ES2901400T3 - Métodos para inhibir la ateroesclerosis administrando un inhibidor de PCSK9 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 para su uso en un método de reducción de la gravedad de la lesión o reducción de área de la lesión esclerótica en al menos un 2 % en un sujeto humano que tiene ateroesclerosis, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno se administra por vía subcutánea al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para inhibir la ateroesclerosis administrando un inhibidor de PCSK9

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de tratamientos terapéuticos para ateroesclerosis. Más específicamente, la invención se refiere a la administración de inhibidores de la proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) para inhibir la formación de placas ateroescleróticas en un sujeto.

Antecedentes

La ateroesclerosis representa la causa principal de muerte y morbilidad cardiovascular en el mundo occidental. Los factores de riesgo de ateroesclerosis incluyen niveles altos de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL), niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL), hipertensión, diabetes mellitus, antecedentes familiares, género masculino, tabaquismo y colesterol alto en suero.

La proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) es una proproteína convertasa que pertenece a la subfamilia de proteinasa K de la familia de subtilasa secretora. Es una serina proteasa implicada en el metabolismo de LDL que se expresa principalmente en el hígado, el riñón y los intestinos. Las evidencias sugieren que PCSK9 aumenta el colesterol LDL en plasma promoviendo la degradación del receptor de LDL, que media la endocitosis de LDL en el hígado, la ruta principal de la eliminación de LDL de la circulación.

El uso de inhibidores de PCSK9 (anticuerpos anti-PCSK9) para reducir el colesterol total en suero, colesterol LDL y triglicéridos en suero se ha descrito en las patentes de Estados Unidos n.° 8.062.640, 8.357.371 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2013/0064834. No obstante, no se ha informado de que los inhibidores de PCSK9 reduzcan o inhiban la progresión de la formación de placas ateroescleróticas en un sujeto. Sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos terapéuticos de inhibición de la formación de placas ateroescleróticas.

Breve compendio de la invención

La presente invención aborda la necesidad en la técnica de métodos terapéuticos proporcionando composiciones para su uso en métodos de reducción de la gravedad de lesiones o reducción del área de lesión esclerótica en al menos un 2 % en un sujeto humano que tiene ateroesclerosis. En determinados aspectos, los métodos en general comprenden seleccionar un sujeto que tiene ateroesclerosis, y administrar por vía subcutánea al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:6 (inhibidor de PCSK9).

En determinadas realizaciones, el sujeto no es hiperlipidémico. En otras realizaciones, el sujeto está aparentemente sano.

En otro aspecto, el sujeto seleccionado puede haber padecido una apoplejía o infarto de miocardio.

En otra realización, el sujeto no es hipercolesterolémico. En otra realización, el sujeto no es hipertrigliceridémico.

En determinadas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II, enfermedad de Kawasaki, enfermedad inflamatoria crónica e hipertensión. En otra realización, el sujeto tiene niveles elevados de un marcador inflamatorio. En una realización adicional, el marcador inflamatorio es proteína C-reactiva. En otra realización adicional, el marcador inflamatorio es una citocina inflamatoria.

En otra realización, el inhibidor de PCSK9 reduce la formación de placas ateroescleróticas en el sujeto en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene hipercolesterolemia familiar heterocigótica (heFH). En otras realizaciones, el sujeto tiene una forma de hipercolesterolemia que no es hipercolesterolemia familiar (noFH).

En determinadas realizaciones, el sujeto está en tratamiento con otro agente modificador de los lípidos antes y/o durante la administración del anticuerpo o proteína de unión a antígeno. Los agentes terapéuticos modificadores de los lípidos incluyen estatinas, inhibidores de la captación de colesterol, ezetimibe, fibratos, niacina, ácidos grasos omega-3 y resinas de ácidos biliares. Las estatinas incluyen cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina y pravastatina.

En determinadas realizaciones, el inhibidor de PCSK9 se proporciona en una forma farmacéutica unitaria que comprende 75 mg, 150 mg, 200 mg o 300 mg del anticuerpos o fragmento de unión a antígeno. La forma farmacéutica unitaria puede ser una jeringa llenada previamente, un autoinyector llenado previamente, un vial, un cartucho, una jeringa reutilizable o un autoinyector reutilizable; la forma farmacéutica unitaria puede estar herméticamente sellada, y puede indicar además la dosificación.

La invención también proporciona un artículo de fabricación o kit que comprende la composición farmacéutica de un inhibidor de PCSK9 para su uso de acuerdo con la invención y un recipiente y, en algunas realizaciones, también incluye instrucciones para su uso.

La invención también proporciona un uso del inhibidor de PCSK9 en la fabricación de un medicamento para el uso de acuerdo con la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-D muestran una serie de gráficos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre varios parámetros después de un periodo de tratamiento de 18 semanas. La figura 1A muestra el efecto sobre el promedio de colesterol total en plasma; la figura 1B muestra el efecto sobre los niveles de triglicéridos. Las figuras 1C y 1D muestran los perfiles de lipoproteína para colesterol evaluados por separación de lipoproteínas por FPLC después de 12 semanas de tratamiento para estudiar los efectos de mAb316P en solitario (figura 1C) y en combinación con atorvastatina (figura 1D). ***P<0,0045 en comparación con control; tttP<0,0045 en comparación con atorvastatina; ttfP <0 ,0045 en comparación de 3 mg/kg de mAb316P a 10 mg/kg de mAb316P (n = 15 por grupo).

La figura 2A muestra un gráfico del efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre los niveles de proteína receptora de lipoproteína de baja densidad hepática. ***P<0,0045 en comparación con control; tP<0,05; ttP < 0 ,01 ; ftfP<0,0045 en comparación con atorvastatina; fP<0,05 en comparación con 3 mg/kg de mAb316P a 10 mg/kg de mAb316P (n = 8 por grupo). La figura 2B muestra un gráfico del efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre los niveles de colesterol no HDL. ***P<0,001 en comparación con control; #P<0,05; ##P<0,01; ###P<0,001 en comparación con atorvastatina.

Las figuras 3A-F son una serie de fotos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre la morfología de las placas. Imágenes representativas de lesiones ateroescleróticas teñidas con hematoxilina-floxinaazafrán en una sección transversal del área de la raíz aórtica para los grupos de control (figura 3A), 3 mg/kg de mAb316P (figura 3B), 10 mg/kg de mAb316P (figura 3C), atorvastatina (figura 3D), 3 mg/kg de mAb316P atorvastatina (figura 3E) y 10 mg/kg de mAb316P atorvastatina (figura 3F), respectivamente, después de 18 semanas de tratamiento.

Las figuras 4A-D muestran una serie de gráficos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre el desarrollo de ateroesclerosis en la raíz y el arco aórtico. Después de 18 semanas de tratamiento, se evaluaron el área de lesión total (figura 4A) y el número de lesiones (figura 4B) por sección transversal. Se evaluó la gravedad de las lesiones y se clasificó como ausencia de lesiones, lesiones suaves (de tipo I-III) y graves (de tipo IV-V) (figura 4C). La carga de placas total en el arco aórtico (figura 4D) se analizó después de tinción con oil-red O. Los datos se expresan como porcentaje del área teñida. *P<0,05; ***P<0,0045 en comparación con control; tP<0,05; ttP<0,01; tttP<0,0045 en comparación con atorvastatina; tP<0,05; tfP<0,01; tttP<0,0045 en comparación con 3 mg/kg de mAb316P a 10 mg/kg de mAb316P (n = 15 por grupo en el área de la raíz y n = 6-7 en el arco).

La figura 5 es un gráfico que representa la correlación entre el promedio de colesterol total en plasma y el área de la lesión ateroesclerótica. Se representó la raíz cuadrada del área de lesión frente al promedio de colesterol total. Se realizó análisis por regresión lineal.

La figura 6 es una serie de fotos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre la composición de la lesión. Imágenes representativas de inmunotinción con Mac-3 para macrófagos, seguido de tinción con rojo sirio para colágeno y alfa actina para células de músculo liso (SMC) para el control y después de 18 semanas de tratamiento con mAb316p en solitario y en combinación con atorvastatina.

Las figuras 7A-C son una serie de gráficos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre la composición de la lesión. Se determinó el contenido de macrófagos (figura 7A izquierda) y el contenido necrótico (figura 7A derecha), incluyendo pliegues de colesterol, como factores de desestabilización, y el contenido de SMC (figura 7B izquierda) y el contenido de colágeno (figura 7B derecha) como factores de estabilización en las lesiones graves (de tipo IV-V) después de la corrección para el tamaño de la lesión. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparación con control; #P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 en comparación con atorvastatina. El índice de estabilidad de las placas se calculó como la relación de los factores de estabilización respecto a los factores de desestabilización (figura 7C). *P<0,05, ***P<0,0045 en comparación con control; tP<0,05, tttP <0 ,0045 en comparación con atorvastatina; fP<0,05 para 3 mg/kg de mAb316P en comparación con 10 mg/kg de mAb316P (n = 15 por grupo).

Las figuras 8A-C son una serie de gráficos que representan el efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre marcadores de inflamación vascular. Se determinó el número de monocitos que se adhieren al endotelio (figura 8A) y el número de linfocitos T en el área de la raíz aórtica (figura 8B) por sección transversal. Además, se determinó la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) como el porcentaje del área teñida (figura 8C). Se incluyen imágenes representativas. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,0045 en comparación con control; tP<0,05, tttP<0,0045 en comparación con atorvastatina (n = 15 por grupo).

Descripción detallada

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente memoria es con el fin de describir realizaciones particulares solamente, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el habitualmente comprendido por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar del valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en la presente memoria, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1,99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ejemplares.

Métodos para inhibir la ateroesclerosis

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 (inhibidor de PCSK9) para su uso en un método de reducción de la gravedad de la lesión o reducción de área de la lesión esclerótica en al menos un 2 % en un sujeto humano que tiene ateroesclerosis, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno se administra por vía subcutánea al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Los factores de riesgo de ateroesclerosis son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, niveles altos de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL), niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL), hipertensión, diabetes mellitus, antecedentes familiares, género masculino, tabaquismo y colesterol alto en suero. Los métodos para evaluar estos factores de riesgo para un sujeto dado también son conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado no es hiperlipidémico. Un sujeto "no hiperlipidémico" es un sujeto que no es un sujeto hipercolesterolémico y/o hipertrigliceridémico. Un sujeto "no hipercolesterolémico" es uno que no se ajusta a los criterios actuales establecidos para un sujeto hipercolesterolémico. Un sujeto "no hipertrigliceridémico" es uno que no se ajusta a los criterios actuales establecidos para un sujeto hipertrigliceridémico (véase, por ejemplo, Harrison's Principles of Experimental Medicine, 13.a edición, McGraw-Hill, Inc., N.Y). Un sujeto hipercolesterolémico tiene un nivel de LDL de >160 mg/dl, o >130 mg/dl y al menos dos factores de riesgo seleccionados del grupo que consiste en género masculino, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria prematura, tabaquismo (más de 10 por día), hipertensión, baja HDL (<35 mg/dl), diabetes mellitus, hiperinsulinemia, obesidad abdominal, alta lipoproteína (a) y antecedentes personales de enfermedad cerebrovascular o vasculopatía periférica oclusiva. Un sujeto hipertrigliceridémico tiene un nivel de triglicéridos (TG) de >250 mg/dl. Por tanto, un sujeto no hiperlipidémico se define como uno cuyos niveles de colesterol y triglicéridos están por debajo de los límites establecidos como se describe anteriormente tanto para los sujetos hipercolesterolémicos como para los hipertrigliceridémicos. En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado no es hiperlipidémico ni recibe tratamiento para hiperlipidemia.

En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado está aparentemente sano. "Aparentemente sano", como se usa en la presente memoria, significa individuos que no han tenido previamente un acontecimiento cardiovascular adverso grave tal como un infarto de miocardio (es decir, individuos que no están en un riesgo elevado de un segundo acontecimiento cardiovascular adverso debido a un acontecimiento cardiovascular adverso primario). Los individuos aparentemente sanos tampoco muestran de otro modo síntomas de enfermedad.

En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado ha padecido previamente un acontecimiento cardiovascular adverso agudo tal como un infarto de miocardio, apoplejía, angina de pecho y/o enfermedad arteriovascular periférica. En una realización, el sujeto seleccionado ha padecido previamente un acontecimiento cardiovascular adverso agudo tal como un infarto de miocardio, apoplejía, angina de pecho y/o enfermedad arteriovascular periférica, pero no es hiperlipidémico. En una realización, el sujeto seleccionado ha padecido previamente un acontecimiento cardiovascular adverso agudo tal como un infarto de miocardio, apoplejía, angina de pecho y/o enfermedad arteriovascular periférica, pero no es hiperlipidémico ni está recibiendo tratamiento para hiperlipidemia.

En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado tiene una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II, enfermedad de Kawasaki, enfermedad inflamatoria crónica e hipertensión. En una realización, el sujeto seleccionado tiene una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus diabetes de tipo II, enfermedad de Kawasaki, enfermedad inflamatoria crónica e hipertensión, pero no es hiperlipidémico. En una realización, el sujeto seleccionado tiene una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus diabetes de tipo II, enfermedad de Kawasaki, enfermedad inflamatoria crónica e hipertensión, pero no es hiperlipidémico ni está recibiendo tratamiento para hiperlipidemia.

En determinadas realizaciones, el sujeto seleccionado tiene niveles elevados de un marcador inflamatorio. En una realización, el sujeto seleccionado tiene niveles elevados de un marcador inflamatorio, pero no es hiperlipidémico. Puede utilizarse cualquier marcador de inflamación sistémica para los fines de la presente invención. Los marcadores inflamatorios adecuados incluyen, sin limitación, proteína C-reactiva (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 7.964.614), citocinas (por ejemplo, IL-6, IL-8 y/o IL-17), y moléculas de adhesión celular (por ejemplo, ICAM-1, ICAM-3, BL-CAM, LFA-2, VCAM-1, NCAM y PECAM).

El nivel de un marcador inflamatorio puede obtenerse mediante cualquier ensayo reconocido en la técnica. Típicamente, el nivel se determina midiendo el nivel del marcador en un líquido corporal, por ejemplo, sangre, linfa, saliva, orina y similares. El nivel puede determinarse por ELISA, o inmunoensayos u otras técnicas convencionales para determinar la presencia del marcador. Para determinar si los niveles del marcador inflamatorio están elevados, el nivel del marcador medido en un sujeto puede compararse con un control adecuado (por ejemplo, un valor predeterminado y/o un valor obtenido de un sujeto sano coincidente).

La composición farmacéutica que comprende el inhibidor de PCSK9 para la fabricación de un medicamento para cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

Inhibidores de PCSK9

Un "inhibidor de PCSK9" es cualquier agente que se une a o interactúa con PCSK9 humana e inhibe la función biológica normal de PCSK9 in vitro o in vivo. Ejemplos no limitantes de categorías de inhibidores de PCSK9 incluyen antagonistas micromoleculares de PCSK9, moléculas antagonistas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de iARN), antagonistas de PCSK9 basados en péptidos (por ejemplo, moléculas de "pepticuerpo"), y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen específicamente a PCSK9 humana. El inhibidor de PCSK9 de la invención es un anticuerpos o proteína de unión a antígeno que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En lo siguiente, los inhibidores de PCSK9 se describen también más en general.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9" o "PCSK9" se refiere a PCSK9 que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO:197 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:198, o un fragmento biológicamente activo de la misma.

En determinadas realizaciones, la administración del inhibidor de PCSK9 reduce la formación de placas ateroescleróticas en el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) en al menos un 10 % (por ejemplo, 10 % 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %) con respecto a la formación de placas ateroescleróticas en un sujeto sin tratar.

Los inhibidores de PCSK9 incluyen un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que se une específicamente a PCSK9. Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o V^l) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (C C^l1). Las regiones V^h y V^l se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada V^h y V^l comprende tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-PCSK9 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis de lado a lado de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas y proteínas de unión a antígeno. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, "proteína de unión a antígeno" y similares, como se usan en la presente memoria, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintética o genomanipulada que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivar, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de genomanipulación recombinantes que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y opcionalmente constantes de anticuerpo. Dicho ADN es conocido y/o está fácilmente disponible en, por ejemplo, fuentes comerciales, colecciones de ADN (incluyendo, por ejemplo, colecciones de fagos-anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno o proteínas de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los residuos aminoacídicos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas manipuladas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de CDR injertada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se abarcan dentro de las expresiones "fragmento de unión a antígeno" y "proteínas de unión a antígeno" como se usan en la presente memoria.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en el mismo marco con una o más secuencias flanqueantes. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse relativamente entre sí en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.

En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones ejemplares no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh-Ch1 ; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1 ; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3, (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden unirse directamente entre sí o pueden unirse mediante una región de bisagra completa o parcial o región conectora. Una región de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, por uno o más enlaces disulfuro).

Como con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ejemplares divulgados en la presente memoria, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si es deseable que el anticuerpo medie citotoxicidad.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención, no obstante, pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, no se pretende que la expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, incluya anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias flanqueantes humanas.

Se pretende que la expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en la presente memoria, incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrita adicionalmente a continuación), anticuerpos aislados de una colección recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos (descrita adicionalmente a continuación), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor etal. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la línea germinal, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro de la cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no se unen mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe a, aunque sin limitación, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región de bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un solo aminoácido en la región de bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (véase, por ejemplo, Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta niveles típicamente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región de bisagra, CH2 o CH3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o extraído de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en que existe en anticuerpo de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

La expresión "se une específicamente" o similares, significa que un anticuerpo o proteína de unión a antígeno forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. Los métodos para determinar si un anticuerpo se une específicamente a un antígeno son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmones superficiales y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une específicamente" a PCSK9, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye anticuerpos que se unen a PCSK9 o parte de los mismos con una K^d de menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 500 nM, menos de aproximadamente 300 nM, menos de aproximadamente 200 nM, menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 90 nM, menos de aproximadamente 80 nM, menos de aproximadamente 70 nM, menos de aproximadamente 60 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 40 nM, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 4 nM, menos de aproximadamente 3 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM o menos de aproximadamente 0,5 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 humana, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tal como moléculas de PCSK9 de otra especie (no humana).

Se exponen inhibidores de PCSK9 ejemplares en la presente memoria e incluyen, por ejemplo, inhibidores descritos en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US20130115223, US20130071405, US20130064834, US20130064825, US20120122954, US20120015435, US20110313024, US 20110015252, US20110230542, US20110009628 y el número de serie de Estados Unidos 61/682.349. Los inhibidores de PCSK9 incluyen un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "LGT209" como se describe en la publicación internacional n.° WO2011/072263; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "L1 L3" como se describe en la publicación internacional n.° WO2010/029513; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "5L1721H23_6L3" como se describe en la publicación internacional n.° WO2011/111007; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "5L1721 H23_6L3H3" como se describe en la publicación internacional n.° WO2011/111007; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "31H4" como se describe en la publicación internacional n.° WO2009/026558; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "1B20" como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2009/0232795; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "21B12" descritas en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2009/0142352; un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "508.20.28" como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2012/0195910; o un anticuerpo que tiene secuencias VH/VL de Ab "508.20.33" como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2012/0195910.

Los anticuerpos anti-PCSK9 pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones flanqueantes y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que se obtuvieron los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente memoria con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. Hay métodos que implican el uso de anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente memoria, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones flanqueantes y/o CDR se mutan en el uno o más residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o en el uno o más residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución conservativa de aminoácido del uno o más residuos de la línea germinal correspondiente (dichos cambios de secuencia se denominan en la presente memoria colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera divulgadas en la presente memoria, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. Todos los residuos flanqueantes y/o CDR dentro de los dominios V^h y/o V^l pueden retromutarse en los residuos encontrados en la secuencia original de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo. Además, solamente determinados residuos pueden retromutarse en la secuencia original de la línea germinal, por ejemplo, solamente los residuos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. Además, uno o más de los residuos flanqueantes y/o CDR pueden mutarse en el uno o más residuos correspondientes de una secuencia diferente de la línea germinal (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones flanqueantes y/o CDR, por ejemplo, en los que determinados residuos individuales se mutan en el residuo correspondiente de una particular de la línea germinal, mientras que otros determinados residuos que difieren de la secuencia original de la línea germinal se mantienen o se mutan en el residuo correspondiente de una secuencia diferente de la línea germinal. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente para una o más propiedades deseadas, tales como especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), inmunogenia reducida, etc. El uso de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general está incluido dentro de la presente invención.

Los anticuerpos anti-PCSK9 pueden comprender variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en la presente memoria, que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, anticuerpos anti-PCSK9 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR; LCVR; CDR; HCVR y LCVR; HCVR y CDR; LCVR y CDR; o HCVR, LCVR y CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 sustitución conservativa de aminoácido con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en la presente memoria. Las sustituciones pueden estar en secuencias de aminoácidos de CDR, por ejemplo, CDR1, CDR2 y/o CDR3. Específicamente, las sustituciones pueden estar en las secuencias de aminoácidos de CDR3.

La expresión "resonancia de plasmones superficiales", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences division de GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Se pretende que el término "K^d", como se usa en la presente memoria, se refiera a la constante de disociación en equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como parátopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes zonas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por residuos aminoacídicos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinada circunstancia, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

El anticuerpo anti-PCSK9 puede tener características de unión dependientes de pH. Como se usa en la presente memoria, la expresión "unión dependiente de pH" significa que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno muestra "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" (con los fines de la presente divulgación, ambas expresiones pueden usarse indistintamente). Por ejemplo, anticuerpos "con características de unión dependientes de pH" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PCSK9 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se unen a PCSK9 con afinidad al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más veces mayor a pH neutro que a pH ácido.

Los anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes de pH pueden tener una o más variaciones aminoacídicas con respecto al anticuerpo anti-PCSK9 original. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes de pH puede contener una o más sustituciones o inserciones de histidina, por ejemplo, en una o más CDR de un anticuerpos anti-PCSK9 original. Por tanto, se divulgan métodos que comprenden administrar un anticuerpo anti-PCSK9 que comprende secuencias de aminoácidos de CDR (por ejemplo, CDR de la cadena pesada y ligera) que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de CDR de un anticuerpo anti-PCSK9 original, excepto por la sustitución de uno o más aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo original con un residuo de histidina. Los anticuerpos anti-PCSK9 con unión dependiente de pH pueden tener, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más sustituciones de histidina, dentro de una sola CDR de un anticuerpo original o distribuidas por múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) CDR de un anticuerpo anti-PCSK9 original. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PCSK9 pueden tener unión dependiente de pH, que comprenden una o más sustituciones de histidina en HCDR1, una o más sustituciones de histidina en HCDR2, una o más sustituciones de histidina en HCDR3, una o más sustituciones de histidina en LCDR1, una o más sustituciones de histidina en LCDR2 y/o una o más sustituciones de histidina en LCDR3, de un anticuerpo anti-PCSK9 original.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "pH ácido" significa un pH de 6,0 o menos (por ejemplo, menos de aproximadamente 6,0, menos de aproximadamente 5,5, menos de aproximadamente 5,0, etc.). La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de aproximadamente 6,0, 5,95, 5,90, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 o menos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1,7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos puede usarse para preparar anticuerpos humanos que se unen específicamente a PCSK9 humana.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra PCSK9, que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera humana unidas de forma funcional a locus de la región constante de ratón endógena, de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se aíslan y unen de forma funcional a ADN que codifica las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas. El ADN entonces se expresa en una célula que puede expresar el anticuerpo completamente humano.

En general, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés, y se recuperan las células linfáticas (tales como linfocitos B) de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera pueden aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas pueden aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc., usando procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Mientras que la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y de especificidad de diana residen en la región variable.

En general, los anticuerpos que pueden usarse en los métodos de la presente invención tienen altas afinidades, como se describe anteriormente, cuando se miden por unión al antígeno inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención. Mientras que la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y de especificidad de diana residen en la región variable.

Ejemplos específicos de anticuerpos humanos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen específicamente a PCSK9 incluyen cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las tres CDR de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 y 11, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. Como alternativa, ejemplos específicos de anticuerpos humanos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen específicamente a PCSK9 incluyen cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las tres CDR de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:37, 45, 53, 61,69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 165, 173, 181, y 189, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender las tres CDR de la cadena ligera (LCVR1, LCVR2, LCVR3) contenidas dentro de una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6 y 15, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender las tres CDR de la cadena ligera (LCVR1, LCVR2, LCVR3) contenidas dentro de una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:41,49, 57, 65, 73, 81,89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 169, 177, 185, y 193, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina sobra toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia, es decir, la secuencia de aminoácidos identificada con una SEQ ID NO, usando la mejor alineación de secuencias y/o sobre la región de la mejor alineación de secuencias entre las dos secuencias de aminoácidos, en la que la mejor alineación de secuencias puede obtenerse con herramientas conocidas de la técnica, por ejemplo, Align, usando ajustes convencionales, preferiblemente EMBOSS::needle, matriz: Blosum62, abertura de hueco 10,0, extensión de hueco 0,5.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o proteína de unión a antígeno comprende las seis CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de los pares de secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera (HCVR/Lc Vr ) de s Eq ID n O:1/6.

Específicamente, el anticuerpo anti-PCSK9, o proteína de unión a antígeno, que puede usarse en los métodos de la presente invención tiene las secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 seleccionadas de SEQ ID NO: 2/3/4/7/8/10 (mAb316P).

Más específicamente, el anticuerpo o proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO:1 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO:6.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o proteína de unión a antígeno muestra una o más de las siguientes propiedades cuando se administra por inyección subcutánea semanalmente a un ratón APOE*3Leiden.CETP: a. reduce los niveles de colesterol total con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 37 % cuando se administra a 3 mg/kg;

b. reduce los niveles de colesterol total con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 46 % cuando se administra a 10 mg/kg;

c. reduce los niveles de colesterol total con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 48 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina;

d. reduce los niveles de colesterol total con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 58 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina;

e. reduce los niveles de colesterol total en aproximadamente un 36 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario; f. reduce los niveles de colesterol total en aproximadamente un 48 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario; g. reduce los niveles de triglicéridos con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 33 % cuando se administra a 3 mg/kg;

h. reduce los niveles de triglicéridos con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 36 % cuando se administra a 10 mg/kg;

i. reduce los niveles de triglicéridos en aproximadamente un 40 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina;

j. reduce los niveles de triglicéridos en aproximadamente un 51 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario; k. aumenta la expresión de LDLR hepático con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 88 % cuando se administra a 3 mg/kg;

l. aumenta la expresión de LDLR hepático con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 178 % cuando se administra a 10 mg/kg;

m. aumenta la expresión de LDLR hepático en aproximadamente un 71 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

n. aumenta la expresión de LDLR hepático en aproximadamente un 140 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

o. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 70 % cuando se administra a 3 mg/kg;

p. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 87 % cuando se administra a 10 mg/kg;

q. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 88 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina;

r. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica con respecto a controles sin tratar en aproximadamente un 98 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina;

s. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica relativa en aproximadamente un 82 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

t. disminuye el tamaño de la lesión ateroesclerótica relativa en aproximadamente un 97 % cuando se administra a 10 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

u. reduce los niveles de triglicéridos en aproximadamente un 72 % cuando se administra a 3 mg/kg, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

v. reduce los niveles de triglicéridos en aproximadamente un 79 % cuando se administra a 10 mg/kg, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

w. reduce los niveles de colesterol total en aproximadamente un 22 % cuando se administra a 3 mg/kg, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

x. reduce los niveles de colesterol total en aproximadamente un 34 % cuando se administra a 10 mg/kg, con respecto a tratamiento con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina en solitario;

y. aumenta el porcentaje de segmentos aórticos no enfermos en aproximadamente un 236 % cuando se administra a 3 mg/kg, con respecto a control sin tratar;

z. aumenta el porcentaje de segmentos aórticos no enfermos en aproximadamente un 549 % cuando se administra a 10 mg/kg, con respecto a control sin tratar;

aa. aumenta el porcentaje de segmentos aórticos no enfermos en aproximadamente un 607 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a control; y

bb. aumenta el porcentaje de segmentos aórticos no enfermos en aproximadamente un 1118 % cuando se administra a 3 mg/kg en combinación con 3,6 mg/kg/día de atorvastatina, con respecto a control.

Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

De acuerdo con la presente invención, el inhibidor de PCSK9 está contenido dentro de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan transferencia, suministro, tolerancia y similares adecuados. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas anhidras de absorción, emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos conocidos de administración incluyen, aunque sin limitación, vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, por inhalación y oral. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos.

La composición farmacéutica de la presente invención se suministra por vía subcutánea con una aguja y jeringa convencionales. Además, dispositivos de suministro con pluma y dispositivos de suministro con autoinyector fácilmente tienen aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dichos dispositivos de suministro pueden ser reutilizables o desechables, y pueden adaptarse para administrar una dosis variable o una dosis fija. Un dispositivo de suministro reutilizable en general utiliza un cartucho remplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede descartarse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de suministro entonces puede reutilizarse. En un dispositivo de suministro desechable, no hay cartucho remplazable. En su lugar, el dispositivo de suministro desechable viene llenado previamente con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez se ha vaciado el depósito de la composición farmacéutica, se descarta el dispositivo completo. Un dispositivo de suministro adaptado para dosificación variable puede incluir un mecanismo para establecer una dosis dentro de un intervalo de volúmenes de dosis (en algunos casos, el intervalo puede limitarse a un valor menor de un volumen total contenido en el cartucho). Un dispositivo de suministro adaptado para dosificación fija puede incluir un mecanismo que suministra el volumen total del cartucho cuando se acciona el dispositivo de suministro. En dichos casos, el cartucho puede ser una jeringa llenada previamente.

Numerosos dispositivos de suministro tienen aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos incluyen, aunque sin limitación AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, R.U.), DISETRONICTM pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), HUm AlOG MIX 75/251m pen, HUMALOGt M pen, HUMALIN 70/30TM pen (Eli Lilly and Co., Indianápolis, iN), No Vo PENTM I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNlORTM (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), b Dt M pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPENTM, OPTIPEN PROTM, OPTIPEN STARLETTM y OPTICLIKTM (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solamente unos pocos. Ejemplos de dispositivos de suministro con pluma desechables que tenga aplicaciones en suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, el SOLOSTARTM pen (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y el h Um IRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solamente unos pocos. En algunas realizaciones, la pluma o autoinyector reutilizable suministra una dosis fija. En otras realizaciones, la pluma o autoinyector reutilizable puede suministrar una dosis variable. En diferentes realizaciones, la pluma o autoinyector reutilizable puede suministrar una sola dosis o múltiples dosis.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se suministra en un sistema de liberación controlada. En determinadas realizaciones, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201), incluyendo una microbomba. En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad de la diana de la composición, requiriendo, por tanto, solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones subcutáneas, infusiones de goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, hay, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, aducto HCO-50 (polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para satisfacer una dosis de los ingredientes activos. Como se usa en la presente memoria, "forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones individuales para sujetos humanos y/o animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo (es decir, un inhibidor de PCSK9) calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un diluyente, medio o vehículo farmacéutico. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica unitaria comprende 75 mg, 150 mg, 200 mg o 300 mg del anticuerpo o proteína de unión a antígeno. Ejemplos de formas farmacéuticas unitarias adecuadas para composiciones farmacéuticas líquidas incluyen aplicadores tales como viales, jeringas, incluyendo jeringas llenadas previamente y jeringas reutilizables, autoinyectores, incluyendo autoinyectores llenados previamente y autoinyectores reutilizables, cartuchos y ampollas; otras formas farmacéuticas unitarias adecuadas incluyen comprimidos, píldoras, cápsulas, supositorios, obleas, múltiplos segregados de cualquiera de los anteriores y otras formas como se describe en la presente memoria o como se conoce en general en la técnica. La forma farmacéutica unitaria puede sellarse herméticamente. Para formas farmacéuticas unitarias que contienen la composición farmacéutica dentro de un aplicador, la cantidad del inhibidor de PCSK9 puede indicarse en el aplicador.

La presente invención incluye un artículo de fabricación o kit que comprende (a) una o más formas farmacéuticas unitarias que comprenden una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención, y (b) un recipiente o envase. El artículo de fabricación o kit puede comprender además (c) una etiqueta o prospecto con instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación puede comprender además (d) una o más formas farmacéuticas unitarias de un tratamiento modificador de los lípidos (por ejemplo, un envase alveolado de comprimidos que comprenden como ingrediente activo un inhibidor de HMG-CoA reductasa).

Pautas de dosificación y administración

La cantidad de inhibidor de PCSK9 (anticuerpo anti-PCSK9) administrado a un sujeto de acuerdo con la presente invención es, en general, una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en la presente memoria, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosis de inhibidor de PCSK9 que provoca una reducción detectable en las lesiones ateroescleróticas. Por ejemplo, "cantidad terapéuticamente eficaz" de un inhibidor de PCSK9 incluye, por ejemplo, una cantidad de inhibidor de PCSK9 que provoca una reducción de al menos un 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en el área de lesión esclerótica o gravedad de la lesión cuando se administra a un paciente humano, por ejemplo, como se ilustra en los ejemplos en la presente memoria. Como alternativa, pueden usarse modelos animales para establecer si una cantidad particular de un inhibidor de PCSK9 candidato es una cantidad terapéuticamente eficaz.

En el caso de un anticuerpo anti-PCSK9, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 600 mg, por ejemplo, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 1,0 mg, aproximadamente 1,5 mg, aproximadamente 2,0 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 110 mg, aproximadamente 120 mg, aproximadamente 130 mg, aproximadamente 140 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 160 mg, aproximadamente 170 mg, aproximadamente 180 mg, aproximadamente 190 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 210 mg, aproximadamente 220 mg, aproximadamente 230 mg, aproximadamente 240 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 260 mg, aproximadamente 270 mg, aproximadamente 280 mg, aproximadamente 290 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 310 mg, aproximadamente 320 mg, aproximadamente 330 mg, aproximadamente 340 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 360 mg, aproximadamente 370 mg, aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 410 mg, aproximadamente 420 mg, aproximadamente 430 mg, aproximadamente 440 mg, aproximadamente 450 mg, aproximadamente 460 mg, aproximadamente 470 mg, aproximadamente 480 mg, aproximadamente 490 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 510 mg, aproximadamente 520 mg, aproximadamente 530 mg, aproximadamente 540 mg, aproximadamente 550 mg, aproximadamente 560 mg, aproximadamente 570 mg, aproximadamente 580 mg, aproximadamente 590 mg o aproximadamente 600 mg del anticuerpo anti-PCSK9.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 se administra a un sujeto a una dosis de 75 mg. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 se administra a un sujeto a una dosis de 150 mg. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 se administra a un sujeto a una dosis de 300 mg.

La cantidad de anticuerpo anti-PCSK9 contenida dentro de las dosis individuales puede expresarse en términos de miligramos de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente (es decir, mg/kg). Por ejemplo, el anticuerpo anti-PCSK9 puede administrarse a un paciente a una dosis de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del paciente.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, pueden administrarse múltiples dosis de un inhibidor de PCSK9 a un sujeto sobre un periodo de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un inhibidor de PCSK9. Como se usa en la presente memoria, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de inhibidor de PCSK9 se administra al sujeto en un punto diferente en el tiempo, por ejemplo, en diferentes días separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una sola dosis inicial de un inhibidor de PCSK9, seguida de una o más dosis secundarias del inhibidor de PCSK9, y opcionalmente seguidas de una o más dosis terciarias del inhibidor de PCSK9.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias" y "dosis terciarias" se refieren a la secuencia temporal de administración del inhibidor de PCSK9. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de inhibidor de PCSK9 contenida en las dosis iniciales, secundarias y/o terciarias variará de una a otra (por ejemplo, ajustadas en aumento o disminución según lo apropiado) durante el ciclo de tratamiento. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de inhibidor de PCSK9.

En determinadas realizaciones, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 30 (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) días después de la dosis inmediatamente precedente. La expresión "la dosis inmediatamente precedente", como se usa en la presente memoria significa, en una secuencia de múltiples administraciones, la dosis de inhibidor de PCSK9 que se administra a un paciente antes de la administración de la dosis más cercana en la secuencia sin dosis intermedias.

En determinadas realizaciones, los métodos comprenden administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de un inhibidor de PCSK9. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se administra solamente una sola dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Asimismo, en determinadas realizaciones, se administra solamente una sola dosis terciara al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 29 días después de la dosis inmediatamente precedente. Asimismo, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 1 a 60 días después de la dosis inmediatamente precedente. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar sobre el transcurso de la pauta de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el ciclo de tratamiento por un médico, dependiendo de las necesidades del paciente individual después de examen clínico.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 se administra a un sujeto a una dosis inicial de aproximadamente 75 mg cada dos semanas.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo se administra a un sujeto a una dosis inicial de aproximadamente 150 mg cada dos semanas.

En una realización, se administra una dosis inicial durante un periodo de dosificación inicial, tras el que se controla el valor de LDL-C del sujeto para determinar si la dosis inicial debe cambiarse a una dosis secundaria, midiendo el valor de LDL-C para determinar si está en o por debajo de un valor de LDL-C diana. Por ejemplo, un sujeto puede empezar el tratamiento con una dosis inicial de 75 mg del anticuerpo, con un valor de LDL-C diana de 100 miligramos por decilitro (mg/dl). Si el LDL-C del sujeto alcanza un valor de LDL-C diana al final del periodo de dosificación inicial, entonces el sujeto continúa el tratamiento con la dosis inicial, pero cambiar a una dosis secundaria si no se alcanza ese valor diana. En una realización, la dosis inicial es aproximadamente 75 mg, administrada cada dos semanas, el valor de LDL-C diana es 100 mg/dl, y la dosis secundaria, si fuera necesaria, es 150 mg cada dos semanas. Por ejemplo, se puede hacer seguimiento del sujeto en primer lugar después de aproximadamente 8 semanas de tratamiento, y si su valor de LDL-C está por encima de 100 mg/dl, el sujeto se puede valorar en aumento hasta una dosis secundaria de 150 mg, administrada cada dos semanas. La supervisión puede continuar durante todo el periodo de tratamiento. En otra realización, la dosis inicial es 75 mg de anticuerpo cada dos semanas, el valor de LDL-C diana es 70 mg/dl, y la dosis secundaria es 150 mg cada dos semanas si no se alcanza el valor de LDL-C diana.

Tratamientos previos y politerapias

El sujeto puede estar con una pauta terapéutica para el tratamiento de hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis en el momento de, o justo antes de, administración de la composición farmacéutica de la invención. Por ejemplo, a un paciente que se haya diagnosticado previamente con hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis se le puede haber prescrito y puede estar tomando una pauta terapéutica estable de otro tratamiento modificador de lípidos antes de y/o simultáneamente con la administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PCSK9. En otras realizaciones, el sujeto se ha tratado previamente con un tratamiento modificador de lípidos.

Los métodos de la presente invención, de acuerdo con determinadas realizaciones, comprenden administrar como monoterapia una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 a un sujeto, en ausencia de cualquier tratamiento modificador de lípidos simultáneo.

Los métodos de la presente invención, de acuerdo con determinadas realizaciones, también comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende un inhibidor anti-PCSK9 a un sujeto en combinación con otro tratamiento modificador de lípidos.

Como se usa en la presente memoria, los tratamientos modificadores de lípidos incluyen, por ejemplo, (1) agentes que inducen una reducción celular de la síntesis de colesterol inhibiendo la 3-hidroxi-3-metilglutarilo (HMG)-coenzima A (CoA) reductasa, tal como una estatina (por ejemplo, cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.); (2) agentes que inhiben la captación de colesterol y/o las reabsorción de ácidos biliares (tal como ezetimibe); (3) agentes que aumentan el catabolismo de lipoproteínas (tal como niacina); y/o (4) activadores del factor de transcripción LXR que desempeña una función en la eliminación del colesterol, tal como 22-hidroxicolesterol. Los tratamientos modificadores de lípidos también incluyen combinaciones fijas de agentes terapéuticos tales como ezetimibe más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam); niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes reductores de lípidos tales como éster etílico del ácido graso omega-3 (por ejemplo, omacor).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de la manera en que preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los autores de la invención consideran su invención.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra PCSK9 humana

Se generaron anticuerpos humanos anti-PCSK9 como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 8.062.640. El inhibidor ejemplar de PCSK9 usado en el siguiente ejemplo es el anticuerpo humano anti-PCSK9 denominado "mAb316P", también conocido aquí como "alirocumab". El mAb316P tiene las siguientes características de secuencia de aminoácidos: región variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende SEQ ID NO:1; dominio variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende SEQ ID NO:6; región determinante de complementariedad de la cadena pesada 1 (HCDR1) que comprende s Eq ID NO:2; HCDR2 que comprende SEQ ID NO:3; HCDR3 que comprende SEQ ID NO:4; región determinante de complementariedad de la cadena ligera 1 (LCDR1) que comprende SEQ ID NO:7; LCDR2 que comprende SEQ ID NO:8; y LCDR3 que comprende SEQ ID n O:10.

Ejemplo 2: Obtención de objetivos de colesterol de lipoproteína de baja densidad en pacientes con alto riesgo cardiovascular: Resultados de un estudio de población de medicina gestionada

Antecedentes: Las directrices estadounidenses apoyan los objetivos de LDL-C basados en el perfil de riesgo cardiovascular (CV) en el paciente, sin embargo, se conoce poco con respecto a patrones en el mundo real de obtención de objetivos de LDL-C dentro de afecciones de alto riesgo de CV específicas.

Métodos: Se identificaron pacientes de la base de datos Optumlnsight IMPACT (una gran base de datos estadounidense de reclamaciones de múltiples pagadores) con una medición de LDL-C durante julio de 2011 a junio de 2012 y afecciones de alto riesgo de CV. La medición más reciente de LDL-C se definió como la fecha del índice y se identificaron afecciones de alto riesgo de CV jerárquicamente durante el periodo antes del índice como sigue: síndrome coronario agudo reciente (ACS, en los 6 meses antes de la fecha del índice), acontecimientos coronarios (infarto de miocardio, hospitalización por angina inestable, revascularización coronaria), apoplejía y vasculopatía periférica (PVD).

Resultados: En total, 110.739 pacientes cumplieron el criterio de inclusión. La mediana (IQR) de edad fue 59 (53 a 65) años, un 53,7 % eran hombres, y la mediana (IQR) de LDL-C fue 116 (92 a 143) mg/dl. Desde la fecha del índice, un 2,7 % tenía ACS reciente, mientras que un 42,1 %, 9,2 % y 46,0 % tenía evidencia de acontecimientos coronarios, apoplejía y PVD, respectivamente. La siguiente tabla (tabla 1) representa un resumen de la distribución de los pacientes por los niveles de LDL-C desde la fecha del índice para diferentes afecciones de alto riesgo de CV.

Tabla 1: Desglose de los pacientes por el nivel de LDL-C (mg/dl) y afección de riesgo.

Conclusiones: En una gran cohorte contemporánea de pacientes con alto riesgo de CV, pocos consiguieron los objetivos de LDL-C de <70 mg/dl (objetivo opcional para riesgo muy alto de CV) o <100 mg/dl. Aunque conseguir el objetivo de LDL-C mejoró marginalmente en pacientes con afecciones que significaban mayor riesgo de CV, con la consecución más alta en pacientes con ACS reciente, la mayoría de estos pacientes aún estaban por encima de los objetivos de LDL-C. Estos datos muestran que hay una necesidad de esfuerzos continuados por abordar los huecos en la obtención del objetivo de LDL-C y mejorar los resultados de CV en pacientes de alto riesgo.

Ejemplo 3: Obtención de objetivo de colesterol de lipoproteína de baja densidad y tratamiento reductor de lípidos en una población de medicina gestionada de alto riesgo cardiovascular

Antecedentes: Aunque las directrices estadounidenses apoyan las estatinas como tratamiento de primera línea para reducir el LDL-C, se sabe poco con respecto a los patrones en el mundo real de la obtención del objetivo de LDL-C con estatinas y otros tratamientos reductores de lípidos (LLT).

Métodos: Se identificaron pacientes de la base de datos Optumlnsight IMPACT (una gran base de datos estadounidense de reclamaciones de múltiples pagadores) con una medición de LDL-C durante julio de 2011 a junio de 2012 y afecciones de alto riesgo de CV (acontecimientos coronarios (infarto de miocardio, hospitalización por angina inestable, revascularización coronaria), apoplejía y vasculopatía periférica). Se evaluó la prescripción de LLT desde la medición de LDL-C más reciente (fecha del índice) y se clasificó como estatina de alta potencia (atorvastatina 40/80 mg, rosuvastatina 20/40 mg, simvastatina 80 mg), estatina de potencia convencional (otras estatinas), LLT sin estatina (ezetimibe, niacina, fibratos, secuestrantes de ácidos biliares) y sin LLT.

Resultados: En total, 110.739 pacientes cumplieron el criterio de inclusión. La mediana (IQR) de edad fue 59 (53 a 65) años, un 53,7 % eran hombres, y la mediana (IQR) de LDL-C fue 116 (92 a 143) mg/dl. Desde la fecha del índice, un 10,8 % estaba con estatina de alta potencia, un 26,9 % estaba con estatina de potencia convencional, un 5,3 % estaba con LLT sin estatina y un 57,0 % no estaba con ningún LLT. La siguiente tabla (tabla 2) representa un resumen de la distribución de los pacientes por los niveles de LDL-C con respecto a la fecha del índice para diferentes tipos de LLT.

Tabla 2: Desglose de los pacientes por el nivel de LDL-C (mg/dl) y tipo de LLT.

Conclusiones: En esta gran población contemporánea de pacientes en alto riesgo de CV, pocos consiguieron los objetivos de LDL-C de <70 mg/dl (objetivo opcional para riesgo muy alto de CV) o <100 mg/dl. Además, muchos otros pacientes no estaban en el objetivo de LDL-C a pesar de recibir una estatina de alta potencia. Estos datos muestran que hay necesidad de esfuerzos continuados para mejorar la adherencia a LLT, así como nuevos tratamientos para mejorar la obtención del objetivo y los resultados de CV.

Ejemplo 4: Anticuerpo monoclonal contra PCSK-9, MAb316P disminuye de manera dependiente de la dosis la ateroesclerosis, induce un fenotipo de placas más estable y potencia los efectos de atorvastatina en el fondo de ratones transgénicos APOE*3Leiden.CETP

La finalidad de este estudio fue investigar los efectos de dos dosificaciones de mAb316P, en solitario y en combinación con atorvastatina sobre los lípidos plasmáticos, el desarrollo de ateroesclerosis y la composición de la lesión en ratones APOE*3Leiden.CETP. Este es un modelo bien establecido de hiperlipidemia y ateroesclerosis con todos los rasgos característicos de disbetalipoproteinemia familiar (FD) en seres humanos, que se caracteriza por acumulación de lipoproteínas remanentes y una relación aumentada de colesterol de lipoproteína de muy baja densidad LDL (VLDL) a LDL-C. Los ratones APOE*3Leiden tienen una eliminación alterada de (V)LDL y niveles aumentados de TG, y de ese modo están imitando la lenta eliminación observada en seres humanos, en contraste con los ratones de tipo silvestre normales, que tienen una eliminación muy rápida de lipoproteínas que contienen apoB. El perfil de lipoproteínas en ratones APOE*3Leiden.CETP refleja el de los pacientes con FD con una respuesta similar a tratamientos modificadores de lípidos, incluyendo estatinas, fibratos, niacina e inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP). Esto se ilustra mediante una reducción comparable en el colesterol en todas las subfracciones de lipoproteína que contiene apoB con tratamiento con estatina. Se elaboró la hipótesis de que mAb316P en solitario podría reducir la progresión de ateroesclerosis y aumentar los efectos ateroprotectores de atorvastatina. La inhibición de la ateroesclerosis por atorvastatina en ratones APOE*3Leiden.CETP se ha observado previamente.

Métodos

i) Animales

Se usaron noventa ratones transgénicos APOE*3Leiden.CETP hembra (de 9 a 13 semanas de edad), que expresaban CETP humano bajo el control de sus regiones flanqueantes naturales. Durante el estudio, los ratones se alojaron en condiciones convencionales con un ciclo de 12-horas de luz-oscuridad y tenían acceso libre a alimento y agua. Los experimentos en animales se aprobaron por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de The Netherlands Organization for Applied Research.

ii) Diseño experimental

Los ratones recibieron una dieta semisintética rica en colesterol, que contenía un 15 % (p/p) de manteca de cacao y un 0,15 % de colesterol (dieta de tipo Western [WTD]; Hope Farms, Woerden, Países Bajos) para un periodo de ejecución de 3 semanas para aumentar los niveles de colesterol total en plasma (TC) hasta -15 mmol/l. Se controló el peso corporal (BW) y la ingesta de alimento de manera regular durante el estudio. Después de hacerlos coincidir basándose en BW, TC, TG en plasma y edad, los ratones (n = 15 por grupo) recibieron una WTD en solitario o se trataron con dos dosificaciones de mAb316P (3 o 10 mg/kg) en solitario o en combinación con atorvastatina (3,6 mg/kg/d) durante 18 semanas, y se añadió un grupo con atorvastatina en solitario. Se administró MAb316P mediante inyecciones subcutáneas semanalmente y se añadió atorvastatina a la dieta. La dosis de atorvastatina se calculó para intentar una reducción de TC de aproximadamente un 20 % a un 30 %. Al final del periodo de tratamiento, todos los animales se sacrificaron por inhalación de CO². Se aislaron los hígados y los corazones para evaluar los niveles de proteína LDLR hepática, el contenido de lípidos, el desarrollo de ateroesclerosis y la composición de las placas.

iii) Lípidos en plasma, análisis de lipoproteínas y medición de los niveles de MAb316P

Se aisló el plasma de la sangre recogida en recipientes recubiertos de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) mediante exanguinación de la vena de la cola después de ayuno de 4 horas cada 2 a 4 semanas. Se determinó TC y TG en plasma usando kits enzimáticos de acuerdo con los protocolos del fabricante (n.° cat. 1458216 y n.° cat.

1488872, respectivamente; Roche/Hitachi) y se calculó el promedio de los niveles de TC y TG en plasma. Se midieron los perfiles de lipoproteína para TC después de la separación de las lipoproteínas por cromatografía de líquidos de proteínas rápida (FPLC) después de 4, 12 y 18 semanas de tratamiento. Se midieron los niveles de MAb316P mediante enzimoinmunoanálisis de adsorción de Fc humano.

iv) Niveles de proteína LDLR hepática

Se homogeneizaron tejidos hepáticos en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM [pH = 7,4], NaCl 150 mM, ácido desoxicólico al 0,25 %, NP-40 al 1 % [Igepal], EDTA 1 mM, cóctel de inhibidores de proteasa [completo, Roche], PMSF 1 mM, Na3VO4 1 mM) y después se centrifugaron a 6500 rpm a 4 °C durante 30 minutos. Se determinó la concentración de proteína en los lisados celulares por ensayo de proteínas con ácido bicincónico (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se separaron 50 pg de lisados proteínicos por SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore). Las transferencias se sometieron a anticuerpo de cabra anti-LDLR de ratón de R&D Systems y anticuerpo de conejo anticabra conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) de AbD Serotec o anticuerpo de ratón anti-a-tubulina de Sigma y anticuerpos de caballo antirratón conjugado con HRP de Cell Signaling Technologies (de acuerdo con las instrucciones del fabricante); las transferencias de revelaron con West Femto Super Signal ECL (Thermo Scientific) y se sometieron al sistema de imágenes Chemi-Docit. Se cuantificaron las intensidades de las bandas de proteína usando el programa informático Image J.

v) Evaluación histológica de ateroesclerosis

Se aislaron los corazones, se fijaron en formol y se incrustaron en parafina. Se tiñeron secciones transversales (5 pm cada una) del área de la raíz aórtica completa con hematoxilina-floxina-azafrán. Por cada ratón, se usaron cuatro secciones a intervalos de 50 pm para la evaluación cuantitativa y cualitativa de las lesiones ateroescleróticas. Para determinar el tamaño y la gravedad de la lesión ateroesclerótica, las lesiones se clasificaron en cinco categorías de acuerdo con la clasificación de la American Heart Association: I) estría grasa inicial, II) estría grasa regular, III) placa leve, IV) placa moderada y V) placa grave. Se calculó el área de lesión total y el número de lesiones por sección transversal, así como el porcentaje de segmentos sin enfermedad. Para evaluar la gravedad de la lesión como un porcentaje de todas las lesiones, las lesiones de tipo I-III se clasificaron como lesiones leves, y las lesiones de tipo IV-V se clasificaron como lesiones graves. Para determinar la carga de placas total en la aorta torácica, se limpiaron las aortas fijadas por perfusión (del origen aórtico al diafragma) de la grasa extravascular, se abrieron longitudinalmente, se pincharon en la facies y se tiñeron para lípidos con oil-red O como se describe previamente por Verschuren et al. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25:161 -167). Los datos se normalizaron para el área superficial analizada y se expresaron como el porcentaje del área teñida. Se tomaron fotos/imágenes con el microscopio Olympus BX51 y se midieron las áreas de lesión usando el programa informático de imágenes Cell D (Olympus Soft Imaging Solutions).

En la raíz aórtica, se determinó la composición de las lesiones para las lesiones graves (de tipo IV-V) como un porcentaje del área de lesión después de inmunotinción con anticuerpo de ratón antialfa actina humana (1:800; Monosan, Uden, Países Bajos) para células de músculo liso (SMC) y anticuerpo de rata anti-Mac-3 de ratón (1:25; BD Pharmingen, Países Bajos) para macrófagos seguido de tinción con rojo sirio para el colágeno. Se determinó el área necrótica y los pliegues de colesterol, la adhesión de monocitos al endotelio, la abundancia de linfocitos T en el área de la raíz aórtica y el cálculo del índice de estabilidad de placas (definido como la relación del área de colágeno y SMC como factores de estabilización con respecto al área de macrófagos y necrótica como factores de desestabilización) como se describe previamente por Kuhnast et al. (J Hypertens. 2012; 30:107-116), Stary et al. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995; 15:1512-1531) y Kuhnast et al. (PLoS One. 2013; 8: e66467). Se usó anticuerpo de rata anti-CD54 de ratón, GTX76543 (GeneTex, Inc., San Antonio, TX, EE. UU.) para inmunotinción de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1). Se tomaron fotos/imágenes con el microscopio Olympus BX40 con el sistema de imágenes multiespectrales Nuance 2, y las áreas teñidas se cuantificaron usando el programa informático Image J.

vi) Análisis de lípidos hepáticos y excreción fecal de ácidos biliares y esteroles neutros

Se homogeneizaron muestras de tejido hepático en solución salina tamponada con fosfato, y se midió el contenido de proteína. Se extrajeron los lípidos, se separaron por cromatografía en capa fina de alto rendimiento sobre placas de gel de sílice, y se analizaron con el programa informático TINA2.09 (Raytest Isotopen Messgerate Straubenhardt, Alemania), como se describe previamente por Post et al. (Hepatology. 1999; 30:491-500).

Los ratones se alojaron a cinco ratones por jaula, y se recogieron las heces durante dos periodos consecutivos de 72 horas y 48 horas, respectivamente. Se usaron alícuotas de heces liofilizadas para la determinación del contenido de esterol neutro y ácido por cromatografía de gases-líquidos, como se describe previamente por Post et al. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23:892-897).

vii) Análisis citométrico de flujo

Después de 8 semanas de tratamiento, se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de muestras de sangre fresca y se clasificaron en GR-1+ (neutrófilos/granulocitos), GR-1- (linfocitos/monocitos), CD3+ (linfocitos T), CD19+ (linfocitos B) y células CD11 b+/Ly6Clow y CD11 b+/Ly6Chi (monocitos) usando análisis citométrico de flujo (FACS). Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados de Becton Dickinson: GR-1 FITC, CD3 PerCpCy5-5, CD19 V450, CD11 b APC y Ly6C PE-Cy7.

viii) Análisis estadístico

Se calculó la significación de las diferencias entre los grupos de forma no paramétrica usando un ensayo de Kruskal-Wallis para muestras independientes, seguido de un ensayo de la U de Mann-Whitney para muestras independientes. Se usaron análisis de regresión lineal para evaluar las correlaciones entre las variables. Como el área de la lesión ateroesclerótica mostraba una dependencia cuadrática de la exposición en colesterol en plasma, se transformó usando transformación de raíz cuadrada. Se usó IBM SPSS Statistics 20 para Windows (SPSS, Chicago, EE. UU.) para los análisis estadísticos. Todos los grupos se compararon con el grupo de control y con el grupo de atorvastatina, y 3 mg/kg de mAb316P se comparó con 10 mg/kg de mAb316P con o sin atorvastatina. Los valores se presentan como la media ± DT. Valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos para una sola comparación. Se usó el método de Bonferroni para determinar el nivel de significación en el caso de comparaciones múltiples. En las figuras, los efectos significativos después de la corrección para múltiples comparaciones se indican por *** para comparar con el grupo de control, t t t para comparar con el grupo de atorvastatina y £££ para comparar 3 mg/kg de mAb316P con 10 mg/kg de mAb316P.

Resultados

i) Monotratamiento con MAb316P y atorvastatina y su combinación disminuyen el colesterol total en plasma y los triglicéridos en ratones APOE*3Leiden.CETP

Se detectaron los niveles de mAb316P en circulación en todos los grupos a los que se administró mAb316P y variaron entre 5 y 12 pg/ml (3 mg/kg de dosis) y 12 y 30 pg/ml (10 mg/kg de dosis) durante el estudio de 18 semanas. Los ratones APOE*3Leiden.CETP con una WTD que contiene colesterol (grupo de control) alcanzaron niveles promedio de TC y TG en plasma de 16,2 ± 1,8 mmol/l y 2,9 ± 0,6 mmol/l, respectivamente (figuras 1A y 1B). En comparación con el control, mAb316P disminuyó el promedio de TC en plasma (-37 %, P <0,001; -46 %, P <0,001) y TG (-33 %, P <0,001; -39 %, P <0,001), y disminuyó adicionalmente TC en combinación con atorvastatina (-48 %, P <0,001; -58 %, P <0,001). En comparación con atorvastatina, ambos tratamientos combinados disminuyeron TC (-36 %, P <0,001; -48 %, P <0,001) y TG (-40 %, P <0,001; -51 %, P <0,001) hasta un grado mayor que atorvastatina en solitario. Las reducciones en t C después de mAb316P en solitario (-14 %, P <0,01; 3 mg de mAb316P frente a 10 mg de mAb316P) y en combinación con atorvastatina (-19 %, P <0,001; 3 mg de mAb316P+atorvastatina frente a 10 mg de mAb316P+atorvastatina) fueron dependientes de la dosis y se mantuvieron durante el estudio. Las reducciones de TC después de mAb316P (figura 1C), atorvastatina y su combinación (figura 1D) estuvieron confinadas a lipoproteínas que contienen apoB. No se apreciaron efectos sobre BW (ganancia) y la ingesta de alimentos en ninguno de los grupos de tratamiento en comparación con el control.

ii) MAb316P, sin y con atorvastatina, disminuye los lípidos en plasma reduciendo la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad, y reduce el colesterol no HDL

Se midieron los niveles de proteína LDLR hepática para verificar si la inhibición de PCSK9 por mAb316P disminuye los lípidos en plasma rescatando la degradación de LDLR (figura 2A). Los niveles de proteína LDLR hepática estaban aumentados después de tratamiento con mAb316P en solitario (+80 %, P <0,01; 133 %, P <0,01) y junto con atorvastatina (+98 %, P <0,001; 178 %, P <0,05). En comparación con atorvastatina en solitario, ambos tratamientos combinados aumentaron los niveles de proteína LDLR hasta un grado mayor (+71 %, P <0,0045; 140 %, P <0,01). Una correlación inversa entre los niveles de proteína LDLR y TC en plasma confirma la implicación del LDLR en reducir TC por mAb316P (R2 = 0,50, P <0,001).

También se midieron los niveles de colesterol no HDL para verificar si la inhibición de PCSK9 por mAb316P disminuye dichos niveles por regulación por aumento del LDLR (figura 2B).

iii) MAb316P no afecta a los lípidos hepáticos y la excreción fecal de ácidos biliares y esterol neutro

Para evaluar las consecuencias de las alteraciones inducidas por mAb316P en el metabolismo de las lipoproteínas sobre el metabolismo y excreción en heces de lípidos hepáticos, se determinaron los lípidos hepáticos y la excreción de ácidos biliares y esteroles neutros en deposiciones. MAb316P no afectaba al peso del hígado ni al contenido hepático de colesterol y TG, mientras que la atorvastatina y los tratamientos combinados dieron lugar a reducciones significativas en el peso del hígado (-15 %, P = 0,067; -17 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; -20 %, P <0,0045, respectivamente) y ésteres de colesterilo hepáticos (-48 %, P <0,0045; -41 %, P <0,0045 y - 44 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones, respectivamente) en comparación con el grupo de control, sin un cambio en los triglicéridos hepáticos (tabla 3). La producción fecal de ácidos biliares y esteroles neutros no cambió por los tratamientos (tabla 4). Estos datos indican que, a pesar del mayor flujo entrante de colesterol desde el compartimento plasmático, se mantiene la homeostasis de colesterol hepático durante tratamiento con mAb316P y estatina.

Tabla 3: Efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre lípidos hepáticos.

Tabla 4: Efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre la excreción de esterol y ácidos biliares.

iv) MAb316P reduce de forma dependiente de la dosis el desarrollo de ateroesclerosis y potencia los efectos ateroprotectores de atorvastatina

Se evaluaron los efectos de mAb316P sobre el desarrollo de ateroesclerosis, en ausencia y presencia de atorvastatina, en la raíz y el arco aórtico después de 18 semanas de tratamiento. Imágenes representativas de lesiones ateroescleróticas, como se ilustra en la figura 3, muestran que mAb316P, atorvastatina y su combinación reducían la progresión de la lesión. Para confirmar una reducción en el desarrollo de ateroesclerosis, se evaluó el área de la lesión y el número de lesiones por sección transversal (figura 4A y figura 4B), junto con la gravedad de la lesión (figura 4C). Para el grupo de control, el área de la lesión total era 278 ± 89 x 103 |um2 por sección transversal, que consistía en 4,0 ± 0,7 lesiones por sección transversal. MAb316P disminuyó de forma dependiente de la dosis el tamaño de la lesión ateroesclerótica (-71 %, P <0,001; -88 %, P <0,001) y potenció de forma dependiente de la dosis los efectos de atorvastatina (-89 %, P <0,001; -98 %, P <0,001) en comparación con el control. Además, mAb316P, con y sin atorvastatina, también disminuyó el número de lesiones (-17 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; -30 %, P <0,0045 y -41 %, P <0,001; -77 %, P <0,001, respectivamente). Ratones tratados con mAb316P, en solitario y en combinación con atorvastatina, tenían más secciones libres de lesión y lesiones menos graves (de tipo IV-V) en comparación con el control. Atorvastatina en solitario disminuyó el tamaño de la lesión (-35 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones) y redujo la gravedad a un grado menor sin efecto sobre el número de lesiones o segmentos sin enfermedad. En comparación con monotratamiento con atorvastatina, las combinaciones disminuyeron además el tamaño de la lesión (-82 %, P <0,001; -97 %, P <0,001) y el número de lesiones (-38 %, P <0,001; -76 %, P <0,001) y aumentaron la cantidad de segmentos sin enfermedad.

Para evaluar el efecto del tratamiento con mAb316P sobre el desarrollo de la lesión en otro punto a lo largo de la aorta propenso al desarrollo de ateroesclerosis, se midió la superficie de la placa en el arco aórtico (figura 4D). En este sitio, se retarda el desarrollo de la lesión en comparación con la raíz aórtica. De acuerdo con los efectos sobre la aterogénesis en el origen aórtico, 10 mg/kg de mAb316P en solitario (-67 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones) y ambas dosis junto con atorvastatina (-73 %, P <0,0045; -73 %, P <0,0045) redujeron al área de placa total.

Se evaluó el efecto antiaterogénico de mAb316P y atorvastatina (figura 5) y se observó una fuerte correlación entre los niveles de TC en plasma y el área de lesión ateroesclerótica en la raíz aórtica (R2 = 0,84, P <0,001; figura 5), lo que indica una función importante de colesterol en el desarrollo de ateroesclerosis.

v) MAb316P reduce el reclutamiento de monocitos y linfocitos T y mejora el índice de estabilidad de la lesión

Como marcador funcional de inflamación de la pared de los vasos, se contó el número de monocitos que se adhieren al endotelio activado (figura 8A) y el número de linfocitos T en el área de la raíz aórtica (figura 8B) y se calculó por sección transversal (figura 7A). En el grupo de control, estaban presentes 5,7 ± 4,2 monocitos adherentes y 16,7 ± 7,7 linfocitos T. Cuando se administra en solitario y junto con atorvastatina, la mayor dosis de mAb316P (10 mg/kg) disminuyó los monocitos adherentes (-57 %, P <0,01, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones, y -75 %, P <0,001) y la abundancia de linfocitos T (-37 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones, y -62 %, P <0,001). Para destacar adicionalmente el mecanismo por el que mAb316P reducía la adherencia de los monocitos, se evaluó la expresión de ICAM-1 endotelial por inmunohistoquímica (figura 8C). Para el control, un 39 % del endotelio era positivo para ICAM-1 en comparación con un 19 % (P <0,001) después de monotratamiento con 10 mg/kg de mAb316P y un 16 % (P <0,001) cuando se administraba en combinación con atorvastatina. La reducción en la adherencia de los monocitos, por lo tanto, se corroboró mediante una reducción en la expresión de la molécula de adhesión en células endoteliales después de tratamiento con mAb316P en solitario y en combinación con atorvastatina.

Después de investigar la morfología de la lesión, se analizaron los efectos del tratamiento en la composición de las placas en las lesiones graves (de tipo IV-V), que se considera que son las lesiones más vulnerables como se muestra por las imágenes representativas en la figura 6. Para ilustrar que la estabilidad de las placas no siembre es dependiente del tamaño de las lesiones, se incluyeron imágenes representativas de lesiones de tamaño similar para el grupo de control y el grupo de mAb316P. El área de macrófagos en la lesión (figura 7A izquierda) más el área central necrótica en la lesión (incluyendo pliegues de colesterol) (figura 7A derecha), se cuantificaron como factores de desestabilización mientras que las SMC en la cápsula fibrótica (figura 7B izquierda) y el área de colágeno (figura 7B derecha) se cuantificaron como factores de estabilización. Todos se expresaron como un porcentaje del área de lesión total. Las lesiones en el grupo de control consistían en un 10,3 % de macrófagos, un 4,8 % de núcleo necrótico y pliegues de colesterol, un 3,1 % de SMC en la cápsula y un 48,4 % de colágeno. El índice de estabilidad de la lesión (figura 7C) para el grupo de control fue 3,5 ± 0,8. Cuando se administraba en combinación con atorvastatina, la menor dosis de mAb316P (3 mg/kg) disminuía los factores de desestabilización (-26 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones) y aumentó los factores de estabilización (+19 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones), mientras que la mayor dosis (10 mg/kg) en solitario y en combinación con atorvastatina disminuyó los factores de desestabilización (-37 %, P <0,001; 73 %, P <0,001) y aumentó los factores de estabilización (+19 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; 29 %, P <0,001). MAb316P, por lo tanto, mejoró la estabilidad de la lesión como se muestra por un aumento en el índice de estabilidad de la lesión en solitario (+24 %, N.S.; 113 %, P <0,0045) y junto con atorvastatina (+116 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; 556 %, P <0,001).

vi) MAb316P tiende a reducir los monocitos en circulación

Se evaluaron los efectos de mAb316P en solitario y en combinación con atorvastatina sobre el recuento de glóbulos blancos por citometría de flujo. De forma interesante, mAb316P en solitario y junto con atorvastatina redujo los granulocitos/neutrófilos (-20 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; -34 %, P <0,001) y monocitos (-28 %, P <0,05, N.S. después de corrección para múltiples comparaciones; -39 %, P <0,001) cuando se expresan como un porcentaje de la población de PBMC. Más específicamente, mAb316P en solitario y en combinación con atorvastatina tendía a disminuir los monocitos proinflamatorios Ly6Chi (-8 %, P =0,061; -19 %, P <0,001) y a aumentar los antiinflamatorios Ly6Clow (+12 %, P = 0,089; 35 %, P <0,001). Por lo tanto, el efecto de mAb316P sobre el reclutamiento vascular y la adhesión de monocitos puede aumentarse mediante una reducción en los monocitos en circulación.

Tabla 5 Efecto de mAb316P, atorvastatina y su combinación sobre el recuento de glóbulos blancos evaluado por análisis citométrico de flujo después de 8 semanas de tratamiento.

Control 10 mg/kg de MAb316P Atorvastatina 10 mg/kg de MAb316P atorvastatina

Neutrófilos/granulocitos (% de la 8,9 ± 2,4 7,1 ± 2,0 * f t 5,1 ± 1,6 *** 5,9 ± 2,0 *** población de PBMC)

Linfocitos/monocitos (% de la 91,1 ± 2,4 92,9 ± 2,0 * f t 94,9 ± 1,6 *** 94,1 ± 2,0 *** población de PBMC)

■ linfocitos T (% de la población de 22,9 ± 4,6 21,4 ± 5,0 f 17,0 ± 4,8 *** 18,5 ± 4,5 * PBMC)

■ linfocitos B (% de la población de 63,9 ± 8,5 66,3 ± 15,0 69,5 ± 17,4 *** 66,9 ± 2,0 *** PBMC)

■ Monocitos (% de la población de 12,3 ± 5,0 8,9 ± 2,5 * f t t 5,3 ± 2,4 *** 7,5 ± 2,8 *** t PBMC)

■ CD11b+ Ly6Chl (% de monocitos) 62,2 ± 8,5 57,5 ± 8,4 P = 0,061 t 51,2 ± 6,4 *** 50,2 ± 4,1 ***

■ CD11b+ Ly6Cow (% de monocitos) 35,6 ± 7,7 40,0 ± 8,0 P = 0,089 t 47,8 ± 6,3 *** 48,0 ± 3,5 ***

*P<0,05, ***P<0,0125 en comparación i con control; fP<0,05, ftP<0,01, ■tttP < 0 ,0125 en comparación con atorvastatina (n = 15 por grupo)

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 para su uso en un método de reducción de la gravedad de la lesión o reducción de área de la lesión esclerótica en al menos un 2 % en un sujeto humano que tiene ateroesclerosis, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno se administra por vía subcutánea al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz.

2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en la que la cantidad terapéuticamente eficaz reduce el área de lesión esclerótica en al menos un 10 %, al menos un 30 % o al menos un 50 %.

3. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno se administración a una dosis de aproximadamente 75 mg, aproximadamente 150 mg o aproximadamente 300 mg.

4. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno se administra a una dosis inicial de aproximadamente 75 mg o aproximadamente 150 mg cada dos semanas.

5. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo o proteína de unión a antígeno es Alirocumab.

6. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el sujeto a) ha padecido una apoplejía o infarto de miocardio;

b) tiene una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II, enfermedad de Kawasaki, enfermedad inflamatoria crónica e hipertensión;

c) tiene hipercolesterolemia familia heterocigótica (heFH); y/o

d) tiene una forma de hipercolesterolemia que no es hipercolesterolemia familiar (noFH).

7. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el sujeto tiene un nivel elevado de un marcador inflamatorio.

8. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en la que el marcador inflamatorio es proteína C-reactiva o una citocina inflamatoria.

9. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el sujeto está en tratamiento con otro agente modificador de lípidos antes y/o durante la administración del anticuerpo o proteína de unión a antígeno.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9, en la que el agente terapéutico modificador de lípidos se selecciona del grupo que consiste en una estatina, ezetimibe, un fibrato, niacina, un ácido graso omega-3 y una resina de ácidos biliares.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en la que la estatina se selecciona del grupo que consiste en cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina y pravastatina.