TW202325725A - 用於表徵藥物產品雜質之系統及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於表徵尺寸及電荷變體蛋白質藥物產品雜質之系統及方法。

Description

用於表徵藥物產品雜質之系統及方法
本發明概言之係關於蛋白質分離方法及細胞培養方法。
在過去的二十年裏，單株抗體(mAb)已成功地用於靶向眾多個治療領域(Walsh G., Biopharmaceutical benchmarks 2014, Nature biotechnology 2014; 32:992-1000；Lawrence S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nature biotechnology 2007; 25:380-2)。
抗體之異質性為業內已知。舉例而言，低分子量(LMW)物質及高分子量(HMW)物質皆係導致mAb產品之尺寸異質性之產品相關雜質之實例。因蛋白質聚集引起之在治療性mAb藥物產品內形成HMW物質可潛在地損害藥物功效及安全性。蛋白水解片段亦可引起產品之雜質分佈。
儘管mAb具有由兩條二硫鍵連接之重鏈組成之保守共價異四聚體結構，該等重鏈各自經由二硫鍵共價連接至輕鏈，該等蛋白質甚至在過度純化步驟後通常含有少量產品相關雜質。低分子量(LMW)物質(例如Fab片段及無Fab臂之單體)及高分子量(HMW)物質(例如mAb三聚體及mAb二聚體)皆係引起mAb產品之尺寸異質性之產品相關雜質之實例。因蛋白質聚集引起之在治療性mAb藥物產品內形成HMW物質可潛在地損害藥物功效及安全性(例如，引發不期望之免疫原性反應) (Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The AAPS journal 2006; 8:E501-7；Moussa EM、Panchal JP、Moorthy BS、Blum JS、Joubert MK、Narhi LO等人，Immunogenicity of Therapeutic Protein Aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences 2016; 105:417-30)。任何治療性蛋白質之LMW物質可歸因於在產生期間之宿主細胞蛋白酶活性。LMW物質通常具有相對於抗體之單體形式較低或實質上降低之活性，而暴露新穎表位可產生免疫原性或潛在地影響活體內藥物代謝動力學特性(Vlasak J、Ionescu R. Fragmentation of monoclonal antibodies. mAbs 2011; 3:253-63)。因此， HMW及LMW物質被認為皆係在藥物研發期間以常規方式監測之關鍵品質屬性且被視為在製造期間經純化藥物物質之釋放測試之一部分。
mAb產品之分子量異質性傳統上係藉由多種正交分析方法表徵(Michels DA、Parker M、Salas-Solano O. Electrophoresis2012; 33:815-26)。一種最常用於評估mAb產品純度之技術係在非還原條件下實施之SDS-PAGE。在分析期間，對應於LMW物質之小條帶可以常規方式觀察及量化，就抗體而言，包括H2L (2條重鏈及1條輕鏈)、H2 (2條重鏈)、HL (1條重鏈及1條輕鏈)、HC (1條重鏈)及LC (1條輕鏈)物質(Liu H、Gaza-Bulseco G、Chumsae C、Newby-Kew A. Biotechnology Letters2007; 29:1611-22)。
亦可觀察到蛋白水解片段。所提出每一小條帶之屬性可藉由使用抗Fc及抗輕鏈抗體經由埃德曼降解(Edman degradation)、膠內胰蛋白酶消化、隨後質譜分析及西方墨點(western blot)分析進行N末端測序來支持。然而，源自該等方法之任何所提出結構無法在完整蛋白質層級上得到明確確認。此外，用於SDS-PAGE實驗中之樣品製備條件可經由二硫鍵擾亂產生LMW偽影，此可能會過高估計少量LMW物質(Zhu ZC等人， Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 83:89-95 (2013))。
最近，毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)已作為SDS-PAGE之現代等效物出現，提供優異的再現性、靈敏度及通量(Rustandi RR、Washabaugh MW、Wang Y. Electrophoresis, 29:3612-20 (2013)；Lacher NA等人， Journal of Separation Science, 33:218-27 (2010)；Hunt G等人， Journal of Chromatography A744:295-301 (1996))。在mAb產品之CE-SDS分析期間，可以常規方式觀察到少量遷移時間(LMW形式)短於完整抗體之峰。與SDS-PAGE分析不同，該等LMW雜質無法經提取或經受其他分析。因此，在CE-SDS方法中觀察到之LMW雜質之屬性通常係簡單地基於經驗知識提出。
藉由現代質譜儀對完整mAb蛋白進行精確質量量測作為最可靠之鑑定技術之一，在生物製藥工業中變得愈發流行(Kaltashov IA等人， Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 21:323-37 (2010)；Zhang H、Cui W、Gross ML. FEBS Letters, 588:308-17 (2014))。具體而言，多種「聯用(hyphenated)層析-質譜」方法已展示檢測mAb產品中之低豐度雜質並提供SDS-PAGE或CE-SDS方法無法達成之高度詳細之分析的能力(Le JC、Bondarenko PV. Journal of the American Society for Mass Spectrometry; 16:307-11 (2015)；Haberger M等人， mAb8:331-9 (2016))。舉例而言，可使用偶合至質譜之反相層析(RPLC)來檢測mAb藥物產品中所存在之游離輕鏈及相關轉譯後修飾(例如半胱胺醯化及麩胱甘肽化)。然而，與SDS-PAGE及CE-SDS方法相比，RPLC通常缺少足以分離LMW物質之解析度且因此無法闡明完整LMW概況。舉例而言，基於RPLC之完整質量分析從未報告mAb藥物產品中H2L物質之鑑定，此歸因於其低豐度及與主要完整抗體之較差解析度。
另一種有望用於表徵mAb產品相關雜質之基於MS之技術係天然電噴霧電離質譜(天然ESI-MS)，其在與尺寸排除層析(SEC)偶合時尤其有用(Haberger M等人， mAb; 8:331-339 (2016))。然而，在天然SEC-MS分析中鑑定出之LMW物質通常與藉由SDS-PAGE或CE-SDS鑑定出之彼等不同，此乃因各方法之間使用之實驗條件顯著不同。具體而言，SDS-PAGE及CE-SDS所需之樣品製備通常起始於蛋白質變性，其中HC-LC對之N末端區域與HC-HC對之C末端區域之間的非共價相互作用被破壞。因此，若鏈間二硫鍵斷裂，LMW雜質(諸如H2L、半抗體及游離輕鏈物質)能夠自mAb分子解離。
相比之下，天然SEC-MS在近天然條件下分析mAb樣品，容許保留強非共價鏈間相互作用且允許維持mAb分子之四鏈結構，即使鏈間二硫鍵斷裂。儘管SEC管柱化學法之進步使得可使用變性緩衝液(例如30%乙腈、0.1% FA及0.1% TFA)，該等緩衝液通常用於SEC分離之反相層析且直接偶合至在線質譜分析(Liu H、Gaza-Bulseco G、Chumsae C. Journal of the American Society for Mass Spectrometry,20:2258-64 (2009)，但LC解析度對於檢測許多LMW物質仍非最佳的。
本發明之目標係提供用於表徵蛋白質藥物雜質之尺寸變體之系統及方法。
本發明之另一目標係提供雜質之量減少之蛋白質藥物產品。
本發明之另一目標係提供生產蛋白質藥物產品雜質減少之蛋白質藥物產品之方法。
提供用於表徵尺寸及電荷變體蛋白質藥物產品雜質之系統及方法。一個實施例使用具有水性流動相之尺寸排除層析(SEC)偶合天然質譜分析來檢測及表徵尺寸變體蛋白質藥物產品雜質。另一實施例使用離子交換層析(IEX)、較佳具有水性流動相之強陽離子交換層析偶合天然質譜分析來表徵蛋白質藥物產品雜質。在一個實施例中，在自蛋白質藥物產品(例如抗體藥物產品)移除N-連接之聚醣後，尺寸或電荷變體雜質分別自SEC或IEX管柱之溶析係根據分子量物質之尺寸及/或電荷來判定。
所揭示系統及方法可用於表徵尺寸變體、電荷變體、抗體-抗原結合、轉譯後修飾(PTM)表徵、部分還原及烷基化mAb之表徵、共調配藥物之二聚體表徵、IgG4 Fab交換表徵及使用電荷還原之高度異質樣品表徵。可檢測及鑑定之產生酸性變體之例示性PTM包括(但不限於)醣化、葡萄糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化、Fab區之非共有醣基化。可檢測及鑑定之產生鹼性變體之PTM包括(但不限於)琥珀醯亞胺形成、N末端麩胺醯胺(未轉化成焦麩胺酸鹽)、C末端Lys及非/部分醣基化物質。
可用所揭示系統檢測及表徵之例示性低分子量(LMW)蛋白質藥物產品雜質包括(但不限於)前體、降解產物、截短物質、蛋白水解片段(包括Fab、配體或受體片段或重鏈片段)、游離輕鏈、半抗體、H2L、H2、HL、HC或其組合。
例示性高分子量(HMW)雜質包括(但不限於) mAb三聚體及mAb二聚體。
例示性中等HMW包括(但不限於)具有額外輕鏈之單體(H2L3及H2L4種類)、單體加Fab片段複合物、Fab2-Fab2、Fc-Fc及Fab2-Fc。
所揭示SEC-天然MS及IEX-天然MS系統及方法提供詳細變體蛋白質藥物產品鑑定資訊。使用所揭示系統及方法獲得之可靠的鑑定及詳細結構資訊對於深入表徵蛋白質藥物產品中之雜質非常有價值，此通常為後期分子研發所必需。此外，由於所揭示系統及方法使用比SDS-PAGE或CE-SDS溫和之樣品製備，故不太可能產生偽影。所揭示系統及方法可用作半定量分析來比較樣品之間之雜質概況或簡單地以定性方式應用。
一個實施例提供含有蛋白質藥物及賦形劑之蛋白質藥物產品，其中蛋白質藥物產品包含介於0.05與30.0% 重量/重量之間之低分子量、高分子量、中等高分子量蛋白質藥物雜質或其組合。
較佳實施例提供含有蛋白質藥物及賦形劑之蛋白質藥物產品，其中蛋白質藥物產品包含介於0.05與30.0% 重量/重量之間之中等高分子量蛋白質藥物雜質。
蛋白質藥物產品可為抗體、融合蛋白、重組蛋白或其組合。在其他實施例中，藥物產品含有介於1至25%、1至15%、1至10%或1至5% 重量/重量之間之中等高分子量蛋白質藥物雜質。
另一實施例提供用於表徵尺寸或電荷變體蛋白質藥物產品雜質之方法，其包括以下步驟：使蛋白質藥物產品樣品去醣基化，藉由SEC或IEX層析分離蛋白質藥物產品樣品之蛋白質組分，及藉由天然質譜分析經分離蛋白質組分以表徵蛋白質藥物產品樣品中之尺寸或電荷變體蛋白質藥物產品雜質。該方法進一步提供可選還原步驟。蛋白質藥物產品樣品可取自饋料分批培養物。如上文所述，蛋白質藥物產品可為抗體、融合蛋白、重組蛋白或其組合。
另一實施例提供產生抗體之方法，其包括以下步驟：在細胞培養物中培養產生抗體之細胞，自細胞培養物獲得樣品，根據上文所述之方法表徵及量化樣品中之尺寸或電荷變體蛋白質藥物雜質，及改進細胞培養物之一或多個培養條件以減少在抗體之細胞培養期間產生之經表徵低分子蛋白質藥物雜質之量。在一些實施例中，樣品係在細胞培養期間以任一間隔取出。在其他實施例中，樣品係在產生培養物後、在蛋白質收穫或純化後取出。細胞培養物之經改變以減少低分子量蛋白質藥物雜質之量之一或多個條件可選自由以下組成之群：溫度、pH、細胞密度、胺基酸濃度、滲透壓、生長因子濃度、攪動、氣體分壓、表面活性劑或其組合。細胞可為真核或原核。細胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎細胞(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、淋巴球細胞例如自體T細胞、Jurkat (T淋巴球)或Daudi (B淋巴球)、A431 (表皮)細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞中任一者之細胞系。在一個實施例中，細胞為雜交瘤或四源雜交瘤細胞。另一實施例提供藉由本文所述之方法產生之抗體。
另一實施例提供用於表徵尺寸及電荷變體藥物雜質之系統。該系統包括連接至水性流動相且與天然質譜系統流體連通之SEC或IEX層析系統。
I. 定義
除非本文另外指示或上下文明顯矛盾，否則在闡述本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)使用術語「一(a及an)」、「該」及相似指示物皆應理解為涵蓋單數與複數形式二者。
除非本文另外指示，否則本文中數值範圍之列舉僅意欲作為個別提及落入此範圍內之每一單獨值之速記方法，且每一單獨值係如同在本文個別列舉一般併入本說明書中。
使用術語「約」意欲闡述高於或低於所述值約+/- 10%範圍內之值；在其他實施例中，該等值可在高於或低於所述值約+/- 5%之值範圍內；在其他實施例中，該等值可在高於或低於所述值約+/- 2%之值範圍內；在其他實施例中，該等值可在高於或低於所述值約+/- 1%之值範圍內。前述範圍意欲藉由上下文來闡明，且並不暗示進一步限制。除非本文另外指示或上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適宜順序實施。除非另有主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲更好地說明本發明且並不限制本發明之範圍。本說明書中之語言不應理解為指示為本發明實踐所必需之任何非主張要素。
術語「低分子量(LMW)蛋白質藥物雜質」包括(但不限於)前體、降解產物、截短物質、蛋白水解片段(包括Fab片段、Fc或重鏈片段)、配體或受體片段、H2L (2條重鏈及1條輕鏈)、H2 (2條重鏈)、HL (1條重鏈及1條輕鏈)、HC (1條重鏈)及LC (1條輕鏈)物質。LMW蛋白質藥物雜質可為蛋白質產品之不完整形式之任何變體，諸如多聚體蛋白質之一或多個組分。蛋白質藥物雜質、藥物雜質或產品雜質係在本說明書通篇中可互換使用之術語。LMW藥物或產品雜質通常被視為諸如活性、功效及安全性等特性不同於期望藥物產品之彼等之分子變體。
蛋白質產品之降解在細胞培養系統中生產蛋白質藥物產品期間成問題。舉例而言，蛋白質產品之蛋白水解可因細胞培養基中蛋白酶之釋放而發生。培養基添加劑(諸如經添加以抑制金屬蛋白酶之可溶性鐵源、或絲胺酸及半胱胺酸蛋白酶抑制劑)已被應用在細胞培養中來防止降解(Clincke, M.-F.等人， BMC Proc.2011, 5, P115)。C末端片段在生產期間可能因細胞培養物中之羧基肽酶而裂解(Dick, LW等人， Biotechnol Bioeng2008; 100:1132-43)。
術語「高分子量(HMW)蛋白質藥物雜質」包括(但不限於) mAb三聚體及mAb二聚體。HMW物質可分成兩組：1)具有額外輕鏈之單體(H2L3及H2L4種類)及2)單體加Fab片段複合物。此外，在用IdeS酶消化處理後，形成不同二聚化片段(Fab 2-Fab 2、Fc-Fc及Fab 2-Fc)。
「蛋白質」係指包含兩個或更多個藉由肽鍵彼此連結之胺基酸殘基之分子。蛋白質包括多肽及肽且亦可包括諸如以下之修飾：醣基化、脂質附接、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧酸化、烷基化、羥基化及ADP核糖基化。蛋白質可具有科學或商業價值，包括基於蛋白質之藥物，且蛋白質尤其包括酶、配體、受體、抗體及嵌合或融合蛋白。蛋白質係藉由多種類型之重組細胞使用熟知之細胞培養方法產生且通常藉由遺傳改造技術(諸如編碼嵌合蛋白之序列或密碼子最佳化序列、無內含子序列等)引入細胞中，在其中其可駐留為游離基因體或整合至細胞之基因組中。
「抗體」係指由藉由二硫鍵相互連接之四條多肽鏈(兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L))組成之免疫球蛋白分子。每一重鏈具有重鏈可變區(HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個結構域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個結構域(CL)組成。VH及VL區可進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及較為保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。術語「抗體」包括提及任一同型或子類之醣基化及非醣基化免疫球蛋白二者。術語「抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體分子，諸如自經轉染以表現抗體之宿主細胞分離之抗體。術語抗體亦包括雙特異性抗體，其包括可結合至一種以上之不同表位之異四聚體免疫球蛋白。雙特異性抗體概述於美國專利申請公開案第2010/0331527號中，該公開案以引用方式併入本申請案中。
「Fc融合蛋白」包含兩種或更多種蛋白質之一部分或全部，該等蛋白質中之一者係免疫球蛋白分子之Fc部分，該等Fc融合蛋白在自然界中原本不存在。包含融合至抗體衍生多肽(包括Fc結構域)之不同部分之某些異源多肽的融合蛋白之製備已闡述於例如Ashkenazi等人，Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991；Byrn等人，Nature 344:677, 1990；及Hollenbaugh等人，「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」，Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1 - 10.19.11頁，1992。「受體Fc融合蛋白」包含一或多個偶合至Fc部分之受體細胞外結構域，其在一些實施例中包含鉸鏈區，其後為免疫球蛋白之CH2及CH3結構域。在一些實施例中，Fc-融合蛋白包含兩個或更多個結合至一或多個配體之不同受體鏈。舉例而言，Fc-融合蛋白係捕獲劑，例如IL-1捕獲劑或VEGF捕獲劑。
「細胞培養」係指器皿(諸如燒瓶或生物反應器)中細胞之繁殖或增殖，且包括(但不限於)饋料分批培養物、連續培養物、灌注培養物及諸如此類。 II. 蛋白質藥物產品 A. 所關注蛋白質
蛋白質藥物產品可為適於在原核或真核細胞中表現之任何所關注蛋白質且可用於經改造宿主細胞中。舉例而言，所關注蛋白質包括(但不限於)抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、ScFv或其片段、Fc-融合蛋白或其片段、生長因子或其片段、細胞介素或其片段或細胞表面受體之細胞外結構域或其片段。所關注蛋白質可為由單個次單元組成之簡單多肽或包含兩個或更多個次單元之複雜多次單元蛋白質。所關注蛋白質可為生物醫藥產品、食品添加劑或防腐劑或經受純化及品質標準之任何蛋白質產品。
在一些實施例中，蛋白質產品(所關注蛋白質)係抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。在一個實施例中，抗體係IgG1抗體。在一個實施例中，抗體係IgG2抗體。在一個實施例中，抗體係IgG4抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG4抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG1抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗體。
在一些實施例中，抗體係選自由以下組成之群：抗程式化細胞死亡1抗體(例如如美國專利申請公開案第US2015/0203579A1號中所述之抗PD1抗體)、抗程式化細胞死亡配體-1 (例如如美國專利申請公開案第US2015/0203580A1號中所述之抗PD-L1抗體)、抗Dll4抗體、抗血管生成素-2抗體(例如如美國專利第9,402,898號中所述之抗ANG2抗體)、抗血管生成素樣3抗體(例如如美國專利第9,018,356號中所述之抗AngPtl3抗體)、抗血小板源性生長因子受體抗體(例如如美國專利第9,265,827號中所述之抗PDGFR抗體)、抗Erb3抗體、抗泌乳素受體抗體(例如如美國專利第9,302,015號中所述之抗PRLR抗體)、抗補體5抗體(例如如美國專利申請公開案第US2015/0313194A1號中所述之抗C5抗體)、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體(例如如美國專利第9,132,192號中所述之抗EGFR抗體或如美國專利申請公開案第US2015/0259423A1號中所述之抗EGFRvIII抗體)、抗前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9抗體(例如如美國專利第8,062,640號或美國專利申請公開案第US2014/0044730A1號中所述之抗PCSK9抗體)、抗生長及分化因子-8抗體(例如抗GDF8抗體，亦稱為抗肌骨素抗體，如美國專利第8,871,209號或第9,260,515號中所述)、抗升糖素受體(例如如美國專利申請公開案第US2015/0337045A1號或第US2016/0075778A1號中所述之抗GCGR抗體)、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、介白素4受體抗體(例如如美國專利申請公開案第US2014/0271681A1號或美國專利第8,735,095號或第8,945,559號中所述之抗IL4R抗體)、抗介白素6受體抗體(例如如美國專利第7,582,298號、第8,043,617號或第9,173,880號中所述之抗IL6R抗體)、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33 (例如如美國專利申請公開案第US2014/0271658A1號或第US2014/0271642A1號中所述之抗IL33抗體)、抗呼吸道融合病毒抗體(例如如美國專利申請公開案第US2014/0271653A1號中所述之抗RSV抗體)、抗分化簇3 (例如如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國申請案第62/222,605號中所述之抗CD3抗體)、抗分化簇20 (例如如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國專利第7,879,984號中所述之抗CD20抗體)、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化簇-48 (例如如美國專利第9,228,014號中所述之抗CD48抗體)、抗Fel d1抗體(例如如美國專利第9,079,948號中所述)、抗中東呼吸症候群病毒(例如如美國專利申請公開案第US2015/0337029A1號中所述之抗MERS抗體)、抗伊波拉病毒(Ebola virus)抗體(例如如美國專利申請公開案第US2016/0215040號中所述)、抗茲卡病毒(Zika virus)抗體、抗淋巴球活化基因3抗體(例如抗LAG3抗體或抗CD223抗體)、抗神經生長因子抗體(例如如美國專利申請公開案第US2016/0017029號及美國專利第8,309,088號及第9,353,176號中所述之抗NGF抗體)及抗活化素A抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體係選自由以下組成之群：抗CD3×抗CD20雙特異性抗體(如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號中所述)、抗CD3×抗黏蛋白16雙特異性抗體(例如抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體)及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體(例如抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體)。在一些實施例中，所關注蛋白質係選自由以下組成之群：阿昔單抗(abciximab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿達木單抗-atto、阿多-曲妥珠單抗(ado-trastuzumab)、阿倫珠單抗(alemtuzumab)、阿利人單抗(alirocumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、苯雷利珠單抗(benralizumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、貝洛托單抗(bezlotoxumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、布羅達單抗(brodalumab)、卡那單抗(canakinumab)、卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、塞普利單抗(cemiplimab)、西妥昔單抗(cetuximab)、地諾單抗(denosumab)、地妥昔單抗(dinutuximab)、度匹魯單抗(dupilumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、埃洛妥珠單抗(elotuzumab)、艾美賽珠單抗(emicizumab-kxwh)-kxwh、艾坦辛阿利人單抗(emtansinealirocumab)、依凡納單抗(evinacumab)、依洛尤單抗(evolocumab)、法希姆單抗(fasinumab)、戈利木單抗(golimumab)、古塞庫單抗(guselkumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、伊達賽珠單抗(idarucizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、英夫利昔單抗-abda、英夫利昔單抗-dyyb、伊匹單抗(ipilimumab)、伊西貝單抗(ixekizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)、奈伐單抗(nesvacumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、奧托昔單抗(obiltoxaximab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、歐瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉木單抗(olaratumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab)、瑞麗珠單抗(reslizumab)、利諾庫單抗(rinucumab)、利妥昔單抗(rituximab)、賽瑞蘆單抗(sarilumab)、蘇金單抗(secukinumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、妥西珠單抗(tocilizumab)、妥西珠單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲弗單抗(trevogrumab)、優特克單抗(ustekinumab)及維多珠單抗(vedolizumab)。
在一些實施例中，所關注蛋白質係含有Fc部分及另一結構域之重組蛋白(例如Fc-融合蛋白)。在一些實施例中，Fc-融合蛋白係受體Fc-融合蛋白，其含有一或多個偶合至Fc部分之受體細胞外結構域。在一些實施例中，Fc部分包含鉸鏈區，其後為IgG之CH2及CH3結構域。在一些實施例中，受體Fc-融合蛋白含有兩個或更多個結合至單一配體或多個配體之不同受體鏈。舉例而言，Fc-融合蛋白係TRAP蛋白，舉例而言，諸如IL-1捕獲劑(例如利那西普(rilonacept)，其含有融合至Il-1R1細胞外區域之IL-1RAcP配體結合區域，該Il-1R1細胞外區域融合至hIgG1之Fc；參見美國專利第6,927,004號，其全文皆以引用方式併入本文中)或VEGF捕獲劑(例如阿柏西普(aflibercept)或ziv-阿柏西普，其包含VEGF受體Flt1之Ig結構域2，Ig結構域2融合至VEGF受體Flk1之Ig結構域3，該Ig結構域3融合至hIgG1之Fc；參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號)。在其他實施例中，Fc-融合蛋白係ScFv-Fc-融合蛋白，其含有抗體之偶合至Fc部分之一或多個抗原結合結構域，諸如可變重鏈片段及可變輕鏈片段。 B. 細胞培養
所關注蛋白質可在「饋料分批細胞培養物」或「饋料分批培養物」中產生，該培養物係指分批培養物，其中首先將細胞及培養基供應至培養器皿，並在培養期間在有或沒有週期性細胞及/或產物收穫之情況下在終止培養之前，以離散增量將額外培養物營養素緩慢進給至培養物。饋料分批培養物包括「半連續饋料分批培養物」，其中週期性地移除整個培養物(其可包括細胞及培養基)且更換為新鮮培養基。饋料分批培養物不同於簡單的「分批培養物」，而用於細胞培養之所有組分(包括動物細胞及所有培養物營養素)係在分批培養物之培養過程開始時供應至培養器皿。饋料分批培養物可不同於「灌注培養物」，此乃因在標準饋料分批製程中未自培養器皿移除上清液，而在灌注培養中，細胞藉由例如過濾受限於培養物中，且培養基連續或間歇地引入培養器皿及自培養器皿移除。然而，考慮在饋料分批細胞培養期間出於測試目的移除樣品。饋料分批過程繼續進行，直至確定達到最大工作體積及/或蛋白質產生，且隨後收穫蛋白質。
所關注蛋白質可在連續細胞培養中產生。片語「連續細胞培養」係指用於連續生長細胞之技術，通常係在特定之生長期。舉例而言，若需要持續供應細胞，或需要生產特定之所關注蛋白質，則細胞培養可能需要維持在特定之生長期。因此，為將細胞維持在該特定時期，必須持續監測並相應地調整條件。
術語「細胞培養基」及「培養基」係指用於使哺乳動物細胞生長之營養素溶液，其通常提供用於增強細胞生長之必需營養素，諸如碳水化合物能量源、必需胺基酸(例如苯丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、色胺酸、蛋胺酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸及組胺酸)及非必需胺基酸(例如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸及酪胺酸)、微量元素、能量源、脂質、維生素等。細胞培養基可含有提取物，例如血清或蛋白腖(水解物)，其供應支持細胞生長之原材料。培養基可含有酵母源提取物或大豆提取物而非動物源提取物。化學定義培養基係指已知所有化學組分(即具有已知化學結構)之細胞培養基。化學定義培養基完全不含動物源組分，諸如血清或動物源蛋白腖。在一個實施例中，培養基係化學定義之培養基。
溶液亦可含有增強生長及/或存活率超過最小速率之組分，包括激素及生長因子。該溶液可調配成對於所培養之特定細胞之存活及增殖最佳之pH及鹽濃度。
「細胞系」係指經由細胞之連續傳代或繼代培養衍生自特定譜系之一種或多種細胞。術語「細胞」與「細胞群體」可互換使用。
術語「細胞」包括適於表現重組核酸序列之任何細胞。細胞包括原核生物及真核生物之彼等，諸如細菌細胞、哺乳動物細胞、人類細胞、非人類動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或細胞融合物(舉例而言，諸如雜交瘤或四源雜交瘤)。在某些實施例中，細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在其他實施例中，細胞係選自以下細胞：中國倉鼠卵巢(CHO) (例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS (例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、淋巴球例如Jurkat (T淋巴球)或Daudi (B淋巴球)、A431 (表皮)、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、幹細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞系。在一些實施例中，細胞包含一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如PER.C6®細胞)。在一些實施例中，細胞為CHO細胞。在其他實施例中，細胞為CHO K1細胞。 III. 用於表徵蛋白質藥物雜質之變體之系統
多次單元治療性蛋白質,尤其基於單株抗體(mAb)之治療劑由於其複雜的多鏈結構及適應多個酶及化學轉譯後修飾之傾向，尺寸固有地係異質的。儘管蛋白質藥物產品內之尺寸變體之程度可容易地藉由多種生物物理方法量化，但彼等產品相關雜質之明確鑑定尤具挑戰。
儘管mAb具有由兩條二硫鍵連接之重鏈組成之保守的共價異四聚體結構，該等重鏈各自經由二硫鍵共價連接至輕鏈，該等蛋白質甚至在過度純化步驟後通常含有少量產品相關雜質。低分子量(LMW)物質(例如Fab片段及無Fab臂之單體)及高分子量(HMW)物質(例如mAb三聚體及mAb二聚體)皆係導致mAb產品之尺寸異質性之產品相關雜質之實例。因蛋白質聚集在治療性mAb藥物產品內形成HMW物質可潛在地損害藥物功效及安全性二者(例如引發不期望之免疫原性反應)(Rosenberg AS. The AAPS journal, 8:E501-7 (2006)；Moussa EM等人， Journal of Pharmaceutical Science,105:417-30 (2016)。任何治療性蛋白質之LMW物質可在產生期間由宿主細胞蛋白酶活性產生。LMW物質通常具有相對於抗體之單體形式較低或實質上降低之活性，而暴露新穎表位可產生免疫原性或潛在地影響活體內藥物代謝動力學特性(Vlasak J、Ionescu R. mAb,3:253-63 (2011))。因此，認為HMW及LMW物質皆係在藥物研發期間以常規方式監測之關鍵品質屬性且被視為在製造期間經純化藥物物質之釋放測試之一部分。
mAb產品之分子量異質性傳統上係藉由多種正交分析方法表徵(Michels DA、Parker M、Salas-Solano O. Electrophoresis, 33:815-26 (2012))。一種最常用於評價mAb產品純度之技術係在非還原條件下實施之SDS-PAGE。在分析期間，對應於LMW物質之小條帶可以常規方式觀察及量化，就抗體而言，包括H2L (2條重鏈及1條輕鏈)、H2 (2條重鏈)、HL (1條重鏈及1條輕鏈)、HC (1條重鏈)及LC (1條輕鏈)物質(Liu H、Gaza-Bulseco G、Chumsae C、Newby-Kew A. Biotechnology Letters, 29:1611-22 (2007))。
亦可觀察到蛋白水解片段。所提出每一小條帶之屬性可藉由使用抗Fc及抗輕鏈抗體經由埃德曼降解、膠內胰蛋白酶消化、隨後質譜分析及西方墨點分析進行N末端測序來支持。然而，源自該等方法之任何所提出結構無法在完整蛋白質層級上得到明確確認。此外，用於SDS-PAGE實驗中之樣品製備條件可經由二硫鍵擾亂產生LMW偽影，此可能會過高估計少量LMW物質(Zhu ZC等人， Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,83:89-95 (2013))。
最近，毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)已作為SDS-PAGE之現代等效物出現，提供優異的再現性、靈敏度及通量(Rustandi RR、Washabaugh MW、Wang Y. Electrophoresis, 29:3612-20 (2008)；Lacher NA等人， Journal of Separation Science, 33:218-27 (2010)；及Hunt G、Moorhouse KG、Chen AB. Journal of Chromatography A,744:295-301 (1996))。在mAb產品之CE-SDS分析期間，可以常規方式觀察到少量遷移時間(LMW形式)短於完整抗體之峰。與SDS-PAGE分析不同，該等LMW雜質無法經提取或經受其他分析。因此，在CE-SDS方法中觀察到之LMW雜質之屬性通常係簡單地基於經驗知識提出。
藉由現代質譜儀對完整mAb蛋白進行精確質量量測作為最可靠之鑑定技術之一，在生物製藥工業中變得愈發流行(Kaltashov IA等人， Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 21:323-37 (2010))；Zhang H、Cui W、Gross ML. FEBS Letters, 588:308-17 (2014))。具體而言，多種「聯用層析-質譜」方法已展示檢測mAb產品中之低豐度雜質並提供SDS-PAGE或CE-SDS方法無法達成之高度詳細之分析的能力(Le JC、Bondarenko PV. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16:307-11 (2005)；Haberger M等人， mAb; 8:331-9 (2016))。舉例而言，可使用偶合至質譜之反相層析(RPLC)來檢測mAb藥物產品中所存在之游離輕鏈及相關轉譯後修飾(例如半胱胺醯化及麩胱甘肽化)。然而，與SDS-PAGE及CE-SDS方法相比，RPLC通常缺少足以分離LMW物質之解析度且因此無法闡明完整LMW概況。舉例而言，基於RPLC之完整質量分析從未報告mAb藥物產品中H2L物質之鑑定，此歸因於其低豐度及與主要完整抗體之較差解析度。
另一種有望用於表徵mAb產品相關雜質之基於MS之技術係天然電噴霧電離質譜(天然ESI-MS)，其在與尺寸排除層析(SEC)偶合時尤其有用(Haberger M等人， mAb, 8:331-9 (2016))。然而，在天然SEC-MS分析中鑑定出之LMW物質通常與藉由SDS-PAGE或CE-SDS鑑定出之彼等不同，此乃因各方法之間使用之實驗條件顯著不同。具體而言，SDS-PAGE及CE-SDS所需之樣品製備通常起始於蛋白質變性，其中HC-LC對之N末端區域與HC-HC對之C末端區域之間的非共價相互作用被破壞。因此，若鏈間二硫鍵斷裂，LMW雜質(諸如H2L、半抗體及游離輕鏈物質)能夠自mAb分子解離。
相比之下，天然SEC-MS在近天然條件下分析mAb樣品，容許保留強非共價鏈間相互作用且允許維持mAb分子之四鏈結構，即使鏈間二硫鍵斷裂。儘管SEC管柱化學法之進步使得可使用變性緩衝液(例如30%乙腈、0.1% FA及0.1% TFA)，該等緩衝液通常用於SEC分離之反相層析且直接偶合至在線質譜分析(Liu H、Gaza-Bulseco G、Chumsae C. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20:2258-64 (2009))，但LC解析度對於檢測許多LMW物質仍非最佳的。
為應對該等挑戰，提供一平台，該平台使高效SEC及IEX分離與超靈敏天然Nano-ESI質譜檢測相結合，以允許深入且快速地表徵治療性蛋白質藥物產品。 A. 用於表徵蛋白質藥物產品中之尺寸及電荷變體之系統
在一個實施例中，系統包括尺寸排除層析(SEC)管柱或與天然質譜系統流體連通之離子交換層析(IEX)系統。管柱適用於與去醣基化蛋白質一起使用。在一個實施例中，SEC管柱為Waters BEH ®SEC管柱(4.6 × 300 mm)。在一個實施例中，IEX管柱為強陽離子交換管柱。天然質譜系統可為天然電噴霧電離(ESI)質譜系統。在一個實施例中，質譜系統為Thermo Exactive EMR質譜儀。質譜系統亦可含有紫外光檢測器。SEC及IEX管柱經由分析分流器與質譜儀流體連通，該分析分流器可調節至質譜儀之流速。
在一個實施例中，流動相為水性流動相。代表性水性流動相含有140 mM乙酸鈉及10 mM碳酸氫銨。UV軌跡通常係在215及280 nm下記錄。
蛋白質藥物樣品通常為5-10 ug/ul。注射濃度通常為50-100 ug。
在一個實施例中，尺寸排除分離係在室溫下使用0.2 mL/min之等度流持續24分鐘達成。
在一個實施例中，電噴霧之電壓正好在發射器之前藉由液體接頭三通施加。 B. 表徵蛋白質藥物產品雜質之方法
所揭示系統及方法可用於表徵尺寸變體、電荷變體、抗體-抗原結合、PTM表徵、部分還原及烷基化mAb之表徵、共調配藥物之二聚體表徵、IgG4 Fab交換表徵及使用電荷還原之高度異質樣品表徵。可檢測及鑑定之產生酸性變體之例示性轉譯後修飾(PTM)包括(但不限於)醣化、葡萄糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化、Fab區之非共有醣基化。可檢測及鑑定之產生鹼性變體之PTM包括(但不限於)琥珀醯亞胺形成、N末端麩胺醯胺(未轉化成焦麩胺酸鹽)、C末端Lys及非/部分醣基化物質。 1. 尺寸變體
一個實施例提供用於表徵蛋白質藥物產品雜質之尺寸變體之方法，其包括以下步驟：視情況使蛋白質藥物產品樣品去醣基化，藉由天然SEC層析使用水性流動相分離蛋白質藥物產品樣品之蛋白質組分，及藉由質譜分析經分離蛋白質組分以表徵蛋白質藥物產品樣品中蛋白質藥物產品雜質之高分子量物質、低分子量物質及中等高分子量物質。在一個實施例中，流動相包括乙酸銨及碳酸氫銨。
在一個實施例中，蛋白質藥物產品樣品取自饋料分批細胞培養物、連續細胞培養物或灌注細胞培養物或自其純化。
例示性蛋白質藥物產品包括(但不限於)抗體、融合蛋白、重組蛋白或其組合。
例示性低分子量蛋白質藥物產品雜質包括(但不限於)前體、降解產物、截短物質、蛋白水解片段(包括Fab、配體或受體片段或重鏈片段)、游離輕鏈、半抗體、H2L、H2、HL、HC或其組合。
例示性HMW雜質包括(但不限於) mAb三聚體及mAb二聚體。
例示性中等HMW包括(但不限於)具有額外輕鏈之單體(H2L3及H2L4種類)、單體加Fab片段複合物、Fab2-Fab2、Fc-Fc及Fab2-Fc。 2. 電荷變體表徵
一個實施例提供用於表徵蛋白質藥物產品雜質之電荷變體之方法，其包括以下步驟：視情況使蛋白質藥物產品樣品去醣基化，視情況用來自釀膿鏈球菌(Streptocoocus pyogenes)之IdeS處理樣品，藉由天然強陽離子交換層析使用水性流動相分離蛋白質藥物產品樣品之蛋白質組分，及藉由質譜分析經分離蛋白質組分以表徵蛋白質藥物產品樣品中蛋白質藥物產品雜質之電荷變體物質。在一個實施例中，流動相包括乙酸銨及碳酸氫銨。
在一個實施例中，蛋白質藥物產品樣品取自饋料分批細胞培養物、連續細胞培養物或灌注細胞培養物或自其純化。
例示性電荷變體包括(但不限於)醣化、葡萄糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化、Fab區之非共有醣基化。可檢測及鑑定之產生鹼性變體之PTM包括(但不限於)琥珀醯亞胺形成、N末端麩胺醯胺(未轉化成焦麩胺酸鹽)、C末端Lys及非/部分醣基化物質。 C. 產生高純度蛋白質藥物產品之方法
一個實施例提供產生抗體之方法，其包括以下步驟：例如在饋料分批培養物中培養產生抗體之細胞，自細胞培養物獲得樣品，使用本文所揭示之系統及方法表徵及量化樣品中之低分子量、高分子量及中等分子量雜質，及改進細胞培養物之一或多個培養條件以減少在抗體之細胞培養期間產生之經表徵低分子蛋白質藥物雜質之量。通常，改變條件以具有在0.05%至30.0%、較佳0.05%至15%、0.05%至10%、0.05%至5%或0.05%至2% (重量/重量)範圍內之蛋白質藥物雜質。
細胞培養物之經改變以減少低分子量蛋白質藥物雜質之量之一或多個條件係選自由以下組成之群：溫度、pH、細胞密度、胺基酸濃度、滲透壓、生長因子濃度、攪動、氣體分壓、表面活性劑或其組合。
在一個實施例中，產生抗體之細胞為中國倉鼠卵巢細胞。在其他實施例中，細胞為雜交瘤細胞。
另一實施例提供根據本文所提供之方法產生之抗體，具有1至5%、5至10%、10至15%、15至20%之蛋白質藥物雜質。 實例 實例 1 ： mAb-1 藥物物質樣品之 HILIC 分離 方法
在Waters BEH ®SEC管柱(4.6 × 300 mm)上達成SEC分離，該管柱用基於乙酸銨及碳酸氫銨之流動相以0.2 mL/min之流速預平衡。在強陽離子交換管柱上使用基於乙酸銨之緩衝液系統以0.4 mL/min之流速達成IEX分離。在管柱後連接分析分流器以在藉由Thermo Exactive EMR質譜儀分析之前使流減少約1 µL/min，該質譜儀配備有Nanospray Flex™離子源。端視分析物之尺寸，調節捕集氣體壓力、S透鏡RF位準、源內片段化及HCD碰撞能以達成最佳溶解。
因此，引入新的技術平台，該平台將高效SEC及IEX分離與超靈敏天然Nano-ESI質譜檢測相結合，以允許深入且快速地表徵治療性mAb。 結果
使用重組IgG1 mAb (mAb-1)藥物物質樣品作為模型分子。利用SEC-MS，mAb產品中之少量尺寸變體可有效地與主要單體物質分離且經受靈敏MS檢測。以＜1%相對豐度存在之較高分子量物質(例如mAb三聚體及mAb二聚體)及較低分子物質(例如Fab片段及無Fab臂之單體)皆可以常規方式藉由此方法觀察及監測。特定而言，在許多mAb產品中檢測到在mAb單體與mAb二聚體之間溶析之有趣的HMW物質類別(稱為中等HMW物質)，即使其通常以極少量存在(＜0.1%)。經由精確質量量測，可確定彼等中等HMW物質之屬性且將其分成兩組：1)具有額外輕鏈之單體(H2L3及H2L4種類)及2)單體加Fab片段複合物。此外，在用IdeS酶消化處理後，可藉由此方法充分分離及檢測不同二聚化片段(Fab 2-Fab 2、Fc-Fc及Fab 2-Fc)，揭露子結構域層級上之二聚化界面。
利用IEX-MS，可在完整mAb層級上檢測到多種產生電荷變體之PTM。經由分析數百份mAb樣品，發現產生酸性變體之PTM包括醣化、葡萄糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化及Fab區之非共有醣基化；發現產生鹼性變體之PTM包括琥珀醯亞胺形成、N末端麩胺醯胺(未轉化成焦麩胺酸鹽)、C末端Lys及非/部分醣基化物質。在電荷變體研究(例如可比性及強制降解研究)中，此新方法證明在闡明電荷變體形式方面非常有效。
儘管在前述說明書中已經針對本發明之某些實施例闡述本發明，且出於說明之目的，已提出許多細節，但熟習此項技術者將明瞭，本發明容易受到其他實施例之影響，並且在不背離本發明之基本原理之情況下，本文所述之某些細節可有相當大之變化。
在本揭示內容通篇中提及之所有出版物之全文皆以引用方式併入本文中。
本文引用之所有參考文獻之全文皆以引用方式併入。在不背離本發明之精神或基本屬性之情況下，本發明可以其他特定形式體現，且因此，應參考所附申請專利範圍，而非前述說明書來指示本發明之範圍。
圖1A及1B係mAb-1藥物物質樣品之在線天然SEC-MS分離之層析圖。圖1A係紫外概況且圖1B-1E係分別係單體、二聚體、三聚體及四聚體之質譜概況。
圖2A係來自mAb-1藥物物質樣品之Fab 2同二聚體之質譜概況。圖2B係來自mAb-1藥物物質樣品之Fab2-Fc異二聚體之質譜概況。圖2C係來自mAb-1藥物物質樣品之Fc同二聚體之質譜概況。圖2D係mAb-1之分離之總離子層析圖。
圖3A顯示mAb-2藥物物質樣品之在線天然SEC-MS分離之總離子層析圖。圖3B顯示在26 min時集中之部分之低分子量之質譜概況。圖3C顯示在31 min時集中之部分之低分子量之質譜概況。
圖4係富集之LMW樣品(去醣基化)之mAb-1藥物物質之在線天然SEC-MS之總離子流層析圖。
圖5A係mAb-3藥物物質之在線天然SEC-MS之總離子流層析圖，其顯示二聚體、中等HMW及單體雜質之檢測。圖5B係顯示單體雜質之檢測之總離子流層析圖。圖5C-5E係二聚體、中等HMW及單體雜質之質譜概況。
圖6係mAb-3中之中等HMW物質之去捲積質譜，其顯示H2L3之預測質量為167,850 Da。
圖7A顯示mAb-4之提取離子層析圖，其顯示電荷變體雜質之檢測。圖7B顯示所指示電荷變體雜質之質譜概況。
圖8係mAb-4之總離子層析圖，其顯示藉由天然SCX-MS在子結構域層級上表徵電荷變體。
圖9A顯示藉由天然SCX-MS表徵之Fab 2片段之提取離子層析圖。圖9B顯示電荷變體之質譜概況。

Claims (10)

  1. 一種用於表徵中等高分子量蛋白質藥物產品雜質之方法，其包括： 使蛋白質藥物產品樣品去醣基化； 藉由天然尺寸排除層析使用水性流動相分離該蛋白質藥物產品樣品之蛋白質組分； 藉由質譜分析該等經分離之蛋白質組分以表徵該蛋白質藥物產品樣品中之中等高分子量蛋白質藥物產品雜質。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白質藥物產品樣品係來自饋料分批培養物。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該蛋白質藥物產品係選自由以下組成之群組：抗體、融合蛋白、重組蛋白或其組合。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該中等高分子量蛋白質藥物產品雜質之特徵為選自由以下組成之群之中等高分子量蛋白質藥物產品雜質：包括H2L3及H2L4種類之具有額外輕鏈之單體、單體加Fab片段複合物及其組合。
  5. 一種用於表徵中等高分子量藥物雜質之系統，其包括： 天然尺寸排除層析系統，其包括連接至包含水性流動相之流動相管柱之尺寸排阻管柱，其中該尺寸排阻管柱與Nano-ESI質譜系統流體連通。
  6. 一種用於表徵電荷變體藥物雜質之方法，其包括： 使蛋白質藥物產品樣品去醣基化； 藉由天然強陽離子排除層析使用水性流動相分離該蛋白質藥物產品樣品之蛋白質組分； 藉由Nano-ESI質譜分析該等經分離之蛋白質組分以表徵該蛋白質藥物產品樣品中之電荷變體蛋白質藥物產品雜質。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該蛋白質藥物產品樣品係來自饋料分批培養物。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其中該蛋白質藥物產品係選自由以下組成之群組：抗體、融合蛋白、重組蛋白或其組合。
  9. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其中該中等高分子量蛋白質藥物產品雜質之特徵為選自由以下組成之群組之中等高分子量蛋白質藥物產品雜質：包括H2L3及H2L4種類之具有額外輕鏈之單體、單體加Fab片段複合物及其組合。
  10. 如申請專利範圍第1、2、6、或7項之方法，其中該水性流動相包含乙酸銨及碳酸氫銨。
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