CN111655722A - 用于表征药物产品杂质的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于表征蛋白药物产品杂质的尺寸和电荷变体的系统和方法。

Description

用于表征药物产品杂质的系统和方法
技术领域
本发明总体上涉及蛋白分离方法和细胞培养方法。
背景技术
在过去的二十年，单克隆抗体(mAb)已成功地用于靶向宽范围的治疗领域(WalshG.,Biopharmaceutical benchmarks 2014,Nature biotechnology 2014；32:992-1000；Lawrence S.Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.Naturebiotechnology 2007；25:380-2)。
抗体的异质性是本领域已知的。例如，低分子量(LMW)物质和高分子量(HMW)物质都是促成mAb产品的尺寸异质性的产品相关杂质的例子。由蛋白聚集导致的治疗性mAb药物产品中的HMW物质的形成可能潜在地损害药物效力和安全性。蛋白水解片段也可能促成产品的杂质分布。
尽管mAb具有由两条二硫键连接的重链组成的保守共价异四聚体结构(每条重链通过二硫键与轻链共价连接)，但是这些蛋白经常含有低水平的产品相关杂质，即使在大量纯化步骤以后。低分子量(LMW)物质(例如，Fab片段和没有Fab臂的单体)和高分子量(HMW)物质(例如，mAb三聚体和mAb二聚体)都是促成mAb产品的尺寸异质性的产品相关杂质的例子。由蛋白聚集导致的治疗性mAb药物产品中HMW物质的形成可能潜在地损害药物效力和安全性(例如，引起不希望的免疫原性应答)(Rosenberg AS.Effects of proteinaggregates:an immunologic perspective.The AAPS journal 2006；8:E501-7；MoussaEM,Panchal JP,Moorthy BS,Blum JS,Joubert MK,Narhi LO,等人.Immunogenicity ofTherapeutic Protein Aggregates.Journal of Pharmaceutical Sciences 2016；105:417-30)。任何治疗性蛋白的LMW物质都可能源于生产过程中的宿主细胞蛋白酶活性。LMW物质经常具有与抗体的单体形式相比低的活性或实质上降低的活性，同时会暴露新表位，所述新表位可以导致免疫原性或可能影响体内药代动力学特性(Vlasak J,IonescuR.Fragmentation of monoclonal antibodies.mAbs 2011；3:253-63)。结果，HMW和LMW物质都被认为是关键的质量属性，所述属性在药物开发过程中被常规地监测并且在制造过程中作为经纯化的药用物质的释放试验的一部分。
传统上，通过多种正交分析方法来表征mAb产品的分子量异质性(Michels DA,Parker M,Salas-Solano O.Electrophoresis 2012；33:815-26)。评估mAb产品纯度的最常用技术之一是在非还原条件下进行的SDS-PAGE。在分析过程中，可以常规地观察和定量对应于LMW物质的次要带，关于抗体，包括H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)、HC(1条重链)和LC(1条轻链)物质(Liu H,Gaza-Bulseco G,Chumsae C,Newby-Kew A.Biotechnology Letters 2007；29:1611-22)。
也可以观察蛋白水解片段。通过Edman降解的N-端测序、凝胶内胰蛋白酶消化、随后的质谱分析以及使用抗-Fc和抗-轻链抗体的蛋白质印迹分析，可以支持每个次要带的提议身份。但是，从这些方法得到的任何提议结构都不能在完整蛋白水平上得到明确证实。此外，在SDS-PAGE实验中采用的样品制备条件会通过二硫键混乱而产生LMW假象，这可以导致对小量LMW物质的高估(Zhu ZC,等人.Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,83:89-95(2013))。
近年来，毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)已作为SDS-PAGE的现代等同物出现，提供出色的重现性、灵敏度和处理量(Rustandi RR,Washabaugh MW,WangY.Electrophoresis,29:3612-20(2013)；Lacher NA,等人，Journal of SeparationScience,33:218-27(2010)；Hunt G,等人，Journal of Chromatography A 744:295-301(1996))。在mAb产品的CE-SDS分析过程中，可以常规地观察具有比完整抗体更短的迁移时间的次要峰(LMW形式)。与SDS-PAGE分析不同，这些LMW杂质无法提取或进行进一步分析。结果，经常仅基于经验知识提出在CE-SDS方法中观察到的LMW杂质的身份。
作为最可靠的鉴定技术之一，现代质谱仪对完整mAb蛋白的准确质量测量已在生物制药行业中变得日益普及(Kaltashov IA,等人,Journal of the American Societyfor Mass Spectrometry,21:323-37(2010)；Zhang H,Cui W,Gross ML.FEBS Letters,588:308-17(2014))。具体地，多种“联用色谱法-质谱法”方法已证实能够检测mAb产品中的低丰度杂质并提供无法通过SDS-PAGE或CE-SDS方法实现的高度详细的分析(Le JC,Bondarenko PV.Journal of the American Society for Mass Spectrometry；16:307-11(2015)；Haberger M,等人.mAbs 8:331-9(2016))。例如，与质谱法偶联的反相色谱法(RPLC)可以用于检测在mAb药物产品中存在的游离轻链和相关的翻译后修饰(例如半胱氨酰化和谷胱甘肽化)。但是，与SDS-PAGE和CE-SDS方法相比，RPLC经常缺乏足够的分辨率来分离LMW物质，因此无法阐明整个LMW概况。例如，由于其低丰度且与主要完整抗体难以拆分，尚未报道通过基于RPLC的完整质量分析来鉴别mAb药物产品中的H2L物质。
另一种有前途的用于表征mAb产品相关杂质的基于MS的技术是天然电喷射电离质谱法(天然ESI-MS)，其当与尺寸排阻色谱法(SEC)偶联时是特别有用的(Haberger M等人，mAbs；8:331-339(2016))。但是，由于方法之间使用的明显不同的实验条件，在天然SEC-MS分析中鉴定出的LMW物质经常与通过SDS-PAGE或CE-SDS鉴定出的那些LMW物质不同。具体而言，SDS-PAGE和CE-SDS所需的样品制备经常从蛋白变性开始，其中在HC-LC对的N-端区域与HC-HC对的C-端区域之间的非共价相互作用被破坏。结果，如果链间二硫键被破坏，则LMW杂质诸如H2L、半抗体和游离轻链物质能够从mAb分子解离。
相比之下，天然SEC-MS在接近天然条件下分析mAb样品，允许保留强的非共价链间相互作用并允许维持mAb分子的四链结构，即使链间二硫键被破坏。尽管SEC柱化学的进展已经使得使用变性缓冲液(例如30％乙腈,0.1％FA和0.1％TFA)并直接偶联至在线质谱法分析成为可能，所述变性缓冲液通常用在反相色谱法中用于SEC分离(Liu H,Gaza-BulsecoG,Chumsae C.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,20:2258-64(2009)，LC分辨率对于检测许多LMW物质仍然不是最理想的。
本发明的一个目的是提供用于表征蛋白药物杂质的尺寸变体的系统和方法。
本发明的另一个目的是提供具有降低的杂质水平的蛋白药物产品。
本发明的又一个目的是提供生产具有减少的蛋白药物产品杂质的蛋白药物产品的方法。
发明内容
提供了用于表征蛋白药物产品杂质的尺寸和电荷变体的系统和方法。一个实施方案使用与天然质谱法分析偶联的具有水性流动相的尺寸排阻色谱法(SEC)以检测和表征蛋白药物产品杂质的尺寸变体。另一个实施方案使用离子交换色谱法(IEX)，优选与天然质谱法分析偶联的具有水性流动相的强阳离子交换色谱法以表征蛋白药物产品杂质。在一个实施方案中，在从蛋白药物产品(例如抗体药物产品)除去N-连接的聚糖以后，通过分子量物质的尺寸和/或电荷来确定尺寸或电荷变体杂质分别从SEC或IEX柱的洗脱。
所公开的系统和方法可以用于表征尺寸变体、电荷变体、抗体-抗原结合、翻译后修饰(PTM)表征、部分地还原的和烷基化的mAb的表征、共配制的药物的二聚体表征、IgG4Fab交换表征和使用电荷减少的高异质样品表征。促成酸性变体的可以检测和鉴别的示例性PTM包括但不限于在Fab区域处的糖化、葡糖醛酸基化、羧甲基化、唾液酸化、非一致糖基化。可以检测和鉴定出有助于碱性变体的PTM包括但不限于琥珀酰亚胺形成、N-端谷氨酰胺(未转化成焦谷氨酸盐)、C-端Lys和非-/部分-糖基化的物质。
用公开的系统可以检测和表征的示例性低分子量(LMW)蛋白药物产品杂质包括但不限于前体、降解产物、截短的物质、蛋白水解片段(包括Fab)、配体或受体片段或重链片段、游离轻链、半抗体、H2L、H2、HL、HC或它们的组合。
示例性的高分子量(HMW)杂质包括但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。
示例性的中间HMW包括但不限于具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物质)、单体+Fab片段复合物、Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc。
公开的SEC-天然MS和IEX-天然MS系统和方法提供了详细的变体蛋白药物产品鉴定信息。用公开的系统和方法得到的可靠鉴定和详细结构信息对于蛋白药物产品中杂质的深入表征非常有价值，所述深入表征经常是后期分子开发所需要的。此外，由于所公开的系统和方法使用比SDS-PAGE或CE-SDS更温和的样品制备，因此不太可能产生假象。所公开的系统和方法可以用作半定量分析以比较样品之间的杂质特性或简单地定性应用。
一个实施方案提供了一种含有蛋白药物和赋形剂的蛋白药物产品，其中所述蛋白药物产品包含0.05至30.0％w/w的低分子量、高分子量、中间高分子量蛋白药物杂质或它们的组合。
一个优选实施方案提供了一种含有蛋白药物和赋形剂的蛋白药物产品，其中所述蛋白药物产品包含0.05至30.0％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
所述蛋白药物产品可以是抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。在其它实施方案中，所述药物产品含有1至25％、1至15％、1至10％或1至5％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
另一个实施方案提供了一种用于表征蛋白药物产品杂质的尺寸或电荷变体的方法，其包括以下步骤：将蛋白药物产品样品去糖基化,通过SEC或IEX色谱法分离所述蛋白药物产品样品的蛋白组分，和通过天然质谱法分析分离的蛋白组分以表征所述蛋白药物产品样品中蛋白药物产品杂质的尺寸或电荷变体。所述方法进一步提供了任选的还原步骤。所述蛋白药物产品样品可以取自补料分批培养物。如上面所指出的，所述蛋白药物产品可以是抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
另一个实施方案提供了一种生产抗体的方法，其包括以下步骤：在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞，从所述细胞培养物得到样品，根据上述方法表征和定量所述样品中的蛋白药物杂质的尺寸或电荷变体，和改变细胞培养物的一种或多种培养条件以减少在所述抗体的细胞培养过程中产生的所表征的低分子蛋白药物杂质的量。在某些实施方案中，在细胞培养过程中以任何间隔采集所述样品。在其它实施方案中，在生产培养以后、蛋白收获以后或纯化以后采集所述样品。为了减少低分子量蛋白药物杂质的量而改变的细胞培养物的一种或多种条件可以选自温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或它们的组合。所述细胞可以是真核的或原核的。所述细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1,DXB-11CHO,Veggie-CHO),COS细胞(例如COS-7),视网膜细胞,Vero细胞,CV1细胞,肾细胞(例如HEK293,293EBNA,MSR 293,MDCK,HaK,BHK21),HeLa细胞,HepG2细胞,WI38细胞,MRC 5细胞,Colo25细胞,HB 8065细胞,HL-60细胞,淋巴细胞细胞，例如自体T细胞,Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞),A431(表皮)细胞,U937细胞,3T3细胞,L细胞,C127细胞,SP2/0细胞,NS-0细胞,MMT细胞,干细胞,肿瘤细胞,和从前述细胞中的任一种衍生出的细胞系。在一个实施方案中，所述细胞是杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)细胞。另一个实施方案提供了通过本文所述的方法生产的抗体。
另一个实施方案提供了一种用于表征药物杂质的尺寸和电荷变体的系统。所述系统包括连接至水性流动相且与天然质谱法系统流体连通的SEC或IEX色谱法系统。
附图说明
图1A和1B是mAb-1药用物质样品的在线天然SEC-MS分离的色谱图。图1A是紫外曲线，图1B-1E分别是单体、二聚体、三聚体和四聚体的质谱曲线。
图2A是来自mAb-1药用物质样品的Fab2同源二聚体的质谱曲线。图2B是来自mAb-1药用物质样品的Fab2-Fc异源二聚体的质谱曲线。图2C是来自mAb-1药用物质样品的Fc同源二聚体的质谱曲线。图2D是mAb-1的分离的总离子色谱图。
图3A显示了mAb-2药用物质样品的在线天然SEC-MS分离的总离子色谱图。图3B显示了来自中心在26分钟的级分的低分子量的质谱曲线。图3C显示了来自中心在31分钟的级分的低分子量的质谱曲线。
图4是来自富集的LMW样品(去糖基化)的mAb-1药用物质的在线天然SEC-MS的总离子流色谱图。
图5A是mAb-3药用物质的在线天然SEC-MS的总离子流色谱图，其显示了二聚体、中间HMW和单体杂质的检测。图5B是显示单体杂质的检测的总离子流色谱图。图5C-5E是二聚体、中间HMW和单体杂质的质谱曲线。
图6是在mAb-3中的中间HMW物质的解卷积质谱图，其显示了H2L3的预测质量为167,850Da。
图7A显示了mAb-4的提取离子色谱图，其显示了电荷变体杂质的检测。图7B显示了指定的电荷变体杂质的质谱曲线。
图8是mAb-4的总离子色谱图，其显示了通过天然SCX-MS在子结构域水平对电荷变体的表征。
图9A显示了通过天然SCX-MS表征的Fab2片段的提取离子色谱图。图9B显示了电荷变体的质谱曲线。
具体实施方式
I.定义
术语“一个”、“一种”、“所述”和类似所指物在描述本申请要求保护的发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)的应用应当解释为覆盖单数和复数，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。
除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。
术语“约”的应用意图描述在大约±10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，所述值的值可以是在大约±5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，所述值的值可以是在大约±2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，所述值的值可以是在大约±1％的范围内高于或低于所述值。前述范围意在通过上下文明确，并且不暗示进一步的限制。可以以任意合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意图更好地阐释本发明，且不构成对本发明范围的限制，除非另有声明。在说明书中的语言不应解释为，指示任何没有声明的要素是实践本发明所必需的。
术语“低分子量(LMW)蛋白药物杂质”包括但不限于前体、降解产物、截短的物质、蛋白水解片段，包括Fab片段、Fc或重链片段、配体或受体片段、H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)、HC(1条重链)和LC(1条轻链)物质。LMW蛋白药物杂质可以是蛋白产物的不完整形式的任何变体，诸如多聚体蛋白的一种或多种组分。蛋白药物杂质、药物杂质或产品杂质是在本说明书中可以互换使用的术语。LMW药物或产品杂质通常被认为是其性能(诸如活性、效力和安全性)可能与所需药物产品的性能不同的分子变体。
在细胞培养系统中生产蛋白药物产品期间，蛋白产物的降解是有问题的。例如，由于蛋白酶在细胞培养基中的释放，可能发生蛋白产物的蛋白酶解。培养基添加剂，例如为了抑制金属蛋白酶而添加的可溶性铁源或丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂，已经在细胞培养中补充以防止降解(Clincke,M.-F.,等人,BMC Proc.2011,5,P115)。由于细胞培养物中的羧基肽酶，C-端片段可能在生产过程中被切割(Dick,LW等人,Biotechnol Bioeng 2008；100:1132-43)。
术语“高分子量(HMW)蛋白药物杂质”包括但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。HMW物质可以分为两组：1)具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物质)和2)单体+Fab片段复合物。另外，在用IdeS酶消化处理后，形成不同的二聚化片段(Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc)。
“蛋白”表示包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸残基的分子。蛋白包括多肽和肽，还可以包括修饰诸如糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白可能具有科学或商业意义，包括基于蛋白的药物，并且蛋白尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。使用众所周知的细胞培养方法由不同类型的重组细胞产生蛋白，并且在它可以作为附加体存在或整合到细胞基因组中的情况下，通常通过基因工程技术(例如，编码嵌合蛋白的序列或密码子优化的序列，无内含子的序列，等)引入细胞中。
“抗体”表示由通过二硫键相互连接的四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。每个重链具有一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链具有一个轻链可变区和一个轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。所述VH和VL区域可以进一步细分成被称作互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括对任何同种型或亚类的糖基化和未糖基化免疫球蛋白的提及。术语“抗体”包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的抗体分子，例如从转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括可以结合超过一种不同表位的异四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体通常在美国专利申请公开号2010/0331527中描述，其通过引用并入本申请中。
“Fc融合蛋白”包含两种或更多种蛋白的一部分或全部，其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分，否则它们在自然界中不会一起发现。例如，Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88:10535,1991；Byrn等人,Nature344:677,1990；和Hollenbaugh等人,“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”,见CurrentProtocols in Immunology,增刊4,第10.19.1至10.19.11页,1992已经描述了融合蛋白的制备，所述融合蛋白包含与抗体衍生多肽的各个部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个细胞外结构域，其在某些实施方案中包含铰链区，随后是免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，所述Fc-融合蛋白包含结合至一个或多个配体的两个或更多个不同的受体链。例如，Fc-融合蛋白是陷阱，例如IL-1陷阱或VEGF陷阱。
“细胞培养”表示细胞在容器诸如烧瓶或生物反应器中的繁殖或增殖，并且包括但不限于补料分批培养、连续培养、灌注培养等。
II.蛋白药物产品
A.目标蛋白
蛋白药物产品可以是适合在原核或真核细胞中表达的任何目标蛋白，并且可以用在经工程改造的宿主细胞中。例如，目标蛋白包括但不限于抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc-融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的细胞外结构域或其片段。目标蛋白可以是由单个亚基组成的简单多肽，或包含两个或更多个亚基的复杂多亚基蛋白。目标蛋白可以是生物药物产品、食品添加剂或防腐剂，或任何符合纯化和质量标准的蛋白产物。
在某些实施方案中，所述蛋白产物(目标蛋白)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、结合抗原的抗体片段、单链抗体、双体、三抗体或四抗体、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG4抗体。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在某些实施方案中，所述抗体选自抗-程序性细胞死亡1抗体(例如在美国专利申请公开号US2015/0203579A1中描述的抗-PD1抗体)、抗-程序性细胞死亡配体-1(例如在美国专利申请公开号US2015/0203580A1中描述的抗-PD-L1抗体)、抗-Dll4抗体、抗-促血管生成素-2抗体(例如在美国专利号9,402,898中描述的抗-ANG2抗体)、抗-促血管生成素-样3抗体(例如在美国专利号9,018,356中描述的抗-AP3抗体)、抗-血小板衍生的生长因子受体抗体(例如在美国专利号9,265,827中描述的抗-PDGFR抗体)、抗-Erb3抗体、抗-催乳素受体抗体(例如在美国专利号9,302,015中描述的抗-PRLR抗体)、抗-补体5抗体(例如在美国专利申请公开号US2015/0313194A1中描述的抗-C5抗体)、抗-TNF抗体、抗-表皮生长因子受体抗体(例如在美国专利号9,132,192中描述的抗-EGFR抗体或在美国专利申请公开号US2015/0259423A1中描述的抗-EGFRvIII抗体)、抗-前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如在美国专利号8,062,640或美国专利申请公开号US2014/0044730A1中描述的抗-PCSK9抗体)、抗-生长和分化因子-8抗体(例如在美国专利号8,871,209或9,260,515中描述的抗-GDF8抗体，也被称作抗-肌肉生长抑制素抗体)、抗-胰高血糖素受体(例如在美国专利申请公开号US2015/0337045A1或US2016/0075778A1中描述的抗-GCGR抗体)、抗-VEGF抗体、抗-IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如在美国专利申请公开号US2014/0271681A1或美国专利号8,735,095或8,945,559中描述的抗-IL4R抗体)、抗-白介素6受体抗体(例如在美国专利号7,582,298、8,043,617或9,173,880中描述的抗-IL6R抗体)、抗-IL1抗体、抗-IL2抗体、抗-IL3抗体、抗-IL4抗体、抗-IL5抗体、抗-IL6抗体、抗-IL7抗体、抗-白介素33(例如在美国专利申请公开号US2014/0271658A1或US2014/0271642A1中描述的抗-IL33抗体)、抗-呼吸道合胞体病毒抗体(例如在美国专利申请公开号US2014/0271653A1中描述的抗-RSV抗体)、抗-分化簇3(例如在美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1和美国申请号62/222,605中描述的抗-CD3抗体)、抗-分化簇20(例如在美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1和美国专利号7,879,984中描述的抗-CD20抗体)、抗-CD19抗体、抗-CD28抗体、抗-分化簇-48(例如在美国专利号9,228,014中描述的抗-CD48抗体)、抗-Fel d1抗体(例如在美国专利号9,079,948中描述的)、抗-中东呼吸综合征病毒(例如在美国专利申请公开号US2015/0337029A1中描述的抗-聚体抗体)、抗-埃博拉病毒抗体(例如在美国专利申请公开号US2016/0215040中描述的)、抗-Zika病毒抗体、抗-淋巴细胞活化基因3抗体(例如抗-LAG3抗体或抗-CD223抗体)、抗-神经生长因子抗体(例如在美国专利申请公开号US2016/0017029和美国专利号8,309,088和9,353,176中描述的抗-NGF抗体)和抗-激活素A抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体选自：抗-CD3x抗-CD20双特异性抗体(在美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1中描述的)、抗-CD3x抗-粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗-CD3x抗-Muc16双特异性抗体)和抗-CD3x抗-前列腺-特异性的膜抗原双特异性抗体(例如，抗-CD3x抗-PSMA双特异性抗体)。在某些实施方案中，所述目标蛋白选自：阿昔单抗、阿达木单抗、阿达木单抗-atto、曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑珠单抗、alirocumab、atezolizumab、avelumab、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝那利珠单抗、贝伐珠单抗、bezlotoxumab、兰妥莫单抗、brentuximab vedotin、brodalumab、卡那奴单抗、卡罗单抗喷地肽、培化舍珠单抗、cemiplimab、西妥昔单抗、地舒单抗、dinutuximab、dupilumab、durvalumab、依库珠单抗、依洛珠单抗、emicizumab-kxwh、emtansinealirocumab、evinacumab、evolocumab、fasinumab、戈利木单抗、guselkumab、替伊莫单抗、idarucizumab、英夫利昔单抗、英夫利昔单抗-abda、英夫利昔单抗-dyyb、伊匹木单抗、ixekizumab、美泊珠单抗、奈昔木单抗、nesvacumab、nivolumab、obiltoxaximab、阿托珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、olaratumab、奥马珠单抗、帕木单抗、pembrolizumab、培妥珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、雷昔库单抗、瑞利珠单抗、rinucumab、利妥昔单抗、sarilumab、secukinumab、司妥昔单抗、托珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、trevogrumab、乌司奴单抗和维多珠单抗。
在某些实施方案中，所述目标蛋白是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如，Fc-融合蛋白)。在某些实施方案中，Fc-融合蛋白是受体Fc-融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个细胞外结构域。在某些实施方案中，所述Fc部分包含铰链区，其后面是IgG的CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，所述受体Fc-融合蛋白含有与单个配体或多个配体结合的两个或多个不同受体链。例如，Fc-融合蛋白是陷阱蛋白，例如IL-1陷阱(例如rilonacept，其含有与Il-1R1细胞外区域融合的IL-1RAcP配体结合区域，而所述Il-1R1细胞外区域与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号6,927,004，其通过引用整体并入本文)，或VEGF陷阱(例如，阿柏西普或阿柏西普，其包含与VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，而所述VEGF受体Flk1的Ig结构域3与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号7,087,411和7,279,159)。在其它实施方案中，Fc-融合蛋白是ScFv-Fc-融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域，诸如可变重链片段和可变轻链片段。
B.细胞培养
可以在“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”中生产目标蛋白，这表示分批培养，其中首先将细胞和培养基供应到培养容器，然后在培养过程中向培养物中以不连续增量缓慢地添加其它培养营养物，在培养终止之前有或没有周期性的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中定期除去整个培养物(其可能包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，而在分批培养中在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都提供给培养容器。补料分批培养可能不同于“灌注培养”，只要在标准补料分批过程中未从培养容器中除去上清液，而在灌注培养中，通过例如过滤将细胞保留在培养物中，并连续地或间歇地将培养基引入培养容器和从培养容器中除去。但是，考虑了在补料分批细胞培养过程中出于试验目的而取出样品。补料分批过程继续直到确定达到最大工作容积和/或蛋白产量并随后收获为止。
可以在连续细胞培养中生产目标蛋白。短语“连续细胞培养”涉及通常在特定生长阶段用于连续培养细胞的技术。例如，如果需要恒定的细胞供应，或者需要生产特定的目标蛋白，则细胞培养可能需要维持在特定的生长阶段。因此，必须连续地监测和调节条件以将细胞维持在该特定阶段。
术语“细胞培养基”和“培养基”表示用于培养哺乳动物细胞的营养物溶液，其通常提供必要的营养物以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源，必需氨基酸(例如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可以含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解物)，它们提供支持细胞生长的原料。培养基可能含有酵母衍生的提取物或大豆提取物，而不是动物衍生的提取物。化学成分确定的培养基表示其中所有化学组分都已知的(即，具有已知的化学结构)的细胞培养基。化学成分确定的培养基完全不含动物衍生的组分，诸如血清-或动物-衍生的蛋白胨。在一个实施方案中，所述培养基是化学成分确定的培养基。
所述溶液还可以含有在最小速率以上增强生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。可以将溶液配制成对于所培养的特定细胞的存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。
“细胞系”表示通过细胞的连续传代或传代培养从特定谱系衍生出的一个或多个细胞。术语“细胞”与“细胞群体”互换使用。
术语“细胞”包括适合用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞，诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，例如，杂交瘤或四源杂交瘤。在某些实施方案中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其它实施方案中，所述细胞选自下述细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB8065、HL-60、淋巴细胞，例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)、A431(表皮)、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和从前述细胞衍生出的细胞系。在某些实施方案中，所述细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如
Figure BDA0002565562590000131
细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在其它实施方案中，所述细胞是CHO K1细胞。
III.用于表征蛋白药物杂质的变体的系统
多亚基治疗性蛋白，尤其是基于单克隆抗体(mAb)的治疗剂，由于其复杂的多链结构以及适应多种酶促和化学翻译后修饰的倾向，在大小上固有地是异质的。尽管可以通过多种生物物理方法容易地定量在蛋白药物产品内的尺寸变体的水平，但是那些产品相关杂质的明确鉴定尤其具有挑战性。
尽管mAb具有由两条二硫键连接的重链组成的保守共价异四聚体结构(每条重链通过二硫键与轻链共价连接)，但是这些蛋白经常含有低水平的产品相关杂质，即使在大量纯化步骤以后。低分子量(LMW)物质(例如，Fab片段和没有Fab臂的单体)和高分子量(HMW)物质(例如，mAb三聚体和mAb二聚体)都是促成mAb产品的尺寸异质性的产品相关杂质的例子。由蛋白聚集导致的治疗性mAb药物产品中HMW物质的形成可能损害药物效力和安全性(例如，引起不希望的免疫原性应答)(Rosenberg AS.The AAPS journal,8:E501-7(2006)；Moussa EM,等人Journal of Pharmaceutical Science,105:417-30(2016；)。任何治疗性蛋白的LMW物质都可能源于生产过程中的宿主细胞蛋白酶活性。LMW物质经常具有与抗体的单体形式相比低的活性或实质上降低的活性，同时会暴露新表位，所述表位可以导致免疫原性或可能影响体内药代动力学特性(Vlasak J,Ionescu R.mAbs,3:253-63(2011))。结果，HMW和LMW物质都被认为是关键的质量属性，所述属性在药物开发过程中被常规地监测并且在制造过程中作为经纯化的药用物质的释放试验的一部分。
传统上，通过多种正交分析方法来表征mAb产品的分子量异质性(Michels DA,Parker M,Salas-Solano O.Electrophoresis,33:815-26(2012))。评估mAb产品纯度的最常用技术之一是在非还原条件下进行的SDS-PAGE。在分析过程中，可以常规地观察和定量对应于LMW物质的次要带，关于抗体，包括H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)、HC(1条重链)和LC(1条轻链)物质(Liu H,Gaza-Bulseco G,Chumsae C,Newby-Kew A.Biotechnology Letters,29:1611-22(2007))。
也可以观察蛋白水解片段。通过Edman降解的N-端测序、凝胶内胰蛋白酶消化、随后的质谱分析以及使用抗-Fc和抗-轻链抗体的蛋白质印迹分析，可以支持每个次要带的提议身份。但是，从这些方法得到的任何提议结构都不能在完整蛋白水平上得到明确证实。此外，在SDS-PAGE实验中采用的样品制备条件会通过二硫键混乱而产生LMW假象，这可以导致对小量LMW物质的高估(Zhu ZC,等人.Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,83:89-95(2013))。
近年来，毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)已作为SDS-PAGE的现代等同物出现，提供出色的重现性、灵敏度和处理量(Rustandi RR,Washabaugh MW,WangY.Electrophoresis,29:3612-20(2008)；Lacher NA,等人.Journal of SeparationScience,33:218-27(2010)；和Hunt G,Moorhouse KG,Chen AB.Journal ofChromatography A,744:295-301(1996))。在mAb产品的CE-SDS分析过程中，可以常规地观察具有比完整抗体更短的迁移时间的次要峰(LMW形式)。与SDS-PAGE分析不同，这些LMW杂质无法提取或进行进一步分析。结果，经常仅基于经验知识提出在CE-SDS方法中观察到的LMW杂质的身份。
作为最可靠的鉴定技术之一，现代质谱仪对完整mAb蛋白的准确质量测量已在生物制药行业中日益普及(Kaltashov IA,等人,Journal of the American Society forMass Spectrometry,21:323-37(2010))；Zhang H,Cui W,Gross ML.FEBS Letters,588:308-17(2014))。具体地，多种“联用色谱法-质谱法”方法已证实能够检测mAb产品中的低丰度杂质并提供无法通过SDS-PAGE或CE-SDS方法实现的高度详细的分析(Le JC,BondarenkoPV.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,16:307-11(2005)；Haberger M,等人.mAbs；8:331-9(2016))。例如，与质谱法偶联的反相色谱法(RPLC)可以用于检测在mAb药物产品中存在的游离轻链和相关的翻译后修饰(例如半胱氨酰化和谷胱甘肽化)。但是，与SDS-PAGE和CE-SDS方法相比，RPLC经常缺乏足够的分辨率来分离LMW物质，因此无法阐明整个LMW概况。例如，由于其低丰度且与主要完整抗体难以拆分，尚未报道通过基于RPLC的完整质量分析来鉴别mAb药物产品中的H2L物质。
另一种有前途的用于表征mAb产品相关杂质的基于MS的技术是天然电喷射电离质谱法(天然ESI-MS)，其当与尺寸排阻色谱法(SEC)偶联时是特别有用的(Haberger M,等人.mAbs；8:331-9(2016))。但是，由于方法之间使用的明显不同的实验条件，在天然SEC-MS分析中鉴定出的LMW物质经常与通过SDS-PAGE或CE-SDS鉴定出的那些LMW物质不同。具体而言，SDS-PAGE和CE-SDS所需的样品制备经常从蛋白变性开始，其中在HC-LC对的N-端区域与HC-HC对的C-端区域之间的非共价相互作用被破坏。结果，如果链间二硫键被破坏，则LMW杂质诸如H2L、半抗体和游离轻链物质能够从mAb分子解离。
相比之下，天然SEC-MS在接近天然条件下分析mAb样品，允许保留强的非共价链间相互作用并允许维持mAb分子的四链结构，即使链间二硫键被破坏。尽管SEC柱化学的进展已经使得使用变性缓冲液(例如30％乙腈,0.1％FA和0.1％TFA)并直接偶联至在线质谱法分析成为可能，所述变性缓冲液通常用在反相色谱法中用于SEC分离(Liu H,Gaza-BulsecoG,Chumsae C.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,20:2258-64(2009))，LC分辨率对于检测许多LMW物质仍然不是最理想的。
为了应对这些挑战，提供了一种平台，该平台将高效SEC和IEX分离与超灵敏的天然Nano-ESI质谱法检测偶联以对治疗性蛋白药物产品进行深入和快速的表征。
A.用于表征蛋白药物产品中的尺寸和电荷变体的系统
在一个实施方案中，所述系统包括与天然质谱法系统流体连通的尺寸排阻色谱法(SEC)柱或离子交换色谱法(IEX)系统。所述柱适合与去糖基化蛋白一起使用。在一个实施方案中，所述SEC柱是Waters
Figure BDA0002565562590000151
SEC柱(4.6×300mm)。在一个实施方案中，所述IEX柱是强阳离子交换柱。天然质谱法系统可以是天然电喷射电离(ESI)质谱法系统。在一个实施方案中，所述质谱法系统是Thermo Exactive EMR质谱仪。所述质谱法系统还可以含有紫外线检测器。SEC和IEX柱通过分析型分流器与质谱仪流体连通，所述分析型分流器可以调节向质谱仪的流速。
在一个实施方案中，所述流动相是水性流动相。一种代表性的水性流动相含有140mM醋酸钠和10mM碳酸氢铵。通常在215和280nm记录紫外迹线。
蛋白药物样品通常为5-10ug/ul。注射浓度通常为50-100ug。
在一个实施方案中，使用0.2mL/分钟的等度流24分钟在室温实现尺寸排阻分离。
在一个实施方案中，通过刚好在发射器之前的液体连接三通施加用于电喷射的电压。
B.表征蛋白药物产品杂质的方法
所公开的系统和方法可以用于表征尺寸变体、电荷变体、抗体-抗原结合、PTM表征、部分地还原的和烷基化的mAb的表征、共配制的药物的二聚体表征、IgG4Fab交换表征以及使用电荷减少的高异质样品表征。可以检测和鉴定出有助于酸性变体的示例性翻译后修饰(PTM)包括但不限于在Fab区域处的糖化、葡糖醛酸基化、羧甲基化、唾液酸化、非一致糖基化。可以检测和鉴定出有助于碱性变体的PTM包括但不限于琥珀酰亚胺形成、N-端谷氨酰胺(未转化成焦谷氨酸盐)、C-端Lys和非-/部分-糖基化的物质。
1.尺寸变体
一个实施方案提供了一种用于表征蛋白药物产品杂质的尺寸变体的方法，其包括以下步骤：任选地将蛋白药物产品样品去糖基化，使用水性流动相通过天然SEC色谱法分离蛋白药物产品样品的蛋白组分，和通过质谱法分析分离的蛋白组分以表征蛋白药物产品样品中的蛋白药物产品杂质的高分子量物质、低分子量物质和中间高分子量物质。在一个实施方案中，所述流动相包括乙酸铵和碳酸氢铵。
在一个实施方案中，从补料分批细胞培养物、连续细胞培养物或灌注细胞培养物取出或纯化所述蛋白药物产品样品。
示例性的蛋白药物产品包括但不限于抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
示例性的低分子量蛋白药物产品杂质包括但不限于前体、降解产物、截短的物质、蛋白水解片段，包括Fab、配体或受体片段或重链片段、游离轻链、半抗体、H2L、H2、HL、HC或它们的组合。
示例性的HMW杂质包括但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。
示例性的中间HMW包括但不限于具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物质)、单体+Fab片段复合物、Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc。
2.电荷变体表征
一个实施方案提供了一种用于表征蛋白药物产品杂质的电荷变体的方法，其包括以下步骤：任选地将蛋白药物产品样品去糖基化,任选地用来自酿脓链球菌(Streptocoocus pyogenes)的IdeS处理所述样品，使用水性流动相通过天然强阳离子交换色谱法分离蛋白药物产品样品的蛋白组分，和通过质谱法分析分离的蛋白组分以表征蛋白药物产品样品中的蛋白药物产品杂质的电荷变体物质。在一个实施方案中，所述流动相包括乙酸铵和碳酸氢铵。
在一个实施方案中，从补料分批细胞培养物、连续细胞培养物或灌注细胞培养物取出或纯化所述蛋白药物产品样品。
示例性的电荷变体包括但不限于在Fab区域处的糖化、葡糖醛酸基化、羧甲基化、唾液酸化、非一致糖基化。可以检测和鉴定出有助于碱性变体的PTM包括但不限于琥珀酰亚胺形成、N-端谷氨酰胺(未转化成焦谷氨酸盐)、C-端Lys和非-/部分-糖基化的物质。
C.生产高纯度蛋白药物产品的方法
一个实施方案提供了一种生产抗体的方法，其包括以下步骤：例如在补料分批培养物中培养生产所述抗体的细胞，从所述细胞培养物得到样品，使用本文中公开的系统和方法表征和定量所述样品中的低分子量、高分子量和中间分子量杂质，和改变细胞培养物的一种或多种培养条件以减少在所述抗体的细胞培养过程中产生的所表征的低分子蛋白药物杂质的量。通常，将所述条件改变成具有在0.05％至30.0％、优选地0.05％至15％、0.05％至10％、0.05％至5％或0.05％至2％(w/w)的范围内的蛋白药物杂质。
为了减少低分子量蛋白药物杂质的量而改变的细胞培养物的一种或多种条件选自温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或它们的组合。
在一个实施方案中，所述生产抗体的细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在其它实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞。
另一个实施方案提供了根据本文提供的方法生产的抗体，其具有1至5％、5至10％、10至15％、15至20％的蛋白药物杂质。
实施例
实施例1：mAb-1药用物质样品的HILIC分离
方法
以0.2mL/分钟的流速在用基于乙酸铵和碳酸氢铵的流动相预平衡过的Waters
Figure BDA0002565562590000181
SEC柱(4.6×300mm)上进行SEC分离。使用基于乙酸铵的缓冲液系统以0.4mL/分钟的流速在强阳离子交换柱上进行IEX分离。在所述柱后连接一个分析型分流器，以在通过配有Nanospray FlexTM离子源的Thermo Exactive EMR质谱仪分析之前将流速降至约1μL/分钟。取决于分析物的尺寸，调节捕集气体压强、S-透镜RF水平、源内片段化和HCD碰撞能量以实现最佳溶解。
因此，引入了一种新技术平台，其将高效SEC和IEX分离与超灵敏的天然Nano-ESI质谱法检测偶联以允许对治疗性mAb进行深入和快速的表征。
结果
使用重组IgG1mAb(mAb-1)药用物质样品作为模型分子。利用SEC-MS，可以将mAb产品中低水平的尺寸变体与主要单体物质有效地分离，并进行灵敏的MS检测。通过该方法可以常规地观察和监测以<1％相对丰度存在的较高分子量物质(例如，mAb三聚体和mAb二聚体)和较低分子量物质(例如Fab片段和没有Fab臂的单体)。具体地，在许多mAb产品中检测到有趣的HMW物质类别，其在mAb单体和mAb二聚体之间洗脱(称为中间HMW物质)，即使它们通常以极低的水平(<0.1％)存在。通过准确的质量测量，可以确定那些中间HMW物质的身份并将其分成两组：1)具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物质)和2)单体+Fab片段复合物。另外，用IdeS酶消化处理后，通过此方法可以很好地分离和检测不同的二聚化片段(Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc)，从而揭示在子结构域水平的二聚化界面。
利用IEX-MS，可以在完整的mAb水平检测各种有助于电荷变体的PTM。通过数百个mAb样品的分析，发现有助于酸性变体的PTM包括在Fab区域处的糖化、葡糖醛酸基化、羧甲基化、唾液酸化和非一致糖基化；发现有助于碱性变体的PTM包括琥珀酰亚胺形成、N-端谷氨酰胺(未转化成焦谷氨酸盐)、C-端Lys和非-/部分-糖基化的物质。在电荷变体研究(例如，可比性和强迫降解研究)中，这种新方案被证明在阐明电荷变体形式方面非常有力。
尽管在前面的说明书中已经关于其某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是本领域技术人员显而易见，本发明容易受其它实施方案影响，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下可以相当大的改变本文所述的某些细节。
贯穿本公开内容提及的所有出版物通过引用整体并入本文。
本文中引用的所有参考文献都以它们的整体通过引用并入。在不脱离本发明的精神或基本属性的情况下可以以其它具体形式来体现本发明，并且因此，在指示本发明的范围时，应当参考所附权利要求，而不是前述说明书。

Claims (23)

1.一种蛋白药物产品，其包含：
蛋白药物和赋形剂，其中所述蛋白药物产品包含0.05％至30.0％(w/w)的中间高分子量蛋白药物杂质。
2.根据权利要求1所述的蛋白药物产品，其中所述蛋白药物产品选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白药物产品，其中所述中间分子量蛋白药物杂质选自具有额外轻链的单体，包括H2L3和H2L4物质；单体+Fab片段复合物；和它们的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白药物产品，其中所述药物产品包含0.05％至25％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白药物产品，其中所述药物产品包含0.05％至15％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白药物产品，其中所述药物产品包含0.05％至10％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白药物产品，其中所述药物产品包含0.05％至5％w/w的中间高分子量蛋白药物杂质。
8.一种用于表征中间高分子量蛋白药物产品杂质的方法，其包括：
将蛋白药物产品样品去糖基化；
使用水性流动相通过天然尺寸排阻色谱法分离蛋白药物产品样品的蛋白组分；
通过质谱法分析分离的蛋白组分以表征蛋白药物产品样品中的中间高分子量蛋白药物产品杂质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白药物产品样品来自补料分批培养物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述蛋白药物产品选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述中间高分子量蛋白药物产品杂质被表征为选自以下的中间高分子量蛋白药物产品杂质：具有额外轻链的单体，包括H2L3和H2L4物质；单体+Fab片段复合物；和它们的组合。
12.一种生产抗体的方法，其包括：
在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞；
从所述细胞培养物得到样品；
根据权利要求8-11中任一项所述的方法表征和定量所述样品中的中间高分子量杂质，以及
改变细胞培养物的一种或多种培养条件以减少在所述抗体的细胞培养过程中产生的所表征的低分子蛋白药物杂质的量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中为了减少中间高分子量蛋白药物杂质的量而改变的细胞培养物的一种或多种条件选自pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或它们的组合。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞；酵母细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)；COS细胞(例如COS-7)；视网膜细胞；Vero细胞；CV1细胞；肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)；HeLa细胞；HepG2细胞；WI38细胞；MRC 5细胞；Colo25细胞；HB 8065细胞；HL-60细胞；淋巴细胞细胞，例如自体T细胞；Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)；A431(表皮)细胞；U937细胞；3T3细胞；L细胞；C127细胞；SP2/0细胞；NS-0细胞；MMT细胞；干细胞、肿瘤细胞和从前述细胞中的任一种衍生出的细胞系。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述细胞是杂交瘤细胞或四源杂交瘤细胞。
16.通过根据权利要求12至15中任一项所述的方法生产的抗体。
17.根据权利要求16所述的抗体，其包含0.05至30.0％(w/w)的中间高分子量蛋白药物杂质。
18.一种用于表征中间高分子量药物杂质的系统，其包含：
天然尺寸排阻色谱法系统，其包含与含有水性流动相的流动相柱连接的尺寸排阻柱，其中所述尺寸排阻柱与Nano-ESI质谱法系统流体连通。
19.一种用于表征电荷变体药物杂质的方法，其包括：
将蛋白药物产品样品去糖基化；
使用水性流动相通过天然强阳离子排阻色谱法分离蛋白药物产品样品的蛋白组分；
通过Nano-ESI质谱法分析分离的蛋白组分以表征蛋白药物产品样品中的电荷变体蛋白药物产品杂质。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白药物产品样品来自补料分批培养物。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述蛋白药物产品选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述中间高分子量蛋白药物产品杂质被表征为选自以下的中间高分子量蛋白药物产品杂质：具有额外轻链的单体，包括H2L3和H2L4物质；单体+Fab片段复合物；和它们的组合。
23.根据权利要求8-11和19-22中任一项所述的方法，其中所述水性流动相包含乙酸铵和碳酸氢铵。
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