JP7321159B2 - 薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステム及び方法 - Google Patents

薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステム及び方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は概して、タンパク質分離方法及び細胞培養方法を対象とする。
発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ここ２０年にわたって、広範囲の治療領域を標的として成功裏に用いられてきた（Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：９９２－１０００（２０１４）（非特許文献1）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：３８０－２（２００７）（非特許文献2））。ｍＡｂは、それぞれジスルフィド結合を通して軽鎖に共有結合的に連結されているジスルフィド連結した２つの重鎖からなる保存共有結合ヘテロ四量体構造を保有しているが、これらのタンパク質は、多くの場合、大規模な精製工程の後であっても低いレベルの生成物関連不純物を含有する。低分子量（ＬＭＷ）種（例えば、ペプチド骨格切断断片）及び高分子量（ＨＭＷ）種（例えば、抗体二量体種）はいずれも、ｍＡｂ生成物のサイズ不均一性に寄与する生成物関連不純物の例である。タンパク質凝集の結果としての、治療用ｍＡｂの薬剤生成物内でのＨＭＷ種の形成は、薬効及び安全性の両方を潜在的に損なう可能性がある（例えば、望ましくない免疫原性応答を引き起こす）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ，８：Ｅ５０１－７（２００６）（非特許文献3）；Ｍｏｕｓｓａ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５：４１７－３０（２００６）（非特許文献4））。任意の治療用タンパク質のＬＭＷ種は、生成の際に宿主細胞プロテアーゼ活性から得られることがある。ＬＭＷ種は、免疫原性につながり得るまたはｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態特性に潜在的に影響し得る新規のエピトープを露出させる一方で、多くの場合、抗体の単量体形態と比較して低いまたは実質的に低減された活性を有する（Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．ｍＡｂｓ，３：２５３－６３（２０１１）（非特許文献5））。その結果、ＨＭＷ種及びＬＭＷ種は、いずれも、薬剤開発の際に、また、製造の際に精製原薬の放出試験の一部として、常套的にモニタリングされる非常に重要な品質特性であるとされている。
ｍＡｂ生成物の分子量の不均一性は、複数の直交分析法によって伝統的に特性決定されている（Ｍｉｃｈｅｌｓ ＤＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｓａｌａｓ－Ｓｏｌａｎｏ Ｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３３：８１５－２６（２０１２）（非特許文献6））。ｍＡｂ生成物の純度を評価するのに最も一般的に使用されている技術の１つがＳＤＳ－ＰＡＧＥであり、これは、非還元条件下に実施される。分析の際、抗体に関して、Ｈ２Ｌ（２種類の重鎖及び１種類の軽鎖）、Ｈ２（２種類の重鎖）、ＨＬ（１種類の重鎖及び１種類の軽鎖）、ＨＣ（１種類の重鎖）、ならびにＬＣ（１種類の軽鎖）種を含めたＬＭＷ種に相当する副バンドが常套的に観察及び定量化され得る（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ－Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ，Ｎｅｗｂｙ－Ｋｅｗ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，２９：１６１１－２２（２００７）（非特許文献7））。タンパク質分解断片も観察される場合がある。各副バンドの提案されている同一性は、エドマン分解を介したＮ末端シーケンシング、インゲルトリプシン消化、続いて質量分光分析、ならびに抗Ｆｃ及び抗軽鎖抗体を使用したウェスタンブロット分析によって支持され得る。しかし、これらの方法から得られるいずれの提案されている構造も、インタクトタンパク質レベルにおいて明確に確認され得ない。さらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ実験において用いられるサンプル調製条件は、ジスルフィド結合のスクランブリングを通してＬＭＷアーチファクトを生じさせる可能性があり、副ＬＭＷ種の過大評価につながり得る（Ｚｈｕ ＺＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，８３：８９－９５（２０１３）（非特許文献8））。より最近では、キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの現代の等価物として出現しており、優れた再現性、感度及びスループットを与えている（Ｒｕｓｔａｎｄｉ ＲＲ，Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９：３６１２－２０（２００８）（非特許文献9）；Ｌａｃｈｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，３３：２１８－２７（２０１０）（非特許文献10）；Ｈｕｎｔ Ｇ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ ＫＧ，Ｃｈｅｎ ＡＢ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７４４：２９５－３０１（１９９６）（非特許文献11））。ｍＡｂ生成物のＣＥ－ＳＤＳ分析の際、インタクト抗体よりも短い移動時間を有する副ピーク（ＬＭＷ形態）が常套的に観察され得る。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析とは異なり、これらのＬＭＷ不純物は、抽出され得ず、またはさらなる分析に供され得ない。その結果、ＣＥ－ＳＤＳ方法において観察されるＬＭＷ不純物の同一性は、多くの場合、単に経験的知識に基づいて提案されている。そのため、ｍＡｂ生成物におけるＬＭＷ不純物を直接分離して明確に同定する直交法は、抗体生成物の開発の際に製造方法の制御を確保するのに必須である。
現代の質量分析計によるインタクトｍＡｂタンパク質の正確な質量測定は、最も信頼性のある同定法の１つとして、バイオ医薬品業界においてますます一般的になってきている（Ｋａｌｔａｓｈｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２１：３２３－３７（２０１０）（非特許文献12））；Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗ，Ｇｒｏｓｓ ＭＬ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３０８－１７（２０１４）（非特許文献13））。具体的には、種々の「ハイフンで結ばれた（hyphenated）クロマトグラフィ－質量分析」方法は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＣＥ－ＳＤＳのいずれの方法によっても達成され得ない、ｍＡｂ生成物における少量の不純物を検出して非常に詳細な分析を提供する能力を実証している（Ｌｅ ＪＣ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１６：３０７－１１（２００５）（非特許文献14）；Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ，８：３３１－９（２０１６）（非特許文献15））。例えば、質量分析と結ばれた逆相クロマトグラフィ（ＲＰＬＣ）は、ｍＡｂ薬剤生成物に存在する遊離軽鎖及び関連する翻訳後修飾（例えば、システイン化及びグルタチオン化）を検出するのに使用され得る。しかし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳ方法と比較して、ＲＰＬＣは、多くの場合、ＬＭＷ種を分離するために十分な分解能を欠いており、そのため、完全なＬＭＷプロファイルは解明できない。例えば、ｍＡｂ薬剤生成物におけるＨ２Ｌ種の同定は、その低い存在度、及び主なインタクト抗体からの乏しい分解能に起因して、ＲＰＬＣベースのインタクト質量分析によって報告されたことがない。ｍＡｂ生成物関連不純物を特性決定するのに有望である別のＭＳベースの技術は、ネイティブエレクトロスプレーイオン化質量分析（ネイティブＥＳＩ－ＭＳ）であり、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）と結ばれると、特に有益である（Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ，８：３３１－９（２０１６）（非特許文献15））。しかし、ネイティブＳＥＣ－ＭＳ分析において同定されるＬＭＷ種は、多くの場合、使用される実験条件が方法間で大幅に異なることに起因して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＣＥ－ＳＤＳによって同定されるものと同じではない。具体的には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳに必要とされるサンプル調製は、多くの場合、タンパク質変性から始まり、ＨＣ－ＬＣ対のＮ末端領域とＨＣ－ＨＣ対のＣ末端領域との間の非共有結合的相互作用が破壊される。その結果、鎖間ジスルフィド結合が破壊されると、ＬＭＷ不純物、例えば、Ｈ２Ｌ、半抗体、及び遊離軽鎖種が、ｍＡｂ分子から解離し得る。比較すると、ネイティブＳＥＣ－ＭＳは、ほぼネイティブな条件下でｍＡｂサンプルを分析して、強い非共有結合的鎖間相互作用が保存されることを許容し、また、鎖間ジスルフィド結合が破壊されてもｍＡｂ分子の４鎖構造が維持されることを可能にする。ＳＥＣカラム化学の発展は、ＳＥＣ分離及びオンライン質量分光分析との直接の組み合わせのために逆相クロマトグラフィにおいて通常使用される変性緩衝剤（例えば、３０％のアセトニトリル、０．１％のＦＡ及び０．１％のＴＦＡ）を使用することを可能にしたが（Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ－Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０：２２５８－６４（２００９）（非特許文献16））、ＬＣの分解能は、多くのＬＭＷ種を検出するには依然として最適に満たない。
そのため、本発明の目的は、ＬＭＷタンパク質薬剤不純物の特性決定のためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の別の目的は、不純物レベルが低減されたタンパク質薬剤生成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、タンパク質薬剤生成物不純物が低減されたタンパク質薬剤生成物を生成する方法を提供することである。
Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：９９２－１０００（２０１４） Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：３８０－２（２００７） Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ，８：Ｅ５０１－７（２００６） Ｍｏｕｓｓａ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５：４１７－３０（２００６） Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．ｍＡｂｓ，３：２５３－６３（２０１１） Ｍｉｃｈｅｌｓ ＤＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｓａｌａｓ－Ｓｏｌａｎｏ Ｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３３：８１５－２６（２０１２） Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ－Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ，Ｎｅｗｂｙ－Ｋｅｗ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，２９：１６１１－２２（２００７） Ｚｈｕ ＺＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，８３：８９－９５（２０１３） Ｒｕｓｔａｎｄｉ ＲＲ，Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９：３６１２－２０（２００８） Ｌａｃｈｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，３３：２１８－２７（２０１０） Ｈｕｎｔ Ｇ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ ＫＧ，Ｃｈｅｎ ＡＢ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７４４：２９５－３０１（１９９６） Ｋａｌｔａｓｈｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２１：３２３－３７（２０１０） Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗ，Ｇｒｏｓｓ ＭＬ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３０８－１７（２０１４） Ｌｅ ＪＣ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１６：３０７－１１（２００５） Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ，８：３３１－９（２０１６） Ｌｉｕ Ｈ，Ｇａｚａ－Ｂｕｌｓｅｃｏ Ｇ，Ｃｈｕｍｓａｅ Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０：２２５８－６４（２００９）
低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステム及び方法が提供される。一実施形態は、質量分光分析と結ばれた親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）を使用する。タンパク質薬剤生成物、例えば抗体薬剤生成物からのＮ連結型グリカンの除去後、ＨＩＬＩＣカラムからのＬＭＷ不純物の溶出を当該分子量種のサイズによって決定する。いくつかの実施形態において、ＨＩＬＩＣ分離を変性条件下で実施して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳの両方法に高度に匹敵するこの方法を使用してＬＭＷ形態の検出を行う。ＬＭＷ薬剤生成物不純物として、限定されないが、軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、ペプチド骨格切断種、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
開示されているＨＩＬＩＣ－ＭＳシステム及び方法は、詳細なＬＭＷ同定情報を提供する。ＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析によって明らかにされる信頼性のある同定及び詳細な構造情報は、タンパク質薬剤生成物におけるＬＭＷ不純物の綿密な特性決定に非常に価値があり、多くの場合、後期の分子開発に必要とされる。さらに、開示されているＨＩＬＩＣ－ＭＳシステム及び方法は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＣＥ－ＳＤＳのいずれよりも穏やかなサンプル調製を使用するため、ＬＭＷアーチファクトを生じる可能性が低い。ＨＩＬＩＣ－ＭＳシステム及び方法は、サンプル間でＬＭＷ不純物プロファイルを比較するための半定量分析として使用されても、単に定量的に適用されてもよい。
一実施形態は、タンパク質薬剤及び賦形剤を含有するタンパク質薬剤生成物であって、約０．０５～約３０．０％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、上記タンパク質薬剤生成物を提供する。タンパク質薬剤生成物は、抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、上記薬剤生成物は、約０．０５％～約２５％、または約０．０５％～約１５％、または約０．０５％～約１０％、または約０．０５％～約５％、または約１～約２５％、約１～約１５％、約１～約１０％、または約１～約５％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含有する。
別の実施形態は、低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するための方法であって、
ｉ）タンパク質薬剤生成物サンプルを脱グリコシル化する工程、
ｉｉ）タンパク質薬剤生成物サンプルのタンパク質成分を親水性相互作用クロマトグラフィによって分離する工程、及び
ｉｉｉ）分離されたタンパク質成分を質量分析によって分析して、タンパク質薬剤生成物サンプルにおける低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定する工程
を含む、上記方法を提供する。
上記方法は、随意の還元工程をさらに提供する。還元工程は、工程ｉ）と工程ｉｉ）との間に行われてよい。タンパク質薬剤生成物サンプルは、流加バッチ培養から採取され得る。上記で記述されているように、タンパク質薬剤生成物は、抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。
さらに別の実施形態は、抗体を産生する方法であって、抗体を産生する細胞を細胞培養において培養する工程、細胞培養からサンプルを得る工程、サンプルにおける低分子量不純物を上記に記載されている方法によって特性決定及び定量化する工程、ならびに、細胞培養の１つ以上の培養条件を変更して、抗体の細胞培養の際に産生される、特性決定される低分子タンパク質薬剤不純物の量を低減する工程、を含む、上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、サンプルは、任意の間隔で細胞培養の際に採取される。他の実施形態において、サンプルは、産生培養の後、タンパク質収集の後または精製後に採取される。低分子量タンパク質薬剤不純物の量を低減するように変化させる、細胞培養の１つ以上の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、かき混ぜ、ガス分圧、界面活性剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。細胞は、真核性または原核性であり得る。細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ８０６５細胞、ＨＬ－６０細胞、リンパ細胞、例えば、自家Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（上皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、及び上記細胞のいずれかに由来する細胞株であり得る。一実施形態において、細胞は、ハイブリドーマまたはクアドローマ細胞である。さらに別の実施形態は、本明細書に記載されている方法によって産生される抗体を提供する。
なお別の実施形態は、低分子量薬剤不純物を特性決定するためのシステムを提供する。システムは、本明細書において例示されている移動相Ａ及び移動相Ｂと連結している親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）カラムを含む親水性相互作用液体クロマトグラフィシステムを含み、ＨＩＬＩＣカラムは、質量分析システムと流体連通している。
なお別の実施形態において、本発明は、本発明による方法の、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明によるシステムの、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための使用に関する。
[本発明1001]
タンパク質薬剤及び賦形剤を含むタンパク質薬剤生成物であって、0．05％～30．0％（ｗ／ｗ）の低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、前記タンパク質薬剤生成物。
[本発明1002]
抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001のタンパク質薬剤生成物。
[本発明1003]
前記低分子量タンパク質薬剤不純物が、分解産物、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ2Ｌ、Ｈ2、ＨＬ、ＨＣ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001または1002のタンパク質薬剤生成物。
[本発明1004]
0．05％～25％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、本発明1001～1003のいずれかのタンパク質薬剤生成物。
[本発明1005]
0．05％～15％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、本発明1001～1004のいずれかのタンパク質薬剤生成物。
[本発明1006]
0．05％～10％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、本発明1001～1005のいずれかのタンパク質薬剤生成物。
[本発明1007]
0．05％～5％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、本発明1001～1006のいずれかのタンパク質薬剤生成物。
[本発明1008]
低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するための方法であって、以下：
ｉ）タンパク質薬剤生成物サンプルを脱グリコシル化する工程；
ｉｉ）前記タンパク質薬剤生成物サンプルのタンパク質成分を親水性相互作用クロマトグラフィによって分離する工程；
ｉｉｉ）前記分離されたタンパク質成分を質量分析によって分析する工程であって、前記タンパク質薬剤生成物サンプルにおける低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定する、工程
を含み、前記タンパク質薬剤生成物が、本発明1001～1007のいずれかに定義されている通りである、前記方法。
[本発明1009]
前記タンパク質薬剤生成物サンプルが、流加バッチ培養からのものである、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記タンパク質薬剤生成物が、抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記低分子量タンパク質薬剤生成物不純物が、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ2Ｌ、Ｈ2、ＨＬ、ＨＣ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される低分子量タンパク質薬剤生成物不純物として特性決定される、本発明1008～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
抗体を産生する方法であって、以下：
ｉ）前記抗体を産生する細胞を細胞培養において培養する工程；
ｉｉ）前記細胞培養からサンプルを得る工程；
ｉｉｉ）前記サンプルにおける低分子量不純物を本発明1008～1011のいずれかの方法によって特性決定する工程及び定量化する工程、ならびに
ｉｖ）前記細胞培養の1つ以上の培養条件を変更する工程であって、前記抗体の細胞培養の際に産生される特性決定される低分子タンパク質薬剤不純物の量を低減する、工程
を含む、前記方法。
[本発明1013]
低分子量タンパク質薬剤不純物の量を低減するように変化させる、前記細胞培養の前記1つ以上の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、かき混ぜ、ガス分圧、界面活性剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ1、ＤＸＢ－11ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－7）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ1細胞、腎細胞（例えば、ＨＥＫ293、293ＥＢＮＡ、ＭＳＲ293、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ21）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ2細胞、ＷＩ38細胞、ＭＲＣ5細胞、Ｃｏｌｏ25細胞、ＨＢ8065細胞、ＨＬ－60細胞、リンパ細胞、例えば、自家Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ431（上皮）細胞、Ｕ937細胞、3Ｔ3細胞、Ｌ細胞、Ｃ127細胞、ＳＰ2／0細胞、ＮＳ－0細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、及び前記細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、本発明1012または1013の方法。
[本発明1015]
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、本発明1012～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
本発明1012～1015のいずれかの方法によって産生される抗体。
[本発明1017]
0．05～30．0％（ｗ／ｗ）の低分子量タンパク質薬剤不純物を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1018]
低分子量薬剤不純物を特性決定するためのシステムであって：
少なくとも2つの移動相カラムに連結された親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）カラムを含む親水性相互作用液体クロマトグラフィシステム
を含み、前記ＨＩＬＩＣカラムが、質量分析システムと流体連通している、前記システム。
[本発明1019]
本発明1008～1011のいずれかの方法の、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための、使用。
[本発明1020]
本発明1018のシステムの、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための、使用。
図１Ａ及びＢは、ｍＡｂ－１原薬サンプルのＨＩＬＩＣ分離のクロマトグラムである。図１Ａは、紫外線プロファイルであり、図１Ｂは、ＨＩＬＩＣプロファイルである。図１ＡにおいてＵＶシグナルを１０倍に増幅して、ＬＭＷ不純物をより良好に可視化した。 最も豊富な電荷状態のｍ／ｚを使用した、異なる軽鎖変異体の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。 β脱離による軽鎖のデコンボリューションマススペクトルを示す。 ２－メルカプト酢酸によって修飾された軽鎖、未修飾軽鎖、及び切り取られたＣ末端残基を有する軽鎖のデコンボリューションマススペクトルを示す。 システイン化による軽鎖のデコンボリューションマススペクトルを示す。 グルタチオン化による軽鎖のデコンボリューションマススペクトルを示す。 Ｆａｂ断片のデコンボリューションマススペクトルを示す。 半抗体のデコンボリューションマススペクトルを示す。 Ｆａｂ切断断片のデコンボリューションマススペクトルを示す。 Ｈ２のデコンボリューションマススペクトルを示す。 ＤＴＴ（矢印番号１）及びＬ－システイン（矢印番号２）によって処理した脱グリコシル化ｍＡｂ－１サンプルのＨＩＬＩＣ－ＵＶ分析を示す。矢印番号３は、未処理ｍＡｂ－１によるトレースを示す。未処理サンプル及びＬ－システイン処理サンプルのシグナルをそれぞれ１０倍及び２倍増幅して、ＬＭＷ不純物をより良好に可視化した。 図５ＡはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定された軽鎖種を示す。図５ＢはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定された重鎖種を示す。図５ＣはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定された半抗体種を示す。 図５ＤはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定された重鎖二量体種を示す。図５ＥはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定されたＨ２Ｌ種を示す。図５ＦはＤＴＴによって処理した後のｍＡｂ－１のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において同定された完全抗体種を示す。 図６Ａは、非還元条件下でのＬｙｓ－Ｃ消化からの軽鎖Ｃ末端ペプチドのＭＳ２スペクトルを示し、ここでＣ末端Ｃｙｓは、ヨードアセトアミドによって修飾されている。図６Ｂは、非還元条件下でのＬｙｓ－Ｃ消化からの軽鎖Ｃ末端ペプチドのＭＳ２スペクトルを示し、ここでＣ末端Ｃｙｓは、＋８９．９８Ｄａの未知の修飾によって修飾されている。 図７Ａは、＋８９．９８Ｄａ非還元Ｌｙｓ－Ｃ消化物の未知の修飾による軽鎖Ｃ末端ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。図７Ｂは、非還元Ｌｙｓ－Ｃ消化物の還元からの＋８９．９８Ｄａの未知の修飾による軽鎖Ｃ末端ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。 未知の修飾について提案された構造（２－メルカプト酢酸）である。 例示的なＨＩＬＩＣ－ＭＳシステムである。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
現在特許請求している発明を説明する文脈における（特に特許請求の範囲の文脈における）用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び同様の指示対象の使用は、本明細書において別途示さない限りまたは文脈によって明確に反論しない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途示さない限り、当該範囲内にあるそれぞれ別個の値を個別に参照する簡単な方法として機能することが単に意図されており、それぞれ別個の値は、あたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
用語「約」の使用は、およそ±１０％の範囲内の、記述されている値を超えるまたは当該値未満のいずれかの値を記載することが意図されており；他の実施形態において、上記値は、およそ±５％の範囲内の、記述されている値を超えるまたは当該値未満のいずれかの値の範囲であってよく；他の実施形態において、上記値は、およそ±２％の範囲内の、記述されている値を超えるまたは当該値未満のいずれかの値の範囲であってよく；他の実施形態において、上記値は、およそ±１％の範囲内の、記述されている値を超えるまたは当該値未満のいずれかの値の範囲であってよい。前述の範囲は、文脈によって明らかになることが意図されており、さらなる限定は暗示されていない。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において別途示さない限りまたは別途文脈によって明確に反論しない限り、いずれの好適な順序で実施されてもよい。ありとあらゆる例、または本明細書において提供されている例示的な語（例えば、「例えば」）の使用は、単に、本発明をより良好に明らかにすることが意図されており、別途特許請求の範囲に記載されていない限り本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。明細書におけるいずれの語も、本発明の実施に必須であるとしていずれかの特許請求の範囲に記載されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
用語「低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬剤不純物」には、限定されないが、前駆体、分解産物、切断された種、Ｆａｂ断片、Ｆｃまたは重鎖断片を含めたタンパク質分解断片、リガンドまたは受容体断片、Ｈ２Ｌ（２種類の重鎖及び１種類の軽鎖）、Ｈ２（２種類の重鎖）、ＨＬ（１種類の重鎖及び１種類の軽鎖）、ＨＣ（１種類の重鎖）、及びＬＣ（１種類の軽鎖）種が含まれる。ＬＭＷタンパク質薬剤不純物は、タンパク質生成物の不完全なバージョンであるいずれかの変異体、例えば、多量体タンパク質の１つ以上の構成要素であり得る。タンパク質薬剤不純物、薬剤不純物、または生成物不純物は、明細書を通して互換可能に使用され得る用語であり、これらには、ＬＭＷタンパク質薬剤不純物が含まれる。ＬＭＷの薬剤不純物または生成物不純物は、概して、所望の薬剤生成物の特性とは異なり得る特性、例えば、活性、効能、及び安全性を有する分子変異体であるとされている。
タンパク質生成物の分解は、細胞培養システムにおけるタンパク質薬剤生成物の生成の際に問題になる。例えば、タンパク質生成物のタンパク質分解は、細胞培地におけるプロテアーゼの放出に起因して起こり得る。培地添加物、例えば、メタロプロテアーゼを阻害するために添加される可溶性鉄源、またはセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤が、分解を防止するために細胞培養において組み込まれてきた（Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｍ．－Ｆ．，ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．２０１１，５，Ｐ１１５）。Ｃ末端断片は、細胞培養におけるカルボキシルペプチダーゼに起因して産生の際に開裂され得る（Ｄｉｃｋ，ＬＷ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８；１００：１１３２－４３）。続いて、ＬＭＷ不純物をプロファイル及びモニタリングする必要がある。
「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに接続した２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質は、ポリペプチド及びペプチドを含み、修飾、例えば、グリコシル化、脂質付着、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ－リボシル化を含んでいてもよい。タンパク質は、タンパク質ベースの薬剤を含めて、科学的または商業的な対象であり得、タンパク質には、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体及びキメラまたは融合タンパク質が含まれる。タンパク質は、周知の細胞培養方法を使用して種々のタイプの組み換え細胞によって産生され、概して、遺伝子組み換え技術によって細胞内に導入され（例として、例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロン不含配列など）、ここで、エピソームとして存在していても細胞のゲノム内に一体化されていてもよい。
「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は１つのドメインからなる（ＣＬ）。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が組み込まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に、さらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ終端からカルボキシ終端まで以下の順序で配置されている、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスの、グリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。用語「抗体」には、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体が含まれる。用語「抗体」にはまた二重特異性抗体も含まれ、これは、１種類を超える異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む。二重特異性抗体は、参照によりこの出願に組み込まれる米国特許出願公開公報第２０１０／０３３１５２７号に概して記載されている。
「Ｆｃ融合タンパク質」は、さもなければ本質的に一緒には見られない、２種類以上のタンパク質の部分または全てを含んでおり、その一方が免疫グロブリン分子のＦｃ部である。（Ｆｃドメインを含む）抗体由来のポリペプチドの種々の部に融合するある特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８： １０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１ － １０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部位にカップリングした、受容体の１以上の細胞外ドメイン（複数可）を含み、ここで、いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンのヒンジ領域、続いてＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、１種類以上のリガンド（複数可）に結合する、２種類以上の違った受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、トラップ、例えば、ＩＬ－１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどである。
「細胞培養」は、容器、例えば、フラスコまたはバイオリアクターにおける細胞の繁殖または増殖を指し、限定されないが、流加バッチ培養、連続培養、灌流培養などを含む。
用語「ＨＩＬＩＣまたはＨＩＬＩＣクロマトグラフィ」は、親水性相互作用液体クロマトグラフィまたは親水性相互作用クロマトグラフィを指し、当該分野の周知の用語とされる。
対象となるタンパク質
原核性または真核性細胞における発現に好適な、対象となるいずれのタンパク質も、提供される遺伝子組み換え宿主細胞システムにおいて使用されてよい。例えば、対象となるタンパク質として、限定されないが、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃ融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または、細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片が挙げられる。対象となるタンパク質は、単一のサブユニットからなる簡単なポリペプチド、または２つ以上のサブユニットを含む複合マルチサブユニットタンパク質であってよい。対象となるタンパク質は、バイオ医薬製品、食品添加物もしくは防腐剤、または精製及び品質基準の規制下にある任意のタンパク質生成物であってよい。
いくつかの実施形態において、タンパク質生成物（対象となるタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリボディもしくはテトラボディ、Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載されている抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗ＤＬＬ４抗体、抗アンジオポエチン２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されている抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されている抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されている抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されている抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載されている抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／００４４７３０Ａ１号に記載されている抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長分化因子８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または同第９，２６０，５１５号に記載されている、抗ミオスタチン抗体としても公知である抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１号または同第ＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されている抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１号または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは同第８，９４５，５５９号に記載されている抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号または同第９，１７３，８８０号に記載されている抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／０２７１６５８Ａ１号または同第ＵＳ２０１４／０２７１６４２Ａ１号に記載されている抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／０２７１６５３Ａ１号に記載されている抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載されている抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されている抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されている抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されている）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載されている抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１６／０２１５０４０号に記載されている）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１６／００１７０２９号ならびに米国特許第８，３０９，０８８号及び同第９，３５３，１７６号に記載されている抗ＮＧＦ抗体）ならびに抗アクチビンＡ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開公報第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載されている）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、及び抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－アット、アド－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エムタンシンアリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、Ｆｃ部位及び別のドメインを含有する組み換えタンパク質である（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部位に結合した、受容体の１種類以上の細胞外ドメイン（複数可）を含有する、受容体Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部位は、ＩｇＧのヒンジ領域、続いてＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２種類以上の違った受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト；全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプトもしくはｚｉｖ－アフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号及び同第７，２７９，１５９号を参照されたい）などのＴＲＡＰタンパク質である。他の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部位に結合した、抗体の１つ以上の抗原結合ドメイン（複数可）、例えば、可変重鎖断片及び可変軽鎖断片のうち１つ以上を含有するＳｃＦｖ－Ｆｃ－融合タンパク質である。
細胞培養
タンパク質産生において、「流加バッチ細胞培養」または「流加バッチ培養」は、細胞及び培地が培養容器に最初に供給され、さらなる培養栄養素が、周期的な細胞及び／もしくは生成物収集を伴ってまたは伴わずに培養の際に培養物に別々の増分でゆっくり流加され、その後培養が終了する、バッチ培養を指す。流加バッチ培養には、周期的に培養全体（細胞及び培地を含んでいてよい）が取り出されて新たな培地によって置き換えられる「半連続流加バッチ培養」が含まれる。流加バッチ培養は、単純な「バッチ培養」と区別される一方で、細胞培養の全成分（動物細胞及び全ての培養栄養素を含む）が、バッチ培養において培養プロセスの開始時に培養容器に供給される。流加バッチ培養は、上清が標準の流加バッチプロセスの際に培養容器から除去されない限り、「灌流培養」とは異なり得るが、灌流培養においては、細胞が、例えば濾過によって培養物中に留め置かれ、培地が、培養容器から連続的または間欠的に導入及び取り出される。しかし、流加バッチ細胞培養の際には試験プロセスのためのサンプルの取り出しが企図される。流加バッチプロセスは、最大作業体積及び／またはタンパク質産生に達したと決定されるまで継続し、タンパク質が続いて収集される。
句「連続細胞培養」は、通常は特に成長期において細胞を連続的に成長させる技術に関する。例えば、一定の細胞供給が必要とされる、または対象となる特定のタンパク質の産生が必要とされるとき、細胞培養は、特定の成長期における管理を必要とし得る。そのため、当該特定の時期に細胞を維持するために、したがって条件が連続的にモニタリング及び調整されなければならない。
用語「細胞培地」及び「培地」は、細胞の成長を高めるのに必要な栄養素、例えば、炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、及びヒスチジン）ならびに非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどを典型的には提供する、哺乳類細胞を成長させるのに使用される栄養溶液を指す。細胞培地は、細胞成長を支持する原料を供給する抽出物、例えば血清またはペプトン（加水分解物）を含有し得る。培地は、動物由来抽出物の代わりに、酵母由来または大豆抽出物を含有し得る。化学的に定義されている培地は、化学成分の全てが公知である（すなわち、公知の化学構造を有する）細胞培地を指す。化学的に定義されている培地は、動物由来成分、例えば、血清または動物由来ペプトンを全く含まない。一実施形態において、培地は、化学的に定義されている培地である。
溶液はまた、ホルモン及び成長因子を含めた、成長及び／または生存を最小の割合を超えて高める成分を含有していてもよい。溶液は、培養されている特定の細胞の生存及び増殖に最適なｐＨ及び塩濃度に調合され得る。
「細胞株」は、細胞の連続継代または継代培養を通して特定の系統に由来する細胞（複数可）を指す。用語「細胞」は、「細胞集団」と互換可能に使用される。
用語「細胞」は、組み換え核酸配列を発現するのに好適ないずれの細胞も含む。細胞には、原核生物及び真核生物のもの、例えば、細菌細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細胞融合、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどなどが含まれる。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。他の実施形態において、細胞は、以下の細胞から選択される：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、リンパ、例えば、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（上皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、及び上記細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態において、細胞は、ＣＨＯ Ｋ１細胞である。
ＩＩ．低分子量タンパク質薬剤不純物を特性決定するためのシステム
マルチサブユニットの治療用タンパク質、特に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの治療剤は、その複雑な多連鎖構造、ならびに複数の酵素的及び化学的翻訳後修飾を受け入れる傾向に起因して、サイズに関して本質的に不均一である。ｍＡｂ薬剤生成物内でのサイズの変化のレベルは、種々の生物物理的方法によって容易に定量化され得るが、これらの生成物関連不純物の一義的な同定は特に困難であった。
質量分光分析と結ばれた親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）を使用して、精製原薬ロット内に存在する、低いレベルの、より低分子量（ＬＭＷ）の不純物を同定した。Ｎ連結型グリカンの除去後、ＨＩＬＩＣ法により、サイズに基づく溶出順序でｍＡｂ関連のＬＭＷ不純物を分離する。高分解能精密質量分析計による続いての質量分析は、単独のＬＣ－ＭＳ分析において種々の少量のＬＭＷ不純物の直接かつ一義的な同定を与える。切断部位及び関連する翻訳後修飾を含めた、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ種（単一の軽鎖を保有する抗体）及びペプチド骨格切断種は、全てが、より詳細に、明確に同定及び解明され得る。常套的な純度アッセイ（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳ）によって取得され得ないかかる詳細な情報は、ＬＭＷ不純物がどのように形成されるかを解明するのに非常に重要であり、この新しい方法を価値のあるものとして、分析的な特性決定のポートフォリオへ追加する。これは、Ｈ２Ｌ種を事前の富化を伴わずにインタクト質量分析によってｍＡｂ原薬サンプルにおいて直接検出した、という最初の公知の報告である。
Ａ．ＬＭＷ不純物を特性決定するためのシステム
当該システムは、移動相Ａ及び移動相Ｂに連結された親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）カラムを含む親水性相互作用液体クロマトグラフィシステムを含み、ＨＩＬＩＣカラムは、質量分析システムと流体連通している。ＨＩＬＩＣカラムは、脱グリコシル化タンパク質との使用に好適である。一実施形態において、開示されているシステムは、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ（商標）ＵＰＬＣシステムを有するＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ（商標）ＵＰＬＣ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｍｉｄｅカラム（３００Å、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を含有する。当該カラムは、典型的には、６０℃で操作される。例示的な移動相には、移動相Ａとして水中０．１％のＴＦＡ、移動相Ｂとしてアセトニトリル中０．１％のＴＦＡが含まれ、流量を０．２ｍＬ／分に設定した。ＵＶトレースは、典型的には、２１５及び２８０ｎｍで記録される。一実施形態において、分離は、１５％のＡで最初の０．５分の保持、続いての、次の０．５分かけての２５％のＡまでの増加、及び次の４０分かけての４０％のＡまでの別の線形的増加により、５５分かけて達成される。勾配は、１分かけて１００％のＡまで傾斜させ、２分間保持し、その後、１分で１５％のＡに降下させ、次いで１０分超の間、最初の状態で維持して、次の稼働のためにカラムを平衡化することができる。
ＵＰＬＣは、質量分析計、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計に直接接続される。キャピラリー電圧は、４０任意単位のシースガス流量及び１５任意単位の補助ガス流量で、典型的には４．０ｋＶに設定される。キャピラリー温度は、概して３５０℃に設定され、プローブヒータ温度は、概して４００℃に設定される。質量スペクトルはｍ／ｚ８００～４０００の質量範囲で取得される。一実施形態において、生データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓによって開発されたＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ソフトウェアを使用してデコンボリューションされる。
Ｂ．ＬＭＷ不純物を特性決定する方法
開示されているシステム及び方法は、ＬＭＷタンパク質薬剤不純物を特性決定するのに使用され得る。一実施形態は、低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するための方法であって、タンパク質薬剤生成物サンプルを脱グリコシル化する工程、タンパク質薬剤生成物サンプルのタンパク質成分を親水性相互作用クロマトグラフィによって分離する工程、及び、分離されたタンパク質成分を質量分析によって分析して、タンパク質薬剤生成物サンプルにおける低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定する工程、を含む、上記方法を提供する。一実施形態において、タンパク質薬剤生成物サンプルは、流加バッチ細胞培養、連続細胞培養または灌流細胞培養から採取または精製される。例示的なタンパク質薬剤生成物として、限定されないが、抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせが挙げられる。例示的な低分子量タンパク質薬剤生成物不純物として、限定されないが、前駆体、分解産物、切断された種、Ｆａｂ、リガンドまたは受容体断片または重鎖断片を含めたタンパク質分解断片、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
別の実施形態は、サンプルを還元する工程を含む。例示的な還元剤として、限定されないが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ３４８３－１２－３）、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、２ＢＭＥ、２－ＭＥ、ｂ－ｍｅｒ、ＣＡＳ６０－２４－２）、２－アミノエタンチオール（２－ＭＥＡ－ＨＣｌ、システアミン－ＨＣｌとも呼ばれる、ＣＡＳ１５６－５７－０）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ５９６１－８５－３）、システイン塩酸塩（Ｃｙｓ－ＨＣｌ、ＣＡＳ５２－８９－１）、または２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）が挙げられる。タンパク質結合を還元するための他の方法、例えば、チオールベースの還元剤が固定化されてペプチド及びタンパク質ジスルフィド結合の固相還元を可能にする、樹脂を含有する固定化還元剤カラムが、当該分野において公知である。ポリペプチド間の化学的相互作用を低減するのに好適な、酸化剤を含めた還元剤も想定される。
例示的な溶出プロファイルは、上記に考察されている通りである。
Ｃ．高純度タンパク質薬剤生成物を生成する方法
一実施形態は、抗体を産生する方法であって、抗体を産生する細胞を、例えば流加バッチ培養において培養する工程、細胞培養からサンプルを得る工程、サンプルにおける低分子量不純物を、本明細書に開示されているシステム及び方法を使用して特性決定及び定量化する工程、ならびに細胞培養の１つ以上の培養条件を変更して、抗体の細胞培養の際に産生される、特性決定される低分子タンパク質薬剤不純物の量を低減する工程、を含む、上記方法を提供する。典型的には、上記条件は、０．０５％～３０．０％、好ましくは０．０５％～１５％、０．０５％～１０％、０．０５％～５％、または０．０５％～２％（ｗ／ｗ）の範囲でタンパク質薬剤不純物を有するように変更される。
低分子量タンパク質薬剤不純物の量を低減するように変化させる、細胞培養の１つ以上の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、かき混ぜ、ガス分圧、界面活性剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態において、抗体を産生する細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。他の実施形態において、細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
別の実施形態は、１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％のタンパク質薬剤不純物を有する、本明細書において提供されている方法によって産生される抗体を提供する。
実施例１：ｍＡｂ－１原薬サンプルのＨＩＬＩＣ分離
材料
この研究に、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ製の組み換えＩｇＧ１ｍＡｂ（ｍＡｂ－１）を使用した。ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、＃Ｐ０７０４Ｌ）をＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、１Ｍトリス－塩酸塩ｐＨ７．５溶液（＃１５５６７－０２７）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、＃２０２９１）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、Ｌ－システイン（＃１６８１４９－２５Ｇ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。アセトニトリル（ＬＣ－ＭＳ ｇｒａｄｅ、＃Ａ９５５－４）及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、＃ＰＩ２８９０４）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水は社内で提供された。
方法
ｍＡｂ－１の脱グリコシル化ならびにＤＴＴ及びＬ－システインによる制限された還元
ｍＡｂ－１サンプルを、１００ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用して５μｇ／μＬの最終濃度まで希釈した。ＰＮＧａｓｅ Ｆを１単位／１０μｇタンパク質の酵素対基質比で添加した。脱グリコシル化反応を３７℃で３時間行った。ＤＴＴによる制限された還元を開始するために、脱グリコシル化ｍＡｂ－１サンプルの２０μｇアリコートを５ｍＭ ＤＴＴによって還元し、直後に、オンラインＵＶ及び質量分光分析用のＨＩＬＩＣカラム上に注入した。Ｌ－システインによる制限された還元を開始するために、脱グリコシル化ｍＡｂ－１サンプルの２０μｇアリコートを５ｍＭ Ｌ－システインによって、次いで、３７℃で３０分間還元した後、オンラインＵＶ及び質量分光分析用のＨＩＬＩＣカラム上に注入した。
ＨＩＬＩＣ－ＵＶ及びＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析
Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｍｉｄｅカラム（３００Å、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）をＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムにおいて使用して全てのＨＩＬＩＣ分離を行った。当該カラムを６０℃で操作した。移動相は、移動相Ａとして水中０．１％のＴＦＡ、移動相Ｂとしてアセトニトリル中０．１％のＴＦＡであり、流量を０．２ｍＬ／分に設定した。ＵＶトレースを２１５及び２８０ｎｍで記録した。分離を、１５％のＡで最初の０．５分の保持、続いての、次の０．５分かけての２５％のＡまでの増加、及び次の４０分かけての４０％のＡまでの別の線形的増加により、５５分かけて達成した。勾配を、次いで、１分かけて１００％のＡまで傾斜させ、２分間保持し、その後、１分で１５％のＡに降下させ、次いで１０分超の間、最初の状態で維持して、次の稼働のためにカラムを平衡化した。ＵＰＬＣをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計に直接接続した。キャピラリー電圧を、４０任意単位のシースガス流量及び１５任意単位の補助ガス流量で、４．０ｋＶに設定した。キャピラリー温度を３５０℃に設定し、プローブヒータ温度を４００℃に設定した。質量スペクトルをｍ／ｚ８００～４０００の質量範囲で取得した。生データを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓによって開発されたＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ソフトウェアを使用してデコンボリューションした。
結果
組み換えＩｇＧ１ｍＡｂ（ｍＡｂ－１）原薬サンプルをモデル分子として使用した。ＰＮＧａｓｅＦにより処理して各重鎖においてＮ連結型グリカンを除去した後、脱グリコシル化ｍＡｂ－１サンプルをＨＩＬＩＣカラムにおいて分離し、（２８０ｎｍ及び２１５ｎｍの両方での）フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出ならびに質量分光分析の両方によって分析した（図１Ａ及び１Ｂ）。ＵＶプロファイル（図Ａ１、底部トレース）において示すように、ｍＡｂ－１原薬サンプルにおけるＬＭＷ不純物の全体のレベルが非常に低く、成功裏の精製プロセスを示唆した。質量分光分析から生じた全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）をＵＶクロマトグラムと比較することによって、（約１８．２分での保持時間による）さらなるピークがＴＩＣトレースにおいて観察され、これは、ＰＮＧａｓｅＦによってｍＡｂ－１から放出される主なグリカン形態（Ｇ０Ｆ）に相当した。オリゴ糖類は、２８０ｎｍまたは２１５ｎｍのいずれにおいてもＵＶ吸収を示さないため、ＵＶ検出においては不可視である。ＰＮＧａｓｅＦ反応体ピークに加えて、全ての他の副ピークは、ｍＡｂ－１関連のＬＭＷ不純物、具体的には、遊離軽鎖（複数の修飾あり）、Ｆａｂ断片、半抗体、Ｆａｂ切断種及びＨ２Ｌ種と同定された（図１Ａ及び１Ｂ）。ＨＩＬＩＣカラムにおけるこれらのＬＭＷ不純物の溶出順序は、これらの相対サイズに関連しており、より小さな断片が、より大きな断片よりも早く溶出した。この分析の前にｍＡｂ分子からＮ連結型グリカンを除去することが必須であることに注意することが重要である。さもなければ、ＨＩＬＩＣカラムにおけるサイズに基づく溶出順序が、グリカンの存在または非存在及び異なる糖型によって複雑化されるであろう。
実施例２：遊離軽鎖
結果
複数の軽鎖関連不純物をｍＡｂ－１サンプルのＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析において検出した（図２Ａ～２Ｅ）。各種の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）は、ＨＩＬＩＣ分離の際に異なる保持時間も示したことを示唆した（図２Ａ）。興味深いことに、システイン化軽鎖（＋約１１９Ｄａ）が、ｍＡｂ－１サンプルに存在する全ての軽鎖種のうちの主な形態であると同定された。これは、ＵＶによって可視である唯一の種である（図２Ｄ）。システイン化は、細胞質において見出され得る、重鎖間及び軽鎖間ジスルフィド結合と遊離システイン分子との間のチオール－ジスルフィド交換反応の結果として起こり得る。また、グルタチオン化軽鎖（＋約３０６Ｄａ）もまた、システイン化軽鎖よりも僅かに遅い保持時間で同定された（図２Ｅ）。システイン化プロセスと同様に、細胞質においても見出され得る遊離グルタチオン（ＧＳＨ）分子は、この修飾の原因となるはずである。予測質量からの差分質量が＋約９０Ｄａである別の興味深いＬＣ変異体も観察された（図２Ｃ）。組み換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼを使用したその後のペプチドマッピング分析は、軽鎖Ｃ末端Ｃｙｓ残基へのこの修飾を位置付けた。正確な差分質量（＋８９．９８Ｄａ）及び同位体分布に基づいて、この修飾が、重鎖間及び軽鎖間ジスルフィド結合と２－メルカプト酢酸分子との間のチオール－ジスルフィド交換反応の結果であったことが推測された。しかし、この化合物がｍＡｂ産生の際にどのように導入または生成されたかは現在調査中である。ＵＶトレースにおいては不可視であるが、未修飾遊離軽鎖はまた、Ｃ末端アミノ酸残基の逐次的な切り取りに相当する軽鎖変異体の群と併せて、より感度の高い質量分光分析によっても検出され得る（図２Ｃ）。デコンボリューションマススペクトル（図２Ｃ）に示されているように、得られたアミノ酸のラダーは、軽鎖のＣ末端配列と一致した（Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）。軽鎖からのＣ末端アミノ酸残基の除去は、細胞培養におけるいくつかのカルボキシルペプチダーゼの存在に起因する（Ｄｉｃｋ ＬＷ，Ｊｒ．，Ｑｉｕ Ｄ，Ｍａｈｏｎ Ｄ，Ａｄａｍｏ Ｍ，Ｃｈｅｎｇ ＫＣ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１００：１１３２－４３（２００８）；Ｈｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１３：２１００－６（２０１６）。最後に、質量減少が約３４Ｄａである別の軽鎖変異体も同定され（図２Ｂ）、軽鎖Ｃ末端Ｃｙｓ残基におけるβ脱離を介してのシステインからデヒドロアラニンへの変換が可能であることを示唆した。この反応は、これまでによく研究されており、保存の際の抗体ヒンジ領域での後の切断のための主な経路として同定されている（Ｃｏｈｅｎ ＳＬ，Ｐｒｉｃｅ Ｃ，Ｖｌａｓａｋ Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２９：６９７６－７（２００７））。全てのこれらの軽鎖関連不純物は、破壊された重鎖間及び軽鎖間ジスルフィド結合にもかかわらず強い非共有結合的相互作用を介して重鎖に依然として結合することができるため、ネイティブ条件下でＳＥＣ法に検出される傾向にないことに注目すべきである。
実施例３：Ｆａｂ断片
結果
ＩｇＧ１分子における重鎖の上部ヒンジ領域は、２つの相補性ＬＭＷ種、Ｆａｂ断片及びＦａｂ切断種の形成につながる加水分解の影響を受けやすいことがよく知られている（Ｃｏｒｄｏｂａ ＡＪ，Ｓｈｙｏｎｇ ＢＪ，Ｂｒｅｅｎ Ｄ，Ｈａｒｒｉｓ ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ： Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８１８：１１５－２１（２００５）。ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法により、ｍＡｂ－１サンプルにおける両方の種を検出した。異なる質量を有する４つの主なＦａｂ断片が同定され（図３Ａ～３Ｄ）、切断部位を、ｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列に基づいて、測定質量を予測質量と比較することによって位置付けた。アミノ酸パターンは、重鎖ヒンジ領域配列（Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ）と一致してデコンボリューションマススペクトルにおいて示された。いずれのＦａｂ断片も、プロテインＡ結合部位の欠失に起因して精製プロセスの際に容易に除去されるはずであることは注目に値することである。そのため、最終薬剤生成物におけるＦａｂ断片の存在は、これらの不純物がサンプルの保存の際に分解産物として導入されたことを示唆した。これらの種の成功裏の検出は、ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法がｍＡｂ薬剤の開発の際に安定性及び強制分解の研究に有用であることを強調している。
実施例４：半抗体
結果
半抗体は、ヒンジ領域における重鎖－重鎖間のジスルフィド結合が、重鎖内ジスルフィド結合にスクランブリングする結果として形成される。ネイティブ条件下、ｍＡｂ分子の４鎖構造は、２つの重鎖Ｃ末端領域間の強い非共有結合的相互作用により、このスクランブリングによっては中断されないままでいる。しかし、変性条件による方法、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＣＥ－ＳＤＳが使用される場合、２つの半抗体分子は、互いから解離してＬＭＷ不純物として現れる。ｍＡｂ－１生成物のＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析の際、半抗体分子が明確に同定された（図３Ｂ）。測定質量（７３，０９９．５Ｄａ）と予測質量（７３，１００．１Ｄａ）との間の良好な一致は、大規模に修飾された遊離軽鎖とは異なり、ジスルフィド結合スクランブリング経路と一致して、実質的な修飾が半抗体の形成に関連しなかったことを示唆した。
実施例５：Ｆａｂ切断種
結果
重鎖ヒンジ領域の切断後のＦａｂ断片に対する相補的断片として、Ｆａｂ切断種も、ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法によりｍＡｂ－１サンプルにおいて同定された（図３Ｃ）。ＨＩＬＩＣカラムにおいて、これらの種が、部分的に分解されたショルダーピークとして主なピークの直前に溶出された。後の質量測定により、Ｆａｂ切断種及び切断部位の同一性が、Ｆａｂ断片において観察されたものと一致してヒンジ領域で位置付けられたことが確認された。電気泳動法と比較して分離において劣る分解能にもかかわらず、ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法は、正確な質量測定により高い忠実性及び特異性で普及しており、一義的な同定を可能にする。Ｆａｂ断片とは異なり、Ｆａｂ切断種は、プロテインＡに結合する保存されたＦｃ領域に起因して、精製の際に主な種から除去することが非常に困難である。Ｆａｂアームを欠失しているモノクローナル抗体分子は、２つの標的結合部位のうち１つが存在しないため、易感染性の効能を示すことが期待される。二重特異性ｍＡｂ分子では、両方のＦａｂアームが治療的機能を達成するのに必須であるため、１つのＦａｂアームの損失は薬剤活性に弊害をもたらす。そのため、原薬サンプルにおいてこれらの種を直接検出及び同定する能力は、時間及び資源が節約されるだけでなく、富化プロセスの際に起こり得るアーチファクトの導入を回避するため、かなり重要である。
実施例６：Ｈ２Ｌ種
結果
Ｈ２Ｌ種は、２つの重鎖及び１つの軽鎖から構成されており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳ方法によって最も豊富なＬＭＷ不純物として頻繁に観察されているが、これらの同定は、通常、間接的かつ不十分な証拠によってのみ支持されている。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるＨ２Ｌ含有副バンドのＮ末端シーケンシング分析は、重鎖及び軽鎖の両方の最初のいくつかのアミノ酸残基を明らかにすることができ、重鎖及び軽鎖間のシグナル強度比は、２：１の比であることを示唆している。Ｈ２Ｌ含有副バンドのゲル内消化、続いてのＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング分析は、重鎖及び軽鎖の両方の存在を明確に確認することができる。しかし、重鎖及び軽鎖間の正確な比を確立することは困難である。両方法は、Ｈ２Ｌ種の部分的な同定を提供するが、いずれも、完全な構造を明らかにすることができない。対照的に、ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法は、インタクトタンパク質レベルでのＨ２Ｌ種の直接の同定を与える。ｍＡｂ－１生成物において、均一なＨ２Ｌ種が、インタクト抗体の僅かに前にＦａｂ切断種と一緒に共溶出することが観察された。Ｈ２Ｌ種の検出質量（１２２，８５１．０Ｄａ）は、Ｈ２Ｌ分子の予測分子量（１２２，８８４．５Ｄａ）よりもおよそ３４Ｄａ小さかった。重鎖システイン残基のβ脱離、恐らくは、重鎖間及び軽鎖間ジスルフィド結合を本来形成するものは、ｍＡｂ－１サンプルにおいてＨ２Ｌ種を形成する根本原因であった。このレベルの信頼及び詳細な情報は、他の確立されている純度アッセイによっては達成され得ず、この方法を、これらのＬＭＷ不純物の本質的な同定を与える際に非常に価値のあるものにする。この研究は、Ｈ２Ｌ種が事前の富化を伴わずにｍＡｂ原薬サンプルにおいてインタクト質量分析によって直接検出されることが示される最初のケースであるとされる（図３Ｄ）。
実施例７：制限された還元による強制条件下で生じたＬＭＷ不純物
結果
ｍＡｂ－１サンプルのＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析と比較して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳ方法は、重鎖二量体及び遊離重鎖を含めたさらなるＬＭＷ不純物を頻繁に同定した。これらの不純物を検出する際の新しいＨＩＬＩＣ法の可能性を実証するために、脱グリコシル化ｍＡｂ－１サンプルをネイティブ条件下で還元剤（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びＬ－システイン）によってさらに処理して種々のＬＭＷ不純物の形成を促進した。ネイティブ条件下では、ｍＡｂ分子における鎖間ジスルフィド結合のみが、分子における唯一の溶媒アクセル可能なジスルフィド結合であるため、ＤＴＴによって還元され得ることが報告されている（Ｌｉｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８２：５２１９－２６（２０１０））。ｍＡｂ－１分子をＤＴＴまたはＬ－システインに短期間暴露した後、遊離軽鎖、遊離重鎖、半抗体、重鎖二量体及びＨ２Ｌ種を含めた、異なる重鎖及び軽鎖の組み合わせによるＬＭＷ不純物が生じ得る。図４に示すように、これらの予測されたＬＭＷ種が、相対的サイズと一致する溶出順序でＨＩＬＩＣ分離において検出された。未処理ｍＡｂ－１サンプルにおいて観察されたものに加えて、２種類以上のＬＭＷ種、具体的には、遊離重鎖種及び重鎖二量体種が、遊離軽鎖と半抗体との間、及び半抗体の僅か後に（部分的に分解されたピーク）、それぞれ溶出することが観察された。
溶出順序が案内する割り当てに加えて、ＨＩＬＩＣ分離後の続いての質量分光分析により、正確な質量に基づいて各不純物の同一性をさらに確認した（図５Ａ～５Ｆ）。興味深いことに、ＤＴＴ処理ｍＡｂ－１サンプルにおける軽鎖種が、未処理サンプルにおいて観察された軽鎖種とはかなり異なる保持時間を示した（図４）。正確な質量測定に基づき、保持時間の差は、未処理サンプルにおいては存在するがＤＴＴ－処理サンプルにおいては存在しない軽鎖におけるシステイン化に起因した。一貫して、ｍＡｂ－１をＬ－システインで処理した場合、小さい画分の軽鎖種が未処理サンプルにおける軽鎖種と同じ保持時間で観察され、これは、Ｌ－システイン－処理サンプルにおけるシステイン化軽鎖の発生を示唆した。最終的に、ＤＴＴ－処理サンプルにおけるＨ２Ｌ種の測定質量（１２２，８８４．５Ｄａ）は、ジスルフィド結合還元を介して生じたＨ２Ｌ種（予測質量：１２２，８８４．５Ｄａ）、及び、β脱離を介して生じた、低いレベルの予め存在するＨ２Ｌ種（予測質量：１２２，８５０．４Ｄａ）から主に構成されるため、未修飾Ｈ２Ｌ種における予測質量（１２２，８８４．５Ｄａ）と一致した。
上記の明細書において本発明をそのある特定の実施形態に関連して説明し、多くの詳細を説明目的で記載しているが、本発明がさらなる実施形態の影響を受けやすいこと、及び、本明細書に記載されている詳細のある特定のものが、本発明の基本原理から逸脱することなくかなり変更され得ることが当業者には明らかである。
この開示を通して言及されている全ての公開公報は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に列挙されている全ての参照文献は、全体が参照により組み込まれる。本発明は、その精神及び本質的な特質から逸脱することなく他の具体的な形態で具現化され得、したがって、本発明の範囲を示すとして、上記の明細書よりもむしろ、添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。

Claims (22)

  1. 脱グリコシル化タンパク質薬剤及び賦形剤を含むタンパク質薬剤生成物であって、０．０５％～３０．０％（ｗ／ｗ）の低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を含み、
    前記タンパク質薬剤が抗体であり、
    前記低分子量タンパク質薬剤生成物不純物が、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、
    前記タンパク質薬剤生成物。
  2. ０．０５％～２５％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を含む、請求項１に記載のタンパク質薬剤生成物。
  3. ０．０５％～１５％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を含む、請求項１または２に記載のタンパク質薬剤生成物。
  4. ０．０５％～１０％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質薬剤生成物。
  5. ０．０５％～５％ｗ／ｗの低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質薬剤生成物。
  6. タンパク質薬剤及び賦形剤を含むタンパク質薬剤生成物における低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するための方法であって、以下：
    ｉ）タンパク質薬剤生成物のサンプルを脱グリコシル化する工程；
    ｉｉ）前記タンパク質薬剤生成物のサンプルのタンパク質成分を親水性相互作用クロマトグラフィによって分離する工程；
    ｉｉｉ）前記分離されたタンパク質成分を質量分析によって分析し、前記タンパク質薬剤生成物のサンプルにおける低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定する、工程
    を含み、前記タンパク質薬剤が抗体であり、前記低分子量タンパク質薬剤生成物不純物が、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記タンパク質薬剤生成物が、請求項１～５のいずれか一項に定義されている通りである、前記方法。
  7. 前記タンパク質薬剤生成物のサンプルが、流加バッチ培養からのものである、請求項６に記載の方法。
  8. 抗体を産生する方法であって、以下：
    ｉ）前記抗体を産生する細胞を細胞培養において培養する工程；
    ｉｉ）前記細胞培養からサンプルを得る工程；
    ｉｉｉ）前記サンプルにおける低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を請求項６または７に記載の方法によって特性決定する工程及び定量化する工程、ならびに
    ｉｖ）前記細胞培養の１つ以上の培養条件を変更し、前記抗体の細胞培養の際に産生される特性決定される低分子量タンパク質薬剤生成物不純物の量を低減する、工程
    を含む、前記方法。
  9. 低分子量タンパク質薬剤生成物不純物の量を低減するように変更される、前記細胞培養の前記１つ以上の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、かき混ぜ、ガス分圧、界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ８０６５細胞、ＨＬ－６０細胞、リンパ細胞、Ａ４３１（上皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、及び前記細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 請求項１～５のいずれか一項において定義される通りであるタンパク質薬剤生成物のサンプルにおいて、低分子量タンパク質薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステムであって：
    少なくとも２つの移動相カラムに連結された親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）カラムを含む親水性相互作用液体クロマトグラフィシステム
    を含み、
    前記ＨＩＬＩＣカラムが、質量分析システムと流体連通しており、
    前記親水性相互作用液体クロマトグラフィシステムが、前記タンパク質薬剤生成物の前記サンプルのタンパク質成分を分離するように構成されており、
    前記分離されたタンパク質成分が、質量分析により分析され、前記タンパク質薬剤生成物の前記サンプルにおける低分子量不純物が特性決定され、かつ、
    前記低分子量不純物が、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、低分子量タンパク質薬剤生成物不純物として特性決定される、
    前記システム。
  13. 請求項６または７に記載の方法の、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための、使用。
  14. 請求項１２に記載のシステムの、タンパク質薬剤生成物の安定性の決定及び強制分解研究のための、使用。
  15. 親水性相互作用クロマトグラフィによる前記タンパク質薬剤生成物のサンプルのタンパク質成分の分離が、前記タンパク質薬剤生成物からＮ連結型グリカンを除去することを含む、請求項６に記載の方法。
  16. 親水性相互作用クロマトグラフィによる前記タンパク質薬剤生成物のサンプルのタンパク質成分の分離が、変性条件下で実施される、請求項６に記載の方法。
  17. 前記タンパク質薬剤生成物のサンプルを還元する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  18. 前記タンパク質薬剤が、組み換えＩｇＧ１ｍＡｂ抗体である、請求項６または７に記載の方法。
  19. 前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ、及びＶｅｇｇｉｅ－ＣＨＯからなる細胞の群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  20. 前記ＣＯＳ細胞が、ＣＯＳ－７細胞である、請求項１０に記載の方法。
  21. 前記腎細胞が、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ細胞およびＢＨＫ２１からなる細胞の群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  22. 前記リンパ細胞が、自家Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）およびＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）からなる細胞の群から選択される、請求項１０に記載の方法。
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