JP4885308B2 - 改良された抗体分子を含有する製剤 - Google Patents
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Description
〔1〕(a)配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド;
(b)配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド;
(c)配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド;
(d)配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド;
(e)配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド;ならびに
(f)配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を含むCDR3を含む、ポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む、製剤。
〔2〕(a)配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(b)配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(c)配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(d)配列番号:19(VH4-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:22(VL1の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(e)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(f)配列番号:21(VH5-M83の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:24(VL5の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(g)配列番号:25(VH4-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:28(VL1)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;
(h)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;ならびに
(i)配列番号:27(VH5-M83)の配列を含む重鎖および配列番号:30(VL5)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。
〔3〕ヒスチジン緩衝液および/またはクエン酸緩衝液を含む、〔1〕または〔2〕に記載の安定な製剤。
〔4〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔5〕1〜500mMのヒスチジン緩衝液および/またはクエン酸緩衝液、1〜1500mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200mg/mLの抗体、ならびに1〜400mMの糖質を含む、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項記載の安定な製剤。
〔6〕塩基性アミノ酸がアルギニンである、〔4〕または〔5〕に記載の製剤。
〔7〕糖質がショ糖またはトレハロースである、〔5〕または〔6〕に記載の製剤。
〔8〕界面活性剤をさらに含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか一項記載の製剤。
〔9〕少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、〔1〕〜〔8〕のいずれか一項記載の製剤。
〔10〕少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、〔1〕〜〔9〕のいずれか一項記載の製剤。
〔11〕少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項記載の製剤。
〔12〕240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、〔1〕〜〔11〕のいずれか一項記載の製剤。
〔13〕4.5〜7.0の範囲のpHを有する、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項記載の製剤。
〔14〕5.5〜6.6の範囲のpHを有する、〔13〕に記載の製剤。
〔15〕液体である、〔1〕〜〔14〕のいずれか一項記載の製剤。
〔16〕調製の間に凍結乾燥に供されていない、〔15〕に記載の製剤。
〔17〕ポリペプチド分子および/または抗体分子の二量体化が低下している、〔1〕〜〔16〕のいずれか一項記載の製剤。
〔18〕ポリペプチド分子および/または抗体分子の二量体化が阻害されている、〔1〕〜〔17〕のいずれか一項記載の製剤。
〔19〕皮下投与用の〔1〕〜〔18〕のいずれか一項記載の製剤。
〔20〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、抗体が、
(a)配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(b)配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(c)配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(d)配列番号:19(VH4-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:22(VL1の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(e)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(f)配列番号:21(VH5-M83の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:24(VL5の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(g)配列番号:25(VH4-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:28(VL1)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;
(h)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;ならびに
(i)配列番号:27(VH5-M83)の配列を含む重鎖および配列番号:30(VL5)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
〔21〕少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結/融解サイクルの間、抗体を安定化する方法であって、抗体が、
(a)配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(b)配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(c)配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(d)配列番号:19(VH4-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:22(VL1の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(e)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(f)配列番号:21(VH5-M83の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:24(VL5の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;
(g)配列番号:25(VH4-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:28(VL1)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;
(h)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体;ならびに
(i)配列番号:27(VH5-M83)の配列を含む重鎖および配列番号:30(VL5)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
(a)配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド;
(b)配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド;
(c)配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド;
(d)配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド;
(e)配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド;ならびに
(f)配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を含むCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を含むCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を含むCDR3を含むポリペプチド
より選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む製剤を提供する。
(A)修飾された抗IL-6レセプター抗体;
(B)塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、ヒスチジン、および/またはリジン);
(C)緩衝剤(例えば、ヒスチジンまたはクエン酸塩)。
(a) 配列番号:1(VH4-M73のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:2(VH4-M73のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:3(VH4-M73のCDR3)の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:10(VL1のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:11(VL1のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:12(VL1のCDR3)の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号:4(VH3-M73のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:5(VH3-M73のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:6(VH3-M73のCDR3)の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:13(VL3のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:14(VL3のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:15(VL3のCDR3)の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号:7(VH5-M83のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:8(VH5-M83のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:9(VH5-M83のCDR3)の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:16(VL5のCDR1)の配列を有するCDR1、配列番号:17(VL5のCDR2)の配列を有するCDR2、および配列番号:18(VL5のCDR3)の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(d)配列番号:19(VH4-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:22(VL1の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(e)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(f)配列番号:21(VH5-M83の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:24(VL5の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(g)配列番号:25(VH4-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:28(VL1)の配列を含む軽鎖を含む抗体、
(h)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む抗体、ならびに
(i)配列番号:27(VH5-M83)の配列を含む重鎖および配列番号:30(VL5)の配列を含む軽鎖を含む抗体。
パパイン消化:F(ab)2またはFab
ペプシン消化:F(ab')2またはFab'
プラスミン消化:Facb
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列。
[VH]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser(配列番号:45)
Ser Gly Gly Gly(配列番号:46)
Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:47)
Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:48)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:49)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:50)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:51)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:52)
(Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:47))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:48))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。
(a)本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程;および
(b)前記遺伝子によりコードされたポリペプチドを得る工程
を含む、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。
本発明は、上述のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はIL-6が関連する関節リウマチなどの疾患に用いることが可能である。即ち本発明は、上述の抗体を有効成分とする関節リウマチなどの疾患の治療剤も提供する。対象となる疾患の好ましい例として、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、クローン病、lymphoma、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still病、アミロイドーシス、多発性硬化症、移植、加齢黄斑変性症、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、IgA 腎症、変形性関節症、喘息、糖尿病性腎症、GVHD、子宮内膜症、肝炎(NASH)、心筋梗塞、動脈硬化、セプシス、骨粗しょう症、糖尿病、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎癌、B-cell non-Hodgkin's、膵癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌悪液質、癌神経浸潤、心筋梗塞、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、中皮腫、多発性筋炎、皮膚筋炎、汎ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、強膜炎、角膜炎、眼窩炎症、視神経炎、糖尿病網膜症、増殖硝子体網膜症、ドライアイ、術後炎症等が挙げられるが、これらに限定されることはない。
トシリズマブ(H鎖 WT-IgG1/配列番号:53、L鎖 WT-κ/配列番号:54)のIL-6レセプターへの親和性を向上させるために、CDR配列に変異を導入したライブラリーを作製し検討した。CDRに変異を導入したライブラリーをスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの親和性を向上する変異を見出し、それらを図1にまとめた。これらの変異を組み合わせた高親和性トシリズマブの例として、RDC-23(H鎖RDC23H-IgG1/配列番号:55、L鎖 RDC-23L-κ/配列番号:56)が挙げられる。RDC-23の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130による生物活性をトシリズマブと比較した(方法は参考例参照)。
トシリズマブの薬物動態を向上させるために、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することができる変異箇所の検討を行った。トシリズマブの立体構造モデルから推察された可変領域変異箇所をスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することできる変異箇所を見出し、それらを図3にまとめた。これらの変異を組み合わせた等電点低下トシリズマブの例として、H53/L28(H鎖 H53-IgG1/配列番号:57、L鎖 L28-κ/配列番号:58)が挙げられる。H53/L28の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、BaF/gp130による生物活性、等電点、および、マウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した(方法は参考例参照)。
可変領域に存在するT細胞エピトープによる免疫原性リスクを低減する変異箇所の同定
トシリズマブの可変領域配列に存在するT細胞エピトープをTEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)を用いて解析を行った。その結果、L鎖CDR2に多くのHLAに結合するT細胞エピトープが存在する(免疫原性リスクが高い配列が存在する)ことが予測された。そこで、TEPITOPE解析においてL鎖CDR2の免疫原性リスクを低減させつつ、安定性、結合活性、中和活性を低下させないアミノ酸置換を検討した。
トシリズマブ L鎖CDR2(配列番号:59)
T細胞エピトープ除去トシリズマブ L鎖CDR2(配列番号:60)
トシリズマブの可変領域配列において、H鎖FR1のH27, H28, H29, H30およびH鎖FR3のH71(Kabatナンバリング、Kabat EA et al., 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH))は、トシリズマブのヒト化の過程において結合活性を維持するためにフレームワーク配列でマウス配列が残存している(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)。残存するマウス配列は免疫原性リスクを高める原因となりうるため、トシリズマブの免疫原性リスクをより低下するためにフレームワーク配列を完全ヒト化する検討を行った。
トシリズマブ H鎖FR1(配列番号:61)
ヒト化 H鎖FR1-A(配列番号:62)(生殖系列 IMGT hVH_4_由来)
トシリズマブ H鎖FR3(配列番号:63)
ヒト化 H鎖FR3(配列番号:64)(Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422由来)
トシリズマブの薬物動態を向上させる方法の一つは、1分子のトシリズマブが複数個のIL-6レセプターを繰り返し結合および中和するように分子を改良する方法である。トシリズマブは膜型IL-6レセプターに結合後、膜型IL-6レセプターに結合したままインターナライゼーションによって細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、膜型IL-6レセプターに結合したままライソソームへ移行し共にライソソームにより分解されると考えられている。すなわち、通常、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターに(1価ないしは2価で)結合し、インターナライズ後、ライソソームで分解されると考えられるため、1分子のトシリズマブは1分子ないしは2分子の膜型IL-6レセプターしか結合および中和できない。
これらの変異を組み合わせたpH依存的結合トシリズマブの例として、H3pI/L73(H鎖 H3pI-IgG1/配列番号:66、L鎖 L73-κ/配列番号:67)が挙げられる。H3pI/L73のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、pH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度、BaF/gp130による生物活性、および、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける薬物動態をトシリズマブと比較した(方法は参考例参照)。
トシリズマブのH鎖C末端の不均一性の低減
IgG抗体のH鎖C末端配列の不均一性として、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2つのアミノ酸であるグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。トシリズマブにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分も不均一性に寄与する。目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながる。可能な限り単一物質であることが望まれ、抗体を医薬として開発する上にはこれらの不均一性が低減されていることが望ましい。よって医薬として開発する上ではH鎖C末端の不均一性は存在しないことが望ましい。
トシリズマブのアイソタイプはIgG1であるが、トシリズマブは中和抗体であることから、免疫原性や副作用を考慮した場合、Fcγレセプターへの結合は好ましくない可能性が考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられ(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられた(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。一方、抗体を医薬として開発するにあたり、そのタンパク質の物理化学的性質、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する不均一性が極めて多いことが報告されている(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.)。ジスルフィド結合に由来する目的物質/関連物質の不均一性の製造間差を維持しつつ医薬として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれる。よってIgG2アイソタイプの抗体を医薬として開発する上で、安定性を低下させることなくジスルフィド結合由来の不均一性を低減することが望ましい。
上述のとおり、トシリズマブのアイソタイプであるIgG1から、Fcγレセプターへの結合性を低減させ、かつ高い安定性を維持したまま、C末端の不均一性を低減し、かつIgG2アイソタイプの定常領域を有する抗体の不均一性を低減することが可能であることが見出された。さらに、薬物動態に関してもトシリズマブのアイソタイプであるIgG1よりも優れた定常領域であることが望ましい。
上記実施例で見出されたトシリズマブの可変領域および定常領域の変異を複数組み合わせたトシリズマブ改変体を作製し、各種スクリーニングを実施した結果、完全ヒト化IL-6レセプター抗体として、Fv3-M73(H鎖 VH4-M73/配列番号:25、L鎖 VL1-κ/配列番号:28)、Fv4-M73(H鎖 VH3-M73/配列番号:26、L鎖 VL3-κ/配列番号:29)、Fv5-M83(H鎖 VH5-M83/配列番号:27、L鎖 VL5-κ/配列番号:30)を見出した。
トシリズマブ、対照、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度の経時変化を評価した(方法は参考例参照)。トシリズマブ、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度の経時変化を図18に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもトシリズマブおよび対照と比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が向上した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はトシリズマブと比較して大幅に向上した。
上記のように、Fv4-M73を調製する。実施例6〜7に記載されるように、Fv4-M73は、不均一性、安定性、安全性、および薬物動態の向上のために、非天然の定常領域M73から構成されているため、Fv4-M73の安定性プロファイル(たとえば、最も安定な緩衝液種)は、IgG1などの天然の定常領域から構成された抗体とは異なる可能性がある。天然のIgG1定常領域から構成された抗体は、一般に、ヒスチジン酢酸緩衝液の下で最も安定であることが報告されている(WO/2006/044908)。そこで、Fv4-M73の安定性に対する緩衝液種の効果を試験した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC):抗体の凝集物および断片の存在について抗体製剤をスクリーニングするために、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。試料をサイズ排除G3000 SWXLカラム(TOSOH)に注入した。移動相は、0.5 mL/分の流速で均一濃度で流れる50 mMリン酸ナトリウム、300 mM塩化ナトリウム(pH7.0)とし、溶出したタンパク質を、220 nmにおけるUV吸光度により検出した。検出されたすべてのタンパク質種の相対量を、他の全ての検出されたピークの総面積と比較して、生成物ピークの面積%として報告した。抗体モノマーピークより早く溶出するピークを、凝集物パーセンタイルで記録し、抗体モノマーピークより遅いが緩衝液ピークより早く溶出するピークを、断片パーセンタイルで記録した。
Fv4-M73を、(表10に記載された)異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存された場合に、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、凍結-融解された試料(-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解)に対しても分析を行った。25℃および40℃での2/4/8週間の保存後の、製剤中に存在する凝集物の割合(%)および凝集物の割合(%)の初期値からの増加分を、図22〜25に示す。凝集物の量の増加は、安定性の低下の指標となる。
Fv4-M73を、(表11に記載された)異なる緩衝液製剤で100 mg/mLの最終濃度に製剤化し、25℃および40℃で保存し、2ヶ月間にわたり、UV検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料を分析した。また、所定の回数の凍結-融解サイクル(-20℃で0.5日間の凍結、室温で30分間の融解)も実施した。製剤に含有されている凝集物の割合(%)の初期値からの増加分を、経時的にプロットし、図30および31に示す。凝集物の量(%)の増加は、安定性の低下の指標となる。
Fv4-M73を、表12に記載されるような6つの異なる製剤で200 mg/mLの最終濃度に製剤化した。
組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターの調製
抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターを以下のように調製した。J.Biochem. (1990) 108, 673-676で報告されているN末端側1番目から344番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター(Yamasaki et al., Science (1988) 241, 825-828 (GenBank # X12830))のCHO細胞定常発現株を作製した。SR344発現CHO細胞から得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、SR344に対する特異抗体を固定したカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの3つのカラムクロマトグラフィーにより、可溶型ヒトIL-6レセプターを精製した。主要ピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺伝子配列 (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プライマーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6レセプター遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株(cyno.sIL-6R産生CHO細胞)を作製した。cyno.sIL-6R産生CHO細胞の培養液をHisTrapカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex200pg16/60ゲルろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)でさらに精製を行い、可溶型カニクイザルIL-6レセプター(以下、cIL-6R)の最終精製品とした。
カニクイザルIL-6は以下のように調製した。SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212アミノ酸をコードする塩基配列を作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細胞に導入することで定常発現細胞株を作製した(cyno.IL-6産生CHO細胞)。cyno.IL-6産生CHO細胞の培養液をSP-Sepharose/FFカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲルろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)でさらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6(以下、cIL-6)の最終精製品とした。
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性抗IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1(US 2007/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列:配列番号:77、L鎖アミノ酸配列:配列番号:78)を発現させるため、哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)により作製し、定常領域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、哺乳動物発現ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。作製した発現ベクターを用い、発現および精製を行った。発現および精製は実施例1に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6レセプター抗体(以降、「対照」と記す)を得た。
トシリズマブの変異体はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定した。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)を10 % ウシ胎児血清 (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ(直径10 cm, CORNING)の各ディッシュへ10 mLずつプレーティングし、CO2インキュベーター(37℃、5% CO2)内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)を通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清からrProtein A Sepharose(商標)Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者に公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価した。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5 x 104 cells/mLとなるように600 ng/mLないしは60 ng/mLのヒトインターロイキン-6(TORAY)(最終濃度は300 ng/mLないしは30 ng/mL)、適当量の可溶型ヒトIL-6レセプターおよび10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、96ウェルプレート(CORNING)の各ウェルに50μLずつ分注した。次に、精製した抗体を10% FBSを含むRPMI1640に希釈して、各ウェルに50μLずつ混合した。37℃、5% CO2条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬(Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所)を20μL/ウェルで加え、直後にSUNRISE CLASSIC(TECAN)を用いて450 nmの吸光度(参照波長620 nm)を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度(参照波長620 nm)を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評価した。
Biacore T100(GE Healthcare)を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法でプロテインAあるいはプロテイン A/Gあるいは抗IgG(γ鎖特異的)F(ab')2を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の抗体を結合させ、さらにpH7.4において種々の濃度に調製した可溶型IL-6レセプターを分析物として流し、抗体と可溶型ヒトIL-6レセプターの相互作用を測定した。測定は全て37℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、動力学的パラメーターである結合速度定数ka(1/Ms)、および解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値をもとにKD(M)を算出した。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)を用いた。
Biacore T100(GE Healthcare)を用いてpH5.8, pH7.4における膜型IL-6レセプターへの抗原抗体反応を観測した。センサーチップ上に固定化した可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合を測定することで、膜型IL-6レセプターへの結合を評価した。SR344を当業者に公知の方法に従ってビオチン化し、ストレプトアビジンとビオチンの親和性を利用し、ストレプトアビジンを介してビオチン化可溶型ヒトIL-6レセプターをセンサーチップ上に固定化した。測定は全て37℃で実施し、移動相の緩衝液は10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20とし、そこにpH依存的結合クローンをpH7.4の条件下で注入して可溶型ヒトIL-6レセプターと結合させたのち(注入試料の緩衝液は10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)、移動相のpHである5.8で各クローンのpH依存的な解離を観測した。試料濃度を0.25μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20で結合させ、10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH5.8における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)を用いプロットすることにより、pH5.8における解離速度定数(kd(1/s))を算出した。同様にまた、試料濃度を0.5μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で結合させ、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH7.4における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)を用いプロットすることにより、pH7.4における解離速度定数(kd(1/s))を算出した。
FcRnはFcRnとβ2-ミクログロブリンの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列(J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381)を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域(Met1-Leu290)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトFcRnアミノ酸配列/配列番号:79)。同様に、公開されているヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子配列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99 (26), 16899-16903)を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-ミクログロブリン全長(Met1-Met119)をコードするDNA断片を増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトβ2-ミクログロブリンアミノ酸配列/配列番号:80)。
マウス血漿中抗体濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて当業者に公知の方法で測定した。
Claims (20)
- (a)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;ならびに
(b)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体を含む、製剤。 - ヒスチジン緩衝液および/またはクエン酸緩衝液を含む、請求項1記載の製剤。
- 少なくとも一つの塩基性アミノ酸を含む、請求項1または2記載の製剤。
- 1〜500 mMのヒスチジン緩衝液および/またはクエン酸緩衝液、1〜1500 mMの少なくとも一つの塩基性アミノ酸、1〜200 mg/mLの抗体、ならびに1〜400 mMの糖質を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の製剤。
- 塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項3または4記載の製剤。
- 糖質がショ糖またはトレハロースである、請求項4または5記載の製剤。
- 界面活性剤をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の製剤。
- 少なくとも10 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の製剤。
- 少なくとも50 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。
- 少なくとも80 mg/mlの量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、請求項1〜9のいずれか一項記載の製剤。
- 240 mg/ml以下の量のポリペプチドおよび/または抗体を含有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の製剤。
- 4.5〜7.0の範囲のpHを有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。
- 5.5〜6.6の範囲のpHを有する、請求項12記載の製剤。
- 溶液である、請求項1〜13のいずれか一項記載の製剤。
- 調製の間に凍結乾燥に供されていない、請求項14記載の製剤。
- 前記ポリペプチド分子および/または抗体分子の二量体化が低減されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の製剤。
- 前記ポリペプチド分子および/または抗体分子の二量体化が阻害されている、請求項1〜16のいずれか一項記載の製剤。
- 皮下投与用の請求項1〜17のいずれか一項記載の製剤。
- 少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液を安定化する方法であって、該抗体が、
(a)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;ならびに
(b)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。 - 少なくとも一つの塩基性アミノ酸を添加する工程を含む、抗体を含有する溶液の凍結/融解サイクルの間、該抗体を安定化する方法であって、該抗体が、
(a)配列番号:20(VH3-M73の可変領域)の配列を含む重鎖可変領域および配列番号:23(VL3の可変領域)の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体;ならびに
(b)配列番号:26(VH3-M73)の配列を含む重鎖および配列番号:29(VL3)の配列を含む軽鎖を含む、抗体
より選択される少なくとも一つの抗体である、方法。
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