JP2021512074A - サイズバリアントおよび電荷バリアントである薬物製品不純物を特徴解析するためのシステムおよび方法 - Google Patents

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Abstract

サイズバリアントおよび電荷バリアントタンパク質薬物製品不純物を特徴解析するためのシステムおよび方法が提供される。

Description

発明の分野
本発明は概して、タンパク質の分離方法および細胞の培養方法を対象とする。
発明の背景
ここ２０年にわたり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を採用して広範な治療領域を標的とすることに成功している（Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４；３２：９９２−１０００（非特許文献1）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｓ．Ｂｉｌｌｉｏｎ ｄｏｌｌａｒ ｂａｂｉｅｓ−−ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｒｕｇｓ ａｓ ｂｌｏｃｋｂｕｓｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７；２５：３８０−２（非特許文献2））。
当分野において、抗体の不均一性が知られている。例えば、低分子量（ＬＭＷ）種および高分子量（ＨＭＷ）種は両方とも目的物質由来の不純物の例であり、ｍＡｂ製品のサイズ不均一性の原因となる。タンパク質凝集の結果として治療用ｍＡｂ薬物製品内にＨＭＷ種が形成されると、潜在的に薬物の有効性と安全性の両方を損なう可能性がある。タンパク質分解断片も、製品の不純物プロファイルの原因となり得る。
ｍＡｂは保存された共有結合性ヘテロ四量体構造を保有しており、各々がジスルフィド結合を介して軽鎖に共有結合されている二つのジスルフィド結合重鎖からなる。一方で、これらタンパク質はしばしば、徹底した精製工程の後であっても低レベルの目的物質由来不純物を含有している。低分子量（ＬＭＷ）種（例えば、Ｆａｂ断片、およびＦａｂアームを有さない単量体）および高分子量（ＨＭＷ）種（例えば、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体）は両方とも目的物質由来不純物の例であり、それらはｍＡｂ製品のサイズ不均一性の原因となる。タンパク質凝集の結果として治療用ｍＡｂ薬物製品内にＨＭＷ種が形成されると、潜在的に薬物の有効性と安全性の両方を損なう可能性がある（例えば望ましくない免疫原性反応を惹起させる、など）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２００６；８：Ｅ５０１−７（非特許文献3）；Ｍｏｕｓｓａ ＥＭ，Ｐａｎｃｈａｌ ＪＰ，Ｍｏｏｒｔｈｙ ＢＳ，Ｂｌｕｍ ＪＳ，Ｊｏｕｂｅｒｔ ＭＫ，Ｎａｒｈｉ ＬＯ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１６；１０５：４１７−３０（非特許文献4））。任意の治療用タンパク質のＬＭＷ種は、宿主細胞のプロテアーゼ活性の結果、産生中に生じる場合がある。ＬＭＷ種はしばしば、抗体の単量体型と比較して低い活性、または実質的に低い活性を有していながら、新たなエピトープを露出しており、これが免疫原性を導く、または、潜在的にインビボでの薬物動態特性に影響を与える可能性がある（Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｍＡｂｓ ２０１１；３：２５３−６３（非特許文献5））。結果として、ＨＭＷ種およびＬＭＷ種の両方ともが、薬物開発中に日常的にモニタリングされ、そして精製された原薬の放出試験の一環として製造中に日常的にモニタリングされる重要な品質特性とみなされている。
ｍＡｂ製品の分子量の不均一性は従来、複合的な直交分析方法により特徴解析されている（Ｍｉｃｈｅｌｓ ＤＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｓａｌａｓ−Ｓｏｌａｎｏ Ｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０１２；３３：８１５−２６（非特許文献6））。ｍＡｂ製品の純度の評価に最も一般的に使用されている技術の一つは、非還元条件下で実施されるＳＤＳ−ＰＡＧＥである。分析中、ＬＭＷ種に対応する小さなバンドは日常的に観察され、および定量されることができ、そうしたバンドとして抗体に関しては、Ｈ２Ｌ（２つの重鎖と１つの軽鎖）種、Ｈ２（２つの重鎖）種、ＨＬ（１つの重鎖と１つの軽鎖）種、ＨＣ（１つの重鎖）種およびＬＣ（１つの軽鎖）種が挙げられる（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ，Ｎｅｗｂｙ−Ｋｅｗ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００７；２９：１６１１−２２（非特許文献7））。
タンパク質分解断片も観察される場合がある。それぞれの小さなバンドに対して提唱されるアイデンティティは、Ｅｄｍａｎ分解を介したＮ末端シーケンシング、ゲル内トリプシン消化後の質量分析、および抗Ｆｃ抗体と抗軽鎖抗体を使用したウェスタンブロット分析によりサポートされ得る。ただし、これらの方法から提唱される構造はすべて、インタクトなタンパク質レベルでは明確には確認できない。さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験で採用されるサンプル調製条件は、ジスルフィド結合のスクランブル化を通してＬＭＷのアーチファクトを生成させ、これによって、少数であったＬＭＷ種の過大評価が導かれてしまう可能性がある（Ｚｈｕ ＺＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，８３：８９−９５（２０１３）（非特許文献8））。
近年ではキャピラリー電気泳動−硫酸ドデシルナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥの現代版として登場し、優れた再現性、感度およびスループットをもたらしている（Ｒｕｓｔａｎｄｉ ＲＲ，Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９：３６１２−２０（２０１３）（非特許文献9）；Ｌａｃｈｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３：２１８−２７（２０１０）（非特許文献10）；Ｈｕｎｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ７４４：２９５−３０１（１９９６）（非特許文献11））。ｍＡｂ製品のＣＥ−ＳＤＳ分析中に、インタクトな抗体よりも短い移動時間のマイナーピーク（ＬＭＷ型）が日常的に観察される場合がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とは異なり、これらのＬＭＷ不純物を抽出したり、さらなる分析を行うことはできない。結果として、ＣＥ−ＳＤＳ法で観察されたＬＭＷ不純物のアイデンティティも多くの場合、単に経験則に基づき提唱されているにすぎない。
最新の質量分析計によるインタクトなｍＡｂタンパク質の精密な質量測定が、最も信頼性の高い識別技術の一つとしてバイオ医薬産業ではますます普遍的になってきている（Ｋａｌｔａｓｈｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２１：３２３−３７（２０１０）（非特許文献12）；Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗ，Ｇｒｏｓｓ ＭＬ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３０８−１７（２０１４）（非特許文献13））。具体的には、様々な「複合的クロマトグラフィー−質量分析」法が、ｍＡｂ製品中のわずかな不純物を検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法またはＣＥ−ＳＤＳ法のいずれにも実現できない高度に詳細な分析を提供する能力を示している（Ｌｅ ＪＣ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；１６：３０７−１１（２０１５）（非特許文献14）；Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ８：３３１−９（２０１６）（非特許文献15））。例えば、質量分析法と連結した逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を使用して、ｍＡｂ薬物製品中に存在する遊離軽鎖と、関連する翻訳後修飾（例えばシステイン化およびグルタチオン化）を検出することができる。しかしＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＣＥ−ＳＤＳ方法と比較して、ＲＰＬＣは多くの場合、ＬＭＷ種を分離するのに充分な分解能を欠いており、完全なＬＭＷプロファイルの解明を行うことはできない。例えば、ＲＰＬＣを基にしたインタクト質量分析からｍＡｂ薬物製品中のＨ２Ｌ種の特定は報告されていない。これは、その存在量の少なさ、そして主要インタクト抗体からの分解能が乏しいことが理由である。
ｍＡｂ製品由来不純物の特徴解析に期待が持てるもう一つのＭＳ系技術は、ネイティブエレクトロスプレーイオン化質量分析法（Ｎａｔｉｖｅ ＥＳＩ−ＭＳ：ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であり、この技術はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と組み合わされたときに特に有益な情報をもたらす（Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ；８：３３１−３３９（２０１６）（非特許文献16））。しかしネイティブＳＥＣ−ＭＳ分析で特定されたＬＭＷ種は多くの場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＣＥ−ＳＤＳで特定された種と同じではない。その理由は、それら方法の間で使用された実験条件が大きく異なるためである。具体的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＥ−ＳＤＳに必要とされるサンプル調製は多くの場合、タンパク質変性から始まる。タンパク質変性により、ＨＣ−ＬＣ対のＮ末端領域間とＨＣ−ＨＣ対のＣ末端領域間の非共有結合的相互作用が破壊される。その結果、鎖間ジスルフィド結合が破壊された場合には、ｍＡｂ分子からは例えばＨ２Ｌ、半抗体および遊離軽鎖種などのＬＭＷ不純物が解離され得る。
比較すると、ネイティブＳＥＣ−ＭＳはほぼ自然な条件下でｍＡｂサンプルを分析する。それにより、たとえ鎖間ジスルフィド結合が破壊されたとしても、強力な非共有結合性鎖間相互作用が保存され、ｍＡｂ分子の四つの鎖の構造は維持されることが可能となる。ＳＥＣカラム化学法の有利な点は、ＳＥＣ分離用の逆相クロマトグラフィーで通常に使用される変性緩衝剤（例えば３０％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、および０．１％ＴＦＡ）を使用することが可能になったこと、およびオンラインの質量分析法に直接つなげることが可能になったことであるが（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０：２２５８−６４（２００９）（非特許文献17））、ＬＣの分解能は多くのＬＭＷ種を検出するにはいまだ最適とは言えない。
本発明の目的は、タンパク質薬物の不純物のサイズバリアントの特徴解析のためのシステムおよび方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、不純物レベルが低下したタンパク質薬物製品を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、タンパク質薬物製品不純物が減少したタンパク質薬物製品を製造する方法を提供することである。
Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４；３２：９９２−１０００ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｓ．Ｂｉｌｌｉｏｎ ｄｏｌｌａｒ ｂａｂｉｅｓ−−ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｒｕｇｓ ａｓ ｂｌｏｃｋｂｕｓｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７；２５：３８０−２ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２００６；８：Ｅ５０１−７ Ｍｏｕｓｓａ ＥＭ，Ｐａｎｃｈａｌ ＪＰ，Ｍｏｏｒｔｈｙ ＢＳ，Ｂｌｕｍ ＪＳ，Ｊｏｕｂｅｒｔ ＭＫ，Ｎａｒｈｉ ＬＯ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１６；１０５：４１７−３０ Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｍＡｂｓ ２０１１；３：２５３−６３ Ｍｉｃｈｅｌｓ ＤＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｓａｌａｓ−Ｓｏｌａｎｏ Ｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０１２；３３：８１５−２６ Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ，Ｎｅｗｂｙ−Ｋｅｗ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００７；２９：１６１１−２２ Ｚｈｕ ＺＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，８３：８９−９５（２０１３） Ｒｕｓｔａｎｄｉ ＲＲ，Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９：３６１２−２０（２０１３） Ｌａｃｈｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３：２１８−２７（２０１０） Ｈｕｎｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ７４４：２９５−３０１（１９９６） Ｋａｌｔａｓｈｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２１：３２３−３７（２０１０） Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗ，Ｇｒｏｓｓ ＭＬ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３０８−１７（２０１４） Ｌｅ ＪＣ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；１６：３０７−１１（２０１５） Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ８：３３１−９（２０１６） Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ；８：３３１−３３９（２０１６） Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０：２２５８−６４（２００９）
サイズバリアントおよび電荷バリアントであるタンパク質薬物製品不純物を特徴解析するためのシステムおよび方法が提供される。一つの実施形態は、ネイティブ質量分析法と連結された水性移動相を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、サイズバリアントタンパク質薬物製品不純物を検出および特徴解析するものである。別の実施形態は、ネイティブ質量分析法と連結された水性移動相を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、好ましくは強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、タンパク質薬物製品不純物を特徴解析するものである。一つの実施形態では、例えば抗体薬物製品などのタンパク質薬物製品からＮ結合型グリカンを除去した後の、ＳＥＣまたはＩＥＸカラムからのそれぞれサイズバリアント不純物または電荷バリアント不純物の溶出は、分子量種のサイズおよび／または電荷により決定される。
本開示システムおよび方法を使用して、サイズバリアント、電荷バリアント、抗体−抗原結合、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の特徴解析、部分的に還元され、アルキル化されたｍＡｂの特徴解析、共製剤化された薬物の二量体の特徴解析、ＩｇＧ４ Ｆａｂ交換特徴解析、ならびに電荷減少を使用した高度に不均一なサンプルの特徴解析を行うことができる。酸性バリアントの原因となり、検出され、および特定され得るＰＴＭの例としては、限定されないが、Ｆａｂ領域での糖化、グルクロン化、カルボキシメチル化、シアル化、非コンセンサスグリコシル化が挙げられる。塩基性バリアントの原因となり、検出され、および特定され得るＰＴＭとしては、限定されないが、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸塩に転換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分的グリコシル化種が挙げられる。
本開示システムを用いて検出および特徴解析され得る低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬物製品不純物の例としては、限定されないが、前駆体、分解産物、切断種、Ｆａｂ、リガンドもしくは受容体の断片または重鎖断片を含むタンパク質分解断片、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
高分子量（ＨＭＷ）不純物の例としては、限定されないが、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体が挙げられる。
中間ＨＭＷの例としては、限定されないが、余剰軽鎖を含む単量体（Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種）、単量体とＦａｂ断片の複合体、Ｆａｂ２−Ｆａｂ２、Ｆｃ−Ｆｃ、およびＦａｂ２−Ｆｃが挙げられる。
本開示のＳＥＣ−ネイティブＭＳシステムおよびＩＥＸ−ネイティブＭＳシステム、ならびに方法は、詳細なバリアントタンパク質薬物製品の識別情報を提供する。本開示システムおよび本開示方法で取得された、信頼性のある識別情報および詳細な構造情報は、タンパク質薬物製品中の不純物に関する綿密な特徴解析にとって非常に価値があり、分子開発の後期段階にしばしば必要とされる情報である。さらに本開示のシステムおよび方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＣＥ−ＳＤＳよりも穏やかなサンプル調製を行うため、アーチファクトが生成される可能性も低い。本開示のシステムおよび方法を半定量的解析として使用して、サンプル間の不純物プロファイルを比較することができ、またはシンプルに定量的に適用することができる。
一つの実施形態は、タンパク質薬物と賦形剤とを含有するタンパク質薬物製品を提供するものであり、当該タンパク質薬物製品は、０．０５〜３０．０重量％の低分子量、高分子量、中間高分子量のタンパク質薬物不純物、またはそれらの組み合わせを含有する。
好ましい実施形態は、タンパク質薬物と賦形剤とを含有するタンパク質薬物製品を提供するものであり、当該タンパク質薬物製品は、０．０５〜３０．０重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する。
タンパク質薬物製品は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせであってもよい。他の実施形態では、薬物製品は、１〜２５重量％、１〜１５重量％、１〜１０重量％、または１〜５重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する。
別の実施形態は、サイズバリアントまたは電荷バリアントであるタンパク質薬物製品不純物を特徴解析するための方法を提供するものであり、当該方法は、タンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する工程、ＳＥＣクロマトグラフィーまたはＩＥＸクロマトグラフィーによりタンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を分離させる工程、およびネイティブ質量分析により、当該分離されたタンパク質成分を分析して、当該タンパク質薬物製品サンプル中のサイズバリアントまたは電荷バリアントであるタンパク質薬物製品不純物を特徴解析する工程、を含む。当該方法はさらに任意選択の還元工程を提供する。タンパク質薬物製品サンプルは、流加培養から採取されてもよい。上述のように、タンパク質薬物製品は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせであってもよい。
さらに別の実施形態は、抗体を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、細胞培養において当該抗体を産生する細胞を培養する工程、当該細胞培養物からサンプルを取得する工程、当該サンプル中の、サイズバリアントまたは電荷バリアントであるタンパク質薬物不純物を上記の方法に従い特徴解析および定量する工程、ならびに当該細胞培養の一つまたは複数の培養条件を変更して、当該抗体の細胞培養中に産生され、特徴解析された低分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させる工程、を含む。一部の実施形態では、当該サンプルは、任意の間隔で細胞培養中に採取される。他の実施形態では、当該サンプルは、産生培養の後、タンパク質回収の後、または精製の後に採取される。低分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させるために変更される細胞培養の一つまたは複数の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、ガス分圧、界面活性剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。細胞は、真核生物または原核生物であってもよい。細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、またはＶｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株であってもよい。一つの実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である。さらに別の実施形態は、本明細書に記載の方法により作製された抗体を提供するものである。
さらに別の実施形態は、サイズバリアントおよび電荷バリアントである薬物不純物を特徴解析するためのシステムを提供するものである。当該システムは、水性移動相に連結され、ネイティブ質量分析システムと流体連結されたＳＥＣクロマトグラフィーシステムまたはＩＥＸクロマトグラフィーシステムを含む。
図１Ａおよび１Ｂは、ｍＡｂ−１原薬サンプルのオンラインネイティブＳＥＣ−ＭＳ分離のクロマトグラムである。図１Ａは紫外線プロファイルであり、図１Ｂ〜１Ｅは、それぞれ単量体、二量体、三量体、および四量体の質量分析プロファイルである。 同上。 図２Ａは、ｍＡｂ−１の原薬サンプルからのＦａｂ２ホモ二量体の質量分析プロファイルである。図２Ｂは、ｍＡｂ−１の原薬サンプルからのＦａｂ２−Ｆｃヘテロ二量体の質量分析プロファイルである。図２Ｃは、ｍＡｂ−１の原薬サンプルからのＦｃホモ二量体の質量分析プロファイルである。図２Ｄは、ｍＡｂ−１の分離に関する総イオンクロマトグラフである。 図３Ａは、ｍＡｂ−２原薬サンプルのオンラインネイティブＳＥＣ−ＭＳ分離の総イオンクロマトグラムを示す。図３Ｂは、２６分を中心とする分画からの低分子量の質量分析プロファイルを示す。図３Ｃは、３１分を中心とする分画からの低分子量の質量分析プロファイルを示す。 富化ＬＭＷサンプル（脱グリコシル化）からのｍＡｂ−１原薬のオンラインネイティブＳＥＣ−ＭＳの総イオン電流クロマトグラムである。 図５Ａは、ｍＡｂ−３原薬のオンラインネイティブＳＥＣ−ＭＳの総イオン電流クロマトグラムであり、二量体、中間ＨＭＷ、および単量体の不純物の検出を示す。図５Ｂは、総イオン電流クロマトグラムであり、単量体不純物の検出を示す。 図５Ｃ〜５Ｅは、二量体、中間ＨＭＷ、および単量体の不純物の質量分析プロファイルである。 ｍＡｂ−３中の中間ＨＭＷ種のデコンボリューション化質量スペクトルであり、Ｈ２Ｌ３の予測質量を１６７，８５０Ｄａとして示す。 図７Ａは、ｍＡｂ−４の抽出イオンクロマトグラフィーであり、電荷バリアント不純物の検出を示す。図７Ｂは、指定される電荷バリアント不純物の質量分析プロファイルを示す。 ｍＡｂ−４の総イオンクロマトグラムであり、ネイティブＳＣＸ−ＭＳによるサブドメインレベルでの電荷バリアントの特徴解析を示す。 図９Ａは、ネイティブＳＣＸ−ＭＳにより特徴解析されたＦａｂ２断片の抽出イオンクロマトグラムを示す。図９Ｂは、電荷バリアントの質量分析プロファイルを示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本明細書において請求される本発明を記載する文脈（特に請求の範囲の文脈）において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および類似の指示対象の用語の使用は、単数および複数の両方を包含するとみなされる。
本明細書において別段の示唆が無い限り、本明細書において値の範囲の列挙は単に、当該範囲内にある別個の値のそれぞれを個々に言及するための簡潔表現法としての機能を果たすことが意図されており、個々の値のそれぞれが、それらが個々に本明細書において列挙されているように本明細書内に組み込まれる。
「約」という用語の使用は、記述される値のおよそ±１０％の範囲で上回る、または下回る値を記述することが意図されている。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±５％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±２％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±１％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。先行する範囲は、文脈で明白となることが意図されており、さらなる限定は示唆されない。本明細書において別段の示唆が無い限り、または文脈から相反することが明白でない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の適切な順序で実施されることができる。本明細書に提示される任意の、およびすべての例の使用、または例示的文言（例えば）は単に本発明をより詳細に解説することが意図されており、別段であることが請求されない限り、本発明範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書において、請求されていない要素を、本発明の実施に必須の要素であると示唆すると解釈されるべき文言はない。
「低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語は、限定されないが、前駆体、分解産物、切断種、Ｆａｂ断片、Ｆｃまたは重鎖断片を含むタンパク質分解断片、リガンドまたは受容体断片、Ｈ２Ｌ（２つの重鎖と１つの軽鎖）種、Ｈ２（２つの重鎖）種、ＨＬ（１つの重鎖と１つの軽鎖）種、ＨＣ（１つの重鎖）種、およびＬＣ（１つの軽鎖）種が挙げられる。ＬＭＷタンパク質薬物不純物は任意のバリアントであってもよく、バリアントは、例えば多量体タンパク質の一つまたは複数の構成要素などのタンパク質製品の不完全型である。タンパク質薬物不純物、薬物不純物、または製品不純物は、本明細書全体を通じて相互交換可能に使用され得る用語である。ＬＭＷの薬物または製品の不純物は概して、例えば活性、有効性および安全性といった特性を有する分子バリアントとみなされ、そうした特性は所望の薬物製品とは異なる特性である場合がある。
タンパク質製品の分解は、細胞培養系でのタンパク質薬物製品の製造中に問題がある。例えばタンパク質製品の分解は、細胞培養培地中のプロテアーゼの放出に起因して発生する場合がある。例えばメタロプロテアーゼを阻害するために添加される可溶性鉄源、またはセリンプロテアーゼ阻害剤およびシステインプロテアーゼ阻害剤などの培地添加物を細胞培養に加えて、分解が防止されている（Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｍ．−Ｆ．，ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．２０１１，５，Ｐ１１５）。細胞培養中のカルボキシルペプチダーゼによって、製造中にＣ末端断片が切断される場合がある（Ｄｉｃｋ，ＬＷ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８；１００：１１３２−４３）。
「高分子量（ＨＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語には、限定されないが、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体が含まれる。ＨＭＷ種は二つの群に分けられる：（１）余剰軽鎖を伴う単量体（Ｈ２Ｌ３種、Ｈ２Ｌ４種）；および（２）単量体とＦａｂ断片の複合体。さらにＩｄｅＳ酵素消化を用いた処置後に、様々な二量体化断片（Ｆａｂ２−Ｆａｂ２、Ｆｃ−ＦｃおよびＦａｂ２−Ｆｃ）が形成される。
「タンパク質」とは、ペプチド結合によって相互に結合された二つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質にはポリペプチドとペプチドが含まれ、さらに例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの修飾も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質系薬物を含む科学的または商業的な対象のタンパク質であってもよく、特に酵素、リガンド、受容体、抗体およびキメラタンパク質または融合タンパク質を含む。タンパク質は公知の細胞培養法を使用して様々なタイプの組換え細胞により産生される。一般的に遺伝子操作技術により細胞内に導入され（例えばキメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンレス配列など）、そこでエピソームとして存在し、または細胞ゲノム内に統合され得る。
「抗体」とは、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へと、さらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化された免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって、調製される、発現される、生成される、または単離される抗体分子を含む。抗体という用語はさらに、複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、二特異性抗体も含む。二特異性抗体は米国特許出願公開２０１０／０３３１５２７に概要が記載されており、当該特許出願は本明細書に参照により援用される。
「Ｆｃ融合タンパク質」は、二つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、そのうちの一つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、他方は自然界では一緒には存在しないものである。抗体に由来するポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合された受容体の細胞外ドメインを一つまたは複数含み、一部の実施形態では、ヒンジ領域の後に免疫グロブリンのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、一つまたは複数のリガンドに結合する二つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどのトラップである。
「細胞培養」とは、例えばフラスコまたはバイオリアクターなどの容器中での細胞の拡張または増殖を指し、限定されないが、流加培養、連続培養、灌流培養などを含む。
ＩＩ．タンパク質薬物製品
Ａ．対象タンパク質
タンパク質薬物製品は、原核細胞または真核細胞での発現に適した任意の対象タンパク質であってもよく、遺伝子操作された宿主細胞において使用されてもよい。例えば対象タンパク質としては、限定されないが、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃ融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片が挙げられる。対象タンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または二つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬品、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
一部の実施形態では、タンパク質製品（対象タンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一つの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、抗Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１に記載される抗ＰＤ１抗体）、抗Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｌｉｇａｎｄ−１（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン−２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載される抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載される抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載される抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載される抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体Ｃ５抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１に記載される抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗表皮成長因子受容体抗体（例えば米国特許第９，１３２，１９２号に記載される抗ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｋｅｘｉｎ−９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００４４７３０Ａ１に記載される抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗Ｇｒｏｗｔｈ Ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ−８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載される抗ＧＤＦ８抗体。抗ミオスタチン抗体としても知られる）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１またはＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１に記載される抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載される抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載される抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６５８Ａ１またはＵＳ２０１４／０２７１６４２Ａ１に記載される抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６５３Ａ１に記載される抗ＲＳＶ抗体）、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許出願６２／２２２，６０５に記載される抗ＣＤ３抗体）、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載される抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載される抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載される）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１に記載される抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０２１５０４０に記載される）、抗ジカウイルス抗体、抗Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／００１７０２９ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載される抗ＮＧＦ抗体）、および抗Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、二特異性抗体は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二特異性抗体（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載される）、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃｉｎ １６二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二特異性抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象タンパク質は、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アダリムマブ−ａｔｔｏ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ−ａｔｔｏ）、ａｄｏ−トラスツズマブ（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ ベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブロダルマブ（ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カプロマブ ペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セルトリズマブ ペゴル（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、デュピリマブ（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ−ｋｘｗｈ（ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ−ｋｘｗｈ）、エムタンシンアリロクマブ（ｅｍｔａｎｓｉｎｅａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ファシヌマブ（ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イブリツモマブ チウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イダルシズマブ（ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ−ａｂｄａ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ−ａｂｄａ）、インフリキシマブ−ｄｙｙｂ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ−ｄｙｙｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビルトキサキシマブ（ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、サリルマブ（ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、セクキヌマブ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレボグルマブ（ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、およびベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、対象タンパク質は、Ｆｃ部分と別のドメインを含有する組換えタンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質）である。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、受容体Ｆｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ部分に連結された受容体の細胞外ドメインを一つまたは複数含有する。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、それに続いてＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。一部の実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する二つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質は、ＴＲＡＰタンパク質であり、例えばＩＬ−１トラップ（例えば、リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有する；米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと。当該特許はその全体で参照により本明細書に援用される）、またはＶＥＧＦトラップ（例えばアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはｚｉｖ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する；米国特許第７，０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号を参照のこと）である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質であり、これは例えばＦｃ部分に連結された抗体の可変重鎖断片および可変軽鎖断片などの抗原結合ドメインを一つまたは複数含有する。
Ｂ．細胞培養
対象タンパク質は、「流加細胞培養」または「流加培養」で製造されてもよく、この培養は、細胞と培養培地が最初に培養管に供給され、そして追加の培養栄養素が個別の増分で培養中にゆっくりと培養物に供給される回分培養のことを指す。培養終了前に、定期的な、細胞および／または産生物の回収を伴う場合と伴わない場合がある。流加培養には「半連続的流加培養」が含まれる。この培養では定期的に全培養物（細胞と培地を含み得る）が除去され、新たな培地で置き換えられる。流加培養は、シンプルな「回分培養」とは区別される。回分培養では、細胞培養のためのすべての構成要素（動物細胞とすべて培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養管に供給される。標準的な流加培養プロセス中に培養管から上清が除去されない限りにおいては、流加培養は「灌流培養」とは異なり得る。灌流培養では、細胞は例えばろ過により培養物中に残され、培養培地が連続的に、または断続的に導入され、培養管から除去される。しかし検証目的で流加培養の細胞培養物からサンプルが除去されることは予期される。流加培養プロセスは、最大作動量および／または最大タンパク質産生に達したと決定されるまで継続され、その後、タンパク質が回収される。
対象タンパク質は、連続的細胞培養で産生されてもよい。「連続的細胞培養」という文言は、細胞を連続的に増殖させるために使用される、通常は特に増殖期で使用される技術に関する。例えば細胞の定常供給が必要とされる場合、または特定の対象タンパク質の産生が必要とされる場合、細胞培養は特定の増殖期に維持される必要がある場合がある。ゆえに細胞をその特定の相に維持するためには、その状態は連続的にモニタリングされ、状況に応じて調整されなければならない。
「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞の増殖に使用される栄養溶液を指し、典型的には、細胞増殖を強化するために必要な栄養素、例えば炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸（例えばフェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リシンおよびヒスチジン）および非必須アミノ酸（例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどを供給する。細胞培養培地は、抽出物、例えば血清またはペプトン（加水分解物）を含有してもよく、それらは細胞増殖をサポートする原材料を供給する。培地は、動物由来の抽出物の代わりに酵母由来抽出物または大豆抽出物を含有してもよい。化学的に規定された培地とは、化学的構成要素がすべて判明している（すなわち公知の化学的構造を有する）細胞培養培地を指す。化学的に規定された培地は、例えば血清由来ペプトンまたは動物由来ペプトンなどの動物に由来する構成要素を完全に含まない。一つの実施形態では、培地は、化学的に規定された培地である。
溶液は、ホルモンおよび成長因子をはじめとする、最小比率を超える増殖および／または生存を強化する構成要素も含有してもよい。培養される特定の細胞の生存と増殖に最適なｐＨと塩濃度に溶液は製剤化されてもよい。
「細胞株」とは、細胞の連続的な継代を介した、または細胞の継代培養を介した特定の系統に由来する細胞を指す。「細胞」という用語は、「細胞群」と相互交換可能に使用される。
「細胞」という用語は、組換え型核酸配列の発現に好適な任意の細胞を含む。細胞には、原核細胞および真核細胞の細胞、例えば細菌細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、またはハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。ある一定の実施形態では、細胞は，ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。他の実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球、例えばＪｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ Ｋ１細胞である。
ＩＩＩ．タンパク質薬物不純物のバリアントを特徴解析するためのシステム
マルチサブユニットの治療用タンパク質、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）系の治療剤は、その複雑な多重鎖構造、および複数の酵素改変および化学的な翻訳後修飾を受ける傾向によって、サイズに関し、本質的に不均一である。タンパク質薬物製品内のサイズバリアントのレベルは様々な生物物理学的方法によって容易に定量され得るが、それら目的物質由来不純物を明確に識別することは非常に困難である。
ｍＡｂは保存された共有結合性ヘテロ四量体構造を保有しており、各々がジスルフィド結合を介して軽鎖に共有結合されている二つのジスルフィド結合重鎖からなる。一方で、これらタンパク質はしばしば、徹底した精製工程の後であっても低レベルの目的物質由来不純物を含有している。低分子量（ＬＭＷ）種（例えば、Ｆａｂ断片、およびＦａｂアームを有さない単量体）および高分子量（ＨＭＷ）種（例えば、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体）は両方とも目的物質由来不純物の例であり、それらはｍＡｂ製品のサイズ不均一性の原因となる。タンパク質凝集の結果として治療用ｍＡｂ薬物製品内にＨＭＷ種が形成されると、潜在的に薬物の有効性と安全性の両方を損なう可能性がある（例えば望ましくない免疫原性反応の惹起など）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ，８：Ｅ５０１−７（２００６）；Ｍｏｕｓｓａ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０５：４１７−３０（２０１６；）。任意の治療用タンパク質のＬＭＷ種は、宿主細胞のプロテアーゼ活性の結果、産生中に生じる場合がある。ＬＭＷ種はしばしば、抗体の単量体型と比較して低い活性、または実質的に低い活性を有していながら、新たなエピトープを露出しており、これが免疫原性を導き、または潜在的にインビボでの薬物動態特性に影響を与える可能性がある（Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．ｍＡｂｓ，３：２５３−６３（２０１１））。結果として、ＨＭＷ種およびＬＭＷ種の両方ともが、薬物開発中に日常的にモニタリングされ、そして精製された原薬の放出試験の一環として製造中に日常的にモニタリングされる重要な品質特性とみなされている。
ｍＡｂ製品の分子量の不均一性は従来、複合的な直交分析方法により特徴解析されている（Ｍｉｃｈｅｌｓ ＤＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｓａｌａｓ−Ｓｏｌａｎｏ Ｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３３：８１５−２６（２０１２））。ｍＡｂ製品の純度の評価に最も一般的に使用されている技術の一つは、非還元条件下で実施されるＳＤＳ−ＰＡＧＥである。分析中、ＬＭＷ種に対応する小さなバンドは日常的に観察され、および定量されることができ、そうしたバンドとして抗体に関しては、Ｈ２Ｌ（２つの重鎖と１つの軽鎖）種、Ｈ２（２つの重鎖）種、ＨＬ（１つの重鎖と１つの軽鎖）種、ＨＣ（１つの重鎖）種およびＬＣ（１つの軽鎖）種が挙げられる（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ，Ｎｅｗｂｙ−Ｋｅｗ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９：１６１１−２２（２００７））。
タンパク質分解断片も観察される場合がある。それぞれの小さなバンドに対して提唱されるアイデンティティは、Ｅｄｍａｎ分解を介したＮ末端シーケンシング、ゲル内トリプシン消化後の質量分析、および抗Ｆｃ抗体と抗軽鎖抗体を使用したウェスタンブロット分析によりサポートされ得る。ただし、これらの方法から提唱される構造はすべて、インタクトなタンパク質レベルでは明確には確認できない。さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験で採用されるサンプル調製条件は、ジスルフィド結合のスクランブル化を通してＬＭＷのアーチファクトを生成させ、これによって、少数であったＬＭＷ種の過大評価が導かれてしまう可能性がある（Ｚｈｕ ＺＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ８３：８９−９５（２０１３））。
近年ではキャピラリー電気泳動−硫酸ドデシルナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥの現代版として登場し、優れた再現性、感度およびスループットをもたらしている（Ｒｕｓｔａｎｄｉ ＲＲ，Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９：３６１２−２０（２００８）；Ｌａｃｈｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３：２１８−２７（２０１０）；およびＨｕｎｔ Ｇ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ ＫＧ，Ｃｈｅｎ ＡＢ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７４４：２９５−３０１（１９９６））。ｍＡｂ製品のＣＥ−ＳＤＳ分析中に、インタクトな抗体よりも短い移動時間のマイナーピーク（ＬＭＷ型）が日常的に観察される場合がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とは異なり、これらのＬＭＷ不純物を抽出したり、さらなる分析を行うことはできない。結果として、ＣＥ−ＳＤＳ法で観察されたＬＭＷ不純物のアイデンティティも多くの場合、単に経験則に基づき提唱されているにすぎない。
最新の質量分析計によるインタクトなｍＡｂタンパク質の精密な質量測定が、最も信頼性の高い識別技術の一つとしてバイオ医薬産業ではますます普遍的になってきている（Ｋａｌｔａｓｈｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２１：３２３−３７（２０１０））；Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗ，Ｇｒｏｓｓ ＭＬ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３０８−１７（２０１４））。具体的には、様々な「複合的クロマトグラフィー−質量分析」法が、ｍＡｂ製品中のわずかな不純物を検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法またはＣＥ−ＳＤＳ法のいずれにも実現できない高度に詳細な分析を提供する能力を示している（Ｌｅ ＪＣ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１６：３０７−１１（２００５）；Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ；８：３３１−９（２０１６））。例えば、質量分析法と連結した逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を使用して、ｍＡｂ薬物製品中に存在する遊離軽鎖と、関連する翻訳後修飾（例えばシステイン化およびグルタチオン化）を検出することができる。しかしＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＣＥ−ＳＤＳ方法と比較して、ＲＰＬＣは多くの場合、ＬＭＷ種を分離するのに充分な分解能を欠いており、完全なＬＭＷプロファイルの解明を行うことはできない。例えば、ＲＰＬＣを基にしたインタクト質量分析からｍＡｂ薬物製品中のＨ２Ｌ種の特定は報告されていない。これは、その存在量の少なさ、そして主要インタクト抗体からの分解能が乏しいことが理由である。
ｍＡｂ製品由来不純物の特徴解析に期待が持てるもう一つのＭＳ系技術は、ネイティブエレクトロスプレーイオン化質量分析法（Ｎａｔｉｖｅ ＥＳＩ−ＭＳ：ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であり、この技術はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と組み合わされたときに特に有益な情報をもたらす（Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ，８：３３１−９（２０１６））。しかしネイティブＳＥＣ−ＭＳ分析で特定されたＬＭＷ種は多くの場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＣＥ−ＳＤＳで特定された種と同じではない。その理由は、それら方法の間で使用された実験条件が大きく異なるためである。具体的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＥ−ＳＤＳに必要とされるサンプル調製は多くの場合、タンパク質変性から始まる。タンパク質変性により、ＨＣ−ＬＣ対のＮ末端領域間とＨＣ−ＨＣ対のＣ末端領域間の非共有結合的相互作用が破壊される。その結果、鎖間ジスルフィド結合が破壊された場合には、ｍＡｂ分子からは例えばＨ２Ｌ、半抗体および遊離軽鎖種などのＬＭＷ不純物が解離され得る。
比較すると、ネイティブＳＥＣ−ＭＳはほぼ自然な条件下でｍＡｂサンプルを分析する。それにより、たとえ鎖間ジスルフィド結合が破壊されたとしても、強力な非共有結合性鎖間相互作用が保存され、ｍＡｂ分子の四つの鎖の構造は維持されることが可能となる。ＳＥＣカラム化学法の有利な点は、ＳＥＣ分離用の逆相クロマトグラフィーで通常に使用される変性緩衝剤（例えば３０％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、および０．１％ＴＦＡ）を使用することが可能になったこと、およびオンラインの質量分析法に直接つなげることが可能になったことである（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ−Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０：２２５８−６４（２００９）。しかしＬＣの分解能は多くのＬＭＷ種を検出するにはいまだ最適とは言えない。
これらの課題に対処するために、高性能のＳＥＣおよびＩＥＸ分離と、超高感度のネイティブＮａｎｏ−ＥＳＩ質量分析検出を組み合わせ、治療用タンパク質薬物製品の綿密で迅速な特徴解析が可能なプラットフォームが提供される。
Ａ．タンパク質薬物製品のサイズバリアントおよび電荷バリアントの特徴解析用システム
一つの実施形態では、当該システムは、ネイティブ質量分析システムと流体連結されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムまたはイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）システムを含む。当該カラムは、脱グリコシル化タンパク質を用いた使用に適している。一つの実施形態では、ＳＥＣカラムは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラム（４．６×３００ｍｍ）である。一つの実施形態では、ＩＥＸカラムは、強カチオン交換カラムである。ネイティブ質量分析システムは、ネイティブエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量分析システムであってもよい。一つの実施形態では、質量分析システムは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ質量分析計である。質量分析システムは、紫外線光検出器を含んでもよい。ＳＥＣカラムおよびＩＥＸカラムは、質量分析計への流速を調整することができる分析的フロースプリッターを介して質量分析計と流体連結されている。
一つの実施形態では、移動相は、水性移動相である。代表的な水性移動相は、１４０ｍＭの酢酸ナトリウムと１０ｍＭの重炭酸アンモニウムを含有する。ＵＶトレースは典型的には２１５ｎｍおよび２８０ｎｍで記録される。
タンパク質薬物サンプルは典型的には５〜１０ｕｇ／ｕｌである。注射濃度は典型的には５０〜１００ｕｇである。
一つの実施形態では、サイズ排除分離は、２４分間、０．２ｍＬ／分の定組成フローを使用して、室温で実施される。
一つの実施形態では、エレクトロスプレーの電圧は、エミッターの直前の液体ジャンクションティー（ｌｉｑｕｉｄ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｅ）を通して適用される。
Ｂ．タンパク質薬物製品不純物の特徴解析方法
本開示システムおよび方法を使用して、サイズバリアント、電荷バリアント、抗体−抗原結合、ＰＴＭの特徴解析、部分的に還元され、アルキル化されたｍＡｂの特徴解析、共製剤化された薬物の二量体の特徴解析、ＩｇＧ４ Ｆａｂ交換特徴解析、ならびに電荷減少を使用した高度に不均一なサンプルの特徴解析を行うことができる。酸性バリアントの原因となり、検出され、および特定され得る翻訳後修飾（ＰＴＭ）の例としては、限定されないが、Ｆａｂ領域での糖化、グルクロン化、カルボキシメチル化、シアル化、非コンセンサスグリコシル化が挙げられる。塩基性バリアントの原因となり、検出され、および特定され得るＰＴＭとしては、限定されないが、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸塩に転換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分的グリコシル化種が挙げられる。
１．サイズバリアント
一つの実施形態は、タンパク質薬物製品不純物のサイズバリアントを特徴解析するための方法を提供するものであり、当該方法は、タンパク質薬物製品サンプルを任意で脱グリコシル化する工程、水性移動相を使用したネイティブＳＥＣクロマトグラフィーによりタンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を分離させる工程、および質量分析法により、当該分離されたタンパク質成分を分析して、当該タンパク質薬物製品サンプル中のタンパク質薬物製品不純物の高分子量種、低分子量種、および中間高分子量種を特徴解析する工程、を含む。一つの実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含む。
一つの実施形態では、タンパク質薬物製品サンプルは、流加細胞培養物、連続細胞培養物、または灌流細胞培養物から採取される、または精製される。
例示的なタンパク質薬物製品としては、限定されないが、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
低分子量タンパク質薬物製品不純物の例としては、限定されないが、前駆体、分解産物、切断種、Ｆａｂ、リガンドもしくは受容体の断片または重鎖断片を含むタンパク質分解断片、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ＨＭＷ不純物の例としては、限定されないが、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体が挙げられる。
中間ＨＭＷの例としては、限定されないが、余剰軽鎖を含む単量体（Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種）、単量体とＦａｂ断片の複合体、Ｆａｂ２−Ｆａｂ２、Ｆｃ−Ｆｃ、およびＦａｂ２−Ｆｃが挙げられる。
２．電荷バリアントの特徴解析
一つの実施形態は、タンパク質薬物製品不純物の電荷バリアントを特徴解析するための方法を提供するものであり、当該方法は、任意でタンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する工程、任意で当該サンプルを化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＩｄｅＳを用いて処置する工程、水性移動相を使用したネイティブ強カチオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を分離させる工程、および質量分析法により当該分離されたタンパク質成分を分析して、当該タンパク質薬物製品サンプル中のタンパク質薬物製品不純物の電荷バリアント種を特徴解析する工程、を含む。一つの実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含む。
一つの実施形態では、タンパク質薬物製品サンプルは、流加細胞培養物、連続細胞培養物、または灌流細胞培養物から採取される、または精製される。
電荷バリアントの例としては、限定されないが、Ｆａｂ領域での糖化、グルクロン化、カルボキシメチル化、シアル化、非コンセンサスグリコシル化が挙げられる。塩基性バリアントの原因となり、検出され、および特定され得るＰＴＭとしては、限定されないが、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸塩に転換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分的グリコシル化種が挙げられる。
Ｃ．高純度のタンパク質薬物製品を製造する方法
一つの実施形態は、抗体を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、抗体を産生する細胞を例えば流加培養中で培養する工程、当該細胞培養物からサンプルを取得する工程、当該サンプル中の低分子量不純物、高分子量不純物および中間分子量不純物を、本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用して特徴解析し、定量する工程、ならびに当該細胞培養の一つまたは複数の培養条件を変更して、当該抗体の細胞培養中に産生され、特徴解析された低分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させる工程、を含む。典型的には、当該条件は、タンパク質薬物不純物が、０．０５重量％〜３０．０重量％、好ましくは０．０５重量％〜１５重量％、０．０５重量％〜１０重量％、０．０５重量％〜５重量％、または０．０５重量％〜２重量％の範囲になるように変更される。
低分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させるために変更される細胞培養の一つまたは複数の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、ガス分圧、界面活性剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一つの実施形態では、抗体産生細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。他の実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
別の実施形態は、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％のタンパク質薬物不純物を有する、本明細書に提供される方法に従い産生された抗体を提供する。
実施例１：ｍＡｂ−１原薬サンプルのＨＩＬＩＣ分離
方法
ＳＥＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラム（４．６×３００ｍｍ）で実施された。このカラムは、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムをベースとした移動相を用いて、０．２ｍＬ／分の流速で前もって平衡化された。ＩＥＸ分離は、酢酸アンモニウムをベースとした緩衝系を使用して、０．４ｍＬ／分の流速で、強カチオン交換カラム上で実施された。分析的フロースプリッターをカラムの後に接続して、流量を約１μＬ／分に減少させ、その後に、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅを備え付けられたＴｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ質量分析計による分析を行った。分析物のサイズに応じて、トラップガス圧、Ｓ−レンズＲＦレベル、インソース・フラグメンテーション、およびＨＣＤ衝突エネルギーを調整して、最適分解を実現させた。
したがって、高性能のＳＥＣおよびＩＥＸ分離と、超高感度のネイティブＮａｎｏ−ＥＳＩ質量分析検出を組み合わせることで、治療用ｍＡｂの綿密で迅速な特徴解析が可能な新技術プラットフォームが導入される。
結果
組換えＩｇＧ１ ｍＡｂ（ｍＡｂ−１）原薬サンプルをモデル分子として使用した。ＳＥＣ−ＭＳを活用することで、ｍＡｂ製品中の低レベルのサイズバリアントも効率的に主要単量体種から分離され、高感度ＭＳ検出を行うことができる。１％未満の相対的存在量で存在する高分子量種（例えば、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体）および低分子量種（例えば、Ｆａｂ断片およびＦａｂアームを有さない単量体）の両方とも、この方法によって日常的に観察およびモニタリングされることができる。特に、ｍＡｂ単量体とｍＡｂ二量体の間で溶出される興味深いカテゴリーのＨＭＷ種（中間ＨＭＷ種と名付けられる）は多くの場合、非常に低レベル（０．１％未満）で存在しているにもかかわらず、多くのｍＡｂ製品中に検出された。精密な質量測定を通じて、そうした中間ＨＭＷ種のアイデンティティが決定され、二つの群に分けられることができる：（１）余剰軽鎖を伴う単量体（Ｈ２Ｌ３種、Ｈ２Ｌ４種）；および（２）単量体とＦａｂ断片の複合体。さらに、ＩｄｅＳ酵素消化を用いた処置の後、様々な二量体化断片（Ｆａｂ２−Ｆａｂ２、Ｆｃ−ＦｃおよびＦａｂ２−Ｆｃ）も本方法でよく分離および検出されたことから、サブドメインレベルでの二量体化インターフェースが明らかとなった。
ＩＥＸ−ＭＳを活用することで、電荷バリアントの原因となる様々なＰＴＭが、インタクトなｍＡｂレベルで検出されることができる。数百のｍＡｂサンプルを分析することで、酸性バリアントの原因となるＰＴＭには、Ｆａｂ領域での糖化、グルクロン化、カルボキシメチル化、シアル化、および非コンセンサスグリコシル化が含まれることが判明した。塩基性バリアントの原因となるＰＴＭには、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸塩に転換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分的グリコシル化種が含まれることが判明した。電荷バリアントに関する研究（例えば比較可能性試験および強制分解試験）において、この新た方法は電荷バリアント型の解明に非常に強力であることが証明された。
前述の記載において、本発明はその特定の実施形態に関連付けて記載され、解説を目的として多くの詳細が提示されているが、当業者であれば、本発明はさらなる実施形態を受け入れることができること、および本明細書に記載される詳細の特定部分は、本発明の基礎となる主旨から逸脱することなく大きく変化し得ることが明白であろう。
本開示全体を通じて言及されるすべての公表文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書に引用されるすべての参照文献は、その全体を参照することにより組み込まれる。本発明は、その主旨および本質的な特質から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化されてもよく、したがって、前述の記載ではなく、本発明範囲を示す添付の請求の範囲に対して参照がなされるべきである。

Claims (23)

  1. タンパク質薬物と賦形剤とを含有するタンパク質薬物製品であって、０．０５重量％〜３０．０重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、タンパク質薬物製品。
  2. 抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質薬物製品。
  3. 前記中間分子量タンパク質薬物不純物が、Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種を含む余剰軽鎖を伴う単量体、単量体とＦａｂ断片の複合体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載のタンパク質薬物製品。
  4. 前記薬物製品が、０．０５重量％〜２５重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質薬物製品。
  5. 前記薬物製品が、０．０５重量％〜１５重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質薬物製品。
  6. 前記薬物製品が、０．０５重量％〜１０重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質薬物製品。
  7. 前記薬物製品が、０．０５重量％〜５重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質薬物製品。
  8. 中間高分子量タンパク質薬物製品不純物を特徴解析するための方法であって、
    タンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する工程と；
    前記タンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を、水性移動相を使用したネイティブサイズ排除クロマトグラフィーにより分離させる工程と；、
    前記分離されたタンパク質成分を、質量分析法により分析して、前記タンパク質薬物製品サンプル中の中間高分子量タンパク質薬物製品不純物を特徴解析する工程と
    を含む、方法。
  9. 前記タンパク質薬物製品サンプルが、流加培養からのサンプルである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記タンパク質薬物製品が、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記中間高分子量タンパク質薬物製品不純物が、Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種を含む余剰軽鎖を伴う単量体、単量体とＦａｂ断片の複合体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される中間高分子量タンパク質薬物製品不純物として特徴解析される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 抗体を作製する方法であって、
    細胞培養において前記抗体を産生する細胞を培養する工程と；
    前記細胞培養物からサンプルを取得する工程と；
    請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法に従い前記サンプル中の中間高分子量不純物を特徴解析および定量する工程と；
    前記細胞培養の一つまたは複数の培養条件を変更して、前記抗体の細胞培養中に産生されかつ特徴解析された低分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させる工程と
    を含む、方法。
  13. 中間高分子量タンパク質薬物不純物の量を減少させるために変更される前記細胞培養の前記一つまたは複数の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、ガス分圧、界面活性剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、またはＶｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
  16. 請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法により作製される抗体。
  17. ０．０５重量％〜３０．０重量％の中間高分子量タンパク質薬物不純物を含有する、請求項１６に記載の抗体。
  18. 中間高分子量薬物不純物を特徴解析するためのシステムであって、以下を含む、システム：
    水性移動相を含む移動相カラムに連結されたサイズ排除カラムを備えたネイティブサイズ排除クロマトグラフィーシステムであって、前記サイズ排除カラムは、Ｎａｎｏ−ＥＳＩ質量分析システムと流体連結されている、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーシステム。
  19. 電荷バリアント薬物不純物を特徴解析するための方法であって、
    タンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する工程と；
    前記タンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を、水性移動相を使用したネイティブ強カチオン排除クロマトグラフィーにより分離させる工程と；
    前記分離されたタンパク質成分を、Ｎａｎｏ−ＥＳＩ質量分析法により分析して、前記タンパク質薬物製品サンプル中の電荷バリアントタンパク質薬物製品不純物を特徴解析する工程と
    を含む、方法。
  20. 前記タンパク質薬物製品サンプルが、流加培養からのサンプルである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記タンパク質薬物製品が、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記中間高分子量タンパク質薬物製品不純物が、Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種を含む余剰軽鎖を伴う単量体、単量体とＦａｂ断片の複合体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される中間高分子量タンパク質薬物製品不純物として特徴解析される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記水性移動相が、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含有する、請求項８〜１１および１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
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