5匹のヒト化PCSK9マウスで試験した。すべての抗体を1mg/kgの用量で皮下投与した。抗体注射の1日前に集めたブリード(bleed)(プレブリード(pre-bleed))に加えて、注射後、6時間、1、2、3、4、7、10、14、21、30、39、50、60および74日でブリードを集めた。ブリードからの血清画分を分離し、ELISA免疫測定法を用いた総ヒト抗体分析にかけた。簡潔に言えば、ヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体(ジャクソンイムノリサーチ(Jackson ImmunoResearch)、#109−005−098)を、1μg/mLの濃度で、4℃で一夜インキュベートすることによって96ウェルプレート上へコーティングした。その翌日、プレートをBSAでブロックし、次いで洗浄した。次いで、6用量連続希釈の血清試料および12用量連続希釈のおよびそれぞれの抗体の標準試料をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ジャクソンイムノリサーチ(Jackson ImmunoResearch)、#109−035−098)と結合したヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体を用いてプレートに捕捉されたヒト抗体を検出した。プレートを洗浄し、次いで、製造元の(BDファーミンジェン(BD Pharmingen))推奨に従って比色テトラメチルベンジジン(TMB)基質によって呈色させた。吸光度を450nmで測定し、試料プレートで作成した参照標準曲線を用いて血清試料のヒトIgGの濃度を計算した。結果を図1および2Aに説明し、これらは、それぞれ、WTおよびヒト化マウスで試験した4つの抗PCSK9抗体の濃度変化の時間経過を示す。実験の経過にわたる各コホートについての平均血清抗体濃度(μg/ml±SEM)を表12(日14、21および30)、表13(日39、50および60)および表14(日74)に示す。
in vivoでの血清LDL−Cレベルにおける抗ヒトPCSK9抗体の作用を、マウスPCSK9の代わりにヒトPCSK9を発現するためホモ接合であり、かつ、またマウスLDLRを発現するためヘテロ接合であるマウス(Pcsk9hum/hum Ldlr+/−)において決定した。実験の5日前にマウスから予め採血し(pre-bleed)、群全体で平均LDL−Cレベルが等しくなるようにそれらのLDL−Cレベルに基づいて処置群に選別した。次いで、抗PCSK9抗体または特異性と関連がないアイソタイプ対照抗体のいずれかを、10mg/kgの用量で本研究の日0に、マウスに皮下注射した。本研究では、2つの非修飾親抗PCSK9抗体(316Pおよび300N)および2つのヒスチジン置換変異型抗PCSK9抗体(VK−L30HおよびVH−D106H)を用いた。本実施例では、2つのバージョンの316P、316P(v1)および316P(v2)を用いた。316P(v1)はヒトIgG1 Fcを有するのに対して、316P(v2)はヒトIgG4 Fcを有する。他のすべての試験抗体は、ヒトIgG4 Fcを有した。(本実施例で用いる「300N」抗体は、本明細書の実施例3で用いた「300N(v2)」抗体と同じである)。各処置群に5匹のマウスを用いた。
mg/kg単回投与は、それぞれ、日7でベースラインから約45%を超えるLDL−Cの低下、および日14でベースラインから約44%を超えるLDL−Cの低下をもたらした。さらに、VK−L30Hの単回投与で処置したマウスは、33日までの間にベースラインから少なくとも33%のLDL−Cにおける持続性の低下を示した。VK−L30Hで処置したマウスのLDL−Cレベルは、10mg/kg単回投与の後、日46でベースラインの約20%下にとどまった。VH−D106Hを投与したマウスは、LDL−CにおいてVK−L30Hと同様の初期低下を有したが、しかしLDL−Cレベルは、日33までベースラインからわずか約13%しか低下しなかった。また、316P(v1)の単会投与によってVK−L30Hとほぼ同じベースラインからのLDL−Cにおける初期パーセント低下が導かれたが(抗体投与後の日7でベースラインから約49%の低下が達成された)しかし、LDL−C低下作用は、ヒスチジン置換突然変異体ほど延長されなかった。316P(v2)および300Nは、最大の短期LDL−C低下作用を示した(各抗体について日7でベースラインから約58%の低下)が、しかし、ヒスチジン置換突然変異体と比較して持続作用はより短かった。
Claims (10)
- ヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)を結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、ここで:
(a)抗体またはそのフラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定して、酸性pHよりも中性pHで少なくとも13倍大きな親和性によってPCSK9を結合する;
(b)表面プラズモン共鳴によって測定して、25℃でPCSK9に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性/中性KD比が約12.5を超える;
(c)表面プラズモン共鳴によって測定して、25℃でPCSK9に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性/中性KD比が約7.5を超える;
(d)表面プラズモン共鳴によって測定して、25℃でPCSK9に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性/中性t1/2比が約0.14未満である;
(e)25℃および酸性pHで約4.5分未満の解離半減期(t1/2)によってPCSK9を結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、25℃および中性pHで約35分を超えるt1/2によってPCSK9を結合する;
(f)表面プラズモン共鳴によって測定して、中性pHでPCSK9に結合する抗体のt1/2よりも少なくとも10倍短いt1/2によって酸性pHでPCSK9を結合する;または
(g)酸性pHよりも中性pHで少なくとも12倍より大きな親和性によってPCSK9を結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、中性pHでPCSK9に結合する抗体のt1/2よりも少なくとも10倍短いt1/2によって酸性pHでPCSK9を結合する;
ここで、酸性pHは6.0またはそれ未満のpHを意味し、中性pHは約7.0〜約7.4のpHを意味する;
そしてここで、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、3つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)および3つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含み、
該HCDR1が、配列番号:220を含み、
該HCDR2が、配列番号:222を含み、
該HCDR3が、配列番号:224または788を含み、
該LCDR1が、配列番号:802を含み、
該LCDR2が、配列番号:230を含み、および
該LCDR3が、配列番号:232を含む;
上記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、酸性pHよりも中性pHで少なくとも14倍、または少なくとも15倍大きな親和性によってPCSK9を結合する、請求項1の(a)に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、25℃および酸性pHで約2分未満、または約1.5分未満の解離半減期(t1/2)によってPCSK9を結合し、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、25℃および中性pHで約35分を超えるt1/2によってPCSK9を結合する、請求項1の(e)に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、中性pHでhPCSK9に結合する抗体のt1/2よりも少なくとも15倍、または少なくとも20倍短いt1/2によって酸性pHでPCSK9を結合する、請求項1の(f)に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 酸性pHでの抗体またはその抗原結合性フラグメントのPCSK9/LDLR遮断IC50値よりも少なくとも36倍より小さいIC50によって中性pHで、PCSK9と低密度リポタンパク質受容体(LDLR)との間の相互作用を遮断する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントを約10mg/kgの単回投与で対象に投与したとき、血清LDL−Cがベースラインから少なくとも33%低下し、該血清LDL−Cの低下が、投与後、少なくとも26日間、または少なくとも33日間持続する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントを約10mg/kgの単回投与で対象に投与したとき、血清LDL−Cがベースラインから少なくとも15%低下し、該血清LDL−Cの低下が、投与後、少なくとも42日間、または少なくとも55日間持続する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントであって、
(a)HCVRが、配列番号:218を含み、そしてLCVRが、L30Hのアミノ酸置換を含む配列番号:226の変異体を含む;
または
(b)HCVRが、D106Hのアミノ酸置換を含む配列番号:218の変異体を含み、そしてLCVRが、L30Hのアミノ酸置換を含む配列番号:226の変異体を含む;
上記単離された抗体または抗原結合性フラグメント。 - 薬剤に使用するための請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 高コレステロール血症の治療に使用するための、または血清LDL−Cレベルを低下させるための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合
性フラグメント、または請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。
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