BR112013021526B1 - Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio - Google Patents

Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio Download PDF

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Abstract

polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fc(gama)riia (tipo r) e fc(gama)riia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fc(gama)riib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio. a presente invenção refere-se a um polipeptídio contendo uma região fc em que a atividade de se ligar a ambos os tipos de polimorfismo genético h e r de fc(gama)riia é mantida ou reduzida em comparação com a de um polipeptídio de origem, e em que a atividade de se ligar a fc(gama)riib está aumentada em comparação com a do polipeptídio de origem; uma composição farmacêutica contendo o polipeptídio; um agente terapêutico ou profilático para doenças imunes/inflamatórias, que compreende a composição farmacêutica; processos para a produção desses produtos; e um método para manter ou reduzir a atividade de ligação a ambos os tipos de polimorfismo genético acima mencionados de fc(gama)riia ou aumentar a atividade de ligação a fc(gama)riib. especificamente, descobriu-se que um polipeptídio que contenha uma região fc de anticorpo que contenha uma mutação produzida por substituição de pro localizada na 238ª posição, conforme numerado de acordo com o método de numeração eu, por asp e uma mutação produzida por substituição de leu na 328ª posição, conforme numerado de acordo com o método de numeração eu, por glu está aumentado com relação à atividade de ligação a fc(gama)riib e está mantido ou reduzido com relação à atividade de ligação a ambos os tipos de polimorfismo genético h e r de fc(gama)riia. também se descobriu que um polipeptídio que contenha uma região fc de anticorpo que contenha uma mutação produzida por substituição de pro localizada na 238ª posição, conforme numerado de acordo com o método de numeração eu, por asp e outro tipo de mutação está aumentado com relação à atividade de ligação a fc(gama)riib e está mantido ou reduzido com relação à atividade de ligação a ambos os tipos de polimorfismo genético h e r de fc(gama)riia.

Description

Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídios compreendendo uma região Fc de IgG que tenham mantido ou diminuído as atividades de ligação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem por introdução de substituições de aminoácidos na região Fc de IgG; composições farmacêuticas compreendendo o polipeptídio; agentes terapêuticos ou agentes preventivos compreendendo o polipeptídio para doenças inflamatórias imunológicas; e métodos para sua produção. Além disso, a presente invenção se refere a métodos para a manutenção ou diminui-ção das atividades de ligação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e aumento da atividade de ligação a FcYRIIb em comparação com um polipeptídio de origem; e métodos para a supressão da produção de anticorpo em comparação com o polipeptídio de origem em administração in vivo. A presente invenção também se refere a métodos para a produção de um polipeptí- dio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem; e métodos para a produção de um polipep- tídio que suprima a produção de anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem em administração in vivo.
Antecedentes da Técnica
[002] Os anticorpos estão atraindo a atenção como substâncias farmacêuticas, pois são altamente estáveis no sangue e têm poucos efeitos colaterais (Documentos Não Patente 1 e 2). Quase todas as substâncias farmacêuticas de anticorpos atualmente no mercado são anticorpos da subclasse IgG1 humana. Uma das funções conhecidas dos anticorpos da classe IgG é citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (daqui por diante designada por atividade ADCC) (Documento Não Patente 3). Para que um anticorpo exiba atividade ADCC, a região Fc do anticorpo tem de se ligar a um receptor de FcY (daqui por diante designado por FcYR) que é um receptor de ligação a anticorpo presente na superfície de células efetoras como células matadoras, células matadoras naturais e macrófagos ativados.
[003] Em seres humanos, as isoformas FcYRIa (CD64A), FcYRIIa (CD32A), FcYRIIb (CD32B), FcYRIIIa (CD16A) e FcYRIIIb (CD16B) foram relatadas como a família de proteínas FcYR, e os respectivos alo- tipos também foram relatados (Documento Não Patente 7). FcYRIa, FcYRIIa e FcYRIIIa são chamas de FcYR ativadora, pois têm funções imunologicamente ativas, e FcYRIIb é chamada de FcYR inibitória, pois tem funções imunossupressivas (Documento Não Patente 8).
[004] Na ligação entre a região Fc e FcYR, demonstrou-se que vários resíduos de aminoácidos na região de articulação do anticorpo e domínio CH2 e uma cadeia de açúcar fixada a Asn na posição 297 (numeração EU) ligada ao domínio CH2 são importantes (Documentos Não Patente 4, 5, e 6). Várias variantes com propriedades de ligação a FCYR, principalmente anticorpos com mutações introduzidas nesses sítios, foram até agora estudadas; e foram obtidas variantes da região Fc com atividades de ligação mais elevadas com relação à FCYR ati- vadora (Documentos de Patente 1, 2, 3 e 4).
[005] Quando a FcyR ativadora é reticulada com um complexo imune, ela fosforila motivos ativadores à base de tirosina do imunorre- ceptor (ITAMs) contidos no domínio intracelular ou na cadeia y comum da FcR (um parceiro de interação), ativa um transdutor de sinal SYK e desencadeia uma resposta imune inflamatória iniciando uma cascata de sinais de ativação (Documento Não Patente 9).
[006] FcyRIIb é a única FcyR expressada em células B (Documento Não Patente 10). Relatou-se que a interação da região Fc do anticorpo com FcyRIIb suprime a resposta imune primária de células B (Documento Não Patente 11). Além disso, relatou-se que, quando a FcyRIIb em células B e um receptor de célula B (BCR) são reticulados mediante um complexo imune no sangue, a ativação de células B é suprimida, e a produção de anticorpo por células B é suprimida (Documento Não Patente 12). Nessa transdução de sinal imunossupressi- vo mediada por BCR e FcyRIIb, é necessário o motivo inibitório à base de tirosina do imunorreceptor (ITIM) contido no domínio intracelular de FcyRIIb (Documentos Não Patente 13 e 14). Quando o ITIM é fosfori- lado com a sinalização, inositol polifosfato 5-fosfatase contendo SH2 (SHIP) é recrutada, a transdução de outras cascatas de sinais de FcyR ativadora é inibida, e a resposta imune inflamatória é suprimida (Documento Não Patente 15). Além disso, relatou-se que a agregação de apenas FcyRIIb suprime transitoriamente o influxo de cálcio devido à reticulação de BCR e proliferação de células B de maneira independente do BCR, sem induzir apoptose de células B produtoras de IgM (Documento Não Patente 16).
[007] Além disso, FcYRIIb também é expressada em células den- dríticas, macrófagos, neutrófilos ativados, mastócitos e basófilos. FcYRIIb inibe as funções da FCYR ativadora, como fagocitose e liberação de citocinas inflamatórias nessas células e suprime respostas imunes inflamatórias (Documento Não Patente 8).
[008] A importância das funções imunossupressivas da FcYRIIb foi elucidada até agora mediante estudos que usam camundongos com FcYRIIb inativada. Há relatos de que, em camundongos com FcYRIIb inativada, a imunidade humoral não está apropriadamente regulada (Documento Não Patente 17), a sensibilidade a atrite induzida por colágeno (CIA) está aumentada (Documento Não Patente 18), sintomas do tipo lúpus estão presentes, e sintomas do tipo síndrome de Goodpasture estão presentes (Documento Não Patente 19).
[009] Além disso, relatou-se que uma inadequação regulatória de FcYRIIb está relacionada a doenças autoimunes humanas. Por exemplo, foram relatadas a relação entre polimorfismo genético na região transmembrana e na região promotora de FcYRIIb e a frequência de desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (Documentos Não Patente 20, 21, 22, 23, e 24), e a diminuição da expressão de FcYRIIb na superfície de células B em pacientes com SLE (Documento Não Patente 25 e 26).
[0010] Dos modelos com camundongos e achados clínicos, considera-se que a FcYRIIb desempenhe o papel de controlar doenças au- toimunes e doenças inflamatórias principalmente pelo envolvimento com células B, e é uma molécula alvo promissora para o controle de doenças autoimunes e doenças inflamatórias.
[0011] Sabe-se que a IgG1, usada principalmente como uma substância farmacêutica de anticorpo comercialmente disponível, se liga não apenas a FcYRIIb, mas também fortemente a FcYR ativadora (Do- cumento Não Patente 27). Pode ser possível desenvolver substâncias farmacêuticas de anticorpos com mais propriedades imunossupressi- vas em comparação com as de IgG1 utilizando uma região Fc com maior ligação a FcYRIIb, ou melhor seletividade de ligação a FcYRIIb em comparação com a FCYR ativadora. Por exemplo, foi sugerido que o uso de um anticorpo com uma região variável que se liga a BCR e uma Fc com maior ligação a FcYRIIb pode inibir a ativação de células B (Documento Não Patente 28). Foi relatado que a reticulação de FcYRIIb em células B e IgE ligado a um receptor de células B suprime a diferenciação de células B em plasmócitos, o que, como resultado, causa a supressão da produção de IgE; e, em camundongos trans-plantados com PBMC humanas, as concentrações de IgG e IgM humanas são mantidas, ao passo que a concentração de IgE humana é diminuída (Documento Não Patente 29). Além de IgE, foi relatado que, quando FcYRIIb e CD79b formando um complexo com receptor de células B são reticulados por um anticorpo, a proliferação de células B é suprimida in vitro, e os sintomas são aliviados no modelo de artrite por colágeno (Documento Não Patente 30).
[0012] Além de células B, foi relatado que a reticulação de FcεRI e FcYRIIb em mastócitos usando moléculas em que a parte Fc de uma IgG com maiior ligação a FcYRIIb está fusionada à parte Fc da IgE que se liga a uma FcεRI de receptor de IgE, causa a fosforilação de FcYRIIb, suprimindo, dessa forma, o influxo de cálcio dependente de FcεRI. Isso sugere que a inibição da desgranulação mediante estimulação com FcYRIIb é possível por intensificação da ligação de FcYRIIb (Documento Não Patente 31).
[0013] Portanto, sugere-se que um anticorpo com uma Fc com melhor atividade de ligação a FcYRIIb seja promissor como um agente terapêutico para doenças inflamatórias como doenças autoimunes.
[0014] Além disso, mutantes com maior ligação a FcYRIIb foram sugeridos como agentes terapêuticos promissores para câncer, assim como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias como doenças autoimunes. Até agora, descobriu-se que FcYRIIb desempenha um importante papel na atividade agonista de anticorpos agonistas contra a família de receptores anti-TNF. Especificamente, foi sugerido que a interação com FcYRIIb é requerida para a atividade agonista de anticorpos contra CD40, DR4, DR5, CD30 e CD137, que estão incluídos na família de receptores de TNF (Documentos Não Patente 32, 33, 34, 35, 36, e 37). O Documento Não Patente 32 mostra que o uso de anticorpos com maior ligação a FcYRIIb intensifica o efeito antitumoral de anticorpos anti-CD40. Portanto, espera-se que anticorpos com FcYRIIb intensificado tenham um efeito de intensificação da atividade agonista de anticorpos agonistas, incluindo anticorpos contra a família de receptores anti-TNF.
[0015] Foram relatados anticorpos com uma Fc com melhor atividade de ligação a FcYRIIb (Documento Não Patente 28). Nesse Documento, a atividade de ligação a FcYRIIb foi melhorada pela adição de alterações como S267E/L328F, G236D/S267E, e S239D/S267E a um região Fc do anticorpo. Dentre eles, o anticorpo com a introdução da mutação S267E/L328F se liga mais fortemente a FcYRIIb e mantém o mesmo nível de ligação a FcYRIa e FcYRIIa tipo H que a de uma IgG1 de ocorrência natural. Entretanto, outro relatório mostra que essa alteração intensifica a ligação a FcYRIIa de tipo R várias centenas de vezes até o mesmo nível da ligação a FcYRIIb, o que significa que a seletividade de ligação a FcYRIIb não é melhorada em comparação com FcYRIIa de tipo R (Documento de Patente 5).
[0016] Mesmo que a ligação a FcYRIIb tenha sido aumentada em comparação com a de IgG1, apenas o efeito do aumento da ligação a FcYRIIa e não o aumento da ligação a FcYRIIb é considerado como tendo influência sobre células como plaquetas, que expressam FcYRIIa, mas não expressam FcYRIIb (Documento Não Patente 8). Por exemplo, sabe-se que o grupo de pacientes que recebeu a administração de bevacizumab, um anticorpo contra VEGF, tem um risco aumentado de tromboembolismo (Documento Não Patente 38). Além disso, foi observado tromboembolismo de maneira similar em testes de desenvolvimento clínico de anticorpos contra o ligante de CD40, e o estudo clínico foi descontinuado (Documento Não Patente 39). Em ambos os casos desses anticorpos, estudos posteriores usando modelos animais sugeriram que os anticorpos administrados agregam plaquetas mediante ligação a FcYRIIa nas plaquetas e formam coágulos sanguíneos (Documentos Não Patente 40 e 41). No lúpus eritematoso sistêmico, que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas mediante um mecanismo dependente de FcYRIIa, e se relatou que a ativação das plaquetas se correlaciona com a gravidade dos sintomas (Documento Não Patente 42). Mesmo que a ligação a FcYRIIb esteja aumentada, a administração de um anticorpo com maior ligação a FcYRIIa a pacientes que já tenham um elevado risco de desenvolver tromboembolismo aumentará o risco de desenvolver tromboembolismo e, portanto, é extremamente perigosa.
[0017] Além disso, relatou-se que anticorpos com maior ligação a FcYRIIa intensificam a fagocitose celular dependente de anticorpo mediada por macrófago (ADCP) (Documento Não Patente 43). Quando os antígenos do anticorpo são fagocitados por macrófagos, os próprios anticorpos também são fagocitados ao mesmo tempo. Nesse caso, fragmentos peptídicos derivados desses anticorpos também são apresentados como um antígeno, e a antigenicidade pode ser tornar mais elevada, aumentando, dessa forma, o risco de produção de anticorpos contra anticorpos (antianticorpos). Mais especificamente, o aumento da ligação a FcYRIIa aumentará o risco de produção de anticorpos contra os anticorpos, e isso diminuirá acentuadamente seu valor como substâncias farmacêuticas.
[0018] Mais especificamente, o valor como substâncias farmacêuticas será consideravelmente reduzido quando a ligação a FcYRIIa estiver aumentada, o que leva a um risco aumentado de formação de trombo mediante agregação plaquetária, antigenicidade mais elevada e risco aumentado de produção de antianticorpo.
[0019] Desse ponto de vista, a Fc com maior ligação a FcYRIIb acima mencionada mostra uma ligação a FcYRIIa de tipo R acentua- damente aumentada em comparação com a de uma IgG1 de ocorrência natural. Consequentemente, seu valor como uma substância farmacêutica para pacientes portadores de FcYRIIa de tipo R é consideravelmente reduzido. Os tipos H e R de FcYRIIa são observados em caucasianos e afro-americanos com aproximadamente a mesma frequência (Documentos Não Patente 44 e 45). Consequentemente, quando essa Fc for usada para o tratamento de doenças autoimunes, o número de pacientes que podem usá-la com segurança, aproveitando, ao mesmo tempo, seus efeitos, será limitado.
[0020] Além disso, em células dendríticas deficientes em FcYRIIb ou células dendríticas em que a interação entre FcYRIIb e a parte Fc do anticorpo é inibida por um anticorpo anti-FcYRIIb, relatou-se que as células dendríticas amadurecem espontaneamente (Documentos Não Patente 46 e 47). Esse relato sugere que FcYRIIb está suprimindo ativamente a maturação de células dendríticas em um estado constante em que a inflamação não está ocorrendo. FcYRIIa é expressada na superfície de células dendríticas, além de FcYRIIb; consequentemente, mesmo que a ligação a FcYRIIb inibitória esteja aumentada e que a ligação a FcYR ativadora, como FcYRIIa, também esteja aumentada, a maturação de células dendríticas pode ser promovida como resultado. Mais especificamente, considera-se que a melhora não apenas da atividade de ligação a FcYRIIb, mas também da razão de atividade de ligação a FcYRIIb com relação à atividade de ligação a FcYRIIa seja importante para fornecer anticorpos com uma ação imunossupressiva.
[0021] Consequentemente, quando se considera a geração a substâncias farmacêuticas que utilizem ação imunossupressiva mediada por ligação a FcYRIIb, há necessidade de uma Fc que não apenas tenha atividade de ligação a FcYRIIb aumentada, mas também tenha ligação a ambas FcYRIIa, alotipos tipos H e R, que seja mantida em um nível similar ou seja enfraquecida a um nível mais baixo que o de uma IgG1 de ocorrência natural.
[0022] Ao mesmo tempo, foram relatados até agora casos em que alterações de aminoácidos foram introduzidas na região Fc para aumentar a seletividade de ligação a FcYRIIb (Documento Não Patente 48). Entretanto, todas as variantes ditas como possuindo melhor seletividade para FcYRIIb, conforme relatado nesse documento, mostraram ligação diminuída a FcYRIIb em comparação com a de uma IgG1 de ocorrência natural. Consequentemente, considera-se que seja difícil que essas variantes realmente induzam uma reação imunossupressiva mediada por FcYRIIb mais fortemente que IgG1.
[0023] Além disso, como FcYRIIb desempenha um importante papel nos anticorpos agonistas acima mencionados, espera-se que a intensificação de sua atividade de ligação aumente a atividade agonista. Entretanto, quando a ligação a FcYRIIa é igualmente aumentada, atividades indesejáveis, como atividade ADCC e atividade ADCP, serão exibidas, e isso pode causar efeitos colaterais. Também desse ponto de vista, é preferível poder intensificar seletivamente a atividade de ligação a FcYRIIb.
[0024] Desses resultados, na produção de substâncias farmacêuticas de anticorpos a serem usados para o tratamento de doenças au- toimunes e câncer utilizando FcYRIIb, é importante que, em comparação com as de uma IgG de ocorrência natural, as atividades de ligação a ambos alotipos de FcYRIIa são mantidas ou diminuídas, e a ligação a FcYRIIb é aumentada. Entretanto, FcYRIIb compartilha 93% de identidade de sequência na região extracelular com a FcYRIIa, que é uma das FcYRs ativadoras, e elas são muito similares estruturalmente. Há alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e, todavia, cada uma delas reage diferentemente com os anticorpos (Documento Não Patente 49). Consequentemente, para produzir uma região Fc que se ligue seletivamente a FcYRIIb, o problema mais difícil pode ser conferir à região Fc do anticorpo a propriedade de atividade de ligação a FcYRIIb seletivamente melhorada, o que envolve distinguir essas sequências homólogas e diminuir ou não aumentar a atividade de ligação a cada alotipo de FcYRIIa, enquanto se aumenta a atividade de ligação a FcYRIIb. Até agora, não foram obtidas variantes com seletividade suficiente para FcYRIIb. O Documento de Patente 5 relata variantes com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada; entretanto, o grau de aumento é baixo, e há uma demanda pelo desenvolvimento de variantes com propriedades similares às acima descritas. Documentos da Técnica Anterior [Documentos de Patente]
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[0078] [Documento Não Patente 49] J Exp Med, 172, 19-25, 1990 Sumário da Invenção Problemas a Serem Resolvidos Pela Invenção
[0079] A presente invenção foi realizada em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é apresentar polipeptí- dios compreendendo uma região Fc de IgG que tenham mantido ou diminuído as atividades de ligação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem mediante introdução de substituições de aminoácidos na região Fc de IgG; composições farmacêuticas compreendendo o polipeptídio; agentes terapêuticos ou agentes preventivos compreendendo o polipeptídio para doenças inflamatórias imunológicas; e métodos para sua produção. Além disso, um objetivo é apresentar um método para manter ou diminuir as atividades de ligação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e para aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb em comparação com um polipeptídio de origem; e um método para a supressão da produção de anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem em administração in vivo. Além disso, um objetivo é apresentar métodos para a produção de um poli- peptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoá- cido na posição 131 (numeração EU) na FcYRIIa é His (tipo H) ou Arg (tipo R), e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem; e métodos para a produção de um polipeptídio com produção de anticorpo suprimida em comparação com um polipeptídio de origem quando administrado in vivo. Meios Para Resolver os Problemas
[0080] Os presentes inventores realizaram pesquisas dedicadas em um polipeptídio compreendendo uma região Fc com ligação mediada por Fc a FcYRIIa diminuída, e ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem. Como resultado, os presentes inventores descobriram que um polipeptídio compreendendo uma região Fc de anticorpo que compreende uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu aumenta atividade de ligação a FcYRIIb, e diminui a atividade de ligação mediada por região Fc com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipos H e R. Além disso, os presentes inventores descobriram um polipeptídio compreendendo uma região Fc de anticorpo que compreende uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e várias outras alterações que aumenta a atividade de ligação a FcYRIIb e mantém ou diminui atividades de ligação mediada por região Fc com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa, tipos H e R.
[0081] Mais especificamente, a presente invenção se refere ao se- guite:
[0082] [1] um polipeptídio variante compreendendo uma região Fc do anticorpo com pelo menos uma alteração de aminoácido, que tem atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H), e atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem, e em que o valor de [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo R)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb] é de 1,2 ou mais;
[0083] [2] o polipeptídio de [1], em que o valor de [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb] é de 4,2 ou mais;
[0084] [3] o polipeptídio de [1] ou [2], em que o valor de [valor de KD do polipeptídio de origem para FcYRIIb]/[valor de KD do polipeptí- dio variante para FcYRIIb] é de 1,6 ou mais;
[0085] [4] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [3], em que o va lor de [valor de KD da mais forte das atividades de ligação do polipep- tídio variante com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD da mais forte das atividades de ligação do polipeptídio de origem com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)] é de 0,7 ou mais;
[0086] [5] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [4], que tem ativi dade de ligação a FcYRIIIa mantida ou diminuída em comparação com a de um polipeptídio de origem;
[0087] [6] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [5], que tem ativi dade de ligação a FcYRIa mantida ou diminuída em comparação com a de um polipeptídio de origem;
[0088] [7] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [6], em que uma alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu;
[0089] [8] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [7], em que uma alteração de aminoácido é pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met;
[0090] [9] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [8], em que o poli- peptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG;
[0091] [10] o polipeptídio de qualquer um de [1] a [8], em que o polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é uma molécula de proteína de fusão com Fc;
[0092] [11] um método para manter ou diminuir as atividades de ligação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H) e aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb de um polipeptídio em comparação com um polipep- tídio de origem, que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc do polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu;
[0093] [12] um método para a supressão da produção de um anti corpo contra um polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem quando administrado in vivo, em que o método compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc do polipeptídio, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu;
[0094] [13] o método de [11] ou [12], em que a alteração de ami- noácido é pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met;
[0095] [14] o método de qualquer um de [11] a [13], em que o poli- peptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG;
[0096] [15] o método de qualquer um de [11] a [13], em que o poli- peptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é uma molécula de proteína de fusão com Fc;
[0097] [16] um método para a produção de um polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H) e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem, em que o método compreende a adição de pelo menos uma alteração de ami- noácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu;
[0098] [17] um método para a produção de um polipeptídio com produção suprimida de um anticorpo contra o polipeptídio em comparação com um polipeptídio de origem quando administrado in vivo, em que o método compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu;
[0099] [18] o método de [16] ou [17], em que a alteração de ami- noácido é pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met;
[00100] [19] o método de qualquer um de [16] a [18], em que o poli- peptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG;
[00101] [20] o método de qualquer um de [16] a [18], em que o poli- peptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é uma molécula de proteína de fusão com Fc;
[00102] [21] um polipeptídio produzido pelo método de qualquer um de [16] a [20];
[00103] [22] uma composição farmacêutica compreendendo o poli- peptídio de qualquer um de [1] a [10] e [21];
[00104] [23] um agente para a supressão da ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, que compreende o poli- peptídio de qualquer um de [1] a [10] e [21];
[00105] [24] um agente para o tratamento ou prevenção de uma do ença inflamatória imunológica, que compreende o polipeptídio de qualquer um de [1] a [10] e [21];
[00106] [25] o agente terapêutico ou agente preventivo de [24], em que a doença inflamatória imunológica é uma doença autoimune e é uma doença que possa ser causada por produção de um anticorpo contra um autoantígeno;
[00107] [26] um agente para o tratamento de uma doença, que compreende o polipeptídio de qualquer um de [1] a [10] e [21], em que a doença é uma doença com deficiência de uma proteína biologicamente essencial; e
[00108] [27] um agente antiviral compreendendo o polipeptídio de qualquer um de [1] a [10] e [21].
[00109] A presente invenção também se refere a métodos para o tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias imunológicas, que compreendem a etapa de administração a um sujeito de um polipeptí- dio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção. Além disso, a presente invenção se refere a kits para uso nos métodos terapêuticos ou métodos preven- tivos da presente invenção, que compreendem um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção também se refere ao uso de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção na produção de agentes terapêuticos ou agentes preventivos para doenças inflamatórias imu- nológicas. Além disso, a presente invenção se refere a um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção para uso em um método terapêutico ou um método preventivo da presente invenção. A presente invenção também se refere a métodos para a supressão da ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, que compreendem a etapa de administração a um sujeito de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção. A presente invenção se refere a kits para uso no método de inibição da presente invenção, que compreendem um poli- peptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção se refere ao uso de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção na produção de agentes que suprimam a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos. A presente invenção se refere a polipeptí- dios da presente invenção ou polipeptídios produzidos pelos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos inibitórios da presente invenção. A presente invenção se refere a métodos para o tratamento de doenças com deficiência de proteínas biologicamente essenciais, que compreendem a etapa de administração a um sujeito de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção. A presente invenção se refere a kits para uso no método terapêutico da presente invenção, que compreendem um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção se refere ao uso de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção na produção de agentes terapêuticos para doenças com deficiência de proteínas biologicamente essenciais. A presente invenção também se refere a um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção para uso em um método terapêutico da presente invenção. A presente invenção se refere a métodos para a inibição de vírus, que compreendem a etapa de administração a um sujeito de um polipeptí- dio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção. A presente invenção se refere a kits para uso no método de inibição da presente invenção, que compreendem um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. Além disso, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção na produção de um agente antiviral. Além disso, a presente invenção se refere a um polipeptídio da presente invenção ou um poli- peptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção para uso no método de inibição da presente invenção. Efeitos da Invenção
[00110] Os polipeptídios compreendendo uma região Fc com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a ambos os alo- tipos de FcYRIIa, tipos R e H, e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem são apresentados pela presente invenção. Com o uso dos polipeptídios com seletividade de ligação a FcYRIIb maior do que para ambos os alotipos de FcYRIIa (tipos H e R), é possível transmitir sinais inibitórios de resposta imune inflamatória mediada por fosforilação de ITIM de FcYRIIb em pacientes portadores de qualquer um dos alotipos, tipo R e tipo H. Além disso, ao conferir a um anticorpo Fc a propriedade de ligação seletiva a FcYRIIb, pode ser possível suprimir a produção de antianti- corpo através da ação imunossupressiva mediada por FcYRIIb. Breve Descrição dos Desenhos
[00111] A Fig. 1 mostra uma comparação da ligação a FcYRIa e ligação a FcYRIIb. A ligação do anticorpo com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e a ligação do anticorpo com substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu foram marcadas. "Mutação A" se refere a uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e "mutação B" se refere a uma alteração produzida por substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu.
[00112] A Fig. 2 mostra uma comparação da ligação a FcYRIIa tipo H e ligação a FcYRIIb. A ligação do anticorpo com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e a ligação do anticorpo com substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu foram marcadas. "Mutação A" se refere a uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e "mutação B" se refere a uma alteração produzida por substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu.
[00113] A Fig. 3 mostra uma comparação da ligação a FcYRIIa tipo R e ligação a FcYRIIb. A ligação do anticorpo com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e a ligação do anticorpo com substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu foram marcadas. "Mutação A" se refere a uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e "mutação B" se refere a uma alteração produzida por substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu.
[00114] A Fig. 4 mostra uma comparação da ligação a FcYRIIIa e ligação a FcYRIIb. A ligação do anticorpo com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e a ligação do anticorpo com substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu foram marcadas. "Mutação A" se refere a uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e "mutação B" se refere a uma alteração produzida por substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu.
[00115] A Fig. 5 mostra a relação entre os resíduos de aminoácidos que constituem as regiões Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e numeração EU (aqui, também chamada de ÍNDICE EU).
[00116] A Fig. 6 mostra um gráfico em que o eixo horizontal mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIb de cada variante PD, e o eixo vertical mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIa tipo R de cada variante PD. O valor para a quantidade de ligação de cada variante PD a cada FcYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação de IL6R-F652, que é um anticorpo de controle antes da introdução da alteração (Fc alterada com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp), a cada FcYR; e, então, o valor obtido foi multiplicado por 100, e usado como o valor de atividade de ligação relativa para cada variante PD a cada FcYR. O traçado de F652 na figura mostra o valor para IL6R-F652.
[00117] A Fig. 7 mostra um gráfico em que o eixo vertical mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIb de variantes produzidas por introdução de cada alteração em GpH7-B3 que não tem a alteração P238D, e o eixo horizontal mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIb de variantes produzidas por introdução de cada alteração em IL6R-F652 que tem a alteração P238D. O valor para a quantidade de ligação a FcYRIIb de cada variante foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação a FcYRIIb do anticorpo pré-alterado; e, então, o valor obtido foi multiplicado por 100, e usado como o valor de atividade de ligação relativa. Aqui, a região A contém alterações que exibem o efeito de aumentar a ligação a FcYRIIb em ambos os casos em que uma alteração é introduzida em GpH7-B3 que não tem P238D e em que uma alteração é introduzida em IL6R-F652 que tem P238D. A região B contém alterações que exibem o efeito de aumentar a ligação a FcYRIIb quando introduzidas em GpH7-B3 que não tem P238D, mas não exibem o efeito de aumentar a ligação a FcYRIIb quando introduzidas em IL6R-F652 que tem P238D.
[00118] A Fig. 8 mostra a estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb.
[00119] A Fig. 9 mostra uma imagem de superposição da estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e a estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb, com relação à região extracelular FcYRIIb e o domínio CH2 A de Fc pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα.
[00120] A Fig. 10 mostra uma comparação da estrutura detalhada em torno de P238D após superposição da estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e a estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb com relação ao único domínio CH2 A de Fc ou ao único domínio CH2 B de Fc pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα.
[00121] A Fig. 11 mostra que uma ponte de hidrogênio pode ser encontrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (numeração EU) no domínio CH2 A de Fc, e Tyr na posição 160 em FcYRIIb na estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb.
[00122] A Fig. 12 mostra que uma interação eletrostática pode ser encontrada entre Asp na posição 270 (numeração EU) no domínio CH2 B de Fc, e Arg na posição 131 em FcYRIIb na estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb.
[00123] A Fig. 13 mostra um gráfico em que o eixo horizontal mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIb de cada variante 2B, e o eixo vertical mostra o valor relativo da atividade de ligação a FcYRIIa tipo R de cada variante 2B. O valor para a quantidade de ligação de cada variante 2B a cada FcYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação de um anticorpo de controle antes da alteração (Fc alterada com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp) a cada FcYR; e, então, o valor obtido foi multiplicado por 100, e usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante 2B com relação a cada FcYR.
[00124] A Fig. 14 mostra Glu na posição 233 (numeração EU) na cadeia A de Fc e os resíduos vizinhos na região extracelular FcYRIIb na estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb.
[00125] A Fig. 15 mostra Ala na posição 330 (numeração EU) na cadeia A de Fc e os resíduos vizinhos na região extracelular FcYRIIb na estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb.
[00126] A Fig. 16 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (numeração EU) da cadeia B de Fc após superposição das estruturas cristalinas do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e o complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIIa pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα com relação à cadeia B de Fc. Modo Para a Realização da Invenção
[00127] A presente invenção apresenta polipeptídios compreendendo uma região Fc de IgG que tenha mantido ou diminuído a ligação a FcYRIIa, e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem por introdução de substitui- ção(ões) de aminoácido(s) na região Fc de IgG.
[00128] Mais especificamente, a presente invenção apresenta um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo que compreende uma substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu, e um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo que compreende a combinação de uma substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e várias substituições de aminoácidos específicos. Além disso, a presente invenção apresenta um método para a manutenção ou diminuição da atividade de ligação com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa e aumento da atividade de ligação a FcYRIIb em comparação com um polipeptídio de origem. A presente invenção também apresenta um método para a supressão da produção de anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem quando o polipeptídio é administrado in vivo.
[00129] "Polipeptídios da presente invenção" se refere genericamente a peptídios ou proteínas de aproximadamente dez aminoácidos ou mais de comprimento. Além disso, são genericamente polipeptídios derivados de organismos, mas não estão particularmente limitados e, por exemplo, podem ser polipeptídios compreendendo uma sequência artificialmente projetada. Além disso, eles podem ser quaisquer poli- peptídios de ocorrência natural, polipeptídios sintéticos, polipeptídios recombinantes ou outros.
[00130] "Receptores de FcY" (aqui, chamados de receptores de FcY ou FCYR) referem-se a receptores que podem se ligar à região Fc de anticorpos monoclonais IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e na prática significa qualquer membro da família de proteínas codificadas pelos genes de receptor de FCY. Em seres humanos, essa família inclui FCYRI (CD64) incluindo as isoformas FcYRIa, FcYRIb e FCYRIC; FCYRII (CD32) incluindo as isoformas FcYRIIa (incluindo os alotipos H131 (tipo H) e R131 (tipo R)), FcYRIIb (incluindo FcYRIIb-1 e FcYRIIb-2), e FCYRIIC; e FcYRIII (CD16) incluindo as isoformas FcYRIIIa (incluindo os alotipos V158 e F158), e FcYRIIIb (incluindo os alotipos FcYRIIIb-NA1 e FcYRIIIb-NA2), e quaisquer FcYRs humanas, isoformas ou alotipos de FcYR a serem ainda descobertas, mas não se limita a essas. A FcYR inclui FcYRs derivadas de seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos, mas não se limita a essas, e pode ser derivada de qualquer organismo. FcYRs de camundongo incluem FcYRI (CD64), FcYRII (CD32), FcYRIII (CD16), e FcYRIII-2 (CD16-2), e quaisquer FcYRs de camundongo, ou isoformas ou alotipos de FcYR a serem ainda descobertas, mas não se limitam a essas. Exemplos favoráveis desses receptores de FcY incluem FcYRI (CD64), FcYRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcYRIIIA (CD16) e/ou FcYRIIIB (CD16) humana.
[00131] A sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoá- cidos de FcYRI são apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 (NM_000566.3) e 2 (NP_000557.1), respectivamente;
[00132] a sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoá- cidos de FcYRIIa são apresentadas nas SEQ ID NOs: 3 (BC020823.1) e 4 (AAH20823.1), respectivamente;
[00133] a sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoá- cidos de FcYRIIb são apresentadas nas SEQ ID NOs: 5 (BC146678.1) e 6 (AAI46679.1), respectivamente;
[00134] a sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoá- cidos de FcYRIIIA são apresentadas nas SEQ ID NOs: 7 (BC033678.1) e 8 (AAH33678.1), respectivamente; e
[00135] a sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoá- cidos de FCYRIIIB são apresentadas nas SEQ ID NOs 9 (BC128562.1) e 10 (AAI28563.1), respectivamente (o número de Registro RefSeq está indicado entre parênteses).
[00136] Em FcYRIIa, há dois alotipos, um em que o aminoácido na posição 131 de FcYRIIa é histidina (tipo H), e o outro em que esse aminoácido é substituído por arginina (tipo R) (J. Exp. Med, 172: 1925, 1990).
[00137] Aqui, "polipeptídio de origem" se refere a um polipeptídio que servirá de base para a produção de polipeptídios compreendendo uma região Fc do anticorpo da presente invenção. Mais especificamente, é um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo e é o polipeptídio antes da alteração de pelo menos um aminoácido na região Fc. O polipeptídio de origem na presente invenção pode ser, por exemplo, um polipeptídio compreendendo a região Fc de uma IgG de ocorrência natural, ou pode ser um polipeptídio compreendendo uma região Fc de uma IgG à qual uma alteração diferente das alterações de aminoácidos da presente invenção tenha sido feita a uma IgG de ocorrência natural.
[00138] "IgGs de ocorrência natural" se refere a polipeptídios pertencentes a uma classe de anticorpos na prática codificados por genes de imunoglobulina gama e compreendendo uma sequência de amino- ácidos idêntica à de IgGs encontradas na natureza. Por exemplo, uma IgG humana de ocorrência natural significa uma IgG1 humana de ocorrência natural, IgG2 humana de ocorrência natural, IgG3 humana de ocorrência natural, IgG4 humana de ocorrência natural ou outra. IgGs de ocorrência natural também incluem mutantes espontaneamente produzido a partir delas.
[00139] A região Fc de uma IgG de ocorrência natural significa uma região Fc compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à da região Fc derivada de uma IgG encontrada na natureza. A região Fc de uma IgG de ocorrência natural é mostrada na Fig. 5 (SEQ ID NOs: 11-14) e, por exemplo, refere-se a regiões Fc derivadas de IgG1 humana de ocorrência natural, regiões Fc derivadas de IgG2 humana de ocorrência natural, regiões Fc derivadas de IgG3 humana de ocorrência natural, e regiões Fc derivadas de IgG4 humana de ocorrência natural. As regiões Fc de IgGs de ocorrência natural também incluem mu- tantes espontaneamente produzidos a partir delas.
[00140] Na presente invenção, se a atividade de ligação com relação a cada tipo de FCYR está aumentada, mantida ou diminuída ou não em um polipeptídio ou uma região Fc da presente invenção pode ser determinado, por exemplo, por observação de se há uma diminuição ou um aumento no valor da constante de dissociação (KD) obtido dos resultados da análise de sensograma, em que várias FCYRS são submetidas a interação como um analito com anticorpos imobilizados sobre os chips sensores ou capturados sobre os chips sensores usando Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos anti- cadeia lambda, anticorpos anti-cadeia kapa, peptídios antigênicos, proteínas antigênicas ou outros usando BIACORE, que é um analisador de interação que utiliza os fenômenos de ressonância de plásmon de superfície (SPR), conforme mostrado nos Exemplos. Alternativamente, pode ser determinado por observação de se há um aumento ou uma diminuição no valor obtido por divisão da quantidade de alteração no valor de unidade de ressonância (RU) no sensograma antes e depois de vários tipos de FCYRS serem submetidas interação como um analíto com anticorpos imobilizados sobre os chips sensores ou capturados sobre os chips sensores usando Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos anti-cadeia lambda, anticorpos anti-cadeia kapa, peptídios antigênicos, proteínas antigênicas, ou outros, pela quantidade de alteração das unidades de ressonância (RU) antes e depois de os anticorpos serem imobilizados ou capturados sobre o chip sensor. Além disso, pode ser determinado por observação de um aumento ou uma diminuição nos valores de constante de dissociação (KD) obtidos da análise de sensograma, em que uma amostra como um anticorpo a ser avaliado é submetida a interação como um analito usando um chip sensor ao qual FCYR é imobilizada diretamente ou mediante um anticorpo antietiqueta. Alternativamente, pode ser determinado por observação de se a quantidade de alteração nos valores do sensograma aumenta ou diminui antes e depois de uma amostra como um anticorpo a ser avaliada ser submetida a interação como um analíto com o chip sensor ao qual FCYR é imobilizada diretamente ou mediante um anticorpo antietiqueta.
[00141] Especificamente, a atividade de ligação de uma região Fc com relação a um receptor de Fcy pode ser medida pela triagem do Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada (ALPHA), o método BIACORE que utiliza os fenômenos de ressonância de plásmon de superfície (SPR), ou outros, além de ELISA ou separação de células ativada por fluorescência (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010).
[00142] A triagem ALPHA é realizada por tecnologia ALPHA que usa dois glóbuos, um doador e um receptor, com base nos seguintes princípios. Sinais luminescentes só são detectados quando moléculas ligadas a glóbulos doadores interagem fisicamente com moléculas ligadas aos glóbulos receptores, e os dois glóbulos estão em íntima proximidade entre si. O fotossensibilizador excitado a laser nos glóbulos doadores converte o oxigênio ambiente em oxigênio singleto em estado excitado. O oxigênio singleto é disperso em torno dos glóbulos doadores e, quando atinge os glóbulos receptores adjacentes, uma reação quimioluminescente é induzida nos glóbulos, e luz é, por fim, emi- tida. Quando as moléculas ligadas aos glóbulos doadores não interagem com as moléculas ligadas aos glóbulos receptores, a reação qui- mioluminescente não ocorre, porque o oxigênio singleto produzido pelos glóbulos doadores não atingem os glóbulos receptores.
[00143] Por exemplo, um complexo polipeptídico biotinilado é ligado aos glóbulos doadores, e o receptor de FCY etiquetado com glutationa S transferase (GST) é ligado aos glóbulos receptores. Na ausência de um complexo polipeptídico competitivo compreendendo uma região Fc mutante, o complexo polipeptídico compreendendo uma região Fc de tipo selvagem interage com o receptor de FCY e produz sinais de 520 - 620 nm. O complexo polipeptídico compreendendo uma região Fc mutante não etiquetada compete com o complexo polipeptídico compreendendo uma região Fc de tipo selvagem para interação com o receptor de Fcy. As atividades de ligação relativas podem ser determinadas por quantificação da diminuição na fluorescência observada como resultado da competição. A biotinilação de complexos polipeptídicos como anticorpos usando Sulfo-NHS-biotina e outros é bem conhecida. O método de expressão do receptor de Fcy e GST em uma célula portadora de um gene de fusão produzido pela fusão de um polinucleotídeo que codifica o receptor de Fcy em quadro com um polinucleotídeo que codifica GST em um vetor expressável, e realização de uma purificação usando uma coluna de glutationa é apropriadamente adotado como um método para etiquetar um receptor de Fcy com GST. Os sinais obtidos são, de preferência, analisados, por exemplo, por seu ajuste a um modelo de competição de um sítio que usa uma análise de regressão não linear usando software como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
[00144] Uma das substâncias (o ligante) na observação de uma interação é imobilizada sobre uma película fina de ouro em um chip sensor e, por projeção de luz pelo lado inverso do chip sensor de modo que ocorra reflexo total na interface entre a película fina de ouro e o vidro, uma parte da intensidade de reflexo reduzida é formada em parte da luz refletida (sinal SPR). Quando se faz a outra das substâncias (o analito) na observação de uma interação fluir sobre a superfície do chip sensor, e o ligante se liga ao analito, a massa da molécula ligante imobilizada aumenta, e o índice de refração do solvente sobre a superfície do chip sensor se altera. A posição do sinal SPR se desloca como resultado dessa alteração no índice de refração (por outro lado, a posição do sinal retorna quando essa ligação se dissocia). o sistema Bia- core indica a quantidade de deslocamento acima mencionada ou, mais especificamente, a variável temporal da massa por traçado da alteração na massa sobre a superfície do chip sensor na ordenada como o dado de medição (sensograma). A quantidade de analito ligado ao li- gante aprisionado na superfície do chip sensor é determinada a partir do sensograma. Parâmetros cinéticos como as constantes de taxa de associação (ka) e constantes de taxa de dissociação (kd) são determinados a partir das curvas do sensograma, e as constantes de dissociação (KD) são determinadas a partir da razão dessas constantes. No método BIACORE, usa-se, de preferência, um método para medir a inibição. Um exemplo do método para medir a inibição é descrito em Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11): 4005-4010.
[00145] Um polipeptídio com atividade de ligação a FCYR diminuída se refere a um polipeptídio que se liga a FCYR com uma atividade de ligação substancialmente menor do que o polipeptídio de origem quando o ensaio é realizado por manutenção da quantidade do poli- peptídio de origem e da quantidade do polipeptídio compreendendo pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc do polipeptídio de origem (também chamado de polipeptídio variante) praticamente iguais.
[00146] Por exemplo, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, a razão de valor de KD (valor de KD de um polipeptídio variante/valor de KD de um polipeptídio de origem) é, de preferência, de 1,25 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 100 ou mais, 1.000 ou mais, ou 10.000 ou mais.
[00147] Além disso, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, o valor de KD está, de preferência, aumentado em 1 μM ou mais e, mais preferivelmente, aumentado em 2 μM ou mais, 3 μM ou mais, 5 μM ou mais, 10 μM ou mais, 20 μM ou mais, 50 μM ou mais, e 100 μM ou mais. Além disso, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, o valor de KD é, de preferência, de 0,0001 μM ou mais e, mais preferivelmente, 0,001 μM ou mais, 0,01 μM ou mais, 0,1 μM ou mais, 0,5 μM ou mais, 1 μM ou mais, 2 μM ou mais, 3 μM ou mais, 5 μM ou mais, 10 μM ou mais, 100 μM ou mais, ou 1.000 μM ou mais.
[00148] Um polipeptídio com atividade de ligação a FCYR aumentada se refere a um polipeptídio que se liga a FCYR com uma atividade de ligação substancialmente maior do que o polipeptídio de origem quando o ensaio é realizado por manutenção da quantidade do poli- peptídio de origem e da quantidade do polipeptídio variante praticamente iguais.
[00149] Por exemplo, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, a razão de valor de KD (valor de KD de um polipeptídio de origem/valor de KD de um polipeptídio variante) é, de preferência, de 1,25 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 100 ou mais, 1.000 ou mais, ou 10.000 ou mais.
[00150] Além disso, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, o valor de KD está, de preferência, diminuído em 0,001 μM ou mais e, mais preferivelmente, diminuído em 0,01 μM, 0,1 μM, 1 μM ou mais, 2 μM ou mais, 3 μM ou mais, 5 μM ou mais, 10 μM ou mais, 20 μM ou mais, 50 μM ou mais e 100 μM ou mais.
[00151] Além disso, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima mencionado, o valor de KD é, de preferência, de 5 μM ou menos e, mais preferivelmente, 3 μM ou menos, 1 μM ou menos, 0,5 μM ou menos, 0,1 μM ou menos, 0,01 μM ou menos, 0,001 μM ou menos, ou 0,0001 μM ou menos.
[00152] Um polipeptídio com atividade de ligação a FCYR inalterada (mantida) se refere a um polipeptídio que se liga a FCYR com uma atividade de ligação praticamente inalterada ou equivalente à do polipep- tídio de origem quando o ensaio é realizado por manutenção da quantidade do polipeptídio de origem e da quantidade do polipeptídio compreendendo pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc do polipeptídio de origem (também chamado de polipeptídio variante) praticamente iguais.
[00153] Se um polipeptídio é um polipeptídio com atividade de ligação a FcyRIIa mantida ou diminuída e com atividade de ligação a FcyRIIb aumentada ou não pode ser determinado usando-se o valor de KD desse polipeptídio para FcyRIIa e o valor de KD desse polipep- tídio para FcyRIIb determinados de acordo com os exemplos acima mencionados. Um exemplo é o caso em que o valor de KD do polipep- tídio da presente invenção para FcyRIIb está diminuído em comparação com o valor de KD do polipeptídio de origem para FcyRIIb; e o valor de KD do polipeptídio da presente invenção para FcyRIIa (tipo R e tipo H) está aumentado ou mantido em comparação com o valor de KD do polipeptídio de origem para FcyRIIa (tipo R e tipo H). Além disso, é possível determinar por combinação apropriada do valor de KD do po- lipeptídio para FcyRIa e o valor de KD do polipeptídio para FcyRIIIa, que foram determinados de acordo com o exemplo acima mencionado.
[00154] Na presente invenção, uma atividade de ligação a FcYRIIb aumentada significa que, por exemplo, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima descrito, a razão de KD de [valor de KD do polipeptídio de origem]/[valor de KD do polipeptídio variante] é, de preferência, 1,6 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais e 50 ou mais.
[00155] Atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H) significa que, por exemplo, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima descrito, a razão de KD de [valor de KD para as mais fortes das atividades de ligação de um polipeptídio variante com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD para as mais fortes das atividades de ligação de um polipeptídio de origem com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)] é, de preferência, de 0,7 ou mais, 1 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais e 50 ou mais.
[00156] Os polipeptídios da presente invenção têm, de preferência, atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa tipo R e FcYRIIa tipo H. Além disso, têm, de preferência, atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa tipo R e FcYRIIa tipo H, assim como uma atividade de ligação a FcYRIIIa mantida ou diminuída. Além disso, têm, de preferência, uma atividade de ligação mantida ou diminuída com relação a FcYRIa.
[00157] A atividade de ligação mantida ou diminuída com relação a FcYRIIIa ou FcYRIa significa que, por exemplo, nos valores de KD medidos pelo método de medição acima descrito, a razão de KD de [valor de KD do polipeptídio variante]/[valor de KD do polipeptídio de origem] é, de preferência, de 1 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais e 50 ou mais.
[00158] Além disso, se um polipeptídio da presente invenção é ou não um polipeptídio com melhor seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para FcYRIIa pode ser determinado por comparação da razão do valor de KD para FcYRIIa parao valor de KD para FcYRIIb do polipeptídio da presente invenção (valor de KD para FcYRIIa/valor de KD para FcYRIIb) com a razão do valor de KD para FcYRIIa parao valor de KD para FcYRIIb do peptídio de origem (valor de KD para FcYRIIa/valor de KD para FcYRIIb), que foram determinados de acordo com os exemplos acima mencionados. Especificamente, quando o va-lor da razão de KD para o polipeptídio da presente invenção é maior que o do polipeptídio de origem, pode-se determinar que o polipeptídio da presente invenção tem uma melhor seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para FcYRIIa em comparação com o polipeptídio de origem.
[00159] A seletividade de ligação entre FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIb é, por exemplo, a razão de valor de KD [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo R)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb], de preferência, 1,2 ou mais, 2 ou mais, ou 3 ou mais para os valores de KD medidos pelo método de medição acima descrito e, mais preferivelmente, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, ou 30 ou mais.
[00160] A seletividade de ligação entre FcYRIIa (tipo H) e FcYRIIb é, por exemplo, a razão de valor de KD [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb], de preferência, 4,2 ou mais, 5 ou mais, ou 10 ou mais para os valores de KD medidos pelo método de medição acima descrito e, mais preferivelmente, 20 ou mais, 30 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, ou 200 ou mais.
[00161] Além disso, se as atividades de ligação dos polipeptídios da presente invenção com relação a várias FcYRs foram mantidas, au- mentadas ou diminuídas ou não pode ser determinado a partir do aumento ou diminuição da quantidade de ligação das várias FCYRS aos polipeptídios da presente invenção, que foram determinados de acordo com os exemplos acima descritos. Aqui, a quantidade de ligação das várias FCYRS aos polipeptídios se refere a valores obtidos por determinação da diferença nos valores de RU de sensogramas que se alteraram antes e depois da interação de várias FcyRs como o analito com cada polipeptídio e sua divisão pelas diferenças nos valores de RU de sensogramas que se alteraram antes e depois da captura dos polipep- tídios aos chips sensores.
[00162] Se os polipeptídios da presente invenção são ou não um polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcyRIIa (tipo R e tipo H) e com atividade de ligação aumentada com relação a FcyRIIb pode ser determinado usando-se a quantidade de ligação a FcyRIIa do polipeptídio e a quantidade de ligação a FcyRIIb do polipeptídio, que foram determinadas de acordo com os exemplos acima descritos.
[00163] Um exemplo é o caso em que a quantidade de ligação a FcyRIIb de um polipeptídio da presente invenção está aumentada em comparação com a quantidade de ligação a FcyRIIb de um polipeptídio de origem, e a quantidade de ligação a FcyRIIa (tipo R e tipo H) de um polipeptídio da presente invenção é equivalente (mantida) ou, de preferência, está diminuída com relação à quantidade de ligação de um polipeptídio de origem com relação a FcyRIIa (tipo R e tipo H). Além disso, é possível determinar por combinação apropriada da quantidade de ligação a FcyRIa com a quantidade de ligação a FcyRIIIa do poli- peptídio determinadas de acordo com os exemplos acima descritos.
[00164] "Região Fc" se refere à região compreendendo um fragmento que consiste em uma parte de articulação ou sua parte, domínio CH2 ou domínio CH3 em uma molécula de anticorpo. De acordo com a numeração EU (aqui, também chamada de ÍNDICE EU) (veja a Fig. 5), uma região Fc de classe IgG se refere, por exemplo, à região da cisteína na posição 226 até a terminação C, ou da prolina na posição 230 até a terminação C, mas não se limita a isso.
[00165] A região Fc pode ser obtida, de preferência, por reeluição da fração adsorvida na coluna de proteína A após digestão parcial de anticorpos monoclonais IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou outros usando uma protease como pepsina. A protease não é particularmente limitada, contanto que possa digerir um anticorpo de comprimento total de modo que Fab e F(ab')2 sejam produzidos de maneira restritiva por ajuste apropriado das condições de reação da enzima, como pH, e os exemplos incluem pepsina e papaína.
[00166] A presente invenção apresenta uma região constante de anticorpo compreendendo uma região Fc que compreende uma alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu em IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4). Polipeptídios com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIa, FcYRIIIa, e ambos os alotipos de FcYRIIa, tipos R e H, assim como atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um poli- peptídio de origem podem ser fornecidos por introdução de uma alte-ração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu em IgG humana.
[00167] Na presente invenção, pelo menos uma alteração pode ser adicionalmente acrescentada à região Fc de IgG humana compreendendo a alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu. Aqui, alteração se refere a qualquer uma ou uma combinação de substituições, deleções, adições e inserções. Alte rações adicionais podem ser adicionalmente incluídas com essas alterações. A alteração adicional pode ser selecionada de qualquer um ou combinações de substituições, deleções ou modificações de aminoá- cidos. Por exemplo, podem-se acrescentar alterações que aumentem a atividade de ligação a FcYRIIb, assim como mantenham ou diminuam as atividades de ligação com relação a FcYRIIa (tipo H) e FcYRIIa (tipo R). A adição dessas alterações melhora a seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para FcYRIIa.
[00168] Dentre elas, preferem-se alterações que melhorem a seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para FcYRIIa (tipo R), e alterações que melhorem a seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para FcYRIIa (tipo H) são mais preferidas. Exemplos preferidos de alterações de substituição de um aminoácido incluem:
[00169] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp,
[00170] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe,
[00171] a alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Phe,
[00172] a alteração de substituição de Asn na posição 325 (numeração EU) por Met,
[00173] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ile,
[00174] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Asp,
[00175] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val,
[00176] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Trp,
[00177] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numera- ção EU) por Gln,
[00178] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Met,
[00179] a alteração de substituição de Gly na posição 236 (numeração EU) por Asp,
[00180] a alteração de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) por Asn,
[00181] a alteração de substituição de Asn na posição 325 (numeração EU) por Ser,
[00182] a alteração de substituição de Leu na posição 235 (numeração EU) por Tyr,
[00183] a alteração de substituição de Val na posição 266 (numeração EU) por Met,
[00184] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Tyr,
[00185] a alteração de substituição de Leu na posição 235 (nume- ração EU) por Trp,
[00186] a alteração de substituição de Leu na posição 235 (nume- ração EU) por Phe,
[00187] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Gly,
[00188] a alteração de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) por Glu,
[00189] a alteração de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) por Gly,
[00190] a alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Leu,
[00191] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Leu,
[00192] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (nume- ração EU) por Thr,
[00193] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Ser,
[00194] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Met,
[00195] a alteração de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) por Trp,
[00196] a alteração de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) por Tyr,
[00197] a alteração de substituição de Pro na posição 331 (numeração EU) por Phe,
[00198] a alteração de substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) por Asp,
[00199] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Phe,
[00200] a alteração de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Leu,
[00201] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Glu,
[00202] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Ala,
[00203] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (nume- ração EU) por Ile,
[00204] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (nume- ração EU) por Gln,
[00205] a alteração de substituição de Leu na posição 328 (nume- ração EU) por Val,
[00206] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Trp,
[00207] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numera- ção EU) por Arg,
[00208] a alteração de substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Gly,
[00209] a alteração de substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn,
[00210] a alteração de substituição de Ser na posição 324 (numeração EU) por Val,
[00211] a alteração de substituição de Val na posição 266 (numeração EU) por Leu,
[00212] a alteração de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly,
[00213] a alteração de substituição de Ile na posição 332 (numeração EU) por Phe,
[00214] a alteração de substituição de Ser na posição 324 (numeração EU) por Ile,
[00215] a alteração de substituição de Glu na posição 333 (numeração EU) por Pro,
[00216] a alteração de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) por Asp,
[00217] a alteração de substituição de Ser na posição 337 (numeração EU) por Asp,
[00218] a alteração de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) por Gln,
[00219] a alteração de substituição de Thr na posição 335 (numeração EU) por Asp,
[00220] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asn,
[00221] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu,
[00222] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Ile,
[00223] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numera- ção EU) por Glu,
[00224] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Phe,
[00225] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Val,
[00226] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Tyr,
[00227] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numera- ção EU) por Asp,
[00228] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Pro,
[00229] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por His,
[00230] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numera- ção EU) por Ala,
[00231] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numera- ção EU) por Trp,
[00232] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Gln,
[00233] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Gln,
[00234] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Glu,
[00235] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Met,
[00236] a alteração de substituição de Val na posição 266 (numera- ção EU) por Ile,
[00237] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numera- ção EU) por Glu,
[00238] a alteração de substituição de Tyr na posição 300 (numeração EU) por Glu,
[00239] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Met,
[00240] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Val,
[00241] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Thr,
[00242] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Ser,
[00243] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por His,
[00244] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Phe,
[00245] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Gln,
[00246] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Pro,
[00247] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Tyr,
[00248] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Ile,
[00249] a alteração de substituição de Gln na posição 295 (numeração EU) por Leu,
[00250] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Leu,
[00251] a alteração de substituição de Lys na posição 334 (numeração EU) por Asn,
[00252] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Ala,
[00253] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp,
[00254] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala,
[00255] a alteração de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp,
[00256] a alteração de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr,
[00257] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Ala,
[00258] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Asp,
[00259] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Glu,
[00260] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Leu,
[00261] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Met,
[00262] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Tyr,
[00263] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numera- ção EU) por Lys,
[00264] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numera- ção EU) por Arg,
[00265] a alteração de substituição de Glu na posição 233 (numera- ção EU) por Asp,
[00266] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Asp,
[00267] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Glu,
[00268] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp,
[00269] a alteração de substituição de Lys with Ser na posição 326 (numeração EU),
[00270] a alteração de substituição de Lys with Thr na posição 326 (numeração EU),
[00271] a alteração de substituição de Val with Ile na posição 323 (numeração EU),
[00272] a alteração de substituição de Val with Leu na posição 323 (numeração EU),
[00273] a alteração de substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met,
[00274] a alteração de substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp,
[00275] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala,
[00276] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn, e
[00277] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
[00278] Além disso, exemplos de substituições de aminoácidos pre-feridas dentre essas alterações incluem:
[00279] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp,
[00280] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe,
[00281] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val,
[00282] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numera- ção EU) por Gln,
[00283] a alteração de substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn,
[00284] a alteração de substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly,
[00285] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu,
[00286] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln,
[00287] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu,
[00288] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met,
[00289] a alteração de substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp,
[00290] a alteração de substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala,
[00291] a alteração de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp,
[00292] a alteração de substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr,
[00293] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala,
[00294] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp,
[00295] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu,
[00296] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu,
[00297] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Met,
[00298] a alteração de substituição de Gly na posição 237 (numera- ção EU) por Tyr,
[00299] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numera- ção EU) por Lys,
[00300] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numera- ção EU) por Arg,
[00301] a alteração de substituição de Glu na posição 233 (numera- ção EU) por Asp,
[00302] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Asp,
[00303] a alteração de substituição de His na posição 268 (numera- ção EU) por Glu,
[00304] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Asp,
[00305] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Ser,
[00306] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Thr,
[00307] a alteração de substituição de Val na posição 323 (numera- ção EU) por Ile,
[00308] a alteração de substituição de Val na posição 323 (numera- ção EU) por Leu,
[00309] a alteração de substituição de Val na posição 323 (numera- ção EU) por Met,
[00310] a alteração de substituição de Tyr na posição 296 (numera- ção EU) por Asp,
[00311] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Ala,
[00312] a alteração de substituição de Lys na posição 326 (numera- ção EU) por Asn, e
[00313] a alteração de substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
[00314] A alteração acima mencionada pode ser uma alteração in-troduzida em uma posição e, alternativamente, alterações em duas ou mais posições podem ser combinadas. Exemplos preferidos dessas alterações incluem aquelas mencionadas nas Tabelas 6-7 e Tabelas 912.
[00315] Além disso, por exemplo, substituições de aminoácidos que melhorem a atividade de ligação a FcRn (J. Immunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56; J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24; Int. Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69; Nat Biotechnol. 2010 Feb; 28(2): 157-9.; WO 2006/019447; WO 2006/053301; e WO 2009/086320), e substituições de aminoácidos para melhorar a heterogeneidade ou estabilidade do anticorpo (WO 2009/041613) podem ser introduzidas em uma parte de região constante de anticorpo. Alternativamente, polipep- tídios produzidos por conferir a polipeptídios da presente invenção a propriedade de promover desaparecimento de antígenos, que são descritos no WO 2011/122011 ou PCT/JP2011/072550, e polipeptídios que conferem a propriedade de ligação repetida a uma pluralidade de moléculas de antígeno, que são descritos no WO 2009/125825 ou PCT/JP2011/077619, também estão incluídos na presente invenção.
[00316] Exemplos preferidos de polipeptídios da presente invenção incluem anticorpos IgG. Quando um anticorpo IgG é usado como o an-ticorpo, o tipo de região constante não é limitado, e isotipos de IgG (subclasses) como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 podem ser usados. Anti-corpos IgG da presente invenção são, de preferência, IgG humana e, mais preferivelmente, IgG1 humana e IgG4 humana. As sequências de aminoácidos das regiões constantes de cadeia pesada de IgG1 humana e IgG4 humana são conhecidas. Uma pluralidade de sequências de alotipos devido a polimorfismos genéticos foi descrita em Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicação NIH No. 91-3242 para a região constante de IgG1 humana, e qualquer das sequências pode ser usada na presente invenção.
<Substituição>
[00317] Quando se substituem resíduos de aminoácidos, a substituição por um resíduo de aminoácido diferente é realizada com o objetivo de alterar aspectos como (a) - (c) descritos abaixo: (a) estrutura principal do polipeptídio na região de estrutura de folha ou estrutura helicoidal; (b) carga elétrica ou hidrofobicidade no sítio-alvo; ou (c) tamanho da cadeia colateral.
[00318] Os resíduos de aminoácidos são classificados nos seguintes grupos com base em suas propriedades gerais da cadeia colateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu e ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr, asn e gln; (3) ácidos: asp e glu; (4) básicos: his, lys e arg; (5) resíduos que afetam a orientação da cadeia: gly e pro; e (6) aromáticos: trp, tyr e phe.
[00319] A substituição entre resíduos de aminoácidos dentro de cada um desses grupos de aminoácidos é chamada de substituição con- servativa, e a substituição de resíduo de aminoácido entre diferentes grupos é chamada de substituição não conservativa. As substituições na presente invenção podem ser substituições conservativas ou subs-tituições não conservativas, ou uma combinação de substituições con- servativas e substituições não conservativas.
[00320] Alterações na sequência de aminoácidos são produzidas por vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses métodos incluem o método de mutagênese direcionado a sítio (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, e Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site- directed mutagenesis. Gene 152: 271-275; Zoller, MJ, e Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100: 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, e Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer W, e Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; e Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82: 488-492), o método de mutação por PCR e o método de mutação com cassete, mas não se limitam a esses.
[00321] A modificação do aminoácido da presente invenção inclui modificação pós-tradução. Uma modificação pós-tradução específica pode ser a adição ou deleção de uma cadeia de açúcar. Por exemplo, na região constante de IgG1 que consiste na sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 11, o resíduo de aminoácido na posição 297 (numeração EU) pode ser modificado na cadeia de açúcar. A estrutura de cadeia de açúcar para a modificação não está limitada. Genericamente, anticorpos expressados em células eucarióticas compreendem gli- cosilação na região constante. Consequentemente, anticorpos expressados em células como as abaixo normalmente são modificados por algum tipo de cadeia de açúcar: - células de mamíferos produtoras de anticorpos - células eucarióticas transformadas com um vetor de ex-pressão compreendendo um DNA que codifique um anticorpo
[00322] As células eucarióticas aqui mostradas incluem células de levedura e animais. Por exemplo, células CHO e células HEK293H são células animais representativas usadas na transformação com um vetor de expressão compreendendo um DNA que codifica um anticorpo. Por outro lado, aqueles sem glicosilação nesse sítio também estão incluídos na região constante da presente invenção. Anticorpos cuja região constante não é glicosilada podem ser obtidos por expressão de um gene codificador de anticorpo em células procarióticas como Escherichia coli.
[00323] Especificamente, por exemplo, o ácido siálico pode ser adi-cionado à cadeia de açúcar de uma região Fc (MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27).
<Anticorpo>
[00324] Além disso, a presente invenção apresenta anticorpos compreendendo uma região Fc em que qualquer uma das sequências de aminoácidos acima mencionadas esteja alterada.
[00325] O termo "anticorpo/anticorpos" na presente invenção é usado no sentido mais amplo e, contanto que a atividade biológica desejada seja demonstrada, compreende qualquer anticorpo, como anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, variantes de anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos poliespecíficos (anticorpos multiespecíficos) (por exemplo, anticorpos biespecíficos (diacorpos)), anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados.
[00326] Com relação aos anticorpos da presente invenção, o tipo de antígeno e a origem do anticorpo não são limitados, e eles podem ser qualquer tipo de anticorpo. A origem dos anticorpos não é particular-mente limitada, mas os exemplos incluem anticorpos humanos, anti-corpos de camundongo, anticorpos de rato e anticorpos de coelho.
[00327] Métodos para a produção dos anticorpos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e, por exemplo, anticorpos mo- noclonais podem ser produzidos pelo método de hibridoma (Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975)), ou o método de recombinação (patente norte-americana n° 4.816.567). Alternativamente, eles podem ser isolados de uma biblioteca de anticorpos de fagos (Clackson et al., Na-ture 352: 624-628 (1991); Marks et al., J.Mol.Biol. 222: 581-597 (1991)).
[00328] Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo humano remodelado. Especificamente, são conhecidos anticorpos humanizados preparados por enxertia das CDRs de um anticorpo de animal não humano, como um anticorpo de camundongo, em um anti-corpo humano. Técnicas comuns de engenharia genética para a ob-tenção de anticorpos humanizados também são conhecidos. Especifi-camente, por exemplo, PCR de extensão de superposição é conhecida como um método para a enxertia de CDRs de anticorpo de camundongo em FRs humanas.
[00329] Um vetor para a expressão de um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserção de um DNA que codifique uma região variável de anticorpo em que três CDRs e quatro FRs estejam ligadas e de um DNA que codifique uma região constante de anticorpo humano em um vetor de expressão, de modo que esses DNAs estejam fusionados em quadro. Após essa integração, o vetor é transfectado em um hospedeiro para estabelecer células recombinantes, essas células são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expressado para produzir o anticorpo humanizado na cultura das células (veja a Publicação de Patente Europeia n° EP 239,400 e a Pubilicação de Patente Internacional n° WO 1996/002576).
[00330] Quando necessário, um resíduo de aminoácido em uma FR pode ser substituído de modo que as CDRs de um anticorpo humano remodelado formem um sítio de ligação a antígeno apropriado. Por exemplo, uma mutação pode ser introduzida na sequência de aminoá- cidos de uma FR por aplicação do método de PCR usado para enxer- tar CDRs de camundongo em FRs humanas.
[00331] Um anticorpo humano desejado pode ser obtido por imunização com DNA usando um animal transgênico com o repertório completo de genes de anticorpos humanos (veja as Publicações Internacionais n° WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 e WO 1996/033735) como um animal para imunização.
[00332] Além disso, são conhecidas tecnologias para a obtenção de um anticorpo humano por garimpagem de uma biblioteca de anticorpos humanos. Por exemplo, uma região V de anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo de cadeia única (scFv) pelo método de exibição em fagos. O fago que expressa scFv que se liga ao antígeno pode ser selecionado. A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano ligado ao antígeno pode ser determinada por análise dos genes do fago selecionado. Depois de determinar a sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno, pode- se preparar um vetor de expressão por fusão da sequência da região V em quadro com a sequência de uma região C de anticorpo humano desejada e, então, inserção em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células de expressão adequadas, como aquelas acima descritas, e o anticorpo humano pode ser obtido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano. Esses métodos já são conhecidos (veja as Publicações Internacionais n° WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 e WO 1995/15388).
[00333] As regiões variáveis que constituem os anticorpos da presente invenção podem ser regiões variáveis que reconheçam qualquer antígeno.
[00334] Aqui, não há nenhuma limitação particular quanto ao antí- geno, e podem ser quaisquer antígenos. Exemplos desses antígenos incluem, de preferência, ligantes (citocinas, quimiocinas e outros), re-ceptores, antígenos de câncer, antígenos de MHC, antígenos de dife-renciação, imunoglobulinas e complexos imunes parcialmente contendo imunoglobulinas.
[00335] Exemplos de citocinas incluem as interleucinas 1 a 18, fatores estimuladores de colônia (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN-α, IFN-β, IFN-Y e outros), fatores de crescimento (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF e outros), fatores de necrose tumoral (TNF-α e TNF-β), linfotoxina, eritropoietina, leptina, SCF, TPO, MCAF e BMP.
[00336] Exemplos de quimiocinas incluem quimiocinas CC como CCL1 a CCL28, quimiocinas CXC como CXCL1 a CXCL17, quimioci- nas C como XCL1 e XCL2 e quimiocinas CX3C como CX3CL1.
[00337] Exemplos de receptores incluem receptores pertencentes a famílias de receptores como a família de receptores de fator de cres-cimento hematopoiético, família de receptores de citocina, família de receptores do tipo tirosina quinase, família de receptores do tipo seri- na/treonina quinase, família de receptores de TNF, família de receptores acoplados a proteína G, família de receptores do tipo âncora GPI, família de receptores do tipo tirosina fosfatase, família de fatores de adesão e família de receptores de hormônio. Os receptores pertencentes a essas famílias de receptores e suas características foram descritos em muitos documentos, como Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV; Patthy (Cell (1990) 61 (1): 13-14); Ullrich et al. (Cell (1990) 61 (2): 203212); Massagué (Cell (1992) 69 (6): 1067-1070); Miyajima et al. (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10: 295-331); Taga et al. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al. (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481); Smith et al. (Cell (1994) 76 (6): 959-962); e Flower DR. Flower (Bio- chim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3): 207-234).
[00338] Exemplos de receptores específicos pertencentes às famílias de receptores acima mencionadas incluem, de preferência, receptores de eritropoietina (EPO) humanos ou de camundongo (Blood (1990) 76 (1): 31-35; e Cell (1989) 57 (2): 277-285), receptores do fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) humanos ou de camundongo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22): 8702-8706, mG-CSFR; Cell (1990) 61 (2): 341-350), receptores de trombopoietina (TPO) humanos ou de camundongo (Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12): 5640-5644; EMBO J. (1993) 12(7): 2645-53), receptores de insulina humanos ou de camundongo (Nature (1985) 313 (6005): 756761), receptores do ligante Flt-3 humanos ou de camundongo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2): 459-463), receptores do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) humanos ou de camundongo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10): 3435-3439), receptores de interferon (IFN)-α e β humanos ou de camundongo (Cell (1990) 60 (2): 225-234; e Cell (1994) 77 (3): 391-400), receptores de leptina humanos ou de camundongo, receptores do hormônio de crescimento (GH) humanos ou de camundongo, receptores de interleucina (IL)-10 humanos ou de camundongo, receptores do fator de crescimento do tipo insulina (IGF)-I humanos ou de camundongo, receptores do fator inibitório de leucemia (LIF) humanos ou de camundongo e receptores do fator neurotrófico ciliar (CNTF) humanos ou de camundongo.
[00339] Antígenos de câncer são antígenos que são expressos quando as células se tornam malignas e também são chamados de antígenos específicos para tumor. Cadeias de açúcar anormais que aparecem superfícies celulares ou moléculas de proteína quando as células se tornam cancerosas também são antígenos de câncer e também são chamados de antígenos de cadeia de açúcar de câncer. Exemplos de antígenos de câncer incluem, de preferência, GPC3 que é um receptor pertencente à família de receptores do tipo âncora GPI acima mencionada e também é expressos em vários cânceres, incluindo câncer de fígado (Int J Cancer. (2003) 103 (4): 455-65), assim como EpCAM que é expresso em vários cânceres incluindo câncer de pulmão (Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1): 27-31), CA19-9, CA15-3, e sialyl SSEA-1 (SLX).
[00340] Os antígenos de MHC são grosseiramente classificados em antígenos de MHC classe I e antígenos de MHC classe II. Antígenos de MHC classe I incluem HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, e -H, e antígenos de MHC classe II incluem HLA-DR, -DQ, e -DP.
[00341] Os antígenos de diferenciação podem incluir CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 e CDw130.
[00342] Imunoglobulinas incluem IgA, IgM, IgD, IgG e IgE. Imu- nocomplexos incluem um componente de pelo menos qualquer uma das imunoglobulinas.
[00343] Outros antígenos incluem, por exemplo, as moléculas abaixo: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1- antitripsina, antagonista de alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, pep- tídio natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator estimulador de linfócitos B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b- ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP- 2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP- 7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bom- besina, fator neurotrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator do complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno associado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complemento (fator acelerador do decaimento), des (1-3)-IGF-I (brain IGF-1), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRINA, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio folículo estimulante, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio liberador de hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP- cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína de invólucro HCMV gB, glicoproteí- na de invólucro HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hemato- poiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus da herpes simples (HSV), glicoproteína HSV gD, HGFA, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), HIV gp120, alça IIIB gp 120 V3 de HIV, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator de crescimento do tipo insulina 1, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, inte- grina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfa V), integri- na alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicre- ína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócitos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis-Y, antígeno associado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1- alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP- 13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, substância inibidora de Mulleriano, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4, ou -6, neurturi- na, fator de crescimento de nervos (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratireoidiano, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PINA, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP), PlGF, PLP, PP14, pró-insulina, pró- relaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico para próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A de relaxina, cadeia B de relaxin, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, fator reuma- tóide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, albumina sérica, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína associada a tumor-72), TARC, TCA-3, receptor de células T (por exemplo, receptor alfa/beta de células T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina do tipo PLAP de testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta pan-específica, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF- beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 de timo, hormônio estimulador da tireóide, Tie, TIMP, TIQ, fator tissular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF- beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRAN- CE/RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligan- te DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR, ligante AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Faz, ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor que expressa carboidratos associados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE-caderin-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno viral, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, fator de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidada, PCSK9, pré-calicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromograni- na A, Cromogranina B, tau, VAP1, cininogênio de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, pró-trombina, trombina, fator tissular, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trom- bomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, e S1P; e receptores para hormônios e fatores de crescimento.
[00344] Uma ou mais alterações de resíduos de aminoácidos são permitidas nas sequências de aminoácidos que constituem as regiões variáveis, contanto que suas atividades de ligação a antígeno sejam mantidas. Quando se altera uma sequência de aminoácidos de região variável, não há particularmente nenhuma limitação quanto ao sítio de alteração e número de aminoácidos alterados. Por exemplo, aminoáci- dos presentes na CDR e/ou FR podem ser apropriadamente alterados. Quando se alteram aminoácidos em uma região variável, a atividade de ligação é, de preferência, mantida sem limitação particular; e, por exemplo, em comparação com antes da alteração, a atividade de ligação é de 50% ou mais, de preferência 80% ou mais e, mais preferivelmente, 100% ou mais. Além disso, a atividade de ligação pode ser aumentada em alterações de aminoácidos. Por exemplo, a atividade de ligação pode ser 2, 5, 10 vezes maior do que antes da alteração. Nos anticorpos da presente invenção, a alteração da sequência de aminoácidos pode ser pelo menos uma de substituição, adição, dele- ção e modificação de resíduos de aminoácidos.
[00345] Por exemplo, a modificação da glutamina N-terminal de uma região variável para ácido piroglutâmico por piroglutamilação é uma modificação bem conhecida por aqueles versados na técnica. Assim, quando o término N de cadeia pesada é glutamina, os anticorpos da presente invenção compreendem as regiões variáveis em que a glutamina é modificada para ácido piroglutâmico.
[00346] As regiões variáveis de anticorpos da presente invenção podem ter quaisquer sequências e podem ser regiões variáveis de anticorpos de qualquer origem, como anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de cabra, anticorpos de camelo, anticorpos humanizados produzidos por humanização des ses anticorpos não humanos e anticorpos humanos. "Anticorpos hu-manizados", também chamados de "anticorpos humanos remodelados", são anticorpos em que as regiões determinantes de complemen- tariedade (CDRs) de um anticorpo derivado de um mamífero não humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo, são transplantadas para as CDRs de um anticorpo humano. Métodos para a identificação de CDRs são conhecidas (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). Suas técnicas de recombina- ção genética comuns também são conhecidas (veja a Publicação de Pedido de Patente Europeia n° EP 125023 e WO 96/02576). Além disso, esses anticorpos podem ter várias substituições de aminoácidos introduzidas em suas regiões variáveis para melhorar sua ligação a antígeno, farmacocinética, estabilidade e antigenicidade. Regiões variáveis dos anticorpos da presente invenção são capazes de se ligar repetidamente a antígenos devido a sua dependência do pH na ligação a antígeno (WO 2009/125825).
[00347] As regiões constantes do tipo cadeia K e cadeia À estão presentes em regiões constantes de cadeia leve do anticorpo, mas qualquer uma das regiões constantes de cadeia leve é aceitável. Além disso, regiões constantes de cadeia leve da presente invenção podem ser regiões constantes de cadeia leve com alterações de aminoácidos como substituições, deleções, adições e/ou inserções.
[00348] Por exemplo, para as regiões constantes de cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção, podem-se usar regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos humanos IgG, e são preferidas as regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos IgG1 humanos e as de anticorpos IgG4 humanos.
[00349] Além disso, os polipeptídios da presente invenção podem ser preparados como moléculas de proteína em fusão com Fc por liga- ção a outras proteínas, peptídios fisiologicamente ativos e outros.
[00350] Exemplos das outras proteínas e peptídios biologicamente ativos incluem receptores, moléculas de adesão, ligantes e enzimas, mas não se limitam a esses.
[00351] Exemplos preferidos de moléculas de proteína em fusão com Fc da presente invenção incluem proteínas com domínio Fc fusionado a uma proteína receptora que se liga a um alvo, e esses exemplos incluem proteína de fusão TNFR-Fc, proteína de fusão IL1R-Fc, proteína de fusão VEGFR-Fc e proteína de fusão CTLA4-Fc (Nat Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52; BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60). Além disso, a proteína a ser fusionada a um polipeptídio da presente invenção pode ser qualquer molécula, contanto que se ligue a uma molécula alvo, e exemplos incluem moléculas scFv (WO 2005/037989), molécula de anticorpos de domínio único (WO 2004/058821; WO 2003/002609), moléculas do tipo anticorpo (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469; e Protein Science 2006, 15: 14-27) como DARPins (WO 2002/020565), Affibody (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO 2005/040229), e Adnec- tin (WO 2002/032925). Além disso, anticorpos e moléculas de proteína em fusão com Fc podem ser anticorpos multiespecíficos que se ligam a múltiplos tipos de moléculas alvo ou epítopos.
[00352] Além disso, os anticorpos da presente invenção incluem produtos de modificação de anticorpo. Esses produtos de modificação de anticorpo incluem, por exemplo, anticorpos ligados a várias moléculas, como polietileno glicol (PEG) e substâncias citotóxicas. Esses produtos de modificação de anticorpo podem ser obtidos por modificação química de anticorpos da presente invenção. Métodos para a modificação de anticorpos já estão estabelecidos nesse campo.
[00353] Os anticorpos da presente invenção também podem ser anticorpos biespecíficos. "Anticorpo biespecífico" se refere a um anti-corpo que tenha em uma única molécula regiões variáveis que reco-nheçam diferentes epítopos. Os epítopos podem estar presentes em uma única molécula ou em diferentes moléculas.
[00354] Os polipeptídios da presente invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados pelos métodos descritos abaixo, mas os métodos não se limitam a esses.
[00355] É expresso, um DNA que codifica uma cadeia pesada de anticorpo em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc tenham sido substituídos por outros aminoácidos de interesse e DNA que codifica uma cadeia leve de anticorpo. Um DNA que codifica uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc sejam substituídos por outros aminoácidos de interesse pode ser preparado, por exemplo, por obtenção de um DNA que codifica a região Fc de uma cadeia pesada natural e introdução de uma substituição apropriada, de modo que um códon que codifique um aminoácido particular na região Fc codifique outro aminoácido de interesse.
[00356] Alternativamente, um DNA que codifica uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc sejam substituídos por outros aminoácidos de interesse também pode ser preparado projetando-se e, então, quimicamente sintetizando-se um DNA que codifica uma proteína em que um ou mais resíduos de ami- noácidos na região Fc da cadeia pesada natural sejam substituídos por outros aminoácidos de interesse. A posição e o tipo de substituição de aminoácido não são particularmente limitados. Além disso, a alteração não se limita a substituição, e a alteração pode ser qualquer uma de deleção, adição ou inserção ou uma combinação dessas.
[00357] Alternativamente, um DNA que codifica uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc sejam substituídos por outros aminoácidos de interesse pode ser preparada como uma combinação de DNAs parciais. Essas combinações de DNAs parciais incluem, por exemplo, a combinação de um DNA que codifica a região variável e um DNA que codifica uma região constante, e a combinação de um DNA que codifica uma região Fab e um DNA que codifica uma região Fc, mas não se limitam a essas. Além disso, um DNA que codifica uma cadeia leve pode ser preparada da mesma forma como uma combinação de DNAs parciais.
[00358] Métodos para a expressão dos DNAs acima descritos incluem os métodos descritos abaixo. Por exemplo, um vetor de expressão de cadeia pesada é construído por inserção de um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada em um vetor de expressão juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia pesada. Da mesma forma, um vetor de expressão de cadeia leve é construído por inserção de um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve em um vetor de expressão juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. Alternativamente, esses genes de cadeia pesada e leve podem ser inseridos em um único vetor.
[00359] Quando se insere um DNA que codifica o anticorpo de interesse em um vetor de expressão, o DNA é inserido de modo que o anticorpo seja expressado sob o controle de uma região reguladora de expressão, como um intensificador ou promotor. Em seguida, células hospedeiras são transformadas com esse vetor de expressão para expressar o anticorpo. Nesses casos, pode-se usar uma combinação apropriada de hospedeiro e vetor de expressão.
[00360] Exemplos dos vetores incluem vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript e pCR-Script. Alternativamente, quando se visa a subclonar e excisar cDNA, além dos vetores acima descritos, podem- se usar pGEM-T, pDIRECT, pT7 e outros.
[00361] Os vetores de expressão são particularemente úteis quando se usam vetores para a produção dos polipeptídios da presente invenção. Por exemplo, quando a célula hospedeira é E. coli, como JM109, DH5α, HB101 e XL1-Blue, os vetores de expressão têm de portar um promotor que permite uma expressão eficiente em E. coli, por exemplo, o promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341: 544546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência), promotor T7 ou outros. Esses vetores incluem pGEX-5X-1 (Phar- macia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, ou pET (nesse caso, o hospedeiro é, de preferência, BL21 que expressa T7 RNA polimerase), além dos vetores acima descritos.
[00362] Os vetores podem conter sequências de sinal para secreção de polipeptídio. Como uma sequência de sinal para secreção de polipeptídio, uma sequência de sinal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169: 4379; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência) pode ser usada quando um polipeptídio é secretado no periplasma de E. coli. O vetor pode ser introduzido em células hospedeiras pelo método da lipofectina, método do fosfato de cálcio, e método de DEAE-Dextrano, por exemplo.
[00363] Além de vetores de expressão em E. coli, os vetores para a produção dos polipeptídios da presente invenção incluem vetores de expressão em mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF- BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17): p5322; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência), pEF, e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de insetos (por exemplo, o "sistema de expressão em baculovírus Bac-to-BAC" (Gibco-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animais (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão retrovirais (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão em levedura (por exemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, e SP-Q01), e vetores de expressão em Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.
[00364] Quando se visa à expressão em células animais, como células CHO, COS e NIH3T3, os vetores têm de ter um promotor essencial para expressão nas células, por exemplo, o promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277: 108; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência), promotor MMTV-LTR, promotor EF1α (Mizus- hima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência), promotor CAG (Gene. (1990) 18: 5322; que é aqui incorporada em sua inteireza por referência) e promotor CMV e, mais preferivelmente, eles têm um gene para seleção de células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a fár- maco que permite a avaliação usando um agente (neomicina, G418 ou outro)). Vetores com essas características incluem pMAM, pDR2, pBK- RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13, por exemplo.
[00365] Além disso, pode-se usar o seguinte método para expressão estável de gene e amplificação do número de cópias do gene nas células: células CHO deficientes em uma via de síntese de ácido nu- cléico são introzidas com um vetor portador de um gene DHFR que compensa a deficiência (por exemplo, pCHOI), e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, pode-se usar o seguinte método para expressão transitória do gene: células COS com um gene que expressa o antígeno T de SV40 em seu cromossomo são transformadas com um vetor com uma origem de replicação de SV40 (pcD e such). Também se podem usar origens de replicação derivadas de vírus de polioma, adenovírus, vírus do papiloma bovino (BPV) e ou- tros. Para amplificar o número de cópias do gene em células hospedei-ras, os vetores de expressão também podem portar marcadores de seleção, como o gene da aminoglicosida transferase (APH), o gene da timidina quinase (TK), o gene da xantina-guanina fosforribosiltransfe- rase (Ecogpt) de E. coli e o gene da diidrofolato redutase (dhfr).
[00366] Os anticorpos podem ser coletados, por exemplo, por cultura de células transformadas e, então, separação dos anticorpos do interior das células transformadas ou do meio de cultura. Os anticorpos podem ser separados e purificados usando-se uma combinação apropriada de métodos, como centrifugação, fracionamento com sulfato de amônio, dessalinização, ultrafiltração, 1q, FcRn, proteína A, coluna de proteína G, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons e cromatografia de filtração em gel.
[00367] Além disso, a presente invenção apresenta métodos para a produção de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo com atividade de ligação a FcYRIIa mantida ou diminuída, e atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um poli- peptídio de origem, que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc do polipeptídio.
[00368] Os exemplos incluem métodos de produção compreendendo as seguintes etapas: (a) a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc de polipeptídios compreendendo uma região Fc do anticorpo; (b) a medição da atividade de ligação a FcYRIIa e da ativi-dade de ligação a FcYRIIb dos polipeptídios alterados na etapa (a); e (c) a seleção de polipeptídios com atividade de ligação a FcYRIIa mantida ou diminuída, e atividade de ligação a FcYRIIb au-mentada em comparação com um polipeptídio de origem.
[00369] Uma modalidade preferida é um método para a produção de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo, que compreende as etapas de: (a) alteração de um ácido nucléico que codifica o polipeptí- dio de modo que a atividade de ligação a FcYRIIa seja mantida ou di-minuída, e a atividade de ligação a FcYRIIb seja aumentada em com-paração com o peptídio de origem; (b) introdução do ácido nucléico em células hospedeiras e seu cultivo para induzir expressão; e (c) coleta do polipeptídio da cultura de células hospedeiras.
[00370] Além disso, anticorpos e moléculas de proteína em fusão com Fc produzidas por esse método de produção também estão incluídos na presente invenção.
[00371] A presente invenção também apresenta métodos para a produção de um polipeptídio em que a produção de anticorpo contra o polipeptídio é suprimida em comparação com seu polipeptídio de origem quando administrado in vivo, que compreendem a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo.
[00372] Os exemplos incluem um método de produção compreendendo as seguintes etapas: (a) a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo; e (b) a confirmação de que a produção de anticorpo está su-primida quando o polipeptídio alterado na etapa (a) é administrado in vivo em comparação com um polipeptídio de origem.
[00373] Se a produção de anticorpos contra o polipeptídio foi suprimida ou não pode ser confirmado por métodos de administração do polipeptídio a um animal e outros. Alternativamente, a supressão da produção de anticorpo pode ser determinada por medição das ativida- des de ligação com relação a FcYRIIa e FcYRIIb, e observação de um aumento no valor obtido por divisão do valor de KD para FcYRIIa pelo valor de KD para FcYRIIb. Esses polipeptídios são considerados úteis como substâncias farmacêuticas, pois eles podem suprimir a produção de anticorpo sem ativação da FcYR ativadora.
[00374] No método de produção acima mencionado, é preferível aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb, e manter ou diminuir as atividades de ligação com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H); e é preferível, além disso, reduzir as atividades de ligação a FcYRIa e/ou FcYRIIIa.
[00375] Em uma modalidade preferida no método de produção acima mencionado, por exemplo, um polipeptídio compreendendo a região Fc de IgG humana é alterado de modo que a Pro na posição 238 (numeração EU) seja substituída por Asp, ou Leu na posição 328 (numeração EU) seja substituída por Glu. Outras modalidades preferidas incluem a alteração do polipeptídio de modo que pelo menos uma substituição seja selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met, além da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
[00376] Além disso, a presente invenção apresenta métodos para a alteração de um polipeptídio para a produção de um polipeptídio com atividade de ligação a FcYRIIa mantida ou diminuída, e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com seu polipeptídio de origem.
[00377] A presente invenção também apresenta métodos para a alteração de um polipeptídio para a produção de um polipeptídio cuja produção de anticorpo esteja suprimida em comparação com a de um polipeptídio de origem quando é administrado in vivo.
[00378] Em uma modalidade preferida, por exemplo, um polipeptí- dio compreendendo a região Fc de IgG humana é alterado de modo que a Pro na posição 238 (numeração EU) seja substituída por Asp, ou Leu na posição 328 (numeração EU) seja substituída por Glu. Outras modalidades preferidas incluem a alteração do polipeptídio de modo pelo menos uma substituição seja selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met, além da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
[00379] Além disso, a presente invenção apresenta um ácido nu- cléico que codifica um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo com pelo menos uma alteração de aminoácido, que tem atividade de ligação a FcYRIIa mantida ou diminuída, e atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem. O ácido nucléico da presente invenção pode estar em qualquer forma, como DNA ou RNA.
[00380] A presente invenção também apresenta vetores portadores dos ácidos nucléicos acima descritos da presente invenção. O tipo de vetor pode ser apropriadamente selecionado por aqueles versados na técnica dependendo das células hospedeiras a serem introduzidas com o vetor. Os vetores incluem, por exemplo, aqueles acima descritos.
[00381] Além disso, a presente invenção se refere a células hospedeiras transformadas com os vetores acima descritos da presente in- venção. As células hospedeiras apropriadas podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. As células hospedeiras incluem, por exemplo, aquelas acima descritas.
[00382] Além disso, a presente invenção apresenta métodos para a manutenção ou diminuição da atividade de ligação a FcYRIIa e aumento da atividade de ligação a FcYRIIb de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem, em que o método compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc.
[00383] A presente invenção também apresenta métodos para a supressão da produção de anticorpos contra um polipeptídio em com-paração com um polipeptídio de origem quando o polipeptídio é admi-nistrado in vivo, em que o método compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc do polipeptídio com-preendendo uma região Fc do anticorpo.
[00384] Em uma modalidade preferida, por exemplo, um polipeptí- dio compreendendo a região Fc de IgG humana é alterado de modo que a Pro na posição 238 (numeração EU) seja substituída por Asp, ou Leu na posição 328 (numeração EU) seja substituída por Glu. Outras modalidades preferidas incluem a alteração do polipeptídio de modo pelo menos uma substituição seja selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met, além da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
[00385] No método acima mencionado, é preferível aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb, e manter ou diminuir as atividades de li- gação com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H); e é preferível, além disso, manter ou diminuir as atividades de ligação a FcYRIa e/ou FcYRIIIa.
[00386] Os polipeptídios produzidos pelos métodos acima mencionados também estão incluídos na presente invenção.
<Composições Farmacêuticas>
[00387] A presente invenção apresenta composições farmacêuticas compreendendo o polipeptídio da presente invenção.
[00388] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas, além do anticorpo ou moléculas de proteína em fusão com Fc da presente invenção acima descritos, com veículos farmaceuticamente aceitáveis por métodos conhecidos. Por exemplo, as composições podem ser usadas por via parenteral, quando os anticorpos são formulados em uma solução ou suspensão estéril para injeção usando água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições podem ser formuladas por combinação apropriada dos anticorpos ou moléculas de proteína em fusão com Fc com veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, especificamente, água estéril ou salina fisiológica, óleos vegetais, emulsifica- dores, agentes de suspensão, surfatantes, estabilizadores, agentes flavorizantes, excipientes, veículos, preservativos, agentes aglutinantes e outros, por sua misturação a uma dose e forma unitária requerida para implementações farmacêutica genericamente aceitas. Exemplos específicos dos veículos incluem ácido silícico anidro leve, lactose, ce-lulose cristalina, manitol, amido, carmelose cálcica, carmelose sódica, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de cadeia média, óleo de rícino endurecido com polioxietileno 60, sacarose, carbo- ximetil celulose, amido de milho, sal inorgânico e outros. O teor do ingrediente ativo nessa formulação é ajustado de modo que possa obter uma dose apropriada entre a faixa requerida.
[00389] As composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos como água destilada para injeção, de acordo com protocolos padronizados.
[00390] As soluções aquosas usadas para injeção incluem, por exemplo, salina fisiológica e soluções isotônicas contendo glicose ou outros adjuvantes, como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Elas podem ser usadas juntamente com solubilizadores adequados, como álcool, especificamente etanol, polialcoóis, como propi- leno glicol e polietileno glicol, e surfatantes não iônicos, como Polysorbate 80TM e HCO-50.
[00391] Os óleos incluem óleos de gergelim e óleos de soja e podem ser combinados com solubilizadores como benzoato de benzila ou álcool benzílico. Eles podem ser formulados com tampões, por exemplo, tampões fosfato ou tampões acetato de sódio; analgésicos, por exemplo, cloridrato de procaína; estabilizadores, por exemplo, álcool benzílico ou fenol; ou antioxidantes. As injeções preparadas são tipicamente divididas em ampolas apropriadas.
[00392] A administração é, de preferência, realizada por via parenteral e, especificamente, inclui injeção, administração intranasal, administração intrapulmonar e administração percutânea. Por exemplo, as injeções podem ser administradas sistêmica ou localmente por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea.
[00393] Além disso, o método de administração pode ser apropria-damente selecionado de acordo com a idade e sintomas do paciente. Pode-se selecionar uma única dosagem da composição farmacêutica contendo um anticorpo ou um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, por exemplo, na faixa de 0,0001 a 1.000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, a dosagem pode estar, por exemplo, na faixa de 0,001 a 100.000 mg/paciente. Entretanto, a dosagem não está limitada a esses valores. A dosagem e o método de administração variam de-pendendo do peso corporal, idade e sintomas do paciente e podem ser apropriadamente selecionados por aqueles versados na técnica.
[00394] Os polipeptídios acima mencionados da presente invenção são utilizáveis como ingredientes ativos de agentes farmacêuticos que suprimem a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos. Polipeptídios da presente invenção podem suprimir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, por trabalho seletivo sobre FcYRIIb sem ativar a FCYR ativadora. A ativação de células B inclui proliferação, produção de IgE, produção de IgM e produção de IgA. Os polipeptídios acima mencionados da presente invenção reticulam FcYRIIb com IgE para suprimir a produção de IgE de células B, com IgM para suprimir a produção de IgM de células B, e com IgA para suprimir a produção de IgA. Além dos acima, efeitos su-pressivos similares aos acima mencionados são exibidos por reticula- ção direta ou indireta de FcYRIIb com moléculas que sejam expressadas em células B e compreendam o domínio ITAM dentro da célula ou interajam com o domínio ITAM, como BCR, CD19, e CD79b. Além disso, a ativação de mastócitos inclui proliferação, ativação por IgE e outras, e desgranulação. Em mastócitos, os polipeptídios acima mencionados da presente invenção podem suprimir a proliferação, ativação por IgE e outras, e desgranulação por redução direta ou indireta de FcYRIIb com moléculas receptoras de IgE que sejam expressadas em mastócitos e compreendam o domínio ITAM ou interajam com o domínio ITAM, como FcεRI, DAP12, e CD200R3. A ativação de basófilos inclui a proliferação e desgranulação de basófilos. Também em basófi- los, os polipeptídios acima mencionados da presente invenção podem suprimir a proliferação, ativação e desgranulação por redução direta ou indireta de FcYRIIb com moléculas na membrana celular que compre- endam o domínio ITAM dentro da célula ou interajam com o domínio ITAM. A ativação de células dendríticas inclui a proliferação e desgra- nulação de células dendríticas. Também em células dendríticas, os po- lipeptídios acima mencionados da presente invenção podem suprimir a ativação, desgranulação e proliferação por redução direta ou indireta de FcYRIIb com moléculas na membrana celular que compreendam o domínio ITAM dentro da célula ou interajam com o domínio ITAM.
[00395] Na presente invenção, os polipeptídios da presente invenção acima mencionados são utilizáveis como um ingrediente ativo de agentes terapêuticos ou agentes preventivos para doenças inflamatórias imunológicas. Conforme acima descrito, como os polipeptídios da presente invenção podem suprimir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, a administração dos polipeptídios da presente invenção, como resultado, pode tratar ou prevenir doenças inflamatórias imunológicas. Sem estar limitado a estas, o termo "doenças inflamatórias imunológicas" compreende artrite reumatóide, hepatite autoimune, tireoidite autoimune, doenças com bolhas autoimunes, doença adrenocortical autoimune, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, anemia megalocítica, gastrite atrófica autoimune, neutropenia autoimune, orquite autoimune, encefa- lomielite autoimune, doença de receptores autoimune, infertilidade au- toimune, hepatite ativa crônica, glomerulonefrite, fibrose pulmonar intersticial, esclerose múltipla, doença de Paget, osteoporose, mieloma múltiplo, uveíte, espondilite aguda e crônica, artrite gotosa, doença inflamatória do intestino, síndrome do desconforto respiratório adulto (ARDS), psoríase, doença de Crohn, doença de Basedow, diabetes juvenil, doença de Addison, miastenia grave, uveíte induzida por lente, lúpus eritematoso sistêmico, rinite alérgica, dermatite alérgica, colite ulcerativa, hipersensibilidade, degeneração muscular, caquexia, escleroderma sistêmico, escleroderma localizado, síndrome de Sjogren, do ença de Behchet, síndrome de Reiter, diabetes de tipo I e tipo II, trans-torno de reabsorção óssea, reação enxerto-versus-hospedeiro, lesão por isquemia-reperfusão, aterosclerose, trauma cerebral, malária cerebral, sépsis, choque séptico, síndrome do choque tóxico, febre, mialgi- as devidas a torceduras, anemia aplástica, anemia hemolítica, trombo- citopenia idiopática, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain- Barre, tireoidite de Hashimoto, pênfigo, nefropatia por IgA, polinose, síndrome do anticorpo antifosfolipídio, polimiosite, granulomatose de Wegener, arterite nodosa, doença do tecido conjuntivo misto, fibromi- algia, asma, dermatite atópica, gastrite atrófica crônica, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, pancreatite autoimune, sín- drome de aortite, glomerulonefrite rapidamente progressiva, anemia megaloblástica, púrpura trombocitopênica idiopática, hipotireoidismo primário, doença de Addison idiopática, diabetes melito dependente de insulina, lúpus eritematoso discóide crônico, penfigóide, herpes gesta- cional, dermatose bulhosa por IgA linear, epidermólise bulhosa adquirida, alopécia areata, vitiligo vulgar, leucoderma adquirido centrífugo de Sutton, doença de Harada, neuropatia óptica autoimune, azoospermia idiopática, abortamento habitual, hipoglicemia, urticária crônica, es- pondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite enteropática, artrite rea-tiva, espondiloartropatia, entesopatia, síndrome do intestino irritável, síndrome da fadiga crônica, dermatomiosite, miosite por corpúsculo de inclusão, síndrome de Schmidt, doença de Graves, anemia perniciosa, hepatite lupóide, demência pré-senil, doença de Alzheimer, transtorno desmielinizante, esclerose lateral amiotrófica, hipoparatireoidismo, sín- drome de Dressler, síndrome de Eaton-Lambert, dermatite herpetifor- me, alopécia, esclerose sistêmica progressiva, síndrome CREST (cal- cinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofageana, esclerodac- tilia e telangiectasia), sarcoidose, febre reumática, eritema multiforme, síndrome de Cushing, reação a transfusão, doença de Hansen, arterite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, artrite de células gigantes, eczema, granulomatose linfomatóide, doença de Kawasaki, endocarditis, fibrose endomiocárdica, endoftalmite, eritroblastose fetal, fascite eosinofílica, síndrome de Felty, púrpura de Henoch-Schonlein, rejeição de transplante, caxumba, cardiomiopatia, artrite purulenta, febre mediterrânea familiar, síndrome de Muckle-Wells e síndrome do hiper-IgD.
[00396] Além disso, em doenças autoimunes que possam ser causadas pela produção de anticorpos contra autoantígenos (autoanticor- pos), os polipeptídios da presente invenção acima mencionados são utilizáveis como um ingrediente ativo de agentes farmacêuticos para o tratamento ou prevenção das doenças autoimunes por supressão da produção desses autoanticorpos. Relatou-se que o uso de uma molécula produzida por fusão de uma parte Fc do anticorpo com AchR (um autoantígeno da miastenia grave) suprime a proliferação de células B que expressam BCR que reconhece AchR e induzem apoptose (J. Neuroimmunol, 227: 35-43, 2010). O uso de uma proteína de fusão formada entre um antígeno reconhecido por um autoanticorpo e uma região Fc do anticorpo da presente invenção permite a reticulação de FcYRIIb com BCR de uma célula B que expressa BCR para esse auto- antígeno, supressão da proliferação de células B que expressam BCR para o autoantígeno e indução de apoptose. Essas doenças autoimu- nes incluem a síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, gastrite atrófica crônica, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, pancreatite autoimune, síndrome de aortite, sín- drome de Goodpasture, glomerulonefrite rapidamente progressiva, anemia megaloblástica, anemia hemolítica autoimune, neutropenia au- toimune, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Basedow, tireoidite de Hashimoto, hipotireoidismo primário, doença de Addison idiopática, diabetes melito dependente de insulina, lúpus eritematoso discóide crônico, escleroderma localizado, pênfigo, penfigóide, herpes gestacional, dermatose bulhosa por IgA linear, epidermólise bulhosa adquirida, alopécia areata, vitiligo vulgar, leucoderma adquirido centrí-fugo de Sutton, doença de Harada, neuropatia óptica autoimune, azo-ospermia idiopática, abortamento habitual, diabetes do tipo II, hipogli- cemia e urticária crônica; mas não se limitam a essas.
[00397] Além disso, os polipeptídios acima mencionados da presente invenção são utilizáveis como um ingrediente ativo em agentes te-rapêuticos para doenças com deficiência de uma proteína biologicamente essencial. Para doenças com deficiência de uma proteína biologicamente essencial, usam-se métodos terapêuticos que administram e suplementam a proteína como um agente farmacêutico. Entretanto, como o paciente não possui a proteína desde o início, a proteína suplementada externamente é reconhecida como uma substância estranha, e se produzem anticorpos contra essa proteína. Como resultado, a proteína se torna facilmente removida, e o efeito como uma substância farmacêutica é reduzido. O uso de uma proteína de fusão compreendendo essa proteína e uma região Fc do anticorpo da presente invenção permite a reticulação entre FcYRIIb e BCR em células B que reconheçam a proteína e permite a supressão da produção de anticorpo contra a proteína. As proteínas a serem suplementadas incluem o Fator VIII, Fator IX, TPO, EPO, α-iduronidase, iduronato sulfatase, Heparano N-sulfatase tipo A, α-N-acetilglucosaminidase tipo B, acetil CoA: α-glucosaminidase acetiltransferase tipo C, N- acetilglucosamina 6-sulfatase tipo D, galactose 6-sulfatase, N- acetilgalactosamina 4-sulfatase, β-glucuronidase, α-galactosidase, α- galactosidase ácida e glucocerebrosidase. Essas proteínas podem ser suplementadas para doenças como hemofilia, púrpura trombocitopêni- ca idiopática, anemia renal e doença lisossomal (mucopolissacaridose, doença de Fabry, doença de Pompe e doença de Gaucher), sem estar limitado a essas.
[00398] Além disso, os polipeptídios acima mencionados da presente invenção são utilizáveis como um ingrediente ativo para agentes antivirais. Anticorpos que compreendam uma região Fc da presente invenção e sejam anticorpos antivírus podem suprimir a intensificação dependente de anticorpo observada com anticorpos anti-vírus. A inten-sificação dependente de anticorpo é um fenômeno em que um vírus usa anticorpos neutralizadores contra o vírus para ser fagocitado mediante FCYRS ativadoras e infecta células que expressam FCYR, de modo que a infecção se espalhe. Relatou-se que a ligação de anticorpos neutralizadores antivírus da dengue a FcyRIIb desempenha um importante papel na supressão da intensificação dependente de anticorpo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 12479-12484, 2011). A reticu- lação de FcyRIIb com um imunocomplexo com vírus da dengue, que é formado pelos anticorpos neutralizadores antivírus da dengue, inibe a fagocitose mediada por FcyR, resultando na supressão da intensificação dependente de anticorpo. Exemplos de esses vírus incluem o vírus da dengue (DENV1, DENV2, e DENV4) e HIV, mas não se limitam a esses.
[00399] Além disso, os polipeptídios da presente invenção acima descritos são utilizáveis como um ingrediente ativo em agentes pre-ventivos ou agentes terapêuticos para arteriosclerose. Anticorpos contra LDL oxidada, isto é, uma cauas da arteriosclerose, que são anticorpos compreendendo uma região Fc da presente invenção, pode prevenir a adesão dependente de FcyRIIa de células inflamatórias. Relatou-se que, embora anticorpos anti-LDL oxidada inibam a interação entre LDL oxidada e CD36, anticorpos anti-LDL oxidada se ligam a células endoteliais, e os monócitos reconhecem sua parte Fc de maneira dependente de FcyRIIa ou dependente de FcyRI; e isso leva a adesão (Immunol. Lett., 108: 52-61, 2007). O uso de anticorpos compreenden- do uma região Fc da presente invenção para esses anticorpos pode inibir a ligação dependente de FcYRIIa e suprimir a adesão de monóci- tos por sinais inibitórios mediados por FcYRIIb.
[00400] Aqui, os polipeptídios da presente invenção acima descritos são utilizáveis como um ingrediente ativo em agentes terapêuticos ou agentes preventivos para câncer. Conforme acima descrito, sabe-se que a intensificação da ligação a FcYRIIb intensifica a atividade ago- nista de um anticorpo agonista, e intensifica o efeito antitumoral do anticorpo. Consequentemente, anticorpos agonistas que usam a região Fc da presente invenção são utilizáveis para o tratamento ou prevenção de câncer. A região Fc da presente invenção intensifica a atividade agonista de anticorpos agonistas contra receptores da família de receptores de TNF, como Aliases, CD120a, CD120b, receptor de Linfoto- xina β, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, Oste- oprotegerina, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, receptor do fator de crescimento de nervos, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25 e receptor de Ectodisplasina A2. Além disso, a atividade agonista de anticorpos agonistas diferentes daqueles acima descritos também é intensificar. Sem estar limitado a estes, câncer inclui câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma de células escamosas do pulmão), câncer do intestino grosso, câncer retal, câncer do cólon, câncer de mama, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer da tireóide, colan- giocarcinoma, câncer peritoneal, mesotelioma, carcinoma de células escamosas, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de bexiga, câncer esofageano, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofarín- geo, tumor de glândula salivar, timoma, câncer de pele, tumor de célu- las basais, melanoma maligno, câncer anal, câncer do pênis, câncer testicular, tumor de Wilms, leucemia mielóide aguda (incluindo mi- eloleucemia aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia pró- mielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda e leucemia mono- cítica aguda), leucemia mielogênica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfática crônica, linfoma de Hodgkin, linfoma não Ho-dgkin (linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crônica, micose fungóide, linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma de células grandes difuso, linfoma de zona marginal, plasmocitoma de leucemia pilo- cítica, linfoma de células T periféricas e leucemia/linfoma de células T do adulto), histiocitose de células de Langerhans, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, tumor do cérebro (incluindo glioma, astrogli-oma, glioblastoma, meningioma e ependimoma), neuroblastoma, reti-noblastoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, angiossarcoma e hemangiopericitoma.
[00401] Além disso, a presente invenção se refere a métodos para o tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias imunológicas, que compreendem a etapa de administração a um sujeito (paciente) de um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção.
[00402] A presente invenção também apresenta kits para uso nos métodos terapêuticos ou métodos preventivos da presente invenção, que compreende pelo menos um polipeptídio da presente invenção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. Além disso, veículos farmaceuticamente aceitáveis, meios, instruções sobre o método de uso e outros podem ser incluídos no kit. Além disso, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídio da presente in-venção ou um polipeptídio produzido pelos métodos de produção da presente invenção na produção de agentes para o tratamento ou pre- venção de doenças inflamatórias imunológicas. A presente invenção também se refere a polipeptídios da presente invenção ou polipeptí- dios produzidos pelos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos terapêuticos ou métodos preventivos da presente invenção.
[00403] Conforme aqui usado, os códigos de três letras e de uma letra para os respectivos aminoácidos são os seguintes: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Ácido glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
[00404] Todos os documentos da técnica anterior aqui citados são incorporados por referência em sua inteireza.
Exemplos
[00405] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser considerada como estando limitada a eles.
[Exemplo 1] Análise exaustiva da ligação de variantes de Fc a FCYR
[00406] As mutações foram introduzidas em anticorpos IgG1 para gerar anticorpos que tivessem ligação mediada por Fc diminuída com relação a FcyR ativadora, especificamente ambos os alotipos de FcyRIIa, tipos H e R, assim como ligação aumentada a FcyRIIb com relação a IgG1; e a ligação a cada FcyR foi exaustivamente analisada.
[00407] A região variável (SEQ ID NO: 15) de um anticorpo para glipicano 3 compreendendo a CDR de GpH7, que é um anticorpo anti- glipicano 3 com melhor cinética plasmática apresentado no WO 2009/041062, foi usado como a cadeia H de anticorpo comum. Da mesma forma, para a cadeia L de anticorpo comum, usou-se GpL16- k0 (SEQ ID NO: 16) do anticorpo para glipicano 3 com melhor cinética plasmática apresentado no WO 2009/041062. Além disso, B3 (SEQ ID NO: 17), em que uma mutação K439E foi introduzida em G1d produzido por remoção das Gly e Lys C terminais de IgG1, foi usado como região constante de cadeia H do anticorpo. Essa cadeia H é chamada de GpH7-B3 (SEQ ID NO: 18), e a cadeia L é chamada de GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16).
[00408] Com relação a GpH7-B3, os aminoácidos que são considerados como estando envolvidos na ligação a FcyR e os aminoácidos vizinhos (posições 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300 e 324 a 337, de acordo com a numeração EU) foram respectivamente substituídos por 18 tipos de aminoácidos, excluindo os aminoácidos originais e Cys. Essas variantes de Fc são chamadas de variantes B3. Variantes B3 foram expressas e purificadas usando o método do Exemplo de Referência 1, e a ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R, FcyRIIb e FcyRIIIa) foi exaustivamente avaliada usando o mé- todo do Exemplo de Referência 2.
[00409] As figuras foram produzidas com base nos resultados da análise de interação com cada FCYR pelo método abaixo. O valor da quantidade de ligação a FCYR de cada anticorpo derivado da variante B3 foi dividido pelo valor da quantidade de ligação a FcyR do anticorpo usado para comparação que não tem mutações introduzidas em B3 (um anticorpo com a sequência de uma IgG1 humana de ocorrência natural nas posições 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300 e 324 a 337, de acordo com a numeração EU). O valor obtido pela multiplicação desse valor por 100 foi usado como um indicador da atividade de ligação relativa a FcyR de cada variante. O eixo horizontal mostra o valor da atividade de ligação relativa a FcyRIIb de cada variante, e o eixo vertical mostra o valor da respective atividade de ligação relativa de cada variante com relação a FcyRs ativadoras: FcyRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R e FcyRIIIa (Figuras 1, 2, 3 e 4).
[00410] Conforme mostrado pelas legendas nas Figuras 1 - 4, os resultados mostram que de todas as alterações, quando apenas muta-ções chamadas de mutação A (alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp) e mutação B (alteração produzida por substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu) foram introduzidas, houve um notável aumento da ligação a FcyRIIb e uma notável supressão da ligação a ambos os tipos de FcyRIIa em comparação com antes da introdução.
[Exemplo 2] Análise SPR de variantes que se ligam seletivamente a FcYRIIb
[00411] Com relação à alteração identificada no Exemplo 1 em que Pro na posição 238 (numeração EU) é substituída por Asp, a ligação a cada FcyR foi analisada em detalhes.
[00412] A região variável de IL6R-H (SEQ ID NO: 19), que é a região variável do anticorpo contra o receptor de interleucina 6 humana apresentado no WO 2009/125825, foi usada como a região variável de cadeia H do anticorpo, e IL6R-G1d (SEQ ID NO: 20), que compreende G1d com deleção de Gly e Lys C-terminais de IgG1 humana, foi usada como a região constante de cadeia H do anticorpo na cadeia H da IgG1. Pro na posição 238 (numeração EU) em IL6R-G1d foi substituído por Asp para produzir IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 21). A seguir, Leu na posição 328 (numeração EU) em IL6R-G1d foi substituída por Glu para produzir IL6R-G1d-v2 (SEQ ID NO: 23). Além disso, para comparação, Ser na posição 267 (numeração EU) foi substituída por Glu, e Leu na posição 328 (numeração EU) foi substituída por Phe no IL6R- G1d para produzir IL6R-G1d-v3 (SEQ ID NO: 24) conforme descrito no Documento Não Patente 27. IL6R-L (SEQ ID NO: 22), que é a cadeia L de tocilizumab, foi utilizado como uma cadeia L de anticorpo mútua; e juntamente com cada cadeia H, os anticorpos foram expressados e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Os anticorpos obtidos, que compreendem uma sequência de aminoácidos derivada de IL6R-G1d, IL6R-G1d-v1, IL6R-G1d-v2 ou IL6R-G1d-v3 como a cadeia H do anticorpo, são chamadas de IgG1, IgG1-v1, IgG1- v2 e IgG1-v3, respectivamente.
[00413] A seguir, a análise cinética de interações entre esses anticorpos e FCYR foi realizada usando-se Biacore T100 (GE Healthcare). HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usada como o tampão de operação, e a temperatura de medição foi ajustada em 25°C. Usou-se um chip produzido por imobilização de Proteína A sobre um Chip Sensor Series S CM5 (GE Healthcare) pelo método de acoplamento com amina. Um anticorpo de interesse foi capturado nesse chip para interagir com cada FcyR que havia sido diluída com o tampão de operação, e se mediu a ligação ao anticorpo. Após a medição, o anticorpo capturado no chip foi lavado ao se permitir reação com glicina-HCl a 10 mM, pH 1,5, e o chip foi regenerado e repetidamente usado. Os sensogramas obtidos como resultados de medição foram analisados pelo modelo de ligação 1:1 Langmuir usando o Biacore Evaluation Software para calcular a constante de taxa de ligação ka (L/mol/s) e a constante de taxa de dissociação kd (1/s), e a constante de dissociação KD (mol/L) foi calculada a partir desses valores.
[00414] Dessa vez, como a ligação de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcYRIIa tipo H e a FcYRIIIa era fraca, parâmetros cinéticos como KD não puderam ser calculados pelo método analítico acima mencionado. Com relação a essas interações, os valores de KD foram calculados usando o seguinte modelo de ligação 1:1 descrito no Manual do Software Biaco- re T100 BR1006-48 Edição AE.
[00415] O comportamento de interação de moléculas de acordo com o modelo de ligação 1:1 no Biacore pode ser descrito pela Equação 1 mostrada abaixo. Equação 1
Figure img0001
[00416] Req: um traçado dos níveis de ligação em estado constante contra a concentração de analito
[00417] C: concentração
[00418] RI: contribuição bruta do índice de refração na amostra
[00419] Rmax: capacidade de ligação a analito da superfície
[00420] Quando essa equação é rearranjada, a KD pode ser expressa como Equação 2 mostrada abaixo. Equação 2
Figure img0002
[00421] A KD pode ser calculada substituindo-se pelos valores de Rmax, RI, e C nessa equação. Das atuais condições de medição, podem-se usar RI = 0, C = 2 μMol/L. Além disso, o valor Rmax obtido quando se ajusta globalmente o sensograma obtido como resultado da análise da interação de cada FcYR com IgG1 usando o modelo de li- gação 1:1 Langmuir foi dividido pela quantidade de IgG1 capturada, isso foi multiplicado pela quantidade de IgG1-v1 e IgG1-v2 capturada, e o valor resultante foi usado como Rmax. Esse cálculo se baseia na hipótese de que a quantidade limite de cada FCYR que pode ser ligada por IgG1 permanece inalterada para todas as variantes produzidas por introdução de mutações em IgG1, e o Rmax no momento da medição é proporcional à quantidade de anticorpo ligada no chip no momento da medição. Req foi definido como a quantidade de ligação de cada FcyR a cada variante no chip sensor observada no momento da medição.
[00422] Sob essas condições medição, a quantidade de ligação (Req) de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcyRIIa tipo H era de aproximadamente 2,5 RU e 10 RU, respectivamente, e a quantidade de ligação (Req) de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcyRIIIa era de aproximadamente 2,5 RU e 5 RU, respectivamente. A quantidade de IgG1, IgG1-v1, e IgG1-v2 capturada na análise de interações com FcyRIIa de tipo H era de 452 RU, 469,2 RU, e 444,2 RU, respectivamente, e a quantidade de IgG1, IgG1-v1, e IgG1-v2 capturada na análise de interações com FcyRIIIa era 454,5 RU, 470,8 RU, e 447,1 RU, respectivamente. Os valores de Rmax obtidos do ajuste global de sensogramas obtidos como resultado da análise da interação de IgG1 com FcyRIIa de tipo H e FcyRIIIa usando o modelo de ligação 1:1 Langmuir foram de 69,8 RU e 63,8 RU, respectivamente. Quando esses valores foram usados, os valores de Rmax calculados de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcyRIIa tipo H foram de 72,5 RU e 68,6 RU, respectivamente, e os valores de Rmax calculados de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcyRIIIa foram de 66,0 RU e 62,7 RU, respectivamente. Esses valores foram substituídos na Equação 2 para calcular a KD de IgG1-v1 e IgG1-v2 para FcyRIIa tipo H e FcyRIIIa. Equação 2
Figure img0003
[00423] Os valores de KD de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, e IgG1-v3 para cada FCYR (os valores de KD de cada anticorpo para cada FCYR) são mostrados na Tabela 1, e os valores relativos de KD de IgG1-v1, IgG1-v2, e IgG1-v3 obtidos tomando-se os valores de KD de IgG1 para cada FcyR e dividindo-os pelos valores de KD de IgG1-v1, IgG1-v2, e IgG1-v3 para cada FcyR (os valores relativos de KD de cada anticorpo para cada FcyR) são mostrados na Tabela 2. Tabela 1
Figure img0004
[00424] Na Tabela 1 mostrada acima, "*" significa que o valor de KD foi calculado usando-se a Equação 2 por que a ligação de FcyR a IgG não foi suficientemente observada. Equação 2
Figure img0005
Tabela 2
Figure img0006
[00425] (O valor obtido por divisão do valor de KD de IgG1 para cada FcyR pelo valor de KD de cada anticorpo IgG1 para cada FcyR)
[00426] De acordo com a Tabela 2, quando comparada com a de IgG1, a atividade de ligação de IgG1-v1 estava diminuída 0,047 vezes para FcyRIa, diminuída 0,10 vezes para FcyRIIa tipo R, diminuída 0,014 vezes para FcYRIIa tipo H, diminuída 0,061 vezes para FcYRIIIa, e aumentada 4,8 vezes para FcYRIIb.
[00427] Além disso, de acordo com a Tabela 2, quando comparada com a de IgG1, a atividade de ligação de IgG1-v2 estava diminuída 0,74 vezes para FcYRIa, diminuída 0,41 vezes para FcYRIIa tipo R, diminuída 0,064 vezes para FcYRIIa tipo H, diminuída 0,14 vezes para FcYRIIIa, e aumentada 2,3 vezes para FcYRIIb.
[00428] Mais especificamente, esses resultados demonstraram que IgG1-v1 com uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e IgG1-v2 com uma alteração de substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu têm as propriedades de enfraquecer a ligação a todas FcYRs ativadoras incluindo ambos os alotipos de FcYRIIa, enquanto intensifica a ligação a FcYRIIb que é uma FcYR inibitória.
[00429] A seguir, a seletividade da variante obtida para FcYRIIb foi avaliada usando-se a razão de atividade de ligação a FcYRIIb para a atividade de ligação com relação a tipo R ou tipo H de FcYRIIa como o indicador. Especificamente, I/A(R) ou I/A(H), que é um valor obtido por divisão so valor de KD para FcYRIIa tipo R ou tipo H pelo valor de KD para FcYRIIb, foi usada como um indicador para a seletividade de FcYRIIb com relação a cada FcYRIIa. Esse indicador tem um valor maior quando o valor de KD para FcYRIIb se torna menor ou quando o valor de KD para FcYRIIa se torna maior. Isto é, uma variante que mostra um valor maior mostra uma atividade de ligação aumentada para FcYRIIb com relação a FcYRIIa. Esses indicadores são resumidos na Tabela 3 para cada variante. Tabela 3
Figure img0007
[00430] De acordo com os resultados da Tabela 3, em comparação com IgG1, IgG1-v3 que foi produzido por aplicação da tecnologia existente mostrou um valor de 1/A(H) maior do que o de IgG1 e uma maior seletividade para FcYRIIb, mas um valor de 1/A(R) menor do que o de IgG1 e uma melhor seletividade para FcYRIIb. Por outro lado, IgG1-v1 e IgG1-v2 encontradas nos Exemplos têm valores de I/A(R) e I/A(H) maiores do que os de IgG1, e melhor seletividade para FcYRIIb com relação a ambos os alotipos de FcYRIIa.
[00431] Até agora, as alterações com essas propriedades não haviam sido relatadas, e elas são, de fato, muito raras, conforme mostrado nas Figuras 1, 2, 3 e 4. Alterações produzidas por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu são muito úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças inflamatórias imunoló- gicas e outros.
[00432] Além disso, a Tabela 2 mostra que IgG1-v3 descrita no Do-cumento Não Patente 27 certamente mostra uma ligação 408 vezes maior a FcYRIIb, ao passo que a ligação a FcYRIIa tipo H está diminuída 0,51 vezes, e a ligação a FcYRIIa tipo R está aumentada 522 vezes. De acordo com esses resultados, como IgG1-v1 e IgG1-v2 suprimem sua ligação a ambas FcYRIIa tipos R e H, e aumentam sua ligação a FcYRIIb, elas são consideradas variantes que se ligam com maior se-letividade para FcYRIIb em comparação com IgG1-v3. Especificamente, alterações produzidas por substituição de Pro na posição 238 (nu-meração EU) por Asp ou substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu são muito úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças inflamatórias imunológicas e outros. [Exemplo 3] Efeitos da combinação de alterações de ligação seletivas para FcYRIIb com outras substituições de aminoácidos na região Fc
[00433] Um aumento adicional da seletividade para FcYRIIb foi tentada com base na variante que tem melhor seletividade para FcYRIIb e tem a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp encontrada nos Exemplos 1 e 2.
[00434] Em primeiro lugar, em IL6R-G1d_v1 (SEQ ID NO: 21), produzida por introdução em IL6R-G1d da alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, a substituição de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu conforme descrito no Exemplo 2, que aumenta a seletividade para FcYRIIb, foi introduzida para produzir a variante IL6R-G1d-v4 (SEQ ID NO: 25). Essa foi combinada com IL6R-L (SEQ ID NO: 22) e preparada de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. O anticorpo obtido com a sequência de aminoácidos derivada de IL6R-G1d-v4 como a cadeia H do anticorpo foi chamado de IgG1-v4. As atividades de ligação de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, e IgG1-v4 a FcYRIIb foram avaliadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2, e os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4
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[00435] Dos resultados da Tabela 4, como L328E melhora a atividade de ligação a FcYRIIb em 2,3 vezes em comparação com IgG1, sua combinação com P238D, que também melhora a atividade de ligação a FcYRIIb em 4,8 vezes em comparação com IgG1, foi prevista como aumentando ainda mais o grau de melhora da atividade de ligação a FcYRIIb; entretanto, na realidade, a atividade de ligação a FcYRIIb da variante contendo uma combinação dessas alterações estava diminuída 0,47 vezes em comparação com a de IgG1. Esse resultado é um efeito que não poderia ter sido previsto a partir das respectivas alterações.
[00436] Da mesma forma, em IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 21), produzida por introdução em IL6R-G1d the alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, as substituições de Ser na posição 267 (numeração EU) por Glu e de Leu na posição 328 (numeração EU) por Phe conforme descrito no Exemplo 2, que melhoram a atividade de ligação a FcYRIIb, foram introduzidas, e a variante IL6R-G1d-v5 (SEQ ID NO: 26) foi preparada de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. O anticorpo obtido com a sequência de aminoácidos derivada de IL6R-G1d-v5 como a cadeia H do anticorpo foi chamado de IgG1-v5. As atividades de ligação a FcYRIIb de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3, e IgG1-v5 foram avaliadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2, e os resultados são mostrados na Tabela 5.
[00437] S267E/L328F, que tinha um efeito intensificador sobre FcYRIIb no Exemplo 2, foi introduzida na variante P238D, e suas ativi-dades de ligação a FcYRIIb antes e depois da introdução dessa alteração foram avaliadas. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Tabela 5
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[00438] Dos resultados da Tabela 5, como S267E/L328F melhora a atividade de ligação a FcYRIIb em 408 vezes em comparação com IgG1, sua combinação com P238D, que também melhora a atividade de ligação a FcYRIIb em 4,8 vezes em comparação com IgG1, foi prevista como aumentando ainda mais o grau de melhora da atividade de ligação a FcYRIIb; entretanto, na realidade, de maneira similar ao exemplo anterior, a atividade de ligação a FcYRIIb da variante conten- do uma combinação dessas alterações foi melhorada apenas 12 vezes ou quase em comparação com a de IgG1. Esse resultado também é um efeito que não poderia ter sido previsto a partir dos efeitos das res-pectivas alterações.
[00439] Esses resultados mostraram que, embora a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp apenas melhore a atividade de ligação a FcYRIIb, o efeito não é exibido quando é combinada com outras alterações que melhorem a atividade de ligação a FcYRIIb. Uma razão para isso pode ser que a estrutura na interface de interação entre Fc e FcYR é alterada pela introdução da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, e os efeitos de alterações observadas no anticorpo de ocorrência natural não são mais refletidas nos resultados. Portanto, considerou-se que era extremamente difícil criar uma Fc com excelente seletividade para FcYRIIb usando uma Fc compreendendo substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp como um molde, pois a informação sobre efeitos de alterações obtidas com anticorpos de ocorrência natural não podia ser aplicada. [Exemplo 4] Análise exaustiva da ligação a FcYRIIb de variantes intro-duzidas com uma alteração na parte de articulação além de uma alte-ração P238D
[00440] Conforme mostrado no Exemplo 3, em uma Fc produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp em uma IgG1 humana de ocorrência natural, um efeito combinatorial antecipado, mesmo por sua combinação com outra alteração prevista para aumentar ainda mais a ligação a FcYRIIb. Consequentemente, com base na Fc alterada produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp, o exame foi realizado por introdução exaustiva de alterações na Fc para encontrar variantes que aumentem ainda mais a ligação a FcYRIIb. Para a cadeia H do anticorpo, IL6R-F11 (SEQ ID NO: 27) foi produzida por introdução de uma alteração de substituição de Met na posição 252 (numeração EU) por Tyr e uma alteração de substituição de Asn na posição 434 (numeração EU) por Tyr em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 20), e IL6R-F652 (SEQ ID NO: 28) foi preparada por introdução de uma alteração adicional de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp. Plasmídios de expressão contendo uma sequência de cadeia H do anticorpo foram preparados para cada uma das sequências de cadeia H do anticorpo produzidas por substituição da região próxima ao resíduo na posição 238 (numeração EU) (posições 234 a 237, e 239 (numeração EU)) em IL6R-F652, cada uma com 18 aminoácidos excluindo os aminoácidos originais e Cys. IL6R-L (SEQ ID NO: 22) foi utilizada como a cadeia L de anticorpo comum para todos os anticorpos. Essas variantes foram expressas, purificadas e expressas pelo método do Exemplo de Referência 1. Essas variantes de Fc são chamadas de variantes PD. Interações de cada variante PD com FcYRIIa tipo R e FcYRIIb foram exaustivamente avaliadas pelo método do Exemplo de Referência 2.
[00441] Com relação aos resultados da análise da interação com as respectivas FcYRs, produziu-se uma figura de acordo com o seguinte método. O valor obtido por divisão do valor para a quantidade de ligação de cada variante PD a cada FcYR pelo valor para a quantidade de ligação a FcYR do anticorpo pré-alterado que é usado como o controle (IL6R-F652/IL6R-L, que tem uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e, então, multiplicação do resultado por 100, foi usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante PD a cada FcYR. O eixo horizontal mostra os valores relativos da atividade de ligação a FcYRIIb de cada variante PD, e o eixo vertical mostra os valores relativos da atividade de ligação a FcYRIIa tipo R values de cada variante PD (Fig. 6).
[00442] Como resultado, foram encontrados onze tipos de alterações que têm os efeitos de aumentar a ligação a FcYRIIb e manter ou aumentar a ligação a FcYRIIa tipo R em comparação com o anticorpo antes da introdução de alterações. As atividades dessas onze variantes de ligação a FcYRIIb e FcYRIIa R estão resumidas na Tabela 6. Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 27). Tabela 6
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[00443] A Fig. 7 mostra os valores relativos para a atividade de liga- ção a FcYRIIb obtida por introdução adicional dessas onze alterações em uma variante portadora da alteração P238D, e os valores relativos para a atividade de ligação a FcYRIIb obtida por introdução dessas alterações em uma Fc que não contém a alteração P238D no Exemplo 1. Essas onze alterações aumentaram a quantidade de ligação a FcYRIIb em comparação com antes da introdução quando elas foram adicionalmente introduzidas na variante P238D, mas, ao contrário, o efeito de redução da ligação a FcYRIIb foi observado para oito dessas alterações, exceto G237F, G237W e S239D, quando foram introduzidas na variante que não contém P238D (GpH7-B3/GpL16-k0) usada no Exemplo 1. O Exemplo 3 e esses resultados mostraram que, a partir dos efeitos de introdução de alterações em uma IgG1 de ocorrência natural, é difícil predizer os efeitos da introdução das mesmas alterações na variante contendo uma Fc com a alteração P238D. Em outras palavras, não teria sido possível descobrir essas oito alterações aqui identificadas sem esta investigação.
[00444] Os resultados da medição dos valores de KD das variantes indicadas na Tabela 6 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb, e FcYRIIIaV pelo método do Exemplo de Referência 2 estão resumidos na Tabela 7. Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 27). O molde usado para a produção de IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Além disso, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na Tabela mostram, respec-tivamente, o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaR pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb, e o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaH pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) do polipeptídio de origem/KD(IIb) do polipeptídio alterado se refere a um valor obtido por divisão o valor de KD do polipeptídio de origem para FcYRIIb pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Além disso, Tabela 7 mostra valores de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRII- aR e FcYRIIaH de cada variante/valores de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem. Aqui, polipeptídio de origem se refere a uma variante que tem IL6R-F11 (SEQ ID NO: 27) como a cadeia H. Determinou-se que, devido à fraca ligação de FcYR a IgG, era impossível analisar com precisão por análise cinética, e, portanto, as células preenchidas por cinza na Tabela 7 mostram valores calculados pelo uso da Equação 2 do Exemplo de Referência 2. Equação 2
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[00445] A Tabela 7 mostra que todas as variantes melhoraram sua afinidade para FcYRIIb em comparação com IL6R-F11, e a faixa de melhora era de 1,9 vezes a 5,0 vezes. A razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb, e a razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representam uma atividade de ligação a FcYRIIb relativa à atividade de ligação a FcYRIIaR e atividade de ligação a FcYRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcYRIIb, e um valor maior indica uma maior seletividade de ligação para FcYRIIb. Para o polipeptídio de origem IL6R-F11/IL6R-L, a razão de valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb e a razão de valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb são ambas de 0,7, e, portanto, todas as variantes na Tabela 7 mostraram melhora de seletividade de ligação para FcYRIIb em comparação com o polipeptídio de origem. Quando o valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante/valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou reduzida em comparação com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem. Como esse valor era de 0,7 a 5,0 para as variantes obtidas dessa vez, pode-se dizer que a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH das variantes obtidas dessa vez era quase igual ou menor em comparação com o polipeptídio de origem. Esses resul- tados mostraram que, em comparação com o polipeptídio de origem, as variantes obtidas dessa vez têm atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H mantidas ou diminuídas, e melhor seletividade para FcYRIIb. Além disso, em comparação com IL6R-F11, todas as variantes tinham menor afinidade para FcYRIa e FcYRIIIaV. Tabela 7 S
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[Exemplo 5] Análise cristalográfica por raios X de um complexo formado entre uma Fc contendo P238D e uma região extracelular FcYRIIb
[00446] Conforme indicado anteriormente no Exemplo 3, mesmo que uma alteração que melhore a atividade de ligação a FcYRIIb ou a seletividade para FcYRIIb seja introduzida em uma Fc contendo P238D, não se encontrou que a atividade de ligação a FcYRIIb diminuísse, e a razão para isso pode ser que a estrutura na interface de interação entre Fc e FcYRIIb é alterada devido à introdução de P238D. Consequentemente, para descobrir a razão desse fenômeno, a estrutura tridimensional do complexo formado entre uma IgG1 Fc contendo a mutação P238D (daqui por diante, Fc(P238D)) e a região extracelu- lar FcYRIIb foi elucidada por anállise cristalográfica por raios X, e a estrutura tridimensional e o modo de ligação foram comparados com os do complexo formado entre a Fc de uma IgG1 de ocorrência natural (daqui por diante, Fc(WT)) e a região extracelular FcYRIIb. Foram feitos muitos relatos da estrutura tridimensional de um complexo formado entre uma Fc e uma região extracelular FcYR; e as estruturas tridimensionais do complexo Fc(WT)/região extracelular FcYRIIIb (Nature, 2000, 400: 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276: 16469-16477), do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108: 12669-126674), e do complexo Fc(WT)/região extra- celular FcYRIIa (J. Imunol. 2011, 187: 3208-3217) foram analisadas. Embora a estrutura tridimensional do complexo de Fc(WT)/região ex- tracelular FcYRIIb não tenha sido analisada, a estrutura tridimensional de um complexo formado com Fc(WT) é conhecida para FcYRIIa, e as regiões extracelulares de FcYRIIa e FcYRIIb correspondência 93% na sequência de aminoácidos e têm uma homologia muito elevada. Assim, a estrutura tridimensional do complexo de Fc(WT)/região extrace- lular FcYRIIb foi prevista por modelagem usando a estrutura cristalina do complexo Fc(WT)/região extracelular FcYRIIa.
[00447] A estrutura tridimensional do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb foi determinada por anállise cristalográfica por raios X a uma resolução de 2,6 Â. A estrutura obtida como resultado dessa análise é mostrada na Fig. 8. A região extracelu- lar FcYRIIb está ligada entre dois domínios CH2 de Fc, e é similar às estruturas tridimensionais de complexos formados entre Fc(WT) e a respectiva região extracelular de FcYRIIIa, FcYRIIIb, ou FcYRIIa até agora analisada.
[00448] A seguir, para comparação detalhada, a estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e a estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb foram superpostas pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα com relação à região extracelular FcYRIIb e o domínio CH2 A de Fc (Fig. 9). Nesse caso, o grau de superposição entre os domínios CH2 B de Fc não era satisfatório, e foram encontradas diferenças conformacionais nessa parte. Além disso, usando a estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extra- celular FcYRIIb e a estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb, pares de átomos que têm uma distância de 3,7 Â ou menos entre a região extracelular FcYRIIb e domínio CH2 B de Fc foram extraídos e comparados para se observarem as diferentes de interações interatômicas entre FcYRIIb e o domínio CH2 B de Fc em Fc(WT) e Fc(P238D). Conforme mostrado na Tabela 8, as interações interatômicas entre o domínio CH2 B de Fc e FcYRIIb em Fc(P238D) e Fc(WT) não correspondem. Tabela 8
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[00449] Além disso, a estrutura cristalina por raios X do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e a estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb foram superpostas pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα com relação ao único domínio CH2 A de Fc ou ao único domínio CH2 B de Fc, e as estruturas detalhadas próximas a P238D foram comparadas. A localização do resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU), que é uma posição de introdução de mutação, está alterada entre Fc(P238D) e Fc(WT), pode-se ver que, juntamente com essa alteração, a estrutura de alça próxima que continua a partir dessa região de articulação está alterada entre Fc(P238D) e Fc(WT) (Fig. 10). Originalmente em Fc(WT), Pro na posição 238 (numeração EU) está presente no lado interno da proteína, e forma um núcleo hi- drofóbico com os resíduos vizinhos. Entretanto, quando esse resíduo é alterado para um Asp carregado e muito hidrofílico, a presença no mesmo núcleo hidrofóbico causaria uma desvantagem energética em termos de dessolvatação. Consequentemente, em Fc(P238D), para cancelar essa situação energeticamente desvantajosa, o resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU) altera sua orientação para ficar voltado para o lado do solvente, e isso pode ter causado essa alteração na estrutura de alça próxima. Além disso, como essa alça continua a partir da região de articulação reticulada por uma ligação S- S, sua alteração estrutural não se limitará a uma alteração local e afetará o posicionamento relativo do domínio CH2 A e domínio CH2 B de Fc. Como resultado, as interações interatômicas entre FcYRIIb e o domínio CH2 B de Fc foram alteradas. Consequentemente, os efeitos previstos não podiam ser observados quando alterações que melhoram a seletividade e atividade de ligação com relação FcYRIIb em uma IgG de ocorrência natural foram combinadas com uma Fc contendo a alteração P238D.
[00450] Além disso, como resultado de alterações estruturais devidas à introdução de P238D no domínio CH2 A de Fc, foi encontrada uma ponte de hidrogênio entre a cadeia principal de Gly na posição adjacente 237 (numeração EU) e Tyr na posição 160 em FcYRIIb (Fig. 11). O resíduo em FcYRIIa que corresponde a esse Tyr 160 é Phe; e, quando a ligação é com FcYRIIa, essa ponte hidrogênio não se forma. O aminoácido na posição 160 é uma das poucas diferenças entre FcYRIIa e FcYRIIb na interface de interação com Fc; persume-se que a presença dessa ponte hidrogênio, que é específica para FcYRIIb, tenha levado à melhora da atividade de ligação a FcYRIIb e diminuição da atividade de ligação a FcYRIIa em Fc(P238D), e melhora de sua seletividade. Além disso, no domínio CH2 B de Fc, observa-se uma interação eletrostática entre Asp na posição 270 (numeração EU) e Arg na posição 131 em FcYRIIb (Fig. 12). Em FcYRIIa tipo H, que é um dos alotipos de FcYRIIa, o resíduo correspondente é His e, consequentemente, não pode formar essa interação eletrostática. Isso pode explicar porque a atividade de ligação a Fc(P238D) está diminuída em FcYRIIa tipo H em comparação com FcYRIIa tipo R. Observações baseadas nesses resultados de análise cristalográfica por raios X mostraram que a alteração da estrutura de alça ao lado de P238D devido à introdução de P238D e a alteração concomitante no posicionamento relativo do domínio causa formação de novas interações não encontradas na IgG de ocorrência natural, e isso leva a um perfil de ligação seletivo de variantes P238D para FcYRIIb. Expressão e Purificação de Fc(P238D)
[00451] Uma Fc contendo a alteração P238D foi preparada da seguinte maneira. Em primeiro lugar, Cys na posição 220 (numeração EU) de hIL6R-IgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) foi substituído por Ser. Então, a sequência genética de Fc(P238D) de Glu na posição 236 (numeração EU) até seu C terminal foi clonada por PCR. Usando essa se- quência genética clonada, a produção de vetores de expressão e a expressão e purificação de Fc(P238D) foram realizadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Cys na posição 220 (numeração EU) forma uma ligação dissulfeto com Cys da cadeia L em IgG1 em geral. A cadeia L não é co-expressada quando apenas Fc é preparada e, consequentemente, esse resíduo foi substituído por Ser para evitar a formação de ligações dissulfeto desnecessárias. Expressão e purificação da região extracelular FcYRIIb
[00452] Foi preparada de acordo com o método do Exemplo de Re-ferência 2. Purificação do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb
[00453] A 2 mg da amostra de região extracelular FcYRIIb obtida para cristalização, foram adicionados 0,29 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622) expressado por e purificado de Escherichia coli como uma proteína de fusão glutationa S-transferase. Deixou- se permanecer à temperatura ambiente durante três dias em tampão Bis-Tris a 0,1 M a pH 6,5, e o oligossacarídeo ligado a N foi clivado, deixando a N-acetilglucosamina diretamente ligada a Asn. A seguir, essa amostra de domínio extracelular FcYRIIb submetida ao tratamento de clivagem de carboidrato foi concentrada por ultrafiltração com 5000 MWCO e purificada por cromatografia de filtração em gel (Su- perdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPS a 20 mM a pH 7,5 contendo 0,05 M de NaCl. Além disso, à fração de região ex- tracelular FcYRIIb de carboidrato clivado obtida, adicionou-se Fc(P238D) de modo que a razão molar da região extracelular FcYRIIb estivesse presente em um ligeiro excesso, e, após concentração por ultrafiltração com 10.000 MWCO, uma amostra do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb foi obtida mediante purificação por cromatografia de filtração em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPS a 20 mM a pH 7,5 contendo 0,05 M de NaCl. Cristalização do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb
[00454] Uma amostra do complexo de Fc(P238D)/região extracelu- lar FcYRIIb foi concentrada a aproximadamente 10 mg/mL por ultrafil- tração com 10.000 MWCO, e a cristalização foi realizada pelo método de difusão de vapor de gota assentada. Usou-se Hydra II Plus One (MATRIX) para a cristalização; e, para uma solução de estoque contendo Bis-Tris a 100 mM pH 6,5, 17% de PEG3350, 0,2 M de acetato de amônio e 2,7% (p/v) de D-Galactose, produziu-se uma gota de cristalização por misturação a uma razão de solução de estoque : amostra de cristalização = 0,2 μL : 0,2 μL, e, após lacrar, deixou-se permanecer a 20°C, e cristais do tipo placa fina foram obtidos com sucesso. Medição dos dados de difração de raios X de um complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb crystal
[00455] Um dos cristais únicos obtidos do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb foi embebido em uma solução de Bis-Tris a 100 mM pH 6,5, 20% de PEG3350, acetato de amônio, 2,7% (p/v) de D-Galactose, 22,5% (v/v) de etileno glicol. O cristal foi pescado da solução com um alfinete com um pequeno laço de náilon fixado e congelado em nitrogênio líquido; e, então, os dados de difra- ção de raios X foram medidos na instalação de radiação de sincrotron Photon Factory BL-1A na Organização de Pesquisa em Acelerador de Alta Energia. Durante a medição, o cristal foi cosntantemente colocado em uma corrente de nitrogênio a -178°C para mantê-lo em um estado congelado, e um total de 225 imagens de difração de raios X foram coletadas com um detector Quantum 270 CCD (ADSC) fixado a uma linha de feixe com rotação do cristal 0,8° de cada vez. A determinação de parâmetros da célula, a indexação dos pontos de difração e o processamento dos dados de difração das imagens de difração obtidas foram realizadas com o programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite); e, final-mente, obtiveram-se dados de intensidade de difração até 2,46 Â de resolução. O cristal pertence ao grupo espacial P21, e tem os seguintes parâmetros de célula; a = 48,85 Â, b = 76,01 Â, c = 115,09 Â, α = 90°, β = 100,70°, Y = 90°. Análise cristalográfica por raios X do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb
[00456] A estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região ex- tracelular FcYRIIb foi determinada pelo método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP4 Software Suite). Do tamanho da rede cristalina obtida e do peso molecular do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb, previu-se um número de complexos na unidade assimétrica de um. Das coordenadas estruturais do código PDB: 3SGJ que é a estrutura cristalina do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIIa, as partes de resíduos de aminoá- cidos da cadeia A posições 239-340 e da cadeia B posições 239-340 foram tomadas como coordenadas separadas e foram respectivamente usadas como modelos para a busca dos domínios CH2 de Fc. As partes de resíduos de aminoácidos da cadeia A posições 341-444 e da cadeia B posições 341-443 foram tomadas como um único conjunto de coordenadas das mesmas coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ; e essa foi usada como um modelo para a busca de domínios CH3 de Fc. Finalmente, das coordenadas estruturais de código PDB: 2FCB que é a estrutura cristalina do região extracelular FcYRIIb, as partes de resíduos de aminoácidos da cadeia A posições 6-178 foram tomadas e usadas como um modelo para a busca da região extracelu- lar FcYRIIb. A orientação e posição de cada modelo de busca na rede cristalina foram determinadas na ordem de domínio CH3 de Fc, região extracelular FcYRIIb e domínio CH2 de Fc, com base na função de rotação e na função de translação, para se obter o modelo inicial para a estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb. Quando um refinamento de corpo rígido que move os dois domínios CH2 de Fc, os dois domínios CH3 de Fc e a região extrace- lular FcYRIIb foi realizado no modelo inicial obtido, o fator de confiabili-dade cristalográfica, valor R, de tornou 40,4%, e o valor de R Livre se tornou 41,9% para dados de intensidade de difração de 25 Â a 3,0 Â nesse ponto. Além disso, o refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite), e a revisão do modelo para observar os mapas de densidade eletrônica cujo coeficiente tem 2Fo-Fc ou Fo- Fc, que são calculados com base no fator estrutural experimentalmente determinado Fo, no fator estrutural calculado Fc e na fase calculada usando o modelo, foram realizados pelo programa Coot (Paul Emsley), e o refinamento do modelo foi realizado por repetição dessas etapas. Finalmente, como resultado da incorporação de moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade eletrônica que usam 2Fo- Fc ou Fo-Fc como o coeficiente e seguindo o refinamento, o fator de confiabilidade cristalográfica, valores R, e o valor de R Livre do modelo contendo 4.846 átomos não hidrogênio se tornaram 23,7% e 27,6% para 24.291 dados de intensidade de difração de 25 Â a 2,6 Â de resolução, respectivamente. Produção de uma estrutura de modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb
[00457] Com base nas coordenadas estruturais de código PDB: 3RY6 que é a estrutura cristalina do complexo de Fc(WT)/região extra- celular FcYRIIa, usou-se a função Build Mutants do programa Discovery Studio 3.1 (Accelrys) para introduzir mutações que correspondessem à sequência de aminoácidos de FcYRIIb em FcYRIIa nessas coordenadas estruturais. Nesse caso, o Nível de Otimização foi ajustado em Alto, o Raio de Corte foi ajustado em 4,5, cinco modelos foram gerados, e aquele com a melhor contagem de energia dentre eles foi empregado como a estrutura de modelo para o complexo de Fc(WT)/região extracelular FcYRIIb. [Exemplo 6] Análise da ligação a FCYR de variantes de Fc cujos sítios de alteração foram determinados com base nas estruturas cristalinas.
[00458] Com base nos resultados da análise cristalográfica por raios X no complexo formado entre Fc(P238D) e a região extracelular FcYRIIb obtido no Exemplo 5, foram examindas alterações exaustivas foram introduzidas em sítios na Fc alterada com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp que foram previstos como afetando a interação com FcYRIIb, (resíduos das posições 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332, e 334 (numeração EU)) e variantes com uma combinação de alterações que intensifica a ligação a FcYRIIb.
[00459] IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40) foi produzida por introdução em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 20) produzida no Exemplo 2 da alteração produzida por substituição de Lys na posição 439 (numeração EU) por Glu. A seguir, IL6R-BF648 (SEQ ID NO: 41) foi produzida por introdução em IL6R-B3 da alteração produzida por substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 22) foi utilizada como a cadeia L de anticorpo comum para todos os anticorpos. Essas variantes de anticorpos foram expressadas e purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1, e a ligação a cada uma das FcYRs (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb, e FcYRIIIa tipo V) foi exaustivamente avaliada pelo método do Exemplo de Referência 2.
[00460] Produziu-se uma figura de acordo com o seguinte método para os resultados da análise das interações com as respectivas FcYRs. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo de controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L com Pro na posição 238 (numeração EU) substituída por Asp) a cada FCYR, e o obtido foi, então, multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a cada FcyR. O eixo horizontal mostra o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a FcyRIIb, e o eixo vertical mostra o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a FcyRIIa tipo R (Fig. 13).
[00461] Conforme mostrado nas Fig. 13, os resultados mostram que de todas as alterações, 24 tipos de alterações foram encontradas como possuindo um efeito de manutenção ou intensificação da ligação a FcyRIIb em comparação com o anticorpo pré-alterado. A ligação dessas variantes a cada uma das FcyRs é mostrada na Tabela 9. Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40). O molde usado para a produção de IL6R-B3, IL6R- G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*).
Figure img0016
[00462] Os resultados da medição dos valores de KD das variantes mostradas na Tabela 9 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb e FcYRIIIa tipo V pelo método do Exemplo de Referência 2 estão resu-midos na Tabela 10. Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração intro-duzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40). O molde usado para a produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Além disso, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na Tabela representam, respectivamente, o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaR pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb, e o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaH pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) do polipeptídio de origem/KD(IIb) do polipeptídio alterado se refere ao valor obtido por divisão do valor de KD do polipeptídio de origem para FcYRIIb pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Além disso, o valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de cada variante/valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem são mostrados na Tabela 10. Aqui, polipeptídio de origem se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40) como a cadeia H. Determinou- se que devido à fraca ligação de FcYR a IgG, era impossível analisar com precisão por análise cinética, e, portanto, as células preenchidas por cinza na Tabela 10 mostram valores calculados pelo uso da Equação 2 do Exemplo de Referência 2. Equação 2
Figure img0017
[00463] A Tabela 10 mostra que, em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram melhora de afinidade para FcYRIIb, e a faixa de melhora era de 2,1 vezes a 9,7 vezes. A razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb e a razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representam uma atividade de ligação a FcYRIIb relativa à atividade de ligação a FcYRIIaR e à ativi-dade de ligação a FcYRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcYRIIb, e um valor maior indica uma maior seletividade de ligação para FcYRIIb. Como a razão de valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb e a razão de valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb no polipeptídio de origem IL6R-B3/IL6R-L eram de 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes na Tabela 10 mostraram melhora de seletividade de ligação para FcYRIIb em comparação com o polipeptídio de origem. Quando o valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante/valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou diminuída em comparação com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do poli- peptídio de origem. Como esse valor era de 4,6 a 34,0 para as variantes obtidas dessa vez, pode-se dizer que, em comparação com o poli- peptídio de origem, as variantes obtidas dessa vez tinham ligação reduzida pelas mais fortes das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH. Esses resultados mostraram que, em comparação com o polipeptídio de origem, as variantes obtidas dessa vez têm atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H mantidas ou diminuídas, atividade de ligação a FcYRIIb aumentada e melhor seletividade para FcYRIIb. Além disso, em comparação com IL6R-B3, todas as variantes tinham menor afinidade para FcYRIa e FcYRIIIaV. Tabela 10
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[00464] Com relação às variantes promissoras dentre as variantes de combinação obtidas, os fatores que levam a seus efeitos foram es-tudados usando-se a estrutura cristalina. A Fig. 14 mostra a estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb. Nessa figura, a cadeia H posicionada no lado esquerdo é cadeia A de Fc, e a cadeia H posicionada no lado direito é cadeia B de Fc. Aqui, pode-se ver que o sítio na posição 233 (numeração EU) na cadeia A de Fc está localizado próximo a Lys na posição 113 (numeração EU) de FcYRIIb. Entretanto, nessa estrutura cristalina, a cadeia colateral E233 está em uma condição de mobilidade consideravelmente maior, e sua densidade eletrônica não é bem observada. Consequentemente, a alteração produzida por substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp leva a uma diminuição no grau de liberdade da cadeia colateral, pois a cadeia colateral se torna um carbono mais curta. Como resultado, a perda de entropia quando se forma uma interação com Lys na posição 113 (numeração EU) de FcYRIIb pode ser diminuída, e, con-sequentemente, especula-se que isso contribua para uma melhora da energia livre de ligação.
[00465] Da mesma forma, a Fig. 15 mostra o ambiente próximo ao sítio na posição 330 (numeração EU) na estrutura do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb. Essa figura mostra que o am-biente em torno do sítio na posição 330 (numeração EU) de cadeia A de Fc de Fc (P238D) é um ambiente hidrofílico composto por Ser na posição 85, Glu na posição 86, Lys na posição 163 e outros (numeração EU) de FcYRIIb. Consequentemente, especula-se que a alteração produzida por substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys ou Arg contribui para o fortalecimento da interação com Ser na posição 85 (numeração EU) ou Glu na posição 86 (numeração EU) em FcYRIIb.
[00466] A Fig. 16 representa as estruturas de Pro na posição 271 (numeração EU) da cadeia B de Fc após superposição das estruturas cristalinas do complexo de Fc(P238D)/região extracelular FcYRIIb e do complexo de região extracelular Fc(WT)/FcYRIIIa pelo ajuste de mínimos quadrados baseado nas distâncias dos pares de átomos Cα com relação à cadeia B de Fc. Essas duas estruturas correspondem bem, mas têm diferentes estruturas tridimensionais de Pro na posição 271 (numeração EU). Quando a fraca densidade eletrônica em torno dessa área na estrutura cristalina do complexo de Fc(P238D)/região extrace- lular FcYRIIb também é levada em consideração, sugere-se que há a possibilidade que Pro na posição 271 (numeração EU) em Fc(P238D)/FcYRIIb cause uma grande deformação na estrutura, per-turbando, dessa forma, a estrutura de alça para atingir uma estrutura ótima. Consequentemente, a alteração produzida por substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly dá flexibilidade a essa estrutura de alça, e se especula que contribua para a intensificação da ligação por redução da barreira energética quando permite que uma estrutura ótima se forme durante a interação com FcYRIIb.
[Exemplo 7] Exame do efeito combinatorial de alterações que intensifi-cam a ligação a FcYRIIb quando combinadas com P238D.
[00467] Das alterações obtidas nos Exemplos 4 e 6, aquelas que intensificaram a ligação a FcYRIIb ou mantiveram a ligação a FcYRIIb e mostraram efeitos de superssão da ligação a outras FcYRs foram combinadas entre si, e seus efeitos foram examinados.
[00468] As alterações particularmente boas foram selecionadas das Tabelas 6 e 9 e foram combinadas e introduzidas na cadeia H de anti-corpo IL6R-BF648 de maneira similar ao método do Exemplo 6. IL6R-L foi utilizada como a cadeia L de anticorpo comum para todos os anticorpos, os anticorpos foram expressados e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1, e a ligação a cada uma das FcYRs (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb e FcYRIIIa tipo V) foi exaustivamente avaliada pelo método do Exemplo de Referência 2.
[00469] As atividades de ligação relativas foram calculadas para os resultados da análise de interações com as respectivas FCYRS de acordo com o seguinte método. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcyR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo de controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp) a cada FcyR, e multiplicado por 100; e, então, o valor foi usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a cada FcyR. O eixo horizontal mostra o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a FcyRIIb, e o eixo vertical mostra o valor de atividade de ligação relativa de cada variante a FcyRIIa tipo R (Tabela 11).
[00470] Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40). O molde usado para a produção de IL6R- B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Tabela 11
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[00471] Os resultados da medição dos valores de KD das variantes mostradas na Tabela 11 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb e FcYRIIIa tipo V pelo método do Exemplo de Referência 2 estão resu-midos na Tabela 12. Na Tabela, SEQ ID NO se refere à SEQ ID NO da cadeia H da variante avaliada, e alteração se refere à alteração intro-duzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40). O molde usado para a produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L é indicado com um asterisco (*). Além disso, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na Tabela representam, respectivamente, o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaR pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb, e o valor obtido por divisão do valor de KD de cada variante para FcYRIIaH pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) do polipeptídio de origem/KD(IIb) do polipeptídio alterado se refere ao valor obtido por divisão do valor de KD do polipeptídio de origem para FcYRIIb pelo valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Além disso, o valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de cada variante/valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem é mostrado na Tabela 12. Aqui, polipeptídio de origem se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 40) como a cadeia H. Determinou-se que devido à fraca ligação de FcYR a IgG, era impossível analisar com precisão por análise cinética, e, portanto, as células preenchidas por cinza na Tabela 12 mostram valores calculados pelo uso da Equação 2 do Exemplo de Referência 2. Equação 2
Figure img0021
[00472] A Tabela 12 mostra, que, em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram melhora de afinidade para FcYRIIb, e a faixa de melhora era de 3,0 vezes a 99,0 vezes. A razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb e a razão de valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representam uma atividade de ligação a FcYRIIb relativa à atividade de ligação a FcYRIIaR e atividade de ligação a FcYRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcYRIIb, e um valor maior indica uma maior seletividade de ligação para FcYRIIb. Como a razão de valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb, e a razão de valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb do polipeptídio de origem IL6R-B3/IL6R-L foram de 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes na Tabela 12 mostraram melhora de seletividade de ligação para FcYRIIb em comparação com o poli- peptídio de origem. Quando o valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante/valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou diminuída em comparação com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do poli- peptídio de origem. Como esse valor era de 0,7 a 29,9 para as variantes obtidas dessa vez, pode-se dizer que a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH das variantes obtidas dessa vez era quase equivalente ou diminuída em comparação com a do polipeptídio de origem. Esses resultados mostraram que, em comparação com o polipeptídio de origem, as variantes obtidas dessa vez têm atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H mantidas ou diminuídas, atividade de ligação a FcYRIIb aumentada, e melhor seletividade para FcYRIIb. Além disso, em comparação com IL6R-B3, todas as variantes tinham menor afinidade para FcYRIa e FcYRIIIaV. Tabela 12
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Legenda: Nome da variante; Alteração; KD contra FcYRIa (mol/L); KD contra FcYRIIaR (mol/L); KD contra FcYRIIaH (mol/L); KD contra FcYRIIb (mol/L); KD contra FcYRIIIaV (mol/L); KD (IIaR)/KD (IIb); KD (IIaH)/KD (IIb); KD (IIb) do polipeptídio de origem/KD (IIb) do polipeptídio alterado; Valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante/Valor de KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídio de origem [Exemplo de Referência 1] Construção de vetores de expressão de anticorpo; e expressão e purificação de anticorpos
[00473] A síntese de genes de comprimento total que codificam as sequências de nucleotídeos da cadeia H e da cadeia L das regiões va-riáveis do anticorpo foi realizada por métodos de produção conhecidos por aqueles versados na técnica usando Assemble PCR e outros. A introdução de substituições de aminoácidos foi realizada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica usando PCR ou outros. O fragmento de plasmídio obtido foi inserido em uma vetor de expressão em célula animal, e foram produzidos o vetor de expressão de cadeia H e o vetor de expressão de cadeia L. A sequência de nucleotídeos do vetor de expressão obtido foi determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os plasmídios produzidos foram introduzidos transitoriamente na linhagem celular HEK293H derivada de células de câncer de rim embrionário humano (Invitrogen) ou em células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressão do anticorpo. O sobrenadan- te de cultura obtido foi coletado e, então, passado através de um filtro MILLEX(R)-GV de 0,22 μM (Millipore), ou através de um filtro MIL- LEX(R)-GV de 0,45 μM (Millipore) para se obter o sobrenadante de cultura. Os anticorpos foram purificados do sobrenadante de cultura obtido por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) ou Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para a concentração dos an-ticorpos purificados, sua absorbância a 280 nm foi medida com um es- pectrofotômetro. Do valor obtido, o coeficiente de extinção calculado por métodos como PACE foi usado para calcular a anticorpo concentração de anticorpo (Protein Science 1995; 4: 2411-2423). [Exemplo de Referência 2] Método para a preparação de FCYR e método para a análise da interação entre um anticorpo alterado e FCYR
[00474] Os domínios extracelulares de FCYRS foram preparados pelo seguinte método. Em primeiro lugar, um gene do domínio extracelu- lar de FcyR foi sintetizado por um método bem conhecido por aqueles versados na técnica. Ao mesmo tempo, a sequência de cada FcyR foi produzida com base na informação registrada no NCBI. Especificamente, FCYRI foi produzida com base na sequência de NCBI N° de Acesso NM_000566.3, FcyRIIa foi produzida com base na sequência de NCBI N° de Acesso NM_001136219.1, FcYRIIb foi produzida com base na sequência de NCBI N° de Acesso NM_004001.3, FcYRIIIa foi produzida com base na sequência de NCBI N° de Acesso NM_001127593.1, e FcyRIIIb foi produzida com base na sequência de NCBI N° de Acesso NM_000570.3, e uma etiqueta His foi fixada à terminação C. Além disso, polimorfismo é conhecido para FcyRIIa, FcyRIIIa, e FcyRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos por referência a J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcyRIIa; J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcyRIIIa; e J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691 para FcyRIIIb.
[00475] Os fragmentos de genes obtidos foram inseridos em um vetor de expressão em célula animal, e foram produzidos vetores de expressão. Os vetores de expressão produzidos foram introduzidos transitoriamente em células FreeStyle293 derivadas da linhagem celular de câncer de rim embrionário humano (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. Com relação a FcyRIIb usada para análise cristalográfica, a proteína de interesse foi expressada na presença de Kifunensine a uma concentração final de 10 μg/mL, de modo que a cadeia de açúcar adicionada a FcYRIIb seja do tipo de alta manose. As células foram cultivadas e, após coleta do sobrenadante de cultura ob-tido, isso foi passado através de um filtro de 0,22 μM para se obter o sobrenadante de cultura. Em princípio, os sobrenadantes de cultura obtidos foram purificados nas seguintes quatro etapas. As etapas reali-zadas foram cromatografia em coluna de troca de cátions (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia em coluna de afinidade (HisTrap HP) para etiqueta His na etapa 2, cromatografia em coluna de filtração em gel (Superdex200) na etapa 3, e cromatografia asséptica na etapa 4. Entretanto, para FcYRI, cromatografia em coluna de troca de ânions usando Q sepharose FF foi realizada como etapa 1. As proteínas puri-ficadas foram submetidas a medições de absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro; e, dos valores obtidos, as concentraçãos das proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado com métodos como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
[00476] A análise da interação entre cada anticorpo alterado e o receptor de FcY preparado conforme acima mencionado foi realizada usando-se Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 e Biacore 4000. HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão de operação, e a temperatura de medição foi ajustada em 25°C. Foram usados chips produzidos por imobilização do peptídio antigênico, Proteína A (Thermo Scientific), Proteína A/G (Thermo Scientific) e Proteína L (ACTIGEN ou BioVision) pelo método de acoplamento com amina a um chip sensor Series S CM5 (GE Healthcare) ou chip sensor Series S CM4 (GE Healthcare) ou, alternativamente, chips produzidos deixando-se peptídios antigênicos preliminarmente biotini- lados interagir com e se imobilizar sobre um Chip sensor Series S SA (certificado) (GE Healthcare).
[00477] Após a captura de anticorpos de interesse sobre esses chips sensores, deixou-se um receptor de FCY diluído com o tampão de operação interagir, a quantidade lligada a um anticorpo foi medida, e os anticorpos foram comparados. Entretanto, como a quantidade de receptor de FCY ligada depende da quantidade de anticorpos capturados, a quantidade de receptor de FCY ligada foi dividida pela quantidade de cada anticorpo capturado para se obterem valores corrigidos, e esses valores foram comparados. Além disso, anticorpos capturados sobre os chips foram lavados por reação com glicina-HCl a 10 mM, pH 1,5, e os chips foram regenerados e repetidamente usados.
[00478] As análises cinéticas para cálculo dos valores de KD de cada anticorpo alterado para FcyR foram realizadas de acordo com o seguinte método. Em primeiro lugar, anticorpos de interesse foram capturados sobre os chips sensores acima mencionados, e um receptor de Fcy diluído com o tampão de operação foi deixado reagir. Usou-se o Software Biacore Evaluation para ajustar globalmente os resultados medidos ao sensograma obtido usando o modelo de ligação 1:1 Langmuir, e a constante de taxa de associação ka (L/mol/s) e a constante de taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas; e, desses valores, as constantes de dissociação KD (mol/L) foram calculadas.
[00479] Quando a interação entre cada um dos anticorpos alterados e FcyR era fraca, e a análise correta foi determinada como sendo im-possível pela análise cinética acima mencionada, a KD para essas in-terações foi calculada usando a seguinte equação de modelo de ligação 1:1 descrita no Manual do Software Biacore T100 BR1006-48 Edição AE.
[00480] O comportamento de interação de moléculas de acordo com o modelo de ligação 1:1 no Biacore pode ser descrito pela Equação 1 mostrada abaixo. Equação 1
Figure img0024
[00481] Req: um traçado dos níveis de ligação em estado constante contra a concentração de analito
[00482] C: concentração
[00483] RI: contribuição bruta do índice de refração na amostra
[00484] Rmax: capacidade de ligação a analito da superfície
[00485] Quando essa equação é rearranjada, a KD pode ser expressa como Equação 2 mostrada abaixo. Equação 2
Figure img0025
[00486] A KD pode ser calculada substituindo-se pelos valores de Rmax, RI e C nessa equação. Os valores de RI e C podem ser determinados a partir do sensograma dos resultados de medição e condições de medição. Rmax foi calculada de acordo com o seguinte método. Como um alvo de comparação, para anticorpos que tinham interações suficientemente fortes conforme avaliado simultaneamente na mesma rodada de medição, o valor de Rmax foi obtido mediante ajuste global usando o modelo de ligação 1:1 Langmuir, e, então, foi dividido pela quantidade do anticorpo de comparação capturado no chip sensor, e multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliado.
Aplicabilidade Industrial
[00487] Os polipeptídios compreendendo uma região Fc que tenham mantido ou diminuído as atividades de ligação a ambos os aloti- pos de FcYRIIa, tipos R e H, e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com o polipeptídio de origem são apresentados pela presente invenção. Com o uso dos polipeptídios com maior seletividade de ligação para FcYRIIb em vez de para ambos os alotipos de FcYRIIa (tipos R e H), é possível transmitir um sinal inibitório da resposta imune inflamatória mediada por fosforilação de ITIM de FcYRIIb em pacientes portadores de qualquer um dos alotipos, tipos R e H. Além disso, ao conferir a um anticorpo Fc a propriedade de ligação seletiva a FcYRIIb, a produção de antianticorpo pode ser suprimida mediante ações imunossupressivas mediadas por FcYRIIb.

Claims (22)

1. Polipeptídio variante, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc do anticorpo com pelo menos uma alteração de aminoácido, que tem atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H), e atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem, e em que o valor de [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo R)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb] é de 1,2 ou mais, em que a dita pelo menos uma alteração de aminoáci- do compreende a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp.
2. Polipeptídio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o valor de [valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb] é de 4,2 ou mais.
3. Polipeptídio de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac-terizado pelo fato de que o valor de [valor de KD do polipeptídio de origem para FcYRIIb]/[valor de KD do polipeptídio variante para FcYRIIb] é de 1,6 ou mais.
4. Polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o valor de [valor de KD da mais forte das atividades de ligação do polipeptídio variante com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)]/[valor de KD da mais forte das atividades de ligação do polipeptídio de origem com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H)] é de 0,7 ou mais.
5. Polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem atividade de ligação a FcYRIIIa mantida ou diminuída e/ou atividade de ligação FcYRIa mantida ou diminuída, em comparação com a de um polipeptídio de origem. de Leu na posição 328 (numeração EU) por Glu.
6. Polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma alteração de aminoácido compreende a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp e pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
7. Polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG ou uma molécula de proteína de fusão com Fc.
8. Polipeptídeo compreendendo uma região Fc do anticorpo a qual um aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp, e em que a referida região Fc do anticorpo compreende pelo menos um aminoácido selecionado de um grupo que consiste de: Trp na posição 237 (numeração UE); Phe na posição 237 (numeração da UE); Val na posição 267 (numeração UE); Gln na posição 267 (numeração UE); Asn na posição 268 (numeração da UE); Gly na posição 271 (numeração UE); Leu na posição 326 (numeração UE); Gln na posição 326 (numeração UE); Glu na posição 326 (numeração UE); Encontrado na posição 326 (numeração UE); Asp na posição 239 (numeração da UE); Ala na posição 267 (numeração da UE); Trp na posição 234 (numeração UE); Tyr na posição 234 (numeração UE); Ala na posição 237 (numeração da UE); Asp na posição 237 (numeração da UE); Glu na posição 237 (numeração UE); Leu na posição 237 (numeração UE); Met na posição 237 (numeração UE); Tyr na posição 237 (numeração UE); Lys na posição 330 (numeração UE); Arg na posição 330 (numeração UE); Asp na posição 233 (numeração UE); Asp na posição 268 (numeração UE); Glu na posição 268 (numeração UE); Asp na posição 326 (numeração UE); Ser na posição 326 (numeração UE); Thr na posição 326 (numeração UE); Ile na posição 323 (numeração UE); Leu na posição 323 (numeração UE); Met na posição 323 (numeração UE); Asp na posição 296 (numeração UE); Ala na posição 326 (numeração UE); Asn na posição 326 (numeração da UE); e Met na posição 330 (numeração UE).
9. Método para manter ou diminuir as atividades de ligação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H) e aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb de um polipeptídio em comparação com um polipeptídio de origem, o método caracterizado pelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc do polipep- tídio compreendendo a região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
10. Método para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo em comparação com um polipeptídio de origem quando administrado in vivo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc do polipeptídio, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma alteração de ami- noácido compreende substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG ou uma molécula de proteína de fusão com Fc.
13. Método para a produção de um polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas com relação a FcYRIIa (tipo R) e FcYRIIa (tipo H) e com atividade de ligação a FcYRIIb aumentada em comparação com um polipeptídio de origem, o método caracterizado pelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoácido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
14. Método para a produção de um polipeptídio com produção suprimida de um anticorpo contra o polipeptídio em comparação com um polipeptídio de origem quando administrado in vivo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc de um polipeptídio compreendendo uma região Fc do anticorpo, em que a alteração de aminoá- cido é a substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma alteração de ami- noácido compreende substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) por Asp e pelo menos uma substituição selecionada no grupo que consiste em: substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asn; substituição de Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; substituição de Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; substituição de Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; substituição de Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Asp; substituição de His na posição 268 (numeração EU) por Glu; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; substituição de Val na posição 323 (numeração EU) por Met; substituição de Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; substituição de Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreendendo a região Fc do anticorpo é um anticorpo IgG ou uma molécula de proteína de fusão com Fc.
17. Uso de um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um agente/composição para a supressão da ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos.
18. Uso de um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um agente/composição para o tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória imunológica.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória imunológica é uma doença au- toimune e é uma doença que possa ser causada por produção de um anticorpo contra um autoantígeno.
20. Uso de um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um agente/composição para o tratamento de uma doença com deficiência de uma proteína biologicamente essencial.
21. Uso de um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um agente/composição antiviral.
22. Uso de um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória imunológica em um sujeito.
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