TWI465249B

TWI465249B - 針對ｐｃｓｋ９之高親和性人類抗體

Info

Publication number: TWI465249B
Application number: TW098142896A
Authority: TW
Inventors: Mark W Sleeman; Joel H Martin; Tammy T Huang; Douglas Macdonald
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2008-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2014-12-21
Also published as: LTPA2017019I1; CA2747123A1; SI2358756T1; ES2613489T3; ME02760B; AR077724A1; HRP20170488T1; WO2010077854A1; US10023654B2; AU2009333326B2; US20100166768A1; NL300879I2; HUE032681T2; US20190135941A1; HRP20170488T4; RS55771B1; BRPI0922885B1; US20130085266A1; US20170096496A1; HRP20211688T1

Description

針對PCSK9之高親和性人類抗體

本發明之領域

本發明涉及與人類前蛋白轉化酶枯草溶菌素(subtilin/kexin)第9型(PCSK9)特異性結合的人抗體和人抗體的抗原結合片段，以及使用這些抗體的治療方法。

關於相關技術的陳述

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種前蛋白轉化酶，屬於分泌的枯草桿菌酶家族的蛋白酶K亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的，在內質網中經過自身催化分子內加工。證據顯示，PCSK9促進LDL受體的降解從而增加血漿中LDL膽固醇含量，而LDL受體介導肝內的LDL胞吞過程，後者是從循環系統清除LDL的主要途徑。PCSK9蛋白的結構顯示，它具有一個信號序列、接著是一個前結構域、一個含有保守三元殘基(D186、H226和S386)的催化域，以及一個C端結構域。它是作為可溶性74-kDa前體合成的，在內質網中經過自身催化裂解而產生一個14-kDa前結構域和60-kDa催化片段。業已顯示該自身催化活性是分泌過程所需要的。裂解之後，上述前結構域保持與催化結構域緊密相連。

PCSK9的抗體在例如WO 2008/057457、WO 2008/057458、WO 2008/057459、WO 2008/063382、WO 2008/125623以及US 2008/0008697等專利中均有述及。

本發明之概述

在第一個方面，本發明提供了一些與人PCSK9(hPCSK9)特異性結合且中和其活性的完全人單株抗體(mAbs)及其抗原結合片段。

在一個實施例中，本發明包括一種與hPCSK9特異性結合的抗體或抗體的抗原結合片段，並至少具有以下一個特徵：

(i)　相對於給藥前水平，能夠使血清總膽固醇下降至少約25至35%並保持這種下降達至少24天，較佳的是使血清總膽固醇含量下降至少約30至40%；

(i)　相對於給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇下降至少約65至80%並保持這種下降達至少24天；

(iii)　相對於給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40%；

(iv)　不降低血清HDL膽固醇，或相對於給藥前水平，降低血清HDL膽固醇不超過5%。

(i)　相對於給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇下降至少約40至70%並保持這種下降達至少60天或90天；

(iii)　相對於給藥前水平，能夠使血清甘油三酯下降至少約25至40%；

(iv)　不降低血清HDL膽固醇，或相對於給藥前水平，降低血清HDL膽固醇含量不超過5%。

在一個實施例中，該抗體或其片段的特徵是與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的胺基酸殘基238的表位(epitope)結合。在一個較特殊的實施例中，該抗體或其片段與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的一個或一個以上胺基酸殘基238、153、159和343的表位結合。在一個較特殊的實施例中，該抗體或其片段的特徵是與在SEQ ID NO:755的192、194、197和/或237位置不含胺基酸殘基的表位結合。

在一個實施例中，該抗體或其片段的特徵是與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的胺基酸殘基366的表位結合。在一個較特殊的實施例中，該抗體或其片段與在SEQ ID NO:755的147、366和380位置包含一個或一個以上胺基酸殘基的表位結合。在一個較特殊的實施例中，該抗體或其片段的特徵是，在SEQ ID NO:755的215和/或238位置與不含胺基酸殘基的表位結合。

在一個實施例中，該抗體或其片段的特徵是，經表面電漿共振技術測量，相對於pH 7.4條件下的結合親和力(K_D )，在pH 5.5條件下顯示與hPCSK9的結合親和力K_D 增強。在一個特殊的實施例中，經表面電漿共振技術測量，該抗體或其片段在酸性pH條件下與PCSK9的結合親和力比在中性pH條件下增強至少20倍、至少40倍或至少50倍。

在一個實施例中，該抗體或其片段的特徵是，經表面電漿共振技術測量，未顯示在酸性pH條件下與PCSK9的結合親和力比在中性pH條件下有所增強。在一個特殊的實施例中，與中性pH條件相比，酸性pH條件下的結合力較小且T_1/2 較短。

在另一個實施例中，該抗體或抗原結合片段與人、人GOF突變D374Y、獼猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及倉鼠的PCSK9結合。

在一個實施例中，該抗體或抗原結合片段與人和猴的PCSK9結合，但不與小鼠、大鼠或倉鼠的PCSK9結合。

這些mAbs抗體可以是全長的(例如IgG1或IgG4抗體)，或可僅包含一個抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)₂ 或scFv片段)，並可加以修飾以影響其功能，例如消除殘餘的效應子功能(Reddy et al.(2000)J. Immunol. 164:1925-1933)。

在一個實施例中，本發明包括一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個選自由下列組成之群組的重鏈可變域(HCVR)：SEQ ID NO: 2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中，該HCVR是一個選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、66、70、74、90、94、122、138、142、218、234、238、242、258、262、314、330和334。在一個較特殊的實施例中，該HCVR包含SEQ ID NO:90或218。

在一個實施例中，該抗體或其片段進一步包含一個選自由下列組成之群組的輕鏈可變域(LCVR)：SEQ ID NO: 10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740和744，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中，該LCVR是一個選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 58、68、72、82、92、96、130、140、144、226、236、240、250、260、264、322、332和336。在一個較特殊的實施例中，該LCVR包含SEQ ID NO: 92或226。

在一個特殊的實施例中，該抗體或其片段包含一個選自由下列組成之群組的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對：SEQ ID NO: 2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。在一個實施例中，該HCVR和LCVR是一對選自由下列組成之群組的胺基酸序列對：SEQ ID NO: 50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、330/332和334/336。在一個較特殊的實施例中、該HCVR/LCVR序列對包含SEQ ID NO: 90/92或218/226。

在第二個方面，本發明的特點是有一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個選自由下列組成之群組的重鏈CDR3(HCDR3)域：SEQ ID NO: 8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、680、704和728，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個選自由下列組成之群組的輕鏈CDR3(LCDR3)域：SEQ ID NO: 16、40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、616、640、664、688、712和736，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中，該HCDR3/LCDR3序列對是SEQ ID NO: 56/64、80/88、128/136、224/232、248/256或320/328。在一個較特殊的實施例中，該HCDR3/LCDR3包含SEQ ID NO: 80/88或224/232。

在一個進一步的實施例中，本發明包括一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個選自由下列組成之群組的重鏈CDR1(HCDR1)域：SEQ ID NO: 4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、628、652、676、700和724，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個選自由下列組成之群組的重鏈CDR2(HCDR2)域：SEQ ID NO: 6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、606、630、654、678、702和726、或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個選自由下列組成之群組的輕鏈CDR1(LCDR1)域：SEQ ID NO: 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708和732，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個選自由下列組成之群組的輕鏈CDR2(LCDR2)域：SEQ ID NO: 14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、638、662、686、710和734、或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個實施例中，該重鏈和輕鏈CDR序列是SEQ ID NO: 52、54、56、60、62、64；76、78、80、84、86、88；124、126、128、132、134、136；220、222、224、228、230、232；244、246、248、252、254、256；以及316、318、320、324、326、328。在一個較特殊的實施例中，該重鏈和輕鏈CDR序列是SEQ ID NO: 76、78、80、84、86、88；或220、222、224、228、230、232。

在一個相關的實施例中，本發明包括一種與hPCSK9特異性結合的抗體或抗體的抗原結合片段，其中該抗體或抗體片段包含位於選自由下列組成之群組的重鏈和輕鏈序列對內的重鏈和輕鏈CDR域：SEQ ID NO:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。在一個實施例中，該CDR序列位於選自下列一組胺基酸序列對的HCVR和LCVR域內：SEQ ID NO:50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、330/332和334/336。在一個較特殊的實施例中，該CDR序列位於選自下列一組胺基酸序列對的HCVR和LCVR域內：SEQ ID NO: 90/92或218/226。

在一個實施例中，本發明提供了一些與hPCSK9特異性結合且中和其活性的完全人單株抗體(mAbs)或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個或多個如下特徵：

(ii)　相對於給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇下降至少約65至80%並保持這種下降達至少24天；

(iv)　不降低血清HDL膽固醇，或相對於給藥前水平降低血清HDL膽固醇含量不超過5%；

(v)　與包含hPCSK9(SEQ ID NO: 755)的胺基酸殘基238的表位結合；

(vi)　相對於pH 7.4條件下，在pH 5.5時，表面電漿共振測量顯示hPCSK9的結合親和力(K_D )增強，親和力增加至少約20倍至50倍；

(vii)　與人、人GOF突變D374Y、獼猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及倉鼠的PCSK9結合；

(viii)　包含含有SEQ ID NO: 80和88的重鏈和輕鏈CDR3序列；

(ix)　包含選自SEQ ID NO: 90和92的CDR序列。

在一個實施例中，本發明提供了一種與hPCSK9特異性結合及中和其活性的完全人單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個或多個如下特徵：

(ii)　相對於給藥前水平，能夠使血清甘油三酯下降至少約25至40%；

(iii)　不降低血清HDL膽固醇，或相對於給藥前水平降低血清HDL膽固醇含量不超過5%。

(iv)　與包含hPCSK9(SEQ ID NO: 755)的胺基酸殘基366的表位結合；

(v)　經表面電漿共振技術測量，未顯示在酸性pH條件下與PCSK9的結合親和力比在中性pH條件下有所增強；

(vi)　與人和猴的PCSK9結合，但不與小鼠、大鼠或倉鼠的PCSK9結合；

(vii)　包含含有SEQ ID NO: 224和232的重鏈和輕鏈CDR3序列；

(viii)　包含選自SEQ ID NO: 218和226的CDR序列。

在第三方面，本發明提供了編碼抗PCSK9抗體或其片段的核酸分子。本發明還包括運載本發明核酸的重組表現載體，以及引入這類載體的宿主細胞，並包括一些在允許產生抗體和收集所產生抗體的條件下透過培養宿主細胞而生產抗體的方法。

在一個實施例中，本發明提供了一種抗體或其片段，其包含一個由選自由下列組成之群組的核酸序列編碼的HCVR：SEQ ID NO: 1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、721、737和741，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個實施例中，該HCVR是由選自由下列組成之群組的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 49、65、69、73、89、93、121、137、141、217、233、237、241、257、261、313、329和333。在一個較特殊的實施例中，該HCVR是由選自由下列組成之群組的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 89和217。

在一個實施例中，該抗體或其片段進一步包含一個由選自由下列組成之群組的核酸序列編碼的LCVR：SEQ ID NO: 9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739和743，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個實施例中，該LCVR是由選自由下列組成之群組的核酸序列編碼的：SEQ ID NO: 57、67、71、81、91、95、129、139、143、225、235、239、249、259、263、321、331和335。在一個較特殊的實施例中，該LCVR是由選自由下列組成之群組的核酸序列編碼的：SEQ ID NO: 91和225。

在一個實施例中，本發明的特點是一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的HCDR3域：SEQ ID NO: 7、31、55、79、103、127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、631、655、679、703和727，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的LCDR3域：SEQ ID NO: 15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711和735，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個實施例中，該HCDR3和LCDR3序列是由下列核酸序列分別編碼的：SEQ ID NO: 55/63、79/87、127/135、223/231、247/255和319/327。在一個較特殊的實施例中，該HCDR3和LCDR3序列對是由下列核酸序列編碼的：SEQ ID NO: 79/87和223/231。

在一個進一步的實施例中，該抗體或其片段進一步包含一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的HCDR1域：SEQ ID NO: 3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699和723，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的HCDR2域：SEQ ID NO：5、29、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、557、581、605、629、653、677、701和725，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的LCDR1域：SEQ ID NO:11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707和731，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一個由選自由下列組成之群組的核苷酸序列編碼的LCDR2域：SEQ ID NO: 13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、613、637、661、685、709和733，或一種與其實質上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個實施例中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸序列編碼的：SEQ ID NO: 51、53、55、59、61、63；75、77、79、83、85、87；123、125、127、131、133、135；219、221、223、227、229、231；243、245、247、251、253、255；以及315、317、319、323、325、327。在一個較特殊的實施例中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸序列編碼的：SEQ ID NO: 75、77、79、83、85、87；以及219、221、223、227、229、231。

在第四個方面，本發明的特點是一種與hPCSK9特異性結合的分離的抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個HCDR3和一個LCDR3，其中HCDR3包含一個結構式為X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ -X¹⁰ -X¹¹ -X¹² -X¹³ -X¹⁴ -X¹⁵ -X¹⁶ -X¹⁷ -X¹⁸ -X¹⁹ -X²⁰ 的胺基酸序列(SEQ ID NO: 747)，其中X¹ 是Ala；X² 是Arg或Lys；X³ 是Asp；X⁴ 是Ser或Ile；X⁵ 是Asn或Val；X⁶ 是Leu或Trp；X⁷ 是Gly或Met；X⁸ 是Asn或Val；X⁹ 是Phe或Tyr；X¹⁰ 是Asp；X¹¹ 是Leu或Met；X¹² 是Asp或缺位；X¹³ 是Tyr或缺位；X¹⁴ 是Tyr或缺位；X¹⁵ 是Tyr或缺位；X¹⁶ 是Tyr或缺位；X¹⁷ 是Gly或缺位；X¹⁸ 是Met或缺位；X¹⁹ 是Asp或缺位，以及X²⁰ 是Val或缺位；LCDR3包含一個結構式為X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ 的胺基酸序列(SEQ ID NO: 750)，其中X¹ 是Gln或Met；X² 是Gln；X³ 是Tyr或Thr；X⁴ 是Tyr或Leu；X⁵ 是Thr或Gln；X⁶ 是Thr；X⁷ 是Pro；X⁸ 是Tyr或Leu，以及X⁹ 是Thr。

在一個進一步的實施例中，該抗體或其片段進一步包含一個結構式為X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ 的HCDR1序列(SEQ ID NO: 745)，其中X¹ 是Gly；X² 是Phe；X³ 是Thr；X⁴ 是Phe；X⁵ 是Ser或Asn；X⁶ 是Ser或Asn；X⁷ 是Tyr或His；以及X⁸ 是Ala或Trp；一個結構式為X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ 的HCDR2序列(SEQ ID NO: 746)；其中X¹ 是Ile；X² 是Ser或Asn；X³ 是Gly或Gln；X⁴ 是Asp或Ser；X⁵ 是Gly；X⁶ 是Ser或Gly；X⁷ 是Thr或Glu；以及X⁸ 是Thr或Lys；一個結構式為X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X^6- X⁷ -X⁸ -X⁹ -X¹⁰ -X¹¹ -X¹² 的LCDR1序列(SEQ ID NO: 748)，其中X¹ 是Gln；X² 是Ser；X³ 是Val或Leu；X⁴ 是Leu；X⁵ 是His或Tyr；X⁶ 是Arg或Ser；X⁷ 是Ser或Asn；X⁸ 是Asn或Gly；X⁹ 是Asn；X¹⁰ 是Arg或Asn；X¹¹ 是Asn或Tyr；以及X¹² 是Phe或缺位；一個結構式為X¹ -X² -X³ 的LCDR2序列(SEQ ID NO: 749)，其中X¹ 是Trp或Leu；X² 是Ala或Gly；以及X³ 是Ser。圖1顯示了316P和300N mAbs的重鏈和輕鏈可變域的序列比對。

在第五個方面，本發明的特點是一種人抗PCSK9抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個由衍生自V_H 、D_H 和J_H 種系序列的核苷酸序列片段編碼的重鏈可變區(HCVR)，以及一個由衍生自V_K 和J_K 種系序列的核苷酸序列片段編碼的輕鏈可變區(LCVR)，其中該種系序列是(a) V_H 基因片段3-23、D_H 基因片段7-27、J_H 基因片段2、V_K 基因片段4-1以及J_K 基因片段2；或(b) V_H 基因片段3-7、D_H 基因片段2-8、J_H 基因片段6、V_K 基因片段2-28以及J_K 基因片段4。

在第六個方面，本發明的特點是一種與PCSK9蛋白(SEQ ID NO:755)結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段與一種變異PCSK9蛋白的結合比抗體或其片段與SEQ ID NO: 755的PCSK9蛋白之間的結合低50%。在一個特殊的實施例中，該抗體或其抗原結合片段與該變異PCSK9蛋白的結合親和力(K_D )比與PCSK9(SEQ ID NO:755)的結合力低約50%、低約60%、低約70%、低約80%、低約90%或低約95%。

在一個實施例中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO:755的238位包含至少一個突變。在一個較特殊的實施例中，該突變為D238R。在一個實施例中，相對於野生型蛋白SEQ ID NO:755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結合親和力至少小90%，其中該變異蛋白在殘基238處包含一個突變。在一個實施例中，相對於野生型蛋白SEQ ID NO:755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結合親和力至少小80%，其中該變異蛋白在一個或一個以上殘基153、159、238和343處包含一個突變。在一個較特殊的實施例中，該突變是S153R、E159R、D238R和D343R之一。

在一個實施例中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO:755的366位包含至少一個突變。在一個較特殊的實施例中，該突變為E366K。在一個實施例中，相對於野生型蛋白SEQ ID NO:755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結合親和力至少小95%，其中該變異蛋白在殘基366處包含一個突變。在一個實施例中，相對於野生型蛋白SEQ ID NO:755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結合親和力至少小70%、80%或90%，其中該變異蛋白在一個或一個以上殘基147、366和/或380處包含一個突變。在一個較特殊的實施例中，該突變是S147F、E366K和V380M之一。

本發明包括具有一種經修飾的糖基化模式的抗PCSK9抗體。在某些應用中，進行修飾以除去某些不希望的糖基化位點也許是有益的，或例如除去岩藻糖基以提高抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參閱Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其它一些應用中，為了改變補體依賴性細胞毒性(CDC)，可進行半乳糖基化的修飾。

在第七個方面，本發明之特點是一種含有與hPCSK9特異性結合的重組人抗體或其片段以及一種藥學上可接受載體的醫藥組合物。在一個實施例中，本發明之特點是一種組合物，它是本發明之抗體或抗體的抗原結合片段和第二種治療劑的結合。第二種治療劑可為與本發明之抗體或其片段有利地結合的任何藥劑，例如，一種透過抑制3-羥基-3-甲基戊二醯(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘導膽固醇合成的細胞清除的藥劑，例如西利維司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(ros uvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；能夠抑制膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的藥劑；能夠增加脂蛋白分解代謝的(如煙酸)藥劑；和/或在膽固醇如22-羥基膽固醇的清除過程中起作用的LXR轉錄因子的活化劑。

在第八個方面，本發明的特點是一些用本發明之抗PCSK9抗體或抗體的抗原結合片段抑制hPCSK9活性的方法，其中該治療方法包括施用一種療效量的含有本發明之抗體或抗體的抗原結合片段的醫藥組合物。所治療的疾病是透過除去、抑制或降低PCSK9的活性而得到改善、減輕、抑制或預防的任何疾病或症狀。可以本發明之方法治療的具體人群包括需要LDL血漿析離的患者、PCSK9激活突變(獲得功能的突變，即GOF)的患者、雜合家族性高膽固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素無法控制的原發性高膽固醇血症患者；以及具有患高膽固醇血症的危險但可進行預防性治療的患者。其它症狀包括與次要原因如II型糖尿病相關的血脂異常、膽汁鬱積型肝病(原發性膽汁性肝硬變化)、腎病綜合徵、甲狀腺機能減退、肥胖症；以及動脈粥樣硬化和心血管疾病的預防和治療。

在本發明之方法的一些特殊的實施例中，本發明之抗hPCSK9抗體或抗體片段可用於降低偏高的總膽固醇、非HDL膽固醇、LDL膽固醇、和/或或脂蛋白B(載脂蛋白B100)的含量。

本發明之抗體或抗體片段可單獨使用或與第二種藥劑如一種HMG-CoA還原酶的抑制劑和/或其它降低脂質的藥物結合使用。

其他的實施例包括將如上所定義的抗體或抗體的抗原結合片段用於減輕或抑制PCSK9介導的疾病或病症。

本發明包括在用於減輕或抑制PCSK9介導的疾病或病症的藥劑的製造過程中，使用如上所定義的抗體或抗體的抗原結合片段。在一些特殊的實施例中，其中PCSK9介導的疾病或症狀是高膽固醇血症、高血脂症、LDL血漿析離、雜合家族性高膽固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素無法控制、具有患高膽固醇血症的危險、血脂異常、膽汁鬱積型肝病、腎病綜合徵、甲狀腺機能減退、肥胖症、動脈粥樣硬化以及心血管疾病。

在閱讀以下詳細敘述的過程中，其他的實施例將變得很明顯。

本發明之詳細說明

在描述本發明的方法之前，應該理解，本發明並非局限於所描述的具體方法和實驗條件，因為這些方法和條件是可以改變的。還應理解，本文所用的術語僅出於描述具體實施例的目的，並非意在限制本發明，因為本發明之範圍僅受所附專利申請範圍的限制。

除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語將具有與本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同含義。儘管與本文所述的方法和材料類似或相當的任何方法和材料都可用於本發明之實施或試驗，但現將描述的是首選的方法和材料。

定義

本文所用的術語「人類前蛋白轉化酶枯草溶菌素9」或「hPCSK9」是指具有SEQ ID NO:754所示核酸序列和SEQ ID NO:755所示胺基酸序列或其生物活性片段的hPCSK9。

本文所用的術語「抗體」意指由四條多肽鏈即兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)以二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈均由一個重鏈可變區(HCVR或VH)和一個重鏈恒定區組成(由CH1、CH2和CH3域組成)。每條輕鏈均由一個輕鏈可變區(LCVR或VL)和一個輕鏈恒定區(CL)組成。VH和VL區可進一步分成被稱為互補決定區(CDR)的高變區，其中散佈著保存性更好的被稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

一個或多個CDR殘基的取代或一個或多個CDR的刪除也是可能的。在科學文獻中已經敘述了其中一個或兩個CDR被刪除以用於結合的抗體。Padlan et al.(1995 FASEB J. 9:133-139)基於已發表的晶體結構，分析了抗體及其抗原之間的接觸域，並得出結論，只有約五分之一至三分之一的CDR殘基與抗原實際接觸。Padlan還發現了許多抗體，其中一個或兩個CDR不含與抗原接觸的胺基酸(還可參閱Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428)。

不接觸抗原的CDR殘基可基於先前的研究籍由分子模擬和/或根據經驗從位於Chothia CDR域外的Kabat CDR域識別(例如CDRH2中的H60-H65殘基往往是不需要的)。如果一個CDR或其殘基被刪除，通常它會被另一人抗體序列或這類序列共有區內佔據相應位置的胺基酸取代。CDR和胺基酸內的取代位置也可根據經驗選擇。經驗取代可以是保守的或不保守的取代。

本文所用的術語「人抗體」意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。本發明之人mAbs抗體可包括非由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如透過體外隨機誘變或位點特異性誘變或透過體內體細胞突變所引入的突變)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括這樣的胺基酸殘基。但是，本文所用的術語「人抗體」並不意圖包括其中衍生自另一哺乳動物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人構架序列上的mAbs抗體。

「特異性結合」或類似術語意為一個抗體或抗原結合片段與一個在生理條件下相對穩定的抗原形成複合體。特異性結合可以一個至少約1x10^-6 M或更小的平衡解離常數來描述(例如一個較小的K_D 就意味著較緊密的結合)。確定兩個分子是否特異性結合的方法是本領域內眾所周知的，並包括例如平衡透析、表面電漿共振等方法。但是，特異性結合hPCSK9的分離抗體對於其它抗原如來自其它物種的PCSK9分子可顯示交叉反應性。然而，與hPCSK9及一個或一個以上其他抗原結合的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)依然被認為是「特異性結合」hPCSK9的抗體，如本文所用。

術語「高親和力」抗體是指經表面等離子共振技術例如BIACORE^TM 或溶液親和ELISA法測定，其與hPCSK9的結合親和力為至少10^-10 M、較佳的是10^-11 M、更佳的是10^-12 M的mAbs抗體。

術語「慢解離速率(slow off rate)」、「Koff」或「kd」是指經表面等離子共振技術例如BIACORE^TM 測定，以1 x 10^-3 s^-1 或更低、較佳的是以1 x 10^-4 s^-1 或更低的速率常數從hPCSK9解離的抗體。

本文所用的抗體的「抗原結合部分」(或簡稱「抗體片段」)這一術語是指抗體中一個或多個保持了與hPCSK9特異性結合能力的片段。抗體片段可包括一個Fab片段、一個F(ab')₂ 片段、一個Fv片段、一個dAb片段、一個含有CDR的片段，或一個分離的CDR。

本發明的具體實施例、抗體或抗體片段可與一種治療基團(「免疫偶聯物」)如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯。

本文所用的「分離抗體」意指實質上不含其它具有不同抗原特異性的mAbs的抗體(例如特異性結合hPCSK9的分離抗體就在實質上不含能特異性結合hPCSK9之外抗原的mAbs)。但是，特異性結合hPCSK9的分離抗體對於其它抗原如來自其它物種的PCSK9分子可具有交叉反應性。

本文所用的「中和抗體」(或「中和PCSK9活性的抗體」)意指其與hPCSK9的結合將導致PCSK9的至少一種生物活性被抑制的抗體。PCSK9生物活性的這種抑制可透過以本領域內周知的若干標準體外或體內測定法中一種或多種方法測定PCSK9生物活性的一個或多個指標進行評估(參閱下文的實例)。

本文所用的術語「表面等離子共振」是指一種光學現象。基於這種光學現象可利用例如BIACORE^TM 系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)來檢測生物傳感器基質中蛋白質濃度的變化，從而對實時生物特異性相互作用進行分析。

本文所用的術語「K_D 」意指特定的抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。

術語「表位」是指抗原中與抗體結合的區域。表位可定義為結構性表位或功能性表位。功能性表位通常是結構性表位的一個亞型，並具有直接影響相互作用親和力的殘基。表位可以是構象表位，即由非線性胺基酸組成。在某些實施例中，表位可包括決定簇，後者是分子的化學活性表面基團，如胺基酸、糖側鏈、磷醯基類或磺醯基類；在某些實施例中，表位可具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。

術語「本質上相同當指核酸或其碎片時，表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一個核酸(或其互補鏈)最佳比對時，以下述任何著名的算法如FASTA、BLAST或GAP測量，至少有90%的核苷酸鹼基序列相同性，更首選的是至少有95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸鹼基序列相同性。

當應用於多肽時，術語本質上相似」指兩個肽序列用諸如GAP或BESTFIT等程式的預設間隙重量達排列到最佳比對時，兩者至少有90%的序列相同性，更首選的是至少有95%、98%或99%的序列相同性。首選的是，不相同的殘基位置的差別僅在於保守的胺基酸取代。「保守的胺基酸取代」是指這樣一種取代，即一個胺基酸殘基被另一個含有化學性質(例如電荷或疏水性)相似側鏈(R基團)的胺基酸殘基所取代。一般而言，保守的胺基酸取代不會在實質上改變蛋白質的功能性質。在兩個或更多的胺基酸序列相互之間的差別僅在於某些保守取代的情況中，可將序列相似性程度向上調整，以針對取代的保守特性作出校正。進行這種調整的方法是本領域技術人員眾所周知的。參閱例如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。含有化學性質相似側鏈的胺基酸類別的實例包括：1)脂族側鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族羥基側鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含醯胺側鏈：天冬氨酸和穀氨醯胺；4)芳族側鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)鹼性側鏈：賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和6)含硫側鏈：天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽，以及7)含硫側鏈：半胱氨酸和甲硫氨酸。首選的保守胺基酸取代基是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬醯胺-穀氨醯胺。或者，保守的取代是Gonnet et al.(1992)Science 256：1443 45中所公開的PAM250對數似然矩陣(PAM250 log-likelihood matrix)中任何正值的變化。(1992)Science 256:1443 45。「中度保守的」取代是PAM250對數似然矩陣中非負值的任何變化。

多肽的序列相似性通常用序列分析軟件來測量。蛋白質分析軟件是用指定給各種取代(包括保守胺基酸取代)、缺失和其它修飾的相似性程度對相似的序列進行比對。例如，GCG軟體含有諸如「GAP」和「BESTFIT」的程式，可以默認參數使用這些程式，以確定緊密相關的多肽例如來自不同生物物種的同源多肽之間的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白質及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCG Version 6.1。還可以用GCG Version 6.1中的FASTA程序以默認參數或推薦參數來比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重疊區域的比對和序列同一性百分數(Pearson(2000)，出處同上)。當將本發明之序列與含有大量的源自不同生物的序列的數據庫進行比較時，另一首選的算法是BLAST電腦程式，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默認參數。參閱如Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403410及(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

在一些特殊的實施例中，本發明之方法所使用的抗體或抗體片段可為單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以針對同一目標多肽的不同表位，或可含有針對一個以上目標多肽之表位的抗原結合域。可用於本發明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(Ig)CH3結構域和第二個Ig CH3結構域，其中第一個和第二個Ig CH3結構域相互之間相差至少一個胺基酸，且與無胺基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個胺基酸的差別降低了雙特異性抗體與蛋白A的結合力。在一個實施例中，第一個Ig CH3結構域與蛋白A結合，第二個Ig CH3結構域包含一個降低或消除與蛋白A結合的突變，例如一個H95R修飾(按照IMGT表現序列編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個CH3結構域可進一步包含一個Y96F修飾(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436F)。可在第二個CH3域內找到的其他修飾包括：在IgG1 mAbs的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2 mAbs的情況下為N44S、K52N和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4 mAbs情況下為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認為是在本發明的範圍之內。

「有效治療量」這一短語意為對受藥對象能產生所需作用的量。確切的劑量將取決於治療的目的，並可由本領域專業人員使用已知技術確定(例如參閱Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。

人抗體的製備

在轉基因小鼠體內產生人抗體的方法是周知的(例如參閱美國第6,596,541號專利，Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNE^TM )。VELOCIMMUNE^TM 技術涉及到這樣一種轉基因小鼠的產生：該小鼠的基因組包含一些與內源小鼠恒定區基因座有效地連接(operably linked)的人重鏈和輕鏈可變區,使得該小鼠能響應抗原刺激而產生一種包含人可變區和小鼠恒定區的抗體。將編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區的DNA分離出來，並與編碼人重鏈和輕鏈恒定區的DNA有效地連接。然後在能夠表現完全人抗體的細胞中表現該DNA。在具體的實施方案中，該細胞是一種CHO細胞。

抗體可在治療過程中用於阻斷配體-受體之間的相互作用或抑制受體組分之間的相互作用，而不是透過固定補體和參與補體依賴性細胞毒性(CDC)來殺滅細胞，或透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)來殺滅細胞。因此，抗體的恒定區對於抗體固定補體和介導細胞依賴性細胞毒性的能力是重要的。因此，可根據是否需要抗體介導細胞毒性來選擇抗體的同型。

人抗體可以兩種與鉸鏈異質性有關的形式存在。在一種形式中，抗體分子包含一種約150-160 kDa的穩定的四鏈構建物，其中兩個二聚體透過一個重鏈間的二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，該二聚體不是透過重鏈間的二硫鍵連接在一起，而是形成了一種由共價偶聯的輕鏈和重鏈(半抗體)組成的約75-80 kDa的分子。這兩種形式的分離一直極為困難，甚至在親和純化之後也是如此。

第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率，是由於但不限於與抗體的鉸鏈區同型相關的結構差異。人IgG4鉸鏈的鉸鏈區之單個胺基酸取代可將第二種形式(Angal et al.(1993) Molecular Immunology 30:105)的出現頻度顯著地降低到利用人IgG1鉸鏈所觀察到的水平。本發明包括在鉸鏈區、CH2區或CH3區中含有一個或多個突變的抗體。所述的突變可能是合乎需要的，例如在生產中用於提高所需抗體形式的產率。

通常，用所研究抗原攻擊VELOCIMMUNE^TM 小鼠，並從表現抗體的小鼠回收淋巴細胞(如B細胞)。淋巴細胞可與一個骨髓瘤細胞系融合來製備永生融合瘤細胞系，然後對這種融合瘤細胞系進行篩選，以識別能產生對相關抗原具有特異性之抗體的融合瘤細胞系。可將編碼重鏈和輕鏈可變區的DNA分離出來，並與合乎需要的重鏈和輕鏈的同型恒定區連接。這種抗體蛋白可在一種細胞如CHO細胞中產生。另外，編碼抗原特異的嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變域的DNA可直接從抗原特異的淋巴細胞中分離出來。

首先，分離包含一個人可變區和一個小鼠恒定區的抗體的高親和力嵌合抗體。如下所述，根據所需的特點，包括親和力、選擇性、表位等鑑定和選擇抗體。用合乎需要的人恒定區取代小鼠恒定區，以產生本發明之完全人抗體，例如野生型的或經修飾的IgG1或IgG4(例如SEQ ID NO:751、752、753)。所選擇的恒定區可根據特定的用途而改變，而高親和力抗原結合特性和靶標特異性特性則存在於可變區中。

表位作圖和相關技術

為篩選能與特定表位結合的抗體(例如能阻斷IgE與其高親和力受體結合的抗體)，可進行常規的交聯-阻斷分析，如Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述。其它方法包括丙氨酸掃描突變體分析、肽印跡分析(Reineke(2004) Methods Mol Biol 248:443-63)或肽切割分析。另外，還可採用諸如抗原的表位切除、表位提取和化學修飾的方法(Tomer(2000) Protein Science 9：487-496)。

術語「表位」是指抗原上B細胞和/或T細胞對其作出響應的位點。B細胞表位可由毗連的胺基酸形成，或者由透過蛋白質的三級折疊而並列在一起的非毗連胺基酸形成。由毗連胺基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通常可得以保留，而透過三級折疊形成的表位在用變性溶劑處理時通常會失去。表位通常包括至少3個、更經常是至少5個或8-10個以獨特空間構象出現的胺基酸。

修飾輔助概況分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也被稱為基於抗原結構的抗體概況分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是一種根據每種抗體與經化學或酶學修飾的抗原表面的結合狀況的相似性對大量的抗同一抗原的單株抗體(mAbs)進行分類的方法(美國專利2004/0101920號)。每一類均可反映與另一類所代表的表位截然不同或部分重疊的獨特表位。這種技術可以快速過濾遺傳上相同的mAbs，從而可使鑑定工作集中在遺傳上不同的mAbs上。當應用於融合瘤篩選時，MAP有助於鑑定某些罕見融合瘤選殖，後者能產生具有所需特性的mAbs。MAP可用來將本發明的抗PCSK9 mAbs抗體分類成結合不同表位的mAbs抗體組。

在各種各樣的實施例中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結合片段與催化域(SEQ ID NO:755的約153至425)內的一個表位結合；更具體的是，與從約153至約250或從約250至約425的片段內的一個表位結合；更具體的是，本發明之抗體或抗體片段與從約153至約208、從約200至約260、從約250至約300、從約275至約325、從約300至約360、從約350至約400，和/或從約375至約425的片段內一個表位結合。

在各種各樣的實施例中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結合片段與前肽域(SEQ ID NO:755的31至152殘基)內的一個表位結合；更具體的是，與從約31殘基至約90殘基或從約90殘基至約152殘基內一個表位結合；更具體的是，本發明之抗體或抗體片段與從約31殘基至約60殘基、從約60殘基至約90殘基、從約85殘基至約110殘基、從約100殘基至約130殘基、從約125殘基至約150殘基、從約135殘基至約152殘基，和/或從約140殘基至約152殘基的片段內的一個表位結合。

在某些實施例中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結合片段與C端域(SEQ ID NO:755的426至692殘基)內的一個表位結合；更具體的是，與從約426殘基至約570殘基或從約570殘基至約692殘基內一個表位結合；更具體的是，本發明之抗體或抗體片段與從約450殘基至約500殘基、從約500殘基至約550殘基、從約550殘基至約600殘基，和/或從約600殘基至約692殘基的片段內的一個表位結合。

在某些實施例中，抗體或抗體片段與一個表位結合，該表位包括催化域、前肽域或C端域內和/或兩個或三個不同域內的一個以上所列舉表位(例如催化域和C端域內，或前肽域和催化域內，或前肽域、催化域和C端域內的表位)。

在某些實施例中，該抗體或抗原結合片段與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的胺基酸殘基238的hPCSK9上的一個表位結合。實驗結果(表27)顯示，當D238發生突變時，mAb 316P的K_D 顯示結合親和力下降>400倍(~1 x10^-9 M至~410 x10^-9 M)且T_1/2 下降>30倍(從~37至~1 min)。在一個特殊的實施例中，該突變是D238R。在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段與在153、159、238和343位置上含有兩個或兩個以上胺基酸殘基的hPCSK9的一個表位結合。

如下所示，胺基酸殘基153、159或343的突變導致了親和力下降約5至10倍或T_1/2 類似的縮短。在一些特殊的實施例中，突變為S153R、E159R和/或D343R。

在某些實施例中，該抗體或抗原結合片段與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的胺基酸殘基366的hPCSK9上的一個表位結合。實驗結果(表27)顯示，當E366發生突變時，mAb 300N的親和力顯示約50倍的下降(~0.7 x10^-9 M至~36 x10^-9 M)且T_1/2 也類似地縮短(從~120至~2 min)。在一個特殊的實施例中，該突變是E366K。

本發明包括與本文所述的任何特殊代表性抗體一樣與表位結合的抗PCSK9抗體。類似地，本發明還包括與本文所述的任何特殊代表性抗體在與PCSK9或PCSK9片段結合過程中競爭的抗PCSK9抗體。

使用本領域內已知的常規方法，可以容易地確定一種抗體是否與本發明之對照抗PCSK9抗體一樣與同樣的表位結合，或在結合過程中競爭。例如，為了確定一種試驗抗體是否與本發明之對照抗PCSK9抗體一樣與同樣的表位結合，就讓該對照抗體與PCSK9蛋白或肽在飽和條件下結合。然後，評估試驗抗體與該PCSK9分子結合的能力。如果該試驗抗體在與對照抗PCSK9抗體飽和結合之後能夠與PCSK9結合，就可得出結論，該試驗抗體和對照抗PCSK9抗體與不同的表位結合。在另一方面，如果該試驗抗體在與對照抗PCSK9抗體飽和結合之後不能與PCSK9分子結合，那麼該試驗抗體就可與本發明之對照抗PCSK9抗體所結合的同一表位結合。

為了確定一種抗體是否與對照抗PCSK9抗體在結合過程中競爭，在兩個方向實施上述結合方法：在第一個方向，讓對照抗體與PCSK9分子在飽和條件下結合，然後評估試驗抗體與該PCSK9分子的結合。在第二個方向，讓試驗抗體與PCSK9分子在飽和條件下結合，然後評估對照抗體與該PCSK9分子的結合。如果在這兩個方向只有第一個(飽和)抗體能夠與PCSK9分子結合，那就可以得出結論，該試驗抗體與對照抗體在與PCSK9結合的過程中競爭。如同本領域專業人員所能理解的，與對照抗體在結合過程中競爭的抗體未必與對照抗體所結合的同一表位結合，但可與一個重疊或鄰近的表位結合而在空間上阻斷該對照抗體。

如果每個抗體競爭性地抑制(阻斷)另一抗體與抗原的結合，兩個抗體就會與同一或重疊的表位結合。換言之，一種1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量的抗體將抑制另一抗體的結合達至少50%，但較佳的是75%，90%或甚至99%，如競爭結合分析所測量(參閱例如Junghans et al.,Cancer Res. 1990 50:1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一種抗體結合的幾乎所有的胺基酸突變能降低或消除另一種抗體的結合，則兩種抗體具有相同的表位。如果降低或消除一種抗體結合的某些胺基酸突變也能降低或消除另一種抗體的結合，則兩種抗體具有重疊的表位。

然後可進行其他常規實驗(例如肽突變和結合分析)以確定是否觀察到的試驗抗體的結合不足實際上是由於與對照抗體所結合的同一表位結合，或是否空間阻斷(或另一現象)是觀察到的結合不足的原因。這類實驗可採用ELISA、RIA、表面電漿共振技術、流式細胞計量法或本領域內所具備的任何其他定量或定性的抗體結合分析。

在一個特殊的實施例中，本發明包括一種抗PCSK9抗體或抗體的抗原結合片段，它與序列號為SEQ ID NO:755的PCSK9蛋白結合，其中該抗體或其片段與PCSK9和PCSK9蛋白變體之間的結合低於該抗體或片段與序列號為SEQ ID NO:755的PCSK9蛋白之間的結合的50%。在一個特殊的實施例中，該PCSK9蛋白變體在153、159、238和343位置包含至少一個殘基突變。在一個更特殊的實施例中，至少一個突變是S153R、E159R、D238R和D343R。在另一個特殊的實施例中，該PCSK9蛋白變體包含至少一個位於366的突變。在一個特殊的實施例中，該PCSK9蛋白變體在147、366和380位置包含至少一個殘基突變。在一個更特殊的實施例中，該突變是S147F、E366K和/或V380M。

免疫偶聯物

本發明包括一種與治療基團(「免疫偶聯物」)如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯的人抗PCSK9單株抗體。細胞毒素包括任何損害細胞的試劑。適宜於形成免疫偶聯物的細胞毒素和化療劑的例子是本領域內周知的。參閱如WO 05/103081。

雙特異性

本發明之抗體可以是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性mAbs抗體可以針對同一目標多肽的不同表位，或可含有針對一個以上目標多肽的抗原結合域。參閱，如Tutt et al.(1991)J. Immunol. 147:60-69。人抗PCSK9 mAbs抗體可連接到另一個功能分子，如另一個肽或蛋白質上，或與之共同表現。例如，一種抗體或其片段可與一種或多種其他分子實體如另一種抗體或抗體片段實現功能性(例如以化學偶聯、基因融合、非共價鍵連接或其他方式)連接，以產生具有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。

可用於本發明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(1g)CH3結構域和第二個Ig CH3結構域，其中第一個和第二個Ig CH3結構域相互之間相差至少一個胺基酸，且與無胺基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個胺基酸的差別降低了雙特異性抗體與蛋白A的結合力。在一個實施例中，第一個Ig CH3結構域與蛋白A結合，第二個Ig CH3結構域含有一個降低或消除與蛋白A結合的突變，例如一個H95R修飾(按照IMGT表現序列編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個CH3結構域可進一步包含一個Y96F修飾(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436F)。可在第二個CH3域內找到的其他修飾包括：在IgG1抗體的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗體的情況下為N44S、K52N和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗體的情況下為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認為是在本發明的範圍之內。

生物等效物

本發明之抗PCSK9抗體和抗體片段包括某些蛋白，這些蛋白含有不同於所述mAbs抗體的胺基酸序列的胺基酸序列，但保留了與人PCSK9結合的能力。當與母體序列比較時，這類變異的mAbs抗體和抗體片段包含一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代，但顯示了與所述mAbs抗體的生物活性基本上相當的生物活性。類似地，當與所披露序列比較時，本發明之編碼抗PCSK9抗體的DNA序列含有的序列包含一個或多個核苷酸的添加、缺失或取代，但可編碼與本發明之抗PCSK9抗體或抗體片段基本上生物等效的抗PCSK9抗體或抗體片段。這類變異胺基酸和DNA序列的實例已在上面討論。

如果兩種抗原結合蛋白或抗體是醫藥等效物或醫藥替換物，當在相似實驗條件下無論以單劑或以多劑方式以相同摩爾劑量給藥時，其吸收速率和程度均未顯示顯著差別，則它們被認為是生物等效的。某些抗體如果它們的吸收程度相當但吸收速率不相當，它們將被認為是等效物或醫藥替換物，並仍可被認為是生物等效的，因為這種吸收速率的差別是有意設計的並反映在標簽上，這種差別對於達到有效的體內藥物濃度是非關鍵性的(例如對於慢性用途)，並被認為對於所研究的特定醫藥產品在醫學上是無關重要的。在一個實施例中，如果兩種抗原結合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒有臨床意義上的差別，則它們是生物等效的。

在一個實施例中，如果一名患者可以在對照產品和生物產品之間轉換一次或多次而不良副作用的風險並未如預期那樣增加，包括與無這種轉換的連續治療相比在免疫原性方面無顯著的臨床變化或效率降低，則兩種抗原結合蛋白就是生物等效的。

在一個實施例中，如果兩種抗原結合蛋白在使用條件下都以一種或多種共同的作用機制起作用，且這類機制是周知的，則它們就是生物等效的。

生物等效性可以體內和體外的方法演示。生物等效性的測量包括，例如，(a)一種在人類或其他哺乳類動物體內的試驗，其中血液、血漿、血清或其他生物體液中抗體或其代謝物的濃度是作為時間的函數測定的；(b)一種體外試驗，該試驗已與人的體內試驗生物利用率數據建立相關聯繫並可根據人的體內試驗生物利用率數據合理預測；(c)一種人類或其他哺乳類動物的體內試驗，其中抗體(或其目標)適當的急性藥理作用是作為時間的函數測定的；以及(d)一種控制良好的臨床試驗，該試驗確定抗體的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。

本發明抗PCSK9抗體的生物等效變體可透過例如取代生物活性不需要的各種殘基或序列或刪除生物活性不需要的端部或內部殘基或序列而構建。例如，對於生物活性並非必需的半胱氨酸殘基可被刪除或被其他胺基酸取代，以防在復原時形成不必要或不正確的分子內二硫化物橋。

治療群體

本發明提供了一些治療方法以治療需要使用本發明組合物的人類患者。儘管改變生活方式和常規藥物治療往往能成功地降低膽固醇水平，但並非所有患者都能用這些手段達到推薦的目標膽固醇水平。儘管積極地採用常規治療，但各種各樣的症狀，如家族性高膽固醇血症(FH)，似乎會抵制降低LDL-C水平的措施。純合和雜合家族性高膽固醇血症患者(hoFH、heFH)是與過早出現的動脈粥樣硬化血管疾病相關的症狀。但是，診斷為hoFH的患者在很大程度上對常規的藥物治療無反應且只有有限的治療選擇。具體而言，採用抑制膽固醇合成和上調肝臟LDL受體而降低LDL-C的抑制素進行治療，對LDL受體不存在或有缺陷的患者效果甚小。據最近報道，在用最高劑量抑制素治療的基因型確定的hoFH患者中，平均LDL-C下降還不到20%。在此治療方案基礎上增加10 mg/日的依澤替米貝(ezetimibe)導致LDL-C水平總共下降了27%，但離最佳效果仍然相距甚遠。類似地，許多患者對抑制素無反應、用抑制素治療對病情的控制較差，或不能耐受抑制素治療；一般而言，這些患者用其他治療方式不能達到對膽固醇的控制。對於能克服現有治療措施之缺點的新治療方法有著很大的尚未滿足的需要。

可以本發明之方法治療的具體人群包括需要LDL血漿析離的患者、PCSK9激活(GOF)突變的患者、雜合家族性高膽固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素無法控制的原發性高膽固醇血症患者；以及具有患高膽固醇血症的危險但可進行預防性治療的患者。

治療給藥和配方

本發明提供了一些含有本發明之抗PCSK9抗體或其抗原結合片段的治療組合物。本發明之治療組合物將與適宜的載體、賦形劑以及其它加入配方中改善轉移、遞送、耐受性等的製劑一起施用。在藥劑化學師眾所周知的處方集裏可以找到大量的適宜配方。雷氏藥學大全(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA.)。這些配方包括，如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類、含有脂(陽離子或陰離子)的泡囊(如LIPOFECTIN^TM )、DNA偶聯物、無水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體狀凝膠以及含有聚乙二醇的半固體狀混合物。還可參閱Powell et al. Compendium of Excipients for Parenteral Formulations(非腸道用配方之賦形劑概論),PDA(1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311。

其劑量可根據即將受藥的受試者的年齡和體形大小、目標疾病、病症、給藥途徑等因素而改變。當本發明之抗體用於治療與PCSK9相關的各種病症和疾病，包括高膽固醇血症、與LDL和載脂蛋白B相關的疾病，以及脂質代謝疾病等時，對於一名成年患者而言以靜脈輸入本發明之抗體是有利的。通常是按照約0.01至約20 mg/kg體重，較佳的是按照約0.02至7、約0.03至約5，或約0.05至約3 mg/kg體重的單一劑量輸入。取決於病症的嚴重程度，治療的頻率和持續時間可以調節。

各種給藥系統是周知的並可用於本發明之醫藥組合物的給藥，例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊中、能表現突變體病毒的重組細胞、受體介導的胞吞作用(參閱例如Wu et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。給藥方法包括但不限於皮內、肌內、腹腔內、靜脈、皮下、經鼻、硬膜外以及經口給藥。該組合物可以任何方便的途徑給藥，例如，輸注或快速注射，經上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並可與其它生物活性劑一起給藥。給藥方式可以是全身性或局部性的。

該醫藥組合物也可以微囊尤其是脂質體形式給藥(參閱Langer(1990) Science 249:1527-1533；Treat et al.(1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(脂質體用於傳染病和癌症治療),Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；一般參閱同上)。

在某些情況下，該醫藥組合物可以一種控制性釋放系統給藥。在一個實施例中，可使用一個泵(參閱Sefton(1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一個實施例中，可採用聚合物材料；參閱Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。在又一個實施例中，可將一種控制釋放系統置於該組合物目標的附件，從而只需要全身性劑量的一部分(參閱例如，Goodson,in Medical Applications of Controlled Release(控制釋放的醫學應用)，出處同上，vol. 2,pp. 115-138,1984)。

可注射製劑可包括靜脈注射、皮下、皮內和肌內注射、滴注輸液等劑型。這些可注射製劑可以公知的方法製備。例如，可以將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在無菌水介質或通常用於注射的油性介質中，以此方式製備該可注射製劑。作為注射用的水介質有例如生理鹽水、含葡萄糖和其他助劑的等滲溶液等，可結合使用適當的增溶劑，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非離子型表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO- 50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩爾)加合物)]等。作為油性介質，可採用例如芝麻油、豆油等，可結合使用增溶劑，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此製備的注射液最好是裝入一種適當的安瓿瓶中。本發明之醫藥組合物可用標準的針頭和針筒經皮下或靜脈注射。此外，對於皮下給藥，一種筆型給藥裝置可方便地用於本發明之醫藥組合物的給藥。這種筆型給藥裝置可以重複使用或一次性使用。可重複使用的筆型給藥裝置一般採用一種可更換的含醫藥組合物的藥筒。一旦藥筒內所有醫藥組合物均已輸出、藥筒變空，則可方便地丟棄空藥筒，並用一個含醫藥組合物的新藥筒取代。該筆型給藥裝置就可重複使用。在一次性使用的筆型給藥裝置中，沒有可更換的藥筒。而是，該一次性使用的筆型給藥裝置有一個預先充滿醫藥組合物的貯液器。一旦該貯液器內醫藥組合物用完，整個裝置則被丟棄。

許多可重複使用的筆型和自動注射給藥裝置已用於本發明之醫藥組合物的皮下給藥。其例子包括但當然不限於AUTOPEN^TM (Owen Mumford,Inc.,Woodstock，英國)、DISETRONIC^TM 筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25^TM 筆、HUMALOG^TM 筆、HUMALIN 70/30^TM 筆(Eli Lilly and Co.，印第安納州印第安納波利斯)、NOVOPEN^TM I、II和III型(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、NOVOPEN JUNIOR^TM (Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、BD^TM 筆(Becton Dickinson，新澤西州富蘭克林湖)、OPTIPEN^TM 、OPTIPEN PRO^TM 、OPTIPEN STARLET^TM ，以及OPTICLIK^TM (sanofi-aventis，德國法蘭克福)，僅此列舉幾個品牌。用於本發明之醫藥組合物皮下給藥的一次性使用的筆型給藥裝置的例子包括但當然不限於SOLOSTAR^TM 筆(sanofi-aventis)，FLEXPEN^TM (Novo Nordisk)，以及KWIKPEN^TM (Eli Lilly)。

有利的是，上述口服或注射用醫藥組合物是製備成單位劑量的劑型，以包含一定劑量的活性成分。這種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液(安瓿)、栓劑等。單位劑量的上述抗體含量一般為每劑約5至約500 mg；尤其是注射劑型，首選的是上述抗體含量為約5至約100 mg，其他劑型中抗體含量為約10至約250 mg。

本發明提供了一些治療方法，其中將本發明之抗體或抗體片段用於治療各種涉及hPCSK9的高膽固醇血症。本發明之抗PCSK9抗體或抗體片段對於高膽固醇血症及類似病症的治療是尤其有用的。複合合療法可包括本發明之抗PCSK9抗體與例如一種或多種藥劑結合，該藥劑(1)透過抑制3-羥基-3-甲基戊二醯(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘導膽固醇合成的細胞清除，如西利維司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)；(2)能夠抑制膽固醇吸收和1或膽汁酸再吸收；(3)能夠增加脂蛋白分解代謝(如煙酸)；以及在膽固醇如22-羥基膽固醇的清除過程中起作用的LXR轉錄因子的活化劑，或一種固定的結合如依澤替米貝(ezetimibe)加辛伐他汀(simvastatin)；一種抑制素加膽汁樹脂(如消膽胺(cholestyramine)、降脂樹脂II(colestipol)、考來維侖(colesevelam)，煙酸與一種抑制素的固定結合(如煙酸加洛伐他汀)；或與其他降脂質藥劑如歐米加-3-脂肪酸乙酯(如omacor)的固定結合。

實例

舉出以下實例是為了向本領域一般技術人員就如何利用本發明之方法和組合物提供一個完整的披露和說明，並非是為了限制被發明者視為其發明的範圍。已作出許多努力以確保所用數字的準確性，但也應考慮到某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，分子量是指平均分子量，溫度是指攝氏度，壓力是指大氣壓或接近大氣壓。

實例1：抗人PCSK9的人抗體的產生

將VELOCIMMUNE^TM 小鼠用人PCSK9免疫，並以抗原特異免疫測定法用這些小鼠的血清以監測抗原免疫反應。從顯示較高抗hPCSK9抗體效價的免疫小鼠的脾臟收穫表現B細胞的抗hPCSK9，並與小鼠骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤。使用如下所述的分析法篩選該融合瘤以鑑定表現hPCSK9特異性抗體的細胞系。該分析法鑑定了幾種產生嵌合的抗hPCSK9抗體的細胞系，這些抗體分別以H1M300、H1M504、H1M505、H1M500、H1M497、H1M498、H1M494、H1M309、H1M312、H1M499、H1M493、H1M496、H1M503、H1M502、H1M508、H1M495以及H1M492表示。

如美國專利2007/0280945A1中所述，人PCSK9特異性抗體還可從經抗原免疫的B細胞直接分離而不與骨髓瘤細胞融合。選殖重鏈和輕鏈可變域以產生完全人抗hPCSK9抗體，分別以H1H313、H1H314、H1H315、H1H316、H1H317、H1H318、H1H320、H1H321以及H1H334表示。表現這些抗體的穩定的重組CHO細胞系得以確定。

實例2：基因利用分析

為了分析所產生mAbs的結構，對編碼抗體可變區的核酸進行了選殖和測序。經N-端胺基酸測序證實了預測的可變區胺基酸序列。從mAbs的核酸序列和預測的胺基酸序列出發，為每種抗體鏈鑑定了基因的用途。

實施例3：抗原結合親和力測定

hPCSK9與上述融合瘤細胞系所產生的mAbs結合的平衡解離常數(K_D )是根據實時生物傳感器表面電漿共振分析(BIACORE^TM T100)的表面動力學測定的。透過與BIACORE^TM 芯片直接化學偶聯而產生山羊抗小鼠IgG多株抗體，以4 μl/min的流量將每種抗體捕獲在其表面上達90秒鐘，以形成捕獲抗體表面。將濃度為50 nM或12.5 nM的hPCSK9-myc-myc-his(hPCSK9-mmh)注射在該捕獲抗體的表面上，流量為50 μl/min，注射300秒鐘，並於25℃或37℃監測抗原-抗體解離過程達15分鐘(K_D =pM；T_1/2 =min)。

hPCSK9與直接分離脾細胞所產生的mAbs結合的平衡解離常數(K_D )是根據實時生物傳感器表面電漿共振分析(BIACORE^TM T100)的表面動力學測定的。透過與BIACORE^TM 芯片直接化學偶聯而產生山羊人IgG多株抗體，以2 ul/min的流量將每種選定的抗體捕獲在其表面上達6秒鐘，以形成捕獲抗體表面。將濃度為50 nM或12.5 nM的人PCSK9-mmh注射在該捕獲抗體的表面上，流量為70 ul/min，注射5分鐘，並於25℃或37℃監測抗原-抗體解離過程達15分鐘(K_D =pM；T_1/2 =min)

選定mAbs與標記恒河猴(Macaca mulata ) PCSK9(mmPCSK9；SEQ ID NO:756)(mmPCSK9-mmh)於25℃的解離速率(kd)以如上所述方式確定。

實例4：pH值對抗原結合親和力的影響

按照如上所述評估了pH值對CHO細胞產生的全人源抗hPCSK9 mAbs的抗原結合親和力的影響。所測試的mAbs是全人源H1H316P(「316P」)(HCVR/LCVR SEQ ID NO:90/92；CDR序列SEQ ID NO:76/78/80和84/86/88)以及H1M300N(「300N」)(HCVR/LCVR SEQ ID NO:218/226；CDR序列SEQ ID NO:220/222/224和228/230/232)。將hPCSK9-mmh以高密度(約35至45共振單位，RU)或低密度(約5至14 RU)捕獲在抗myc mAb表面。將濃度為50 nM的每種抗體的HBST溶液(pH 7.4或pH 5.5)於25℃注射在捕獲的hPCSK9抗體表面，流量為100 μl/ml，注射1.5分鐘，並監測抗原-抗體解離過程達10分鐘。對照抗體I：抗hPCSK9 mAb SEQ ID NO:79/101(WO 2008/063382)(K_D =pM；T_1/2 =min)。

按照如上所述以改進的BIACORE^TM 分析法於pH 7.4或pH 5.5測定316P和300N的抗原結合特性。簡言之，以胺偶聯法將mAbs固定在BIACORE^TM CM5傳感芯片上。將11至100 nM不同濃度myc-myc-his標記的hPCSK9、小鼠PCSK9(mPCSK9，SEQ ID NO:757)、含有D374Y獲得功能(GOF)點突變的hPCSK9(hPCSK9(D374Y))、獼猴(Macaca fascicularis )PCSK9(mfPCSK9，SEQ ID NO:761)(mfPCSK9)、大鼠(Rattus norvegicus )PCSK9(rPCSK9，SEQ ID NO:763)以及his標記的敘利亞金倉鼠(Mesocricetus auratus )PCSK9(maPCSK9，SEQ ID NO:762)(maPCSK9)，以100 μl/ml流量注射在抗體表面達1.5 min，並於25℃(表6)或37℃(表7)實時監測抗原-抗體解離過程達5分鐘。對照抗體II：抗hPCSK9 mAbs SEQ ID NO:67/12(WO 2009/026558)。注：在實驗條件下未觀察到結合現象(K_D =pM；T_1/2 =min)。

實例5：抗hPCSK9 mAbs與含有點突變D374Y的hPCSK9之結合

選定的抗hPCSK9 mAbs與含有獲得功能(GOF)點突變D374Y的hPCSK9(hPCSK9(D374Y)-mmh)的結合親和力是按照如上所述方法測定的。透過與BIACORE^TM 芯片直接化學偶聯而產生山羊抗人IgG多株抗體，以40 ul/min的流量將每種抗體捕獲在其表面上達8至30秒鐘，以形成捕獲抗體表面。將濃度為1.78 nM至100 nM的hPCSK9(D374Y)-mmh注射在該捕獲抗體的表面上，流量為50 μl/min，注射5分鐘，並於25℃監測hPCSK9(D374Y)-mmh和抗體解離過程達15分鐘：對照抗體III：抗hPCSK9 mAbs SEQ ID NO:49/23(WO 2009/026558)(K_D =pM；T_1/2 =min)。

實例6：抗hPCSK9 mAbs的結合特異性

將316P、300N和對照抗體I抗hPCSK9 mAbs捕獲在BIACORE^TM 2000胺偶聯的抗hFc CM5芯片上。將標記的(myc-myc-his)人PCSK9、人PCSK1(hPCSK1)(SEQ ID NO:759)、人PCSK7(hPCSK7)(SEQ ID NO:760)，或小鼠PCSK9注射(100 nM)在捕獲的mAb表面上，並於25℃結合5分鐘。記錄RU的變化。結果：300N和對照抗體I僅與hPCSK9結合，而316P則與hPCSK9和mPCSK9兩者都結合。

以ELISA測定了抗hPCSK9 mAbs的結合特異性。簡言之，將抗hPCSK9抗體塗覆在一個96孔板上。將1.2 nM人PCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、maPCSK9-h、hPCSK1-mmh或hPCSK7-mmh加至抗體塗覆的板上，並於室溫培養1小時。然後以HRP綴合的抗His抗體檢測與板結合的PCSK蛋白。結果顯示，316P與人、小鼠和倉鼠PCSK9結合，而300N和對照抗體I僅與hPCSK9結合。所有抗hPCSK9 mAbs均不顯示與hPCSK1或hPCSK7的顯著結合。

實例7：抗hPCSK9 mAbs的交叉反應性

用BIACORE^TM 3000測定抗hPCSK9 mAbs與mmPCSK9、mfPCSK9、mPCSK9、maPCSK9或rPCSK9的交叉反應性。將抗hPCSK9 mAbs捕獲在透過與BIACORE^TM 芯片直接化學偶聯而產生的抗hFc的表面上。將純化的帶標記的hPCSK9、hPCSK9(D374Y)、mmPCSK9、mfpCSK9、mPCSK9、maPCSK9或rPCSK9分別以1.56 nM至50 nM的濃度於25℃或37℃注射在抗體表面。測定316P、300N、對照I、對照II或對照III與PCSK9蛋白之間的結合(K_D =pM；T_1/2 =min)。

表13對照III mAb

實例8：抑制hPCSK9和hLDLR域之間的結合

使用BIACORE^TM 3000評估選定抗hPCSK9 mAbs阻斷hPCSK9與人LDLR全長胞外域(hLDLR-ecto SEQ ID NO:758)、hLDLR EGF-A域(SED ID NO:758的313-355胺基酸)、或hLDLR EGF-AB域(SED ID NO:758的314-393胺基酸)(LDLR Genbank編號NM_000527)結合的能力。簡言之，以胺偶聯法將hLDLR-ecto、EGF-A-hFc或EGF-AB-hFc蛋白偶聯在CM5芯片上，以產生受體或受體片段表面。將62.5 nM(2.5倍過量於抗原)的抗hPCSK9 mAbs與25 nM hPCSK9-mmh預混合，然後於25℃溫育40分鐘使抗體-抗原結合達到平衡以形成平衡溶液。於25℃將平衡溶液以2 μl/min流量注射在受體或受體片段表面達40分鐘。測定因抗hPCSK9 mAbs與hLDLR-ecto、EGF-A-hFc或EGF-AB-hFc的結合而引起的RU變化。結果顯示，H1H316P和H1M300N阻斷了hPCSK9-mmh與hLDLR-ecto、hLDLR EGF-A域以及hLDLR EGF-AB域的結合；H1H320P阻斷了hPCSK9-mmh與hLDLR-ecto以及hLDLR EGF-A域的結合；以及H1H321P阻斷了hPCSK9-mmh與hLDLR EGF-A域的結合。

mAbs阻斷hPCSK9與hLDLR-ecto、hLDLR EGF-A域或hLDLR EGF-AB域結合的能力也是用基於ELISA的免疫分析法評估的。簡言之，分別以2 μg/ml濃度將hLDLR-ecto、hLDLR EGF-A-hFc或hLDLR EGF-AB-hFc塗覆在96孔板上，於4℃在PBS緩衝液中培養過夜，並用BSA阻斷非特異性結合位點。用此板在以不同濃度抗hPCSK9 mAbs預平衡的PCSK9-mmh溶液中測量游離hPCSK9-mmh。將定量的hPCSK9-mmh(500 pM)與0至~50 nM不同量的抗體系列溶液預混合，然後在室溫(RT)下溫育1小時使抗體-抗原結合達到平衡。將此平衡樣品溶液轉移至受體或受體片段塗覆的培養板上。結合1小時後，洗滌此培養板並用HRP輟合的myc抗體檢測結合的hPCSK9-mmh。測定IC₅₀ 值(以pM為單位)，其定義為使得與板上塗覆的受體或受體片段結合的hPCSK9-mmh下降50%所需的抗體量。結果顯示，在中性pH(7.2)和酸性pH(5.5)條件下，特異性mAbs均功能性地阻斷PCSK9與三種受體的結合。

mAbs阻斷hPCSK9 GOF突變體hPCSK9(D374Y)-mmh與hLDLR EGF-A域或hLDLR EGF-AB域(IC₅₀ 值，以pM為單位)結合的能力也是用上述基於ELISA的免疫分析法使用定量的0.05 nM hPCSK9(D374Y)-mmh評估的。

mAbs阻斷mmPCSK9或mPCSK9與hLDLR-ecto域、hLDLR EGF-A域或hLDLR EGF-AB域(IC₅₀ 值，以pM為單位)結合的能力，是在中性pH(7.2)條件下使用定量的1 nM mmh標記的mmPCSK9或1 nM mPCSK9，用上述基於ELISA的免疫分析法評估的。

表16

mAbs阻斷hPCSK9、mmPCSK9、rPCSK9、maPCSK9、mfPCSK9或mPCSK9與hLDLR EGF-A域結合的能力(IC₅₀ 值，以pM為單位)，是在中性pH(7.2)條件下(表17)或酸性pH條件下(5.5，表18)，使用定量的0.5 nM hPCSK9-mmh、1 nM mmPCSK9-mmh、1 nM rPCSK9-mmh、1 nM maPCSK9-h、0.3 nM mfPCSK9-mmh或1 nM mPCSK9-mmh，用上述基於ELISA的免疫分析法評估的。

316P和對照抗體I阻斷hPCSK9與hLDLR結合的能力也被測定。簡言之，以胺偶聯法將重組hLDLR或hLDLR-EGFA-mFc固定在BIACORE^TM CM5芯片上。將100 nM的hPCSK9-mmh和316P、對照抗體I mAb或一種非hPCSK9特異性mAb(分別為250 nM)抗原-抗體混合物於室溫下培養1小時，然後於25℃以流量10 μl/ml注射在hLDLR或hLDLR-EGFA表面上達15分鐘。記錄因混合物中游離hPCSK9-mmh與hLDLR或hLDLR-EGFA的結合而引起的RU變化。hPCSK9與hLDLR或hLDLR-EGFA的結合完全被316P和300N阻斷，但未被對照抗體I mAb阻斷。

實例9：表位作圖

為了測定表位結合特異性，產生了三種嵌合的PCSK9-mmh蛋白，其中用小鼠PCSK9域取代了特異性人PCSK9域。嵌合蛋白#1由一個小鼠PCSK9前結構域(SEQ ID NO:757的胺基酸殘基1-155)接著一個人PCSK9催化域(SEQ ID NO:755的殘基153-425)及一個小鼠PCSK9 C-端域(SEQ ID NO:757的殘基429-694)(mPro-hCat-mC-term-mmh)組成。嵌合蛋白#2由一個人PCSK9前結構域(SEQ ID NO:755的殘基1-152)接著一個小鼠PCSK9催化域(SEQ ID NO:757的殘基156-428)及一個小鼠PCSK9C-端(hPro-mCat-mC-term-mmh)組成。嵌合的蛋白#3由小鼠PCSK9前結構域和一個小鼠PCSK9催化域接著一個人PCSK9C-端域(SEQ ID NO:755的殘基426-692)(mPro-mCat-hC-term-mmh)組成。此外，產生了含有點突變D374Y的hPCSK9(hPCSK9(D374Y)-mmh)。

mAbs與試驗蛋白hPCSK9-mmh、小鼠PCSK9-mmh、嵌合蛋白#1、#2和#3，以及hPCSK9(D374Y)-mmh的結合特異性以如下方式測試：將mAbs塗覆在96孔板上於4℃過夜，然後將每種試驗蛋白(1.2 nM)加到板上。於室溫結合1小時之後，洗滌培養板並用HRP-輟合的抗myc多株抗體檢測結合的試驗蛋白(++=OD>1.0；+=OD 0.4-1.0；-=OD<0.4)。

按照上述方法測試了316P、300N及對照抗體抗hPCSK9 mAbs與hPCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、mmPCSK9-mmh、mfPCSK9-mmh、rPCSK9-mmh、嵌合蛋白#1、#2和#3以及hPCSK9(D374Y)-mmh的結合特異性，但蛋白濃度為1.7 nM(-=OD<0.7；+=OD 0.7-1.5；++=OD>1.5)。

以BIACORE^TM 結合分析法獲得了選定mAbs的類似結果。簡言之，將316P、300N或對照抗體I mAb捕獲在胺偶聯抗hFc CM5芯片上，並將每種蛋白100 nM注射在mAb-捕獲表面。測定因每種蛋白與mAb表面的結合而引起的RU變化。

為了進一步評估與mPCSK9-mmh交叉反應的316P的結合特異性，開發了一種交叉競爭ELISA分析法以測定結合域特異性。簡言之，先以1 μg/ml將對嵌合蛋白#1、#2或#3具有特異性的mAbs塗覆在96孔板上過夜。然後將人PCSK9-mmh(2 μg/ml)加入每孔，再於室溫培養1小時。加入316P(1 μg/ml)並於室溫再培養小時。使用HRP-輟合的抗hFc多株抗體檢測板結合的316P。雖然316P與hPCSK9-mmh的結合未受對嵌合蛋白#2或嵌合蛋白#3具有特異性的mAbs存在的影響，但316P與hPCSK9-mmh的結合因對嵌合蛋白#1具有特異性的抗體存在而大大下降。

實例10：基於BIACORE^TM 的抗原結合特性評估

使用BIACORE^TM 1000還確定了316P、300N、對照抗體I、II，以及III mAbs抗體結合特性。簡言之，將hPCSK9-mmh捕獲在抗myc表面。於25℃將第一抗hPCSK9 mAb(50 μg/ml)於25℃注射在PCSK9結合的表面達10分鐘。然後於25℃將第二抗hPCSK9 mAb(50 μg/ml)於25℃注射在第一mAb結合的表面上達10分鐘。測量第一mAb阻斷第二mAb結合的能力並表現為抑制百分比。

實例11：抗hPCSK9抗體吸收LDL量的增加

用人肝細胞肝癌細胞系(HepG2)測定抗hPCSK9 mAbs增加LDL體外吸收的能力。將HepG2細胞以9 x 10⁴ 細胞/孔密度接種在96孔板上DMEM完全培養基中，並在37℃、5% CO₂ 條件下培養6小時，以形成HepG2單層細胞。將在無脂蛋白培養基(LPDS)中濃度為50 nM的人PCSK9-mmh和在LPDS中各種不同濃度(500 nM至0.98 nM)的試驗mAb加入。每次實驗的數據均以IC₅₀ 值表示(IC₅₀ =LDL吸收增加50%時的抗體濃度)。此外，該實驗還顯示，316P和300N兩者均能完全逆轉hPCSK9對LDL吸收的抑制作用，而對照抗體I mAb或H1M508抗hPCSK9 mAb只能逆轉該抑制作用約50%。

還按如上所述在HepG2細胞系中測試了抗hPCSK9 mAbs逆轉不同哺乳動物物種PCSK9蛋白對LDL吸收的抑制作用的能力。簡言之，用抗體在LPDS培養基中的系列稀釋液(從500 nM開始)和50 nM的hPCSK9-mmh、mfPCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、rPCSK9-mmh或maPCSK9-h培養HepG2細胞過夜。還用抗體在LPDS中的系列稀釋液(從50 nM開始)和1 nM hPCSK9(D374Y)培養HepG2細胞過夜。如表24所示，雖然316P能完全逆轉所測試的全部PCSK9蛋白對LDL的抑制作用，但300N只能逆轉hPCSK9、hPCSK9(D374Y)和mfpCSK9對LDL吸收的抑制作用。數值以nM IC₅₀ 表示。

實例12：hPCSK9體內生物作用的中和

為了評估中和PCSK9的生物作用，以流體動力注射(HDD)法注射編碼全長hPCSK9-mmh的DNA重組子，將hPCSK9過分表現在C57BL/6小鼠體內。給4只小鼠(C57BL/6)注射空白載體/鹽水(對照物)，給16小鼠在尾部靜脈注射一種50 μg hPCSK9-mmh-DNA/鹽水混合物，劑量等於它們體重的10%。HDD注射7天後，注射hPCSK9導致了總膽固醇上升1.6倍、LDL-膽固醇(LDL-C)上升3.4倍以及非HDL膽固醇上升1.9倍(相對於對照物)。以定量ELISA評估，第7天的血清hPCSK9水平全都大於1 μg/ml。

HDD注射後，於第6天給3個實驗組(1、5或10 mg/kg)(每組n=4)經腹腔(i.p.)注射H1M300N，導致血清膽固醇水平的顯著衰減。注射後第18小時，在分別用1、5或10 mg/kg H1M300N處理的組內，總膽固醇分別降低了9.8%、26.3%和26.8%，LDL-C分別降低了5.1%、52.3%和56.7%，非HDL膽固醇分別降低了7.4%、33.8%和28.6%。

實例13：猴體內藥物動力學和血清化學研究

在體重為5-7kg、齡為3-5歲的原生雄性獼猴(Macaca fascicularis )中進行了一項藥物動力學(PK)研究。

分組。將猴子分為5個處理組：處理組1(n=3)接受對照緩衝液(10 mM磷酸鈉，pH 6，1 ml/kg)；處理組2(n=3)接受1 ml/kg 316P(5 mg/ml)；處理組3(n=3)接受1 ml/kg 300N(5 mg/ml)；處理組4(n=3)接受1 ml/kg 316P(15 mg/ml)；以及處理組5(n=3)接受1 ml/kg 300N(15 mg/ml)。所有處理均採取IV快速注射，然後用1 ml鹽水沖洗。總劑量(ml)系根據最近的體重計算(每只動物在適應期間稱重兩次，整個研究期間每週稱重一次)。在第1天只注射一劑試驗mAb或對照緩衝液。

動物飼養管理 。動物被關在一種溫度和濕度受監控的環境中。目標溫度和相對濕度範圍分別在18-29℃和30-70%之間。自動照明系統提供12小時白晝週期。為了研究或設施相關的活動，黑暗週期可以打斷。動物被分別關在符合「動物保護法」(Animal Welfare Act)和「實驗動物飼養管理及使用指南」(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,National Research Council 1996)中所推薦的籠子裏。

飼料和餵食 。按照SNBL USA SOP規定，每天餵動物兩次。當特殊步驟要求時(例如在抽血進行血清化驗、采尿之前，或當進行涉及麻醉的步驟時)，則給動物禁食。定期分析飼料內污染物，發現符合製造商規格。

實驗設計 。從SNBL USA庫存選擇適當數量的動物。由獸醫人員檢查動物健康狀況，並進行血清化驗、血液和凝固篩選。將16只經確認為健康的雄性動物用於研究。將15只雄性動物編入特殊研究組，剩下的動物作為備用。採用一種包括血清膽固醇水平(基於適應期兩次抽取的平均值)的分層隨機方案將動物分配至研究組。

適應期 。在開始用藥前，讓經檢疫的動物適應研究室至少14天。從所有動物收集適應期數據，包括備用動物。評估所有動物的可能影響研究表現的行為異常。在第1天之後將備用動物送回庫房。

采血。以靜脈穿刺方式從受控的神智清醒的動物外周靜脈采血。盡可能一次抽取血液，然後妥善地分配。

PK研究 。在用藥前、2分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時分別將血樣(1.5 ml)采入血清分離管(SST)，然後每24小時一次。將樣品儲存血清轉移至2個小瓶內並儲存於-60℃或以下。

用一種優化ELISA法(酶聯免疫吸收分析法)分析血清樣品。簡言之，先用hPCSK9-mmh塗覆微量滴定板。然後將試驗mAb 316P或300N捕獲在hPCSK9-mmh板上。使用一種生物素醯化小鼠抗hIgG4檢測捕獲的316P或300N，然後與NeutrAvidin-HRP的結合。使用100至1.56 ng/ml不同濃度的316P或300N作為標準。使用不含316P或300N的百分之一猴血清(分析基質)作為零標準(0 ng/ml)。圖2所示的結果表明，血清316P和300N水平呈劑量依賴性增加。用WinNonlin軟體分析PK參數(非房室模型分析，Model 201-靜脈快速注射)。

血清化學 。在用藥前、12小時、48小時分別採集血樣，然後每隔48小時采血一次供臨床化學分析，尤其是分析脂質特性(即膽固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯)。除用藥後12小時的採樣，所有動物在採樣前均禁食過夜。樣品體積為約1 ml。使用一台Olympus自動分析儀測定化學參數。所測量的參數為(Xybion代號)：白蛋白(ALB)；鹼性磷酸酯酶(ALP)；丙氨酸氨轉移酶(ALT)；天冬氨酸轉氨酶(AST)；總膽紅素(TBIL)；鈣(Ca)；總膽固醇(TCho)；肌氨酸激酶(CK)；肌酐(CRN)；伽瑪穀氨醯基轉氨酶(GGT)；葡萄糖(GLU)；無機磷(IP)；總蛋白(TP)；甘油三酯(TRIG)；血尿氮(BUN)；球蛋白(GLOB)；白蛋白/球蛋白比(A/G)；氯(Cl)；鉀(K)；鈉(Na)；LDL和HDL膽固醇。殘留血清儲存於-20℃或以下，並於分析後一周之後才棄置。

從取樣至用藥後105天的結果顯示在圖3-7中。在接受了316P和300N的動物中，在第一次給藥後24小時內總膽固醇和LDL-C有所下降，而不論劑量多少。血清總膽固醇迅速和顯著下降(~35%，圖3)。至第6天，觀察到LDL-C的~80%的顯著下降(圖4-5)。在接受15 mg/kg 300N的動物中，總膽固醇(~10-15%下降)和LDL-C(~40%下降)的下降至少持續至研究第80天。此外，在接受15 mg/kg 316P的動物中，HDL-C上升(圖6)。在研究期間，接受更高劑量(15 mg/kg)316P或300N的動物也顯示出甘油三酯的下降(圖7)。316P顯示出對LDL-C水平最大的抑制，相對於基線達80%。這種抑制的持久程度是劑量依賴性的，對於至少60%抑制(相對於基線LDL-C水平)，可分別持續約18天(5 mg/kg劑量)和約45天(15 mg/kg劑量)。300N顯示了一種與316P不同的藥效特性。在相當的劑量情況下，300N抑制LDL-C的持續時間要長得多(給藥5 mg/kg後對LDL-C的50%抑制持續達28天，給藥15 mg/kg後對LDL-C的50%抑制持續達約90天)。經ALT和AST測量確定，肝功能未發生變化或沒有可測出的變化。在研究中接受抗PCSK9抗體的所有動物均顯示LDL-C和總膽固醇迅速得到抑制。

在接受單劑皮下(SC)注射5 mg/kg 316P或5 mg/kg 300N(圖8)的獼猴中，也觀察到了316P和300N類似的LDL-C下降作用。316P和300N兩者均顯著地抑制LDL-C水平並分別維持LDL-C下降作用達約15天和30天(圖8)。此藥效作用(大約40% LDL-C抑制)似乎與猴血清中功能性抗體水平大致相關(圖9)。隨著抗體水平下降至低於10 μg/ml，LDL-C抑制作用似乎也消失了。此外，300N顯示了比316P長得多的循環半衰期，因此所觀察到的LDL-C抑制作用也較持久。

實例14：抗hPCSK9抗體導致LDL受體降解的衰減

為了評估PCSK9對肝臟LDL受體水平的生物影響以及隨後對血清LDL-C水平的影響，給表現hPCSK9但不表現mPCSK9的小鼠(PCSK9 ^hu/hu 小鼠)靜脈注射hPCSK9。具體而言，經尾部靜脈給PCSK9 ^hu/hu 小鼠注射PBS(對照物)，或1.2 mg/kg hPCSK9-mmh。hPCSK9注射後6小時，觀察到血清中總膽固醇上升1.4倍(相對於基線水平)，LDL-C上升2.3倍。hPCSK9注射後4小時，另一組動物(n=3)的肝臟LDL受體水平分析顯示肝勻漿中可檢測LDL受體顯著下降。

為了評估抗hPCSK9對肝臟LDL受體水平的生物影響以及然後對血清LDL-C水平的影響，在上述hPCSK9-mmh蛋白注射前20小時，以相當劑量(5 mg/kg，腹腔注射)給PCSK9 ^hu/hu 小鼠注射316P和一種非hPCSK9特異性mAb。hPCSK9注射4小時後，犧牲小鼠並收集總共8種器官(肝、腦、肺、腎、心、迴腸、腎上腺以及胰腺)，並以西方印跡試驗測定LDL受體水平。僅在肝內觀察到LDL受體水平的變化。與注射PBS對照劑相比，316P注射顯著地阻斷了PCSK9介導的總膽固醇和LDL膽固醇的上升(LDL-C基線為2.49 mg/dl，PCSK9注射後6小時為3.1 mg/dl；上升25%，與載體注射相比為135%)。與單獨注射PBS相比，先前注射的非hPCSK9特異性mAb阻斷LDL-C上升的幅度約為27%(LDL-C=4.1 mg/dl，與PBS 5.6 mg/dl相比)。對另一組小鼠(每組n=3)LDL受體水平的分析顯示，注射PCSK9導致LDL受體水平的顯著下降。這種下降被316P阻斷但未被非hPCSK9特異性mAb阻斷(圖10)。

在PCSK9 ^hu/hu 小鼠中評估了不同劑量316P的影響，結果LDL-C和hPCSK9水平都上升。首先餵PCSK9 ^hu/hu 小鼠一種高碳水化合物飼料達8周，結果LDL-C和hPCSK9水平都上升~2倍。給小鼠注射316P或非hPCSK9特異性mAb，劑量分別為1 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg。24小時後收集血清並分析LDL-C水平。316P以一種依賴劑量的方式有效地降低了LDL-C水平(圖11)。此外，注射劑量為10 mg/kg的316P使LDL-C水平在24小時內迅速地降低至原始值(餵飼料前)(數據未顯示)。

實例15：小鼠PK研究

在6周齡C57BL/6小鼠和11-15周齡hPCSK9雜合小鼠中進行了PK研究。皮下注射單劑對照抗體I、316P或300N，劑量為10 mg/kg。使用一種抗hFc捕獲和抗hFc檢測夾心ELISA分析法，測量0小時(出血前)、6小時、第1、3、6、10、14、21、28、35、42和56天總共12個時間點的血清中hIgG水平(圖12和13)。所有mAbs均在約3天內達到了它們的T_max ，C57BL/6小鼠和hPCSK9雜合小鼠相應的C_max 水平分別為約47-115 μg/ml和55-196 μg/ml。在第56天，C57BL/6小鼠體內對照抗體I mAb水平為約12 μg/ml，300N水平為約11 μg/ml，而316P水平為約低於0.02 μg/ml。在第56天，hPCSK9雜合小鼠體內對照抗體I mAb水平為約29 μg/ml，而300N和316P兩者的水平為低於0.02 μg/ml的數量極限(BQL)。

實例16：抗hPCSK9抗體與突變/變異hPCSK9的結合

為了進一步評估hPCSK9和抗hPCSK9 mAbs之間的結合，產生了21種變異hPCSK9蛋白，其中每種變體含有一個單點突變且兩種變異hPCSK9蛋白都含有一個雙突變。透過與BIACORE^TM 芯片直接化學偶聯而產生F(ab’)2抗hIgG表面，將每種選定的抗體捕獲在其表面上以形成捕獲抗體表面。然後，將每種mmh標記的變異hPCSK9以100 nM至25 nM不同的濃度和60 μl/min流量注射在該捕獲抗體表面達240秒，並於25℃實時監測變異hPCSK9-抗體解離過程達20分鐘。注：在這些實驗條件下未觀察到結合(K_D =M x10^-9 ；T_1/2 =分鐘；WT=野生型)。

結果顯示，當殘基D238發生突變時，316P與hPCSK9的結合親和力降低>400倍，K_D 從1 x 10^-9 M變為410 x 10^-9 M；且T_1/2 縮短約30倍，從37變為1分鐘，說明316P與hPCSK9上的一個含有hPCSK9(SEQ ID NO:755)的D238的表位結合。此外，BIACORE^TM 分析顯示，當153、159或343位的殘基發生突變時，316P結合親和力和T_1/2 降低約5倍至10倍。尤其是，當S153、E159或D343中如何一個發生突變時，K_D 從約1 x 10^-9 M降至約5-8 x 10^-9 M之間；而T_1/2 則從約37分鐘降至約4-6分鐘。

當位於366的殘基發生突變時，300N與hPCSK9的結合降低約50倍，導致K_D 從約0.7 x 10^-9 M下降至約36 x 10^-9 M且T_1/2 從約120分鐘縮短至2分鐘。這些結果表明，300N與hPCSK9上一個表位結合，該表位含有hPCSK9(SEQ ID NO:755)的E366。此外，BIACORE^TM 分析法顯示，當位於147或380的殘基發生突變時，300N結合親和力和T_1/2 下降2倍至>10倍。具體而言，當S147或V380中任何一個發生突變時，K_D 從約0.69 x 10^-9 M降至約2-9 x 10^-9 M之間；而T_1/2 從約120分鐘縮短至約24-66分鐘之間。與316P相比，300N與hPCSK9的結合不是由於殘基238的突變而降低的。

相比之下，對於所測試的任何位突變，對照I抗體未顯示結合親和力或T_1/2 的改變；當殘基215發生突變時(R215E)，對照II抗體顯示親和力下降40倍(從~0.1x10^-9 至~4.5x10^-9 )，T_1/2 縮短約27倍(從~333至12分鐘)；而當殘基237發生突變時，對照III抗體顯示親和力下降(K_D 從~0.6x10^-9 降至~5.9x10^-9 ，且T_1/2 從~481降至~43分鐘)。

使用一種基於ELISA的免疫分析法測試了316P、300N和對照抗hPCSK9 mAbs與hPCSK9變體結合特異性。將抗PCSK9 mAbs塗覆在96孔板上於4℃過夜。將每種溶於CHO-k1瞬間轉染裂解上清液的mmh標記的變異hPCSK9以0至5 nM的不同濃度加到抗體塗覆的培養板上。於室溫結合1小時後，洗滌培養板並用HRP-輟合的抗myc多株抗體檢測結合的變異hPCSK9(-=OD<0.7；+=OD0.7-1.5；++=OD>1.5)。

實例17：316P對正常脂血和高脂血倉鼠的影響

在正常脂血或高脂血敘利亞金倉鼠(Mesocricetus auratus )中，測試了抗PCSK9 mAb 316P降低血清LDL-C的能力。在進入研究之前，讓雄性敘利亞倉鼠(年齡6-8周，體重為80-100克)適應7天。所有動物均餵以標準飼料或一種補充了0.1%膽固醇和10%椰子油的高脂血飼料。給正常脂血倉鼠單劑皮下注射316P mAb，劑量為1、3或10 mg/kg，給高脂血倉鼠注射劑量為3、10或30 mg/kg。在注射後24小時和7、14以及22天，從所有動物組採取血清樣品，評估此時的血清脂質水平並與注射mAbs前7天的基線水平比較。與載體注射相比較，正常脂血倉鼠的循環總膽固醇和LDL-C含量以依賴劑量的方式顯著降低。如圖14所示，在注射所試驗的最高劑量(10 mg/kg)7天後，注射316P有效地降低了LDL-C水平，最多達60%。在高脂血倉鼠中未觀察到類似的316P降低膽固醇的作用。

圖1：重鏈(A)和輕鏈(B)可變區和抗體H1H316P和H1M300N的CDR序列比較表。

圖2：血清中抗體濃度隨時間的變化。316P 5 mg/kg(□)；300N 5 mg/kg(○)；316P 15 mg/kg(■)；300N 15 mg/kg(●)。

圖3：以緩衝液對照物變化百分比表示的血清總膽固醇水平。對照物()；316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(▲)；316P 15 mg/kg(□)；300N 15 mg/kg(△)。

圖4：以緩衝液對照物變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。對照物(＊)；316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(▲)；316P 15 mg/kg(□)；300N 15 mg/kg(△)。

圖5：相對於緩衝液對照物歸一化的血清LDL膽固醇水平。緩衝液對照物(＊)；316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(▲)；316P 15 mg/kg(□)；300N 15 mg/kg(△)。

圖6：以緩衝液對照物變化百分比表示的血清HDL膽固醇水平。對照物(＊)；316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(▲)；316P 15 mg/kg(□)；300N 15 mg/kg(△)。

圖7：以緩衝液對照物變化百分比表示的血清甘油三酯水平。緩衝液對照物(＊)；316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(▲)；316P 15 mg/kg(□)；300N 15 mg/kg(△)。

圖8：單劑量皮下注射後，以從基線的變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。316P 5 mg/kg(■)；300N 5 mg/kg(●)。

圖9：單劑量皮下注射後血清抗體濃度隨時間的變化。316P 5 mg/kg(●)；300N 5 mg/kg(▲)。

圖10：小鼠總肝勻漿LDL受體的西方印跡試驗。於注射PBS(1-3行)、5 mg/kg 316P(4-6行)或5 mg/kg非hPCSK9特異性mAb(7-8行)後24小時，以及1.2 mg/kg hPCSK9-mmh(所有行)注射後4小時取樣。

圖11：316P對PCSK9 ^hu/hu 小鼠體內血清LDL膽固醇水平的影響。緩衝液對照物()；316P 1 mg/kg ()；316P 5 mg/kg()；316P 10 mg/kg()。

圖12：C57BL/6小鼠的抗hPCSK9 mAb血清藥物動力學特性。單劑量注射：對照ImAb(●)為10 mg/kg；316P(▲)為10 mg/kg以及300N(■)為10 mg/kg。

圖13：hPCSK9雜合小鼠的抗hPCSK9 mAb血清藥物動力學特性：單劑量10 mg/kg：對照ImAb(●)；316P(▲)和300N(■)。

圖14：316P對餵以正常飼料的敘利亞倉鼠體內血清LDL膽固醇水平的影響。緩衝液對照物(●)；316P 1 mg/kg(■)；316P 3 mg/kg(▲)；316P 5 mg/kg(▼)。

Claims

一種與人類前蛋白轉化酶枯草溶菌素(subtilin/kexin)第9型(hPCSK9)特異性結合的人抗體或人抗體的抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：76、78、80、84、86、88的重或輕鏈CDR序列。
如申請專利範圍第1項的抗體或抗原結合片段，包含SEQ ID NO：90/92之胺基酸序列對的重鏈可變區/輕鏈可變區(HCVR/LCVR)。
一種分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1或2項的抗體或抗原結合片段。
一種表現載體，其包含如申請專利範圍第3項的核酸分子。
一種產生抗人PCSK9抗體或抗體的抗原結合片段的方法，其包括下列步驟：將申請專利範圍第4項之表現載體引入一個分離的宿主細胞，在允許抗體或其片段產生的條件下培養該細胞，及收集所產生抗體或其片段。
一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1或2項的抗體或抗原結合片段以及一種藥學上可接受載體。
如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其進一步包含第二種治療劑，其中該第二種治療劑選自一種3-羥基-3-甲基戊二醯(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶的抑制劑、一種抑制素(statin)、一種膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的抑制劑、一種增加脂蛋白分解代謝的藥劑，或一種LXR轉錄因子活化劑。
一種如申請專利範圍第6或7項之抗體或抗體的抗原結合片段的用途，其用於製造以PCSK9拮抗劑減輕、改善、抑制或預防之疾病或病症的藥劑。
如申請專利範圍第8項之用途，其中該PCSK9介導的疾病或症狀是選自於由高膽固醇血症、高血脂症、LDL血漿析離、雜合家族性高膽固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素無法控制、具有患高膽固醇血症的危險、血脂異常、膽汁鬱積型肝病、腎病綜合徵、甲狀腺機能減退、肥胖症、動脈粥樣硬化以及心血管疾病所組成的群組。