BR112014013081A2 - veículo contendo fármaco em célula para formação de um complexo imune - Google Patents

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BR112014013081A2
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Tomoyuki Igawa
Naoka Hironiwa
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Abstract

uso de uma molécula de ligação ao antígeno e métodos de rastreamento e para a produção da referida molécula. os presentes inventores referem-se a formação de um complexo imune maior compreendendo antígenos contendo duas ou mais unidades de ligação antigênica (epítopos) e duas ou mais moléculas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos), a eliminação a partir do plasma dos antígenos contendo duas ou mais unidades de ligação antigênica pode ser acelerada. além disso, eles verificaram que pelo uso desta característica e pelo uso adicional de moléculas de ligação a antígeno tendo uma atividade de ligação a antígeno dependente de íon, a eliminação dos antígenos pode ainda ser acelerada e o problema acima pode ser resolvido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE
UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E MÉTODOS DE RASTREAMENTO E PARA A PRODUÇÃO DA REFERIDA MOLÉ- CULA". Campo técnico
[001] A presente invenção refere-se a usos de moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma; métodos para eliminar antígenos do plasma, que compreendem administração de moléculas de ligação ao antígeno; composições farmacêuticas que compreendem mo- léculas de ligação ao antígeno que são capazes de eliminar antígenos do plasma; métodos de rastreamento de moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma; e métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma. Antecedentes da Técnica
[002] Os anticorpos estão chamando a atenção como produtos farmacêuticos já que têm uma alta estabilidade no plasma e têm pou- cos efeitos colaterais. No momento, diversos produtos farmacêuticos de anticorpo tipo IgG estão disponíveis no mercado e muitos produtos farmacêuticos de anticorpo estão atualmente em desenvolvimento (Documentos Não Patente 1 e 2). Entretanto, várias tecnologias apli- cáveis a produtos farmacêuticos de anticorpos de segunda geração foram relatadas, incluindo aqueles que aumentam a função efetora, a capacidade de ligação ao antígeno, a farmacocinética e a estabilidade, e aqueles que reduzem o risco de imunogenicidade (Documento Não Patente 3). Em geral, a dose requerida de produtos farmacêuticos de anticorpos é muito alta. Isto por sua vez levou a problemas como alto custo de produção, bem como a dificuldade na produção de formula- ções subcutâneas. Na teoria, a dose de produtos farmacêuticos de an- ticorpos pode ser reduzida melhorando a farmacocinética do anticorpo ou melhorando a afinidade entre anticorpos e antígenos.
[003] A literatura relatou métodos para melhorar a farmacocinéti- ca de anticorpo usando a substituição artificial de aminoácidos em re- giões constantes (Documentos Não Patentes 4 e 5). Similarmente, a maturação por afinidade foi relatada como uma tecnologia para au- mentar a capacidade de ligação ao antígeno ou a atividade de neutra- lização do antígeno (Documento Não Patente 6). Esta tecnologia per- mite o aumento da atividade de ligação ao antígeno introduzindo mu- tações de aminoácidos na região de CDR de uma região variável ou similares. O aumento da capacidade de ligação ao antígeno permite a melhora da atividade biológica in vitro ou a redução da dosagem, e ainda permite a melhora da eficácia in vivo (no corpo) (Documento 7 Não Patente).
[004] Entretanto, a capacidade de neutralização do antígeno de uma molécula de anticorpo única depende da sua afinidade. Aumen- tando a afinidade, um antígeno pode ser neutralizado por uma quanti- dade menor de um anticorpo. Vários métodos podem ser usados para aumentar a afinidade do anticorpo (Documento 6 Não patente). Além disso, se a afinidade pode ser tornada infinita por ligação covalente do anticorpo ao antígeno, uma molécula de anticorpo única pode neutrali- zar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antígeno). Entretanto, os métodos convencionais têm uma limitação na qual uma molécula de anticorpo única se liga a uma molécula de antígeno única (dois antígenos quando é bivalente). Entretanto, relatou-se recentemente que uma molécula única de liga- ção ao antígeno pode ligar-se a uma pluralidade de moléculas de antí- geno usando uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao an- tígeno de uma maneira dependente de pH (Documento de Patente 1 e Documento Não Patente 8). Uma molécula dependente de pH de liga- ção ao antígeno liga-se fortemente a um antígeno sob condição neutra no plasma e libera o antígeno sob condição acídica no endossoma.
Além disso, após liberação do antígeno, a molécula de ligação ao an- tígeno é liberada no plasma através de FcRn e liga-se a um antígeno novamente; por isso, uma molécula dependente de pH única de liga- ção ao antígeno pode ligar-se repetidamente a diversos antígenos.
[005] Além disso, uma vez que as moléculas de ligação ao antí- geno dependentes de pH que foram modificadas para aumentar a liga- ção de FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) têm a vantagem de serem capazes de ligar-se repetidamente a antígenos, e o efeito de eliminar antígenos do plasma, a administração de tais moléculas de ligação ao antígeno foi relatada permitir a eliminação de antígeno do plasma (Documento de Patente 2). As moléculas de ligação ao antíge- no dependentes de pH convencionais compreendendo uma região de Fc de anticorpo IgG apenas mostram ligação de FcRn sob condições neutras. Por isso, a absorção de complexos formados entre uma mo- lécula de ligação ao antígeno e um antígeno em células pode ser prin- cipalmente pela absorção não específica. De acordo com este relató- rio, as moléculas de ligação ao antígeno dependentes de pH que fo- ram modificadas para aumentar ligação de FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) podem acelerar a eliminação de antígeno mais do que moléculas de ligação ao antígeno dependentes de pH convencionais compreendendo uma região de Fc de anticorpo IgG (Documento de Patente 2).
[006] Uma vez que os antígenos têm retentividade muito curta no plasma em comparação com anticorpos tendo um mecanismo de reci- clagem mediado por FcRn, a ligação de um antígeno no plasma a um anticorpo tendo um mecanismo de reciclagem (em que a ligação não é dependente de pH) prolonga a retentividade normal no plasma e au- menta a concentração plasmática de antígeno. Por exemplo, quando um antígeno plasmático tem múltiplos tipos de funções fisiológicas, mesmo se um tipo da atividade fisiológica for bloqueado pela ligação ao anticorpo, a concentração plasmática do antígeno pode exacerbar sintomas causados por outras funções fisiológicas devido à ligação ao anticorpo. De tal ponto de vista, a eliminação de antígenos plasmáticos é favorável às vezes, e métodos similares aos descritos acima para fazer modificações à região de Fc para aumentar a ligação de FcRn com o objetivo de aceleração da eliminação de antígeno foram relata- dos, mas outros métodos para aceleração da eliminação de antígeno não foram relatados por enquanto.
[007] Os documentos da técnica anterior da presente invenção são mostrados abaixo. Documentos da Técnica Anterior Documentos de Patente
[008] Documento de Patente 1 Publicação Internacional WO2009/125825
[009] Documento de Patente 2 Publicação Internacional WO2011/122011 Documentos não Patentes
[010] Documento não Patente 1 Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073 – 1078
[011] Documento não Patente 2 Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
[012] Documento não Patente 3 Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Anti- body engineering for the development of therapeutic antibodies, Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17-29
[013] Documento não Patente 4 Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N, J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356
[014] Documento não Patente 5 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Nat. Biotechnol.
(1997) 15 (7), 637-640
[015] Documento não Patente 6 Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2005) 102 (24), 8466-8471
[016] Documento não Patente 7 Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665
[017] Documento não Patente 8 Igawa T, et al., Nat. Biotechnol. (2010) 28, 1203-1207 Sumário da invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção
[018] A presente invenção foi alcançada em vista das circunstân- cias acima. Um objetivo da presente invenção é fornecer usos de mo- léculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma; mé- todos para eliminar antígenos do plasma, que compreendem adminis- tração de moléculas de ligação ao antígeno; composições farmacêuti- cas compreendendo moléculas de ligação ao antígeno que são capa- zes de eliminar antígenos do plasma; métodos de rastreamento de moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma; e métodos para produção de moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma. Meios para Solução dos Problemas
[019] Os presentes inventores conduziram estudos dedicados para alcançar os objetivos descritos acima. Como resultado, os pre- sentes inventores produziram moléculas de ligação ao antígeno que compreendem (i) uma região de Fc e (ii) dois ou mais domínios de li- gação ao antígeno onde pelo menos um dos domínios é um domínio de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação de antígeno varia de- pendendo da condição de concentração iônica, que são moléculas de ligação ao antígeno que podem formar um complexo imune compre-
endendo (a) duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e (b) duas ou mais moléculas de antígeno compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas. Além disso, os presentes inventores descobriram que as moléculas de ligação ao antígeno podem ser usa- das para eliminar antígenos do plasma. Além disso, os presentes in- ventores descobriram que as moléculas de ligação ao antígeno são úteis como composições farmacêuticas, e produziram métodos para eliminar antígenos do plasma, que compreendem a administração das moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, os presentes inventores descobriram métodos de rastreamento de moléculas de ligação ao an- tígeno tendo as propriedades acima mencionadas e criaram métodos para produção das moléculas, por meio disso completando a presente invenção.
[020] Mais especificamente, a presente invenção fornece o se- guinte:
[021] [1] uso de uma molécula de ligação ao antígeno compreen- dendo
[022] uma região de Fc e
[023] dois ou mais domínios de ligação ao antígeno,
[024] em que pelo menos um dos domínios é um domínio de li- gação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica, e
[025] em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que compreende
[026] duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e
[027] dois ou mais antígenos, em que os antígenos compreen- dem duas ou mais unidades de ligação antigênicas, para eliminar os antígenos do plasma;
[028] [2] o uso de [1], em que a condição de concentração iônica é uma condição de concentração de íon cálcio;
[029] [3] o uso de [2], em que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração iônica de cálcio que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de cálcio;
[030] [4] o uso de qualquer um de [1] a [3], em que a condição de concentração iônica é uma condição de pH;
[031] [5] o uso de [4], em que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno em uma faixa de pH acídica que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno em uma condição de faixa de pH neutra;
[032] [6] o uso de qualquer um de [1] a [5], em que os antígenos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas são multímeros;
[033] [7] o uso de [6], em que o antígeno é qualquer um de GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK de ODF, ligante de OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas, ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante de CD27 CD70), TNFSF8 (ligante de CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4- 1BB, ligante CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico e IL-8;
[034] [8] o uso de qualquer um de [1] a [5], em que os antígenos que compreendem duas ou mais unidades de ligação antigênicas são monômeros;
[035] [9] o uso de qualquer um de [1] a [8], em que as moléculas de ligação ao antígeno são uma molécula multiespecífica ou multipara- tópica de ligação ao antígeno ou coquetel de moléculas de ligação ao antígeno;
[036] [10] o uso de qualquer um de [1] a [9], em que a região de Fc é representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[037] [11] o uso de qualquer um de [1] a [9], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumen- tada sob uma condição de faixa de pH acídica em comparação com aquela da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[038] [12] o uso de [11], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos se- lecionados a partir do grupo consistindo emem aminoácidos nas posi- ções 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, e 447 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da re- gião de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[039] [13] o uso de [12], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consis- tindo em:
[040] Leu para o aminoácido da posição 238;
[041] Leu para o aminoácido da posição 244;
[042] Arg para o aminoácido da posição 245;
[043] Pro para o aminoácido da posição 249;
[044] Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250;
[045] Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido da posição 251;
[046] Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[047] Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254;
[048] Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido da posição 255;
[049] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 256;
[050] Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido da posição 257;
[051] Asp para o aminoácido da posição 258;
[052] Ser para o aminoácido da posição 260;
[053] Leu para o aminoácido da posição 262;
[054] Lys para o aminoácido da posição 270;
[055] Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272;
[056] Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 279;
[057] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 283;
[058] Asn para o aminoácido da posição 285;
[059] Phe para o aminoácido da posição 286;
[060] Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288;
[061] Val para o aminoácido da posição 293;
[062] Ala, Glu, Gln, ou Met para o aminoácido da posição 307;
[063] Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoá- cido da posição 311;
[064] Pro para o aminoácido da posição 309;
[065] Ala, Asp, ou Pro para o aminoácido da posição 312;
[066] Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314;
[067] Lys para o aminoácido da posição 316;
[068] Pro para o aminoácido da posição 317;
[069] Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318;
[070] Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido da posição 332;
[071] Asn, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 339;
[072] Pro para o aminoácido da posição 341;
[073] Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido da po- sição 343;
[074] Arg para o aminoácido da posição 375;
[075] Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido da posição 376;
[076] Lys para o aminoácido da posição 377;
[077] Asp, Asn ou Val para o aminoácido da posição 378;
[078] Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 380;
[079] Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 382;
[080] Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 385;
[081] Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 386;
[082] Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 387;
[083] Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[084] Asn para o aminoácido da posição 423;
[085] Asn para o aminoácido da posição 427;
[086] Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 428;
[087] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr,
Val ou Tyr para o aminoácido da posição 430;
[088] His ou Asn para o aminoácido da posição 431;
[089] Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433;
[090] Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da po- sição 434;
[091] Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436;
[092] Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 438;
[093] Lys para o aminoácido da posição 440; e
[094] Lys para o aminoácido da posição 442; Ile, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[095] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[096] [14] o uso de qualquer um de [1] a [9], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumen- tada sob uma condição de faixa de pH neutra em comparação com aquela da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[097] [15] o uso de [14], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos se- lecionados a partir do grupo consistindo das posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na se- quência de aminoácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[098] [16] o uso de [15], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consis-
tindo em:
[099] Met para o aminoácido da posição 237;
[0100] Ile para o aminoácido da posição 248;
[0101] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do da posição 250;
[0102] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[0103] Thr para o aminoácido da posição 254;
[0104] Glu para o aminoácido da posição 255;
[0105] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
[0106] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257;
[0107] His para o aminoácido da posição 258;
[0108] Ala para o aminoácido da posição 265;
[0109] Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286;
[0110] His para o aminoácido da posição 289;
[0111] Ala para o aminoácido da posição 297;
[0112] Ala para o aminoácido da posição 303;
[0113] Ala para o aminoácido da posição 305;
[0114] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307;
[0115] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[0116] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido da posição 309;
[0117] Ala, His ou Ile para o aminoácido da posição 311;
[0118] Ala ou His para o aminoácido da posição 312;
[0119] Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314;
[0120] Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315;
[0121] Ala para o aminoácido da posição 317;
[0122] Val para o aminoácido da posição 332;
[0123] Leu para o aminoácido da posição 334;
[0124] His para o aminoácido da posição 360;
[0125] Ala para o aminoácido da posição 376;
[0126] Ala para o aminoácido da posição 380;
[0127] Ala para o aminoácido da posição 382;
[0128] Ala para o aminoácido da posição 384;
[0129] Asp ou His para o aminoácido da posição 385;
[0130] Pro para o aminoácido da posição 386;
[0131] Glu para o aminoácido da posição 387;
[0132] Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[0133] Ala para o aminoácido da posição 424;
[0134] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 428;
[0135] Lys para o aminoácido da posição 433;
[0136] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[0137] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436;
[0138] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0139] [17] o uso de qualquer um de [1] a [13], em que a região de Fc inclui uma região de Fc tendo uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa;
[0140] [18] o uso de [17], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos que são diferentes dos aminoácidos da região de Fc de IgG humana nativa selecionada a partir do grupo consistindo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255,
256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU);
[0141] [19] o uso de [18], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0142] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[0143] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[0144] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[0145] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[0146] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[0147] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[0148] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[0149] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[0150] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[0151] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[0152] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[0153] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0154] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[0155] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[0156] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0157] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[0158] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[0159] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[0160] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[0161] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[0162] His para o aminoácido da posição 244;
[0163] Ala para o aminoácido da posição 245;
[0164] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[0165] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[0166] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[0167] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[0168] Phe para o aminoácido da posição 251;
[0169] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[0170] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[0171] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[0172] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[0173] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[0174] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[0175] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[0176] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[0177] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[0178] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[0179] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[0180] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[0181] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[0182] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[0183] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[0184] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[0185] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[0186] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[0187] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[0188] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[0189] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[0190] Ala para o aminoácido da posição 279;
[0191] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[0192] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[0193] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 282;
[0194] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[0195] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi-
ção 284;
[0196] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[0197] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[0198] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[0199] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[0200] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[0201] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[0202] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[0203] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[0204] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[0205] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[0206] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[0207] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[0208] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[0209] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[0210] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[0211] Ile para o aminoácido da posição 302;
[0212] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[0213] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[0214] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[0215] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311;
[0216] Phe para o aminoácido da posição 313;
[0217] Leu para o aminoácido da posição 315;
[0218] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[0219] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[0220] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[0221] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[0222] Ile para o aminoácido da posição 323;
[0223] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[0224] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[0225] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[0226] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[0227] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[0228] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[0229] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[0230] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[0231] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[0232] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[0233] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[0234] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[0235] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[0236] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[0237] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[0238] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[0239] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[0240] Asp para o aminoácido da posição 378;
[0241] Asn para o aminoácido da posição 379;
[0242] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[0243] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[0244] Glu para o aminoácido da posição 385;
[0245] Thr para o aminoácido da posição 392;
[0246] Leu para o aminoácido da posição 396;
[0247] Lys para o aminoácido da posição 421;
[0248] Asn para o aminoácido da posição 427;
[0249] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[0250] Met para o aminoácido da posição 429;
[0251] Trp para o aminoácido da posição 434;
[0252] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[0253] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[0254] como indicado pela numeração EU;
[0255] [20] o uso de qualquer um de [1] a [16], em que a região de Fc tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ;
[0256] [21] o uso de [20], em que o receptor inibitório de Fcγ é FcγRIIb humano;
[0257] [22] o uso de [20] ou [21], em que o receptor de ativação de Fcγ é FcγRIa humano, FcγRIIa (R) humano, FcγRIIa (H) humano, FcγRIIIa (V) humano ou FcγRIIIa (F) humano;
[0258] [23] o uso de qualquer um de [20] a [22], em que o aminoá- cido na posição 238 ou 328 (numeração EU) na região de Fc é diferen- te do aminoácido na região de Fc de IgG humana nativa;
[0259] [24] o uso de [23], em que o aminoácido na posição 238 da região de Fc é Asp ou o aminoácido da posição 328 da região de Fc é Glu como indicado pela numeração EU;
[0260] [25] o uso de [23] ou [24], em que a sequência de aminoá- cidos da região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoáci- dos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0261] Asp para o aminoácido da posição 233;
[0262] Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0263] Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0264] Asp para o aminoácido da posição 239;
[0265] Ala, Gln ou Val para o aminoácido da posição 267;
[0266] Asn, Asp ou Glu para o aminoácido da posição 268;
[0267] Gly para o aminoácido da posição 271;
[0268] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido da posição 326;
[0269] Arg, Lys, ou Met para o aminoácido da posição 330;
[0270] Ile, Leu, ou Met para o aminoácido da posição 323; e
[0271] Asp para o aminoácido da posição 296;
[0272] como indicado pela numeração EU;
[0273] [26] um método do rastreamento de uma molécula de liga- ção ao antígeno e tem uma função de eliminar um antígeno do plas- ma, em que o método compreende:
[0274] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[0275] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[0276] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[0277] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima;
[0278] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima;
[0279] colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno obti- da em (e) acima com um antígeno; e
[0280] avaliação da formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno;
[0281] [27] um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno e tem uma função de eliminar um antígeno do plasma, em que o método compreende:
[0282] colocar em contato um antígeno com uma molécula de liga- ção ao antígeno compreendendo uma região de Fc e dois ou mais domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domí- nios de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno que varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[0283] avaliação de formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno;
[0284] cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carreia um gene que codifica uma molécula de ligação ao antíge- no que é confirmada para formar um complexo imune em (b) acima; e
[0285] isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma so- lução de cultura obtida em (c) acima;
[0286] [28] um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno e tem uma função de eliminar um antígeno do plasma, em que o método compreende:
[0287] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[0288] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[0289] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[0290] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima;
[0291] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima;
[0292] colocar em contato com a molécula de ligação ao antígeno obtida em (e) acima com um antígeno;
[0293] avaliação de formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno;
[0294] cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carreia um gene que codifica uma molécula de ligação ao antíge- no que é confirmada formar um complexo imune em (g) acima; e
[0295] isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma so- lução de cultura obtida em (h) acima; e
[0296] [29] um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno e tem uma função de eliminar um antígeno do plasma, em que o método compreende:
[0297] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[0298] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[0299] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[0300] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima; e
[0301] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima; e
[0302] em que o método compreende ainda colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno obtida pelo método de produção com um antígeno e avaliar a formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno.
[0303] O supracitado [1] a [25] pode ser declarado novamente co- mo se segue:
[0304] [1’] uma composição farmacêutica para eliminar um antíge- no do plasma, em que a composição farmacêutica compreende uma molécula de ligação ao antígeno compreendo
[0305] uma região de Fc e
[0306] dois ou mais domínios de ligação ao antígeno,
[0307] em que pelo menos um dos domínios é um domínio de li- gação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica, e
[0308] em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que compreende
[0309] duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e
[0310] dois ou mais antígenos, em que os antígenos compreen- dem duas ou mais unidades de ligação antigênicas;
[0311] [2’] a composição farmacêutica de [1’], em que a condição de concentração iônica é uma condição de concentração de íon cálcio;
[0312] [3’] a composição farmacêutica de [2’], em que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração iônica de cálcio que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de cálcio;
[0313] [4’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [3’], em que a condição de concentração iônica é uma condição de pH;
[0314] [5’] a composição farmacêutica de [4’], em que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno em uma faixa de pH acídica que é mais baixa do que a atividade de liga- ção ao antígeno em uma condição de faixa de pH neutra;
[0315] [6’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [5’], em que os antígenos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas são multímeros;
[0316] [7’] a composição farmacêutica de [6’], em que o antígeno é qualquer um de GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP- 1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK de ODF, ligante de OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante de GITR ligante de AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a de Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante de Fas ligante de Apo-1, ligante de APT1), TNFSF7 (ligante de CD27 CD70), TNFSF8 (ligante de CD30
CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante de CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico e IL- 8;
[0317] [8’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [5’], em que os antígenos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas são monômeros;
[0318] [9’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [8’], em que as moléculas de ligação ao antígeno são uma molécula multiespecífica ou multiparatópica de ligação ao antígeno ou coquetel de moléculas de ligação ao antígeno;
[0319] [10’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [9’], em que a região de Fc é representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0320] [11’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [9’], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH acídica em comparação com aquela da região de Fc representada por qual- quer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0321] [12’] a composição farmacêutica de [11’], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma substituição de aminoácido de pe- lo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo con- sistindo das posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, e 447 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0322] [13’] a composição farmacêutica de [12’], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0323] Leu para o aminoácido da posição 238;
[0324] Leu para o aminoácido da posição 244;
[0325] Arg para o aminoácido da posição 245;
[0326] Pro para o aminoácido da posição 249;
[0327] Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250;
[0328] Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido da posição 251;
[0329] Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[0330] Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254;
[0331] Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido da posição 255;
[0332] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 256;
[0333] Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido da posição 257;
[0334] Asp para o aminoácido da posição 258;
[0335] Ser para o aminoácido da posição 260;
[0336] Leu para o aminoácido da posição 262;
[0337] Lys para o aminoácido da posição 270;
[0338] Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272;
[0339] Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 279;
[0340] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 283;
[0341] Asn para o aminoácido da posição 285;
[0342] Phe para o aminoácido da posição 286;
[0343] Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288;
[0344] Val para o aminoácido da posição 293;
[0345] Ala, Glu, Gln, ou Met para o aminoácido da posição 307;
[0346] Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoá-
cido da posição 311;
[0347] Pro para o aminoácido da posição 309;
[0348] Ala, Asp, ou Pro para o aminoácido da posição 312;
[0349] Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314;
[0350] Lys para o aminoácido da posição 316;
[0351] Pro para o aminoácido da posição 317;
[0352] Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318;
[0353] Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido da posição 332;
[0354] Asn, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 339;
[0355] Pro para o aminoácido da posição 341;
[0356] Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido da po- sição 343;
[0357] Arg para o aminoácido da posição 375;
[0358] Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido da posição 376;
[0359] Lys para o aminoácido da posição 377;
[0360] Asp, Asn ou Val para o aminoácido da posição 378;
[0361] Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 380;
[0362] Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 382;
[0363] Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 385;
[0364] Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 386;
[0365] Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 387;
[0366] Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[0367] Asn para o aminoácido da posição 423;
[0368] Asn para o aminoácido da posição 427;
[0369] Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 428;
[0370] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 430;
[0371] His ou Asn para o aminoácido da posição 431;
[0372] Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433;
[0373] Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da po- sição 434;
[0374] Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436;
[0375] Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 438;
[0376] Lys para o aminoácido da posição 440; e
[0377] Lys para o aminoácido da posição 442; Ile, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[0378] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0379] [14’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [9’], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH neutra em comparação com aquela da região de Fc representada por qual- quer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0380] [15’] a composição farmacêutica de [14’], em que a região de Fc é uma região de Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo das posi- ções 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região de Fc repre-
sentada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0381] [16’] a composição farmacêutica de [15’], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0382] Met para o aminoácido da posição 237;
[0383] Ile para o aminoácido da posição 248;
[0384] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do da posição 250;
[0385] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[0386] Thr para o aminoácido da posição 254;
[0387] Glu para o aminoácido da posição 255;
[0388] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
[0389] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257;
[0390] His para o aminoácido da posição 258;
[0391] Ala para o aminoácido da posição 265;
[0392] Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286;
[0393] His para o aminoácido da posição 289;
[0394] Ala para o aminoácido da posição 297;
[0395] Ala para o aminoácido da posição 303;
[0396] Ala para o aminoácido da posição 305;
[0397] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307;
[0398] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[0399] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido da posição 309;
[0400] Ala, His ou Ile para o aminoácido da posição 311;
[0401] Ala ou His para o aminoácido da posição 312;
[0402] Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314;
[0403] Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315;
[0404] Ala para o aminoácido da posição 317;
[0405] Val para o aminoácido da posição 332;
[0406] Leu para o aminoácido da posição 334;
[0407] His para o aminoácido da posição 360;
[0408] Ala para o aminoácido da posição 376;
[0409] Ala para o aminoácido da posição 380;
[0410] Ala para o aminoácido da posição 382;
[0411] Ala para o aminoácido da posição 384;
[0412] Asp ou His para o aminoácido da posição 385;
[0413] Pro para o aminoácido da posição 386;
[0414] Glu para o aminoácido da posição 387;
[0415] Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[0416] Ala para o aminoácido da posição 424;
[0417] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 428;
[0418] Lys para o aminoácido da posição 433;
[0419] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[0420] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436;
[0421] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0422] [17’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [13’], em que a região de Fc inclui uma região de Fc que tem uma ati- vidade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da regi- ão de Fc de IgG humana nativa;
[0423] [18’] a composição farmacêutica de [17’], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos que são diferentes de aminoácidos de região de Fc de IgG humana nativa selecionada a partir do grupo consistindo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU);
[0424] [19’] a composição farmacêutica de [18’], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0425] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[0426] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[0427] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[0428] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[0429] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[0430] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[0431] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[0432] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[0433] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[0434] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[0435] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[0436] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0437] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln,
Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[0438] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[0439] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0440] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[0441] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[0442] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[0443] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[0444] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[0445] His para o aminoácido da posição 244;
[0446] Ala para o aminoácido da posição 245;
[0447] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[0448] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[0449] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[0450] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[0451] Phe para o aminoácido da posição 251;
[0452] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[0453] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[0454] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[0455] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[0456] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[0457] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[0458] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[0459] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[0460] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[0461] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[0462] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[0463] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[0464] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[0465] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[0466] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[0467] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[0468] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[0469] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[0470] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[0471] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[0472] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[0473] Ala para o aminoácido da posição 279;
[0474] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[0475] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[0476] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição
282;
[0477] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[0478] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284;
[0479] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[0480] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[0481] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[0482] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[0483] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[0484] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[0485] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[0486] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[0487] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[0488] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[0489] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[0490] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[0491] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[0492] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[0493] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[0494] Ile para o aminoácido da posição 302;
[0495] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[0496] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[0497] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[0498] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311;
[0499] Phe para o aminoácido da posição 313;
[0500] Leu para o aminoácido da posição 315;
[0501] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[0502] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[0503] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[0504] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[0505] Ile para o aminoácido da posição 323;
[0506] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[0507] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[0508] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[0509] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[0510] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[0511] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[0512] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[0513] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[0514] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[0515] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[0516] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[0517] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[0518] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[0519] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[0520] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[0521] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[0522] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[0523] Asp para o aminoácido da posição 378;
[0524] Asn para o aminoácido da posição 379;
[0525] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[0526] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[0527] Glu para o aminoácido da posição 385;
[0528] Thr para o aminoácido da posição 392;
[0529] Leu para o aminoácido da posição 396;
[0530] Lys para o aminoácido da posição 421;
[0531] Asn para o aminoácido da posição 427;
[0532] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[0533] Met para o aminoácido da posição 429;
[0534] Trp para o aminoácido da posição 434;
[0535] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[0536] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[0537] como indicado pela numeração EU;
[0538] [20’] a composição farmacêutica de qualquer um de [1’] a [16’], em que a região de Fc tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ;
[0539] [21’] a composição farmacêutica de [20’], em que o receptor inibitório de Fcγ é FcγRIIb humano;
[0540] [22’] a composição farmacêutica de [20’] ou [21’], em que o receptor de ativação de Fcγ é FcγRIa humano, FcγRIIa (R) humano, FcγRIIa (H) humano, FcγRIIIa (V) humano ou FcγRIIIa (F) humano;
[0541] [23’] a composição farmacêutica de qualquer um de [20’] a [22’], em que o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) na região de Fc é diferente do aminoácido na região de Fc de IgG huma- na nativa;
[0542] [24’] a composição farmacêutica de [23’], em que o aminoá- cido na posição 238 da região de Fc é Asp ou o aminoácido da posi- ção 328 da região de Fc é Glu como indicado pela numeração EU; e
[0543] [25’] a composição farmacêutica de [23’] ou [24’], em que a sequência de aminoácidos da região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0544] Asp para o aminoácido da posição 233;
[0545] Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0546] Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0547] Asp para o aminoácido da posição 239;
[0548] Ala, Gln ou Val para o aminoácido da posição 267;
[0549] Asn, Asp ou Glu para o aminoácido da posição 268;
[0550] Gly para o aminoácido da posição 271;
[0551] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido da posição 326;
[0552] Arg, Lys, ou Met para o aminoácido da posição 330;
[0553] Ile, Leu, ou Met para o aminoácido da posição 323; e
[0554] Asp para o aminoácido da posição 296;
[0555] como indicado pela numeração EU;
[0556] Além disso, o supracitado [1] a [25] também pode ser decla- rado novamente como se segue:
[0557] [1"] um método para eliminar um antígeno do plasma de um indivíduo, em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo
[0558] uma região de Fc e
[0559] dois ou mais domínios de ligação ao antígeno,
[0560] em que pelo menos um dos domínios é um domínio de li- gação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica, e
[0561] em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que compreende
[0562] duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e
[0563] dois ou mais antígenos, em que os antígenos compreen- dem duas ou mais unidades de ligação antigênicas;
[0564] [2"] o método de [1"], em que a condição de concentração iônica é uma condição de concentração de íon cálcio;
[0565] [3"] o método de [2"], em que o domínio de ligação ao antí- geno tem uma atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração iônica de cálcio que é mais baixa do que a ativida- de de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração iô- nica de cálcio;
[0566] [4"] o método de qualquer um de [1"] a [3"], em que a con- dição de concentração iônica é uma condição de pH;
[0567] [5"] o método de [4"], em que o domínio de ligação ao antí- geno tem uma atividade de ligação ao antígeno em uma faixa de pH acídica que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno em uma condição de faixa de pH neutra;
[0568] [6"] o método de qualquer um de [1"] a [5"], em que os antí- genos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas são multímeros;
[0569] [7"] o método de [6"], em que o antígeno é qualquer um de GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRAN- CE/RANK de ODF, ligante de OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, o ligante de DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante de GITR ligante de AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a de Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF- b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante de Fas ligante de Apo-1, ligante de APT1), TNFSF7 (ligante de CD27 CD70), TNFSF8 (ligante de CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante de CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico e IL-8;
[0570] [8"] o método de qualquer um de [1"] a [5"], em que os antí- genos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênicas são monômeros;
[0571] [9"] o método de qualquer um de [1"] a [9"], em que as mo- léculas de ligação ao antígeno são uma molécula multiespecífica ou multiparatópica de ligação ao antígeno ou coquetel de moléculas de ligação ao antígeno;
[0572] [10"] o método de qualquer um de [1"] a [9"], em que a regi- ão de Fc é representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0573] [11"] o método de qualquer um de [1"] a [9"], em que a regi- ão de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH acídica em comparação com aquela da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0574] [12"] o método de [11"], em que a região de Fc é uma regi- ão de Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoáci- dos selecionados a partir do grupo consistindo das posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, e 447 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região de Fc repre- sentada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0575] [13"] o método de [12"], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0576] Leu para o aminoácido da posição 238;
[0577] Leu para o aminoácido da posição 244;
[0578] Arg para o aminoácido da posição 245;
[0579] Pro para o aminoácido da posição 249;
[0580] Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250;
[0581] Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido da posição 251;
[0582] Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[0583] Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254;
[0584] Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido da posição 255;
[0585] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 256;
[0586] Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido da posição 257;
[0587] Asp para o aminoácido da posição 258;
[0588] Ser para o aminoácido da posição 260;
[0589] Leu para o aminoácido da posição 262;
[0590] Lys para o aminoácido da posição 270;
[0591] Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272;
[0592] Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 279;
[0593] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 283;
[0594] Asn para o aminoácido da posição 285;
[0595] Phe para o aminoácido da posição 286;
[0596] Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288;
[0597] Val para o aminoácido da posição 293;
[0598] Ala, Glu, Gln, ou Met para o aminoácido da posição 307;
[0599] Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoá- cido da posição 311;
[0600] Pro para o aminoácido da posição 309;
[0601] Ala, Asp, ou Pro para o aminoácido da posição 312;
[0602] Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314;
[0603] Lys para o aminoácido da posição 316;
[0604] Pro para o aminoácido da posição 317;
[0605] Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318;
[0606] Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido da posição 332;
[0607] Asn, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 339;
[0608] Pro para o aminoácido da posição 341;
[0609] Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido da po- sição 343;
[0610] Arg para o aminoácido da posição 375;
[0611] Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido da posição 376;
[0612] Lys para o aminoácido da posição 377;
[0613] Asp, Asn ou Val para o aminoácido da posição 378;
[0614] Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 380;
[0615] Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 382;
[0616] Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 385;
[0617] Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 386;
[0618] Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 387;
[0619] Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[0620] Asn para o aminoácido da posição 423;
[0621] Asn para o aminoácido da posição 427;
[0622] Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 428;
[0623] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 430;
[0624] His ou Asn para o aminoácido da posição 431;
[0625] Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433;
[0626] Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da po- sição 434;
[0627] Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436;
[0628] Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 438;
[0629] Lys para o aminoácido da posição 440; e
[0630] Lys para o aminoácido da posição 442; Ile, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[0631] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0632] [14"] o método de qualquer um de [1"] a [9"], em que a regi- ão de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH neutra em comparação com aquela da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0633] [15"] o método de [14"], em que a região de Fc é uma regi- ão de Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoáci- dos selecionados a partir do grupo consistindo das posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0634] [16"] o método de [15"], em que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0635] Met para o aminoácido da posição 237;
[0636] Ile para o aminoácido da posição 248;
[0637] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do da posição 250;
[0638] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[0639] Thr para o aminoácido da posição 254;
[0640] Glu para o aminoácido da posição 255;
[0641] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
[0642] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257;
[0643] His para o aminoácido da posição 258;
[0644] Ala para o aminoácido da posição 265;
[0645] Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286;
[0646] His para o aminoácido da posição 289;
[0647] Ala para o aminoácido da posição 297;
[0648] Ala para o aminoácido da posição 303;
[0649] Ala para o aminoácido da posição 305;
[0650] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307;
[0651] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[0652] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido da posição 309;
[0653] Ala, His ou Ile para o aminoácido da posição 311;
[0654] Ala ou His para o aminoácido da posição 312;
[0655] Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314;
[0656] Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315;
[0657] Ala para o aminoácido da posição 317;
[0658] Val para o aminoácido da posição 332;
[0659] Leu para o aminoácido da posição 334;
[0660] His para o aminoácido da posição 360;
[0661] Ala para o aminoácido da posição 376;
[0662] Ala para o aminoácido da posição 380;
[0663] Ala para o aminoácido da posição 382;
[0664] Ala para o aminoácido da posição 384;
[0665] Asp ou His para o aminoácido da posição 385;
[0666] Pro para o aminoácido da posição 386;
[0667] Glu para o aminoácido da posição 387;
[0668] Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[0669] Ala para o aminoácido da posição 424;
[0670] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 428;
[0671] Lys para o aminoácido da posição 433;
[0672] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[0673] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436;
[0674] como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 16;
[0675] [17"] o método de qualquer um de [1"] a [13"], em que a re- gião de Fc inclui uma região de Fc que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa;
[0676] [18"] o método de [17"], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoáci- dos que são diferentes de aminoácidos de região de Fc de IgG huma- na nativa selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378,
379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU);
[0677] [19"] o método de [18"], em que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoáci- dos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0678] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[0679] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[0680] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[0681] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[0682] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[0683] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[0684] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[0685] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[0686] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[0687] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[0688] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[0689] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0690] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[0691] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[0692] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0693] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[0694] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[0695] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[0696] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[0697] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[0698] His para o aminoácido da posição 244;
[0699] Ala para o aminoácido da posição 245;
[0700] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[0701] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[0702] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[0703] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[0704] Phe para o aminoácido da posição 251;
[0705] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[0706] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[0707] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[0708] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[0709] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[0710] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[0711] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[0712] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[0713] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[0714] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[0715] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[0716] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[0717] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[0718] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[0719] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[0720] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[0721] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[0722] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[0723] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[0724] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[0725] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[0726] Ala para o aminoácido da posição 279;
[0727] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[0728] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[0729] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 282;
[0730] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[0731] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284;
[0732] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[0733] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[0734] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[0735] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[0736] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[0737] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[0738] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[0739] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[0740] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[0741] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[0742] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[0743] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[0744] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[0745] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[0746] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[0747] Ile para o aminoácido da posição 302;
[0748] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[0749] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[0750] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[0751] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311;
[0752] Phe para o aminoácido da posição 313;
[0753] Leu para o aminoácido da posição 315;
[0754] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[0755] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[0756] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[0757] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[0758] Ile para o aminoácido da posição 323;
[0759] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[0760] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[0761] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[0762] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[0763] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[0764] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[0765] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[0766] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[0767] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[0768] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[0769] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[0770] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[0771] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[0772] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[0773] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[0774] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[0775] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[0776] Asp para o aminoácido da posição 378;
[0777] Asn para o aminoácido da posição 379;
[0778] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[0779] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[0780] Glu para o aminoácido da posição 385;
[0781] Thr para o aminoácido da posição 392;
[0782] Leu para o aminoácido da posição 396;
[0783] Lys para o aminoácido da posição 421;
[0784] Asn para o aminoácido da posição 427;
[0785] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[0786] Met para o aminoácido da posição 429;
[0787] Trp para o aminoácido da posição 434;
[0788] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[0789] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[0790] como indicado pela numeração EU;
[0791] [20"] o método de qualquer um de [1"] a [16"], em que a re- gião de Fc tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ;
[0792] [21"] o método de [20"], em que o receptor inibitório de Fcγ é FcγRIIb humano;
[0793] [22"] o método de [20"] ou [21"], em que o receptor de ati- vação de Fcγ é FcγRIa humano, FcγRIIa (R) humano, FcγRIIa (H) hu- mano, FcγRIIIa (V) humano ou FcγRIIIa (F) humano;
[0794] [23"] o método de qualquer um de [20"] a [22"], em que o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) na região de Fc é diferente do aminoácido na região de Fc de IgG humana nativa;
[0795] [24"] o método de [23"], em que o aminoácido na posição 238 da região de Fc é Asp ou o aminoácido da posição 328 da região de Fc é Glu como indicado pela numeração EU; e
[0796] [25"] o método de [23"] ou [24"], em que a sequência de aminoácidos da região de Fc compreende pelo menos um ou mais a- minoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[0797] Asp para o aminoácido da posição 233;
[0798] Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[0799] Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[0800] Asp para o aminoácido da posição 239;
[0801] Ala, Gln ou Val para o aminoácido da posição 267;
[0802] Asn, Asp ou Glu para o aminoácido da posição 268;
[0803] Gly para o aminoácido da posição 271;
[0804] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido da posição 326;
[0805] Arg, Lys, ou Met para o aminoácido da posição 330;
[0806] Ile, Leu, ou Met para o aminoácido da posição 323; e
[0807] Asp para o aminoácido da posição 296;
[0808] como indicado pela numeração EU; Breve descrição dos desenhos
[0809] A Fig. 1 é um diagrama mostrando que um anticorpo com a ligação dependente de pH repetidamente se liga a antígenos solúveis.
(i) Um anticorpo liga-se a antígenos solúveis; (ii) o anticorpo é não es- pecificamente incorporado em uma célula por PEGcitose; (iii) o anti- corpo liga-se a FcRn dentro do endossoma, e os antígenos solúveis dissociam-se do anticorpo; (iv) os antígenos solúveis são transferidos para o lisossoma e degradados; (v) após dissociação dos antígenos solúveis, o anticorpo é reciclado ao plasma via FcRn; (vi) o anticorpo reciclado pode ligar-se a antígenos solúveis novamente.
[0810] A Fig. 2 é um diagrama mostrando que aumentar ligação de FcRn sob condições neutras resulta na melhoria do efeito de um anti- corpo com ligação dependente de pH para ligar-se repetidamente a antígenos: (i) um anticorpo liga-se a antígenos solúveis; (ii) o anticorpo é incorporado em uma célula por PEGcitose via FcRn; (iii) os antíge- nos solúveis dissociam-se do anticorpo no endossoma; (iv) os antíge- nos solúveis são transferidos para o lisossoma e degradados; (v) após dissociação dos antígenos solúveis, o anticorpo é reciclado ao plasma via FcRn; e (vi) o anticorpo reciclado pode ligar-se a antígenos solú- veis novamente.
[0811] A Fig. 3 apresenta sensorgramas de Biacore mostrando a interação de anticorpos anti-IgA humana com IgA humana sob condi- ções de Ca2+ 1,2 mM e Ca2+ 3 M.
[0812] A Fig. 4 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de anticorpo em camundongos normais de grupo administrado com anticorpo para IgA humana + GA1-IgG1, grupo administrado com anticorpo para IgA humana + GA2- IgG1, grupos administrados com anticorpo para IgA humana + GA2- FcγR (-) ou GA2-N434W.
[0813] A Fig. 5 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de IgA humana em camundon- gos normais do grupo administrado com IgA humana somente, grupo administrado com anticorpo para IgA humana + GA1-IgG1, grupo ad-
ministrado com anticorpo para IgA humana + GA2-IgG1, grupo admi- nistrado com anticorpo para IgA humana + GA2-FcγR (-) e grupo ad- ministrado com anticorpo para IgA humana + GA2-N434W.
[0814] A Fig. 6 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de IgA humana não ligado em camundongos normais de grupo administrado com anticorpo para IgA humana + GA1-IgG1, grupo administrado com anticorpo para IgA hu- mana + GA2-IgG1, grupo administrado com anticorpo para IgA huma- na + GA2-FcγR (-) e grupo administrado com anticorpo para IgA hu- mana + GA2-N434W.
[0815] A Fig. 7 é um diagrama ilustrativo mostrando a eficiência da eliminação de antígeno por molécula de anticorpo de um anticorpo de- pendente de pH/Ca que tem a região constante de IgG1 natural que forma um grande complexo imune com um antígeno multimérico.
[0816] A Fig. 8 é um diagrama ilustrativo mostrando a eficiência da eliminação de antígeno por molécula de anticorpo de um anticorpo multiespecífico dependente de pH/Ca que reconhece dois ou mais epí- topos em um antígeno monomérico e é adequado para a formação de um grande complexo imune.
[0817] A Fig. 9 mostra os resultados de análises cromatográficas com filtração em gel que confirmaram que IgE humana e clone 278, que é um anticorpo anti-IgE dependente de pH, forma grandes com- plexos imunes de uma maneira dependente de pH.
[0818] A Fig. 10 é um gráfico mostrando que as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de anticorpo em camun- dongos normais do grupo administrado com clone 278 + IgE humana e grupo administrado com anticorpo para IgE humana + Xolair.
[0819] A Fig. 11 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de IgE humana em camundon- gos normais do grupo administrado com IgE humana somente, grupo administrado com anticorpo para IgE humana + clone 278, e grupo administrado com anticorpo para IgE humana + clone 278.
[0820] A Fig. 12 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo em concentrações plasmáticas de anticorpos GA2-IgG1 e GA2-F1087 em camundongos normais.
[0821] A Fig. 13 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de hIgA em camundongos nor- mais administrados com GA2-IgG1 ou GA2-F1087.
[0822] A Fig. 14 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo em concentrações plasmáticas de anticorpos 278-IgG1 e 278-F1087 em camundongos C57BL/6J.
[0823] A Fig. 15 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de hIgE(Asp6) em camundon- gos C57BL/6J administrados com 278-IgG1 ou 278-F1087.
[0824] A Fig. 16 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de GA2-F760 ou GA2-F1331 em camundongos transgênicos de FcRn humano administrados com GA2-F760 ou GA2-F1331.
[0825] A Fig. 17 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de IgA humana em camundon- gos transgênicos de FcRn humano administrados com GA2-F760 ou GA2-F1331.
[0826] A Fig. 18 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de 278-F760 ou 278-F1331 em camundongos transgênicos de FcRn humano administrados com 278- F760 ou 278-F1331.
[0827] A Fig. 19 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração plasmática de IgE humana em camundon- gos transgênicos de FcRn humano administrados com 278-F760 ou 278-F1331.
[0828] A Fig. 20 apresenta sensorgramas mostrando a interação de PHX-IgG1 com hsIL-6R em pH 7,4 e pH 6,0.
[0829] A Fig. 21 mostra o resultado de avaliar a ligação simultânea de Fv4-IgG1 e PHX-F29 com IL6R pelo método de eletroquimiolumi- nescência (ECL).
[0830] A Fig. 22 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração de anticorpo anti-IL6R no plasma de ca- mundongos normais do grupo administrado com hsIL6R + Fv4-IgG1- e grupos administrados com hsIL6R + Fv4-IgG1 + PHX-IgG1.
[0831] A Fig. 23 é um gráfico mostrando as modificações de curso de tempo na concentração de IL6R humana no plasma de camundon- gos normais do grupo administrado com hsIL6R + Fv4-IgG1 e grupos administrados com hsIL6R + Fv4-IgG1 + PHX-IgG1.
[0832] A Fig. 24 apresenta sensorgramas de Biacore obtidos quando uma solução do anticorpo sozinho ou uma solução de anticor- po-antígeno misturados foi aplicada a FcγR. A linha tracejada mostra o sensorgrama obtido quando a solução do anticorpo sozinho foi aplica- da, e a linha sólida mostra o sensorgrama obtido quando a solução de anticorpo-antígeno misturados foi aplicada.
[0833] A Fig. 25 apresenta sensorgramas de Biacore obtidos quando uma solução do anticorpo sozinho ou uma solução de anticor- po-antígeno misturados foi aplicada a FcRn humano. A linha sólida mostra o sensorgrama obtido quando a solução do anticorpo sozinho foi aplicada, e a linha tracejada mostra o sensorgrama obtido quando a solução de anticorpo-antígeno misturados foi aplicada.
[0834] A Fig. 26 apresenta sensorgramas de Biacore obtidos quando uma solução do anticorpo sozinho ou uma solução de anticor- po-antígeno misturados foi aplicada ao FcRn de camundongo. A linha tracejada mostra o sensorgrama obtido quando a solução do anticorpo sozinho foi aplicada, e a linha sólida mostra o sensorgrama obtido quando a solução de anticorpo-antígeno misturados foi aplicada.
[0835] A Fig. 27 apresenta sensorgramas de Biacore obtidos quando uma solução do anticorpo sozinho ou uma solução de anticor- po-antígeno misturados foi aplicada ao FcRn de camundongo. A linha tracejada mostra o sensorgrama obtido quando a solução do anticorpo sozinho foi aplicada, e a linha sólida mostra o sensorgrama obtido quando a solução de anticorpo-antígeno misturados foi aplicada. Modo para Execução da Invenção
[0836] As definições e a descrição detalhada abaixo são forneci- das para auxiliar a compreensão da presente invenção ilustrada neste pedido. Aminoácidos
[0837] Neste pedido, os aminoácidos são descritos em códigos de uma ou de três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I ou Val/V. Modificação de aminoácidos
[0838] Para modificação de aminoácido na sequência de aminoá- cidos de uma molécula de ligação ao antígeno, métodos conhecidos como métodos de mutagênese sítio-dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobrepo- sição pode ser apropriadamente adotado. Além disso, vários métodos conhecidos também podem ser adotados como métodos de alteração de aminoácido para substituição por aminoácidos não naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, é adequado u- sar um sistema de tradução sem células (Clover Direct (Protein Ex- press)) contendo um tRNA que tem um aminoácido não natural ligado por um tRNA supressor âmbar complementar do códon UAG (códon âmbar) que é um dos códons de parada.
[0839] No presente relatório descritivo, o significado da palavra "e/ou" descrevendo o sítio da alteração de aminoácido inclui cada combinação onde "e" e "ou" são apropriadamente combinados. Espe- cificamente, por exemplo, "os aminoácidos nas posições 33, 55, e/ou 96 são substituídos" inclui a seguinte variação de modificações de a- minoácido:
[0840] aminoácido(s) na posição (a) 33, (b) posição 55, (c) posição 96, (d) posições 33 e 55, (e) posições 33 e 96, (f) posições 55 e 96 e posições (g) 33, 55, e 96. Unidades de ligação antigênicas
[0841] Neste pedido, "unidades de ligação antigênicas" refere-se ao "número de epítopos presentes em uma molécula de antígeno úni- ca em uma forma normalmente presente no plasma na ausência de uma molécula de ligação ao antígeno, em que a molécula de antígeno compreende um epítopo que se liga a uma unidade monovalente de ligação de um domínio de ligação ao antígeno contido em uma molé- cula de ligação ao antígeno da presente invenção". Exemplos de um antígeno que tem duas unidades de ligação antigênicas são antígenos incluindo multímeros geralmente presentes no plasma na forma de homodímeros como GDF, PDGF ou VEGF. Por exemplo, em molécu- las de GDF homodimerizadas, há duas unidades de epítopos cada uma ligada por uma unidade monovalente de ligação de uma região variável contida em uma molécula de anticorpo anti-GDF que compre- ende duas regiões variáveis tendo a mesma sequência (isto é, não o anticorpo biespecífico a ser descrito depois). As moléculas de imuno- globulina como IgE também estão incluídas como exemplos dos antí- genos com duas unidades de ligação antigênicas. IgE normalmente existe no plasma como um tetrâmero que compreende um dímero de cadeia pesada e um dímero de cadeia leve; e no tetrâmero, há duas unidades de epítopos cada uma ligada por uma valência única de uma região variável contida em uma molécula de anticorpo anti-IgE que compreende duas regiões variáveis que têm a mesma sequência (isto é, não o anticorpo biespecífico depois descrito). IgA normalmente exis- te no plasma em duas formas: um tetrâmero que compreende um dí- mero de cadeia pesada e um dímero de cadeia leve e um octâmero produzido quando os tetrâmeros ainda formam um complexo via uma cadeia J; e o tetrâmero e o octâmero respectivamente têm duas uni- dades e quatro unidades de epítopos cada uma ligada por uma valên- cia única de uma região variável contida em uma molécula de anticor- po anti-IgA que compreende duas regiões variáveis que têm a mesma sequência (isto é, não o anticorpo biespecífico depois descrito). Exem- plos de antígenos com três unidades de ligação antigênicas são antí- genos incluindo multímeros geralmente presentes no plasma na forma de homotrímeros como TNFα, RANKL ou CD154 da superfamília de TNF.
[0842] Os exemplos de moléculas de antígeno com uma unidade de ligação antigênica são moléculas geralmente presentes no plasma na forma de monômeros como receptor solúvel de IL-6 (a seguir tam- bém referido como sIL-6R), IL-6, HMGB-1 e CTGF. Os heterodímeros tais como IL-12 compreendendo IL-12p40 e IL-12p35, IL-23 compre- endendo IL-12p40 e IL-23p19 (também referido como IL-30B), IL-23 compreendendo EBI3 e IL27p28 e IL-35 compreendendo IL-12p35 e EBI3 contêm duas moléculas de subunidades estruturalmente diferen- tes. Em uma molécula de anticorpo anti-subunidade compreendendo duas regiões variáveis que se ligam a uma destas subunidades (isto é, não o anticorpo biespecífico descrito a seguir), o epítopo ligado por uma valência única das regiões variáveis é uma unidade; por isso, a unidade de ligação antigênica destes heterodímeros é aquela. A uni- dade de ligação antigênica de heterotrímeros como o complexo multi- subunidade TNFα-TNFβ-hCG é similarmente uma unidade.
[0843] Desde então "a unidade de ligação antigênica" significa o número de epítopos ligados por uma unidade monovalente de ligação de um domínio de ligação ao antígeno, quando há um tipo do parátopo ou múltiplos tipos dos parátopos presentes em uma molécula de liga- ção ao antígeno, a unidade de ligação antigênica do antígeno será di- ferente mesmo se o antígeno ligado por estas moléculas de ligação ao antígeno for o mesmo antígeno. Por exemplo, no caso dos heterodí- meros supracitados, quando a unidade monovalente de ligação no domínio de ligação ao antígeno contido na molécula de ligação ao an- tígeno se liga a um tipo da subunidade no heterodímero, a unidade de ligação antigênica deste antígeno é um, ao passo que quando a molé- cula de ligação ao antígeno é um biparatópica ou uma molécula bies- pecífica de ligação ao antígeno e compreende duas unidades monova- lentes de ligação que se ligam a cada uma das subunidades que for- mam o heterodímero, a unidade de ligação antigênica deste antígeno é dois. Multímeros
[0844] Neste pedido, quando a frase "dois ou mais multímeros" simplesmente é citada, o significado da palavra "multímero" inclui tanto homomultímero como heteromultímero. Os modos da ligação entre as subunidades contidas em um multímero são ligações covalentes como ligações peptídicas ou ligações de dissulfeto e ligações não covalentes estáveis como ligações iônicas, ligações de van der Waals e ligações de hidrogênio, mas não são limitados a estas. Homomultímeros inclu- em uma pluralidade de subunidades idênticas, ao passo que hetero- multímeros contêm uma pluralidade de subunidades diferentes. Por exemplo, o significado da palavra "dímero" inclui tanto homodímeros como heterodímeros; e enquanto um homodímero contêm duas subu- nidades idênticas, um heterodímero contém duas subunidades diferen- tes. Além disso, no caso de um polipeptídeo, o termo "monômero" que expressa cada uma das unidades que formam um multímero refere-se a cada uma das unidades estruturais contínuas ligadas por ligações peptídicas. Antígenos
[0845] Neste pedido, "antígenos" não são particularmente limita- dos em sua estrutura, contanto que compreendam epítopos aos quais domínios de ligação a antígeno se liguem.
[0846] Outros antígenos incluem, por exemplo, as moléculas abai- xo: 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, recep- tor de adenosina A1, A33, ACE, Ace-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1- antitripsina, alfa-V/beta-1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, peptídeo natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator de estimulação de linfócito B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF- R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2, BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), MBP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-1A (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bom- besina, fator neutrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno asso- ciado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, C-
CL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Botulínica, toxina Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR2, CX- CR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoquera- tina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complementari- dade (Fator de aceleração de declínio), des (1-3)-IGF-1 (IGF-1 cere- bral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMM- PRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxi- na, EpCAM, efrina B2/EphB4, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio de estimulação de fo- lículo, factalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-
alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPI- Ib/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação de hor- mônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gBm, glicoproteína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus herpes simplex (HSV), glicoproteína gD do HSV, HGFA, antígeno associado a melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 alça V3, HLA, HLA-DR, HM 1,24, HMGF PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegaloví- rus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-I, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, recep- tor IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator 1 de crescimento do tipo insulina, alfa2 inte- grina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa4 integrina/beta1, alfa4 inte- grina/beta7, alfa5 integrina (alfa V), alfa5 integrina/beta1, alfa5 integri- na/beta 3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, calicreíona 2, calicreína 5, calicreína 6, cali- creína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, ca- licreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 latente bp1, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis- Y, antígeno associado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipo- proteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, su- perfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor da linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor de MGDF,
MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, , MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP- 15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Mucl), MUC18, substância inibidora Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P- caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP), PIGF, PLP, PP14, pró-insulina, pré-relaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A da relaxina, cadeia B da relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STE- AP, STEAP-II, TACE, TACI, MARCADOR-72 (glicoproteína-72 associ- ada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por exemplo, recep- tor de célula T alfa/beta), TdT, TECK, TEMI, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP do testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF- betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF- beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio de estimulação da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tm- po, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF- RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRA- IL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TN-
FRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TAC1), TN- FRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TN- FRSF1A (TNF RI CD120a, P55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, P75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR3 TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 P50), TN- FRSF6 (Faz Apo-1, APTI, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TN- FRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligante ODF, ligante OPG), TNFSF12 (TWEAK ligan- te Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT ligante HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSFS5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligan- te 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor expressando carboidratos associados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE- Caderina, VE-Caderina-2, VEGFR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integri- na, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3,
WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT76A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL- 17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PSCK9, pré-calicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, qui- ninógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, escle- rostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fa- tor V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecam-1, Sinde- cam-2, Sindecam-3, Sindecam-4, LPA e S1P; e receptores para hor- mônio e fatores de crescimento.
[0847] "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antí- geno e se refere a um sítio antigênico ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui apresentada se liga. Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especi- ficado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica. Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cuja sequência de amino- ácidos primária tenha sido reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipi-
camente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos em uma sequência específica. Ao contrário do epítopo linear, um "epítopo conformacional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária contendo o epítopo não é o único determinante do epítopo reconhecido (por e- xemplo, a sequência de aminoácidos primária de um epítopo confor- macional não é necessariamente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um nú- mero maior de aminoácidos em comparação aos epítopos lineares. Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tri- dimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptídeo que formam um epítopo conformacional ficam alinhados e o epítopo é tornado passível de reconhecimento pelo anticorpo. Os métodos para determinar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, crista- lografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-específica, e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limitados a estes. Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).
[0848] Como descrito depois, quando uma molécula de ligação ao antígeno se liga a uma pluralidade de epítopos em uma molécula de antígeno como com um anticorpo biespecífico e tal, o antígeno que pode formar um complexo com a molécula de ligação ao antígeno po- de ser qualquer um dos antígenos exemplificados acima, ou combina- ções destes, isto é, monômeros ou heteromultímeros. Exemplos não limitantes de heteromultímeros incluem heterodímeros como IL-12 compreendendo IL-12p40 e IL-12p35, IL-23 compreendendo IL-12p40 e IL-23p19 (também referido como IL-30B), IL-23 compreendendo EBI-
3 e IL27p28 e IL-35 compreendendo IL-12p35 e EBI-3.
[0849] Enquanto os receptores são citados como os exemplos dos antígenos supracitados, quando estes receptores existem em formas solúveis em fluidos biológicos como plasma, podem formar complexos com as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Por isso, enquanto os receptores supracitados existem nas suas formas solúveis em fluidos biológicos como plasma, podem ser usados como antígenos que podem formar complexos da presente invenção ligando- se a uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Um exemplo de uma modalidade não limitante de tal receptor solúvel é IL- 6R solúvel, que é uma proteína consistindo dos aminoácidos nas posi- ções 1 a 357 na sequência polipeptídica de IL-6R da SEQ ID NO: 1 como descrito em Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958- 4968).
[0850] Os antígenos solúveis são citados como exemplos dos an- tígenos supracitados, e as soluções nas quais os antígenos existem não são limitadas. Os antígenos solúveis podem existir em fluidos bio- lógicos, ou mais especificamente em todos os fluidos que enchem o espaço entre tecidos e células ou vasos em organismos. Em uma mo- dalidade não limitante, os antígenos aos quais as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam podem estar presentes em fluidos extracelulares. Em vertebrados, o fluido extracelular é um termo geral para plasma, fluido intersticial, linfa, tecido conectivo compacto, fluido cerebrospinal, fluido espinhal, punção fluido, sinovial ou tais componentes no osso e cartilagem, fluido alveolar (fluido de lavagem broncoalveolar), fluido peritoneal, fluido pleural, fluido pericárdico, flui- do do cisto, humor aquoso (hidatoide) ou tais fluidos transcelulares (vários fluidos nas cavidades glandulares e fluidos na cavidade do tra- to digestivo e outros fluidos de cavidade de corpo produzidos em con- sequência do transporte ativo / as atividades secretórias das células).
[0851] Quando o epítopo ao qual o domínio de ligação ao antígeno contido em uma molécula de ligação ao antígeno se liga é um epítopo único, uma modalidade não limitante de um antígeno que pode formar um complexo da presente invenção para ligar-se com a molécula de ligação ao antígeno inclui as moléculas exemplificadas abaixo, que incluem homodímeros, homotrímeros, ou similares, como uma unidade de ligação antigênica: GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-alfa, TNF- alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK de ODF, ligante de OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante de DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante de GITR ligan- te de AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a de Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante de Fas ligante de Apo-1, ligante de APT1), TNFSF7 (ligante de CD27 CD70), TNFSF8 (ligante de CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante de CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Espe- cífico e IL-8. Epítopos
[0852] "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antí- geno e refere-se a um sítio de antígeno ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno descrita neste pedido se liga. Dessa forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido segundo sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especi- ficado pela sua estrutura da cadeia de açúcar específica.
[0853] Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cu- ja sequência de aminoácidos primária foi reconhecida. Tal epítopo li- near tipicamente contém pelo menos três e ainda mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, aproximadamente 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos em uma sequência específica.
[0854] Em contraste com o epítopo linear, um "epítopo conforma- cional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária que contém o epítopo não é o único determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequência de aminoácidos primária de um epítopo conformacional não necessariamente é reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um maior número de aminoácidos em comparação com epítopos lineares. Um anticorpo conformacional que reconhece o epítopo reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula proteica se enovela e forma uma estrutura tri- dimensional, as cadeias principais de aminoácidos e/ou de polipeptí- deos que formam um epítopo conformacional ficam alinhadas, e o epí- topo é feito reconhecível pelo anticorpo. Métodos para determinar con- formações de epítopo incluem, por exemplo, cristalografia de raio X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação de spin es- pecífica para o sítio e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limitados a estes. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Proto- cols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).
[0855] A estrutura do domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo é chamada dee parátopo. Um epítopo e um parátopo li- gam-se com estabilidade por meio da ação de ligações de hidrogênio,
força eletrostática, força de van der Waals, ligações hidrofóbicas, e tais entre o epítopo e o parátopo. Esta força da ligação entre o epítopo e parátopo é chamada de afinidade. A soma total da força de ligação quando uma pluralidade de epítopos e uma pluralidade de parátopos se ligam é referida como avidez. Quando um anticorpo compreenden- do uma pluralidade de parátopos (isto é, o anticorpo multivalente) ou similares se ligam a uma pluralidade de epítopos, a afinidade atua adi- tivamente ou sinergisticamente, e por isso a avidez fica mais alta do que a afinidade. Atividade de ligação
[0856] Exemplos de um método para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno teste que contém um domí- nio de ligação ao antígeno direcionado para IgA são descritos abaixo. De acordo com os exemplos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno teste que contém um domínio de ligação ao antígeno de um antígeno IgA exceto tam- bém pode ser apropriadamente conduzido.
[0857] Por exemplo, se uma molécula de ligação ao antígeno teste contendo um domínio de ligação ao antígeno contra IgA reconhece um epítopo linear na molécula de IgA pode ser confirmado, por exemplo, como mencionado abaixo. Por exemplo, um peptídeo linear compre- endendo uma sequência de aminoácidos que forma a região constante de IgA é sintetizado com o objetivo acima. O peptídeo pode ser sinteti- zado quimicamente ou obtido por técnicas de engenharia genética u- sando uma região que codifica a sequência de aminoácidos que cor- responde à região constante em um cDNA de IgA. Então, uma molécu- la de ligação ao antígeno teste contendo um domínio de ligação ao antígeno em direção à IgA é avaliada para sua atividade de ligação em direção a um peptídeo linear compreendendo a sequência de aminoá- cidos que forma a região constante. Por exemplo, um ELISA usando um peptídeo linear imobilizado como um antígeno pode ser realizado para avaliar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno em direção ao peptídeo. Alternativamente, a atividade de ligação em direção a um peptídeo linear pode ser avaliada baseada ao nível da inibição pelo peptídeo linear da ligação da molécula de ligação ao an- tígeno em direção a células com IgA. Estes testes podem demonstrar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno em direção ao peptídeo linear.
[0858] O reconhecimento de um epítopo conformacional por uma molécula de ligação ao antígeno teste compreendendo um domínio de ligação ao antígeno e visa a proteína de IgA pode ser confirmado co- mo afirmado abaixo. Para o objetivo supracitado, como descrito neste pedido, uma técnica de recombinação genética geral é usada para transferir um gene recombinante que codifica IgA para células hospe- deiras (por exemplo, células animais, células de insetos ou células de leveduras) que permitem a formação do epítopo conformacional nativo na proteína de IgA. IgA que contém o epítopo conformacional é prepa- rada da cultura de células recombinantes produzidas desta maneira. O reconhecimento de um epítopo conformacional por uma molécula de ligação ao antígeno teste que compreende um direcionamento do do- mínio de ligação ao antígeno que IgA é, por exemplo, quando a molé- cula de ligação ao antígeno teste se liga fortemente à molécula de IgA quando é colocada em contato com IgA imobilizada que contém o epí- topo conformacional, enquanto a molécula de ligação ao antígeno não se liga substancialmente a um peptídeo linear que compreende uma sequência de aminoácidos que constitui a sequência de aminoácidos de IgA imobilizada. Alternativamente, também é possível usar, em vez do peptídeo linear supracitado, a molécula de ligação ao antígeno tes- te visando IgA que foi desnaturada por um agente redutor que cliva ligações de dissulfeto, como ditiotreitol, ditioeritritol, β-mercaptoetanol,
fosfina, e borohidreto de sódio e/ou agentes caotrópicos como tensoa- tivos incluindo hidrocloreto de guanidina, ureia e lauril sulfato de sódio. Aqui, a frase "não se liga substancialmente" refere-se a uma atividade de ligação não maior do que 80%, normalmente não maior do que 50%, preferencialmente não maior do que 30%, ou particularmente preferencialmente não maior do que 15% da atividade de ligação à IgA humana.
[0859] Os métodos para analisar a atividade de ligação em direção à IgA de uma molécula de ligação ao antígeno teste que contém um domínio de ligação ao antígeno contra IgA incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especifi- camente, a avaliação pode ser realizada baseada no princípio de ELI- SA ou EIA usando IgA como antígeno.
[0860] No formato de ELISA, a atividade de ligação de uma molé- cula de ligação ao antígeno teste que contém um domínio de ligação do antígeno de IgA em direção à IgA pode ser avaliada quantitativa- mente comparando os níveis do sinal gerado pela reação enzimática. Especificamente, uma molécula de ligação ao antígeno teste é adicio- nada a uma placa de ELISA para a qual IgA foi imobilizada. Então, a molécula de ligação ao antígeno teste que se ligou à IgA imobilizada na placa é detectada usando um anticorpo marcado com a enzima que reconhece a molécula de ligação ao antígeno teste. No ELISA, uma diluição serial da molécula de ligação ao antígeno teste pode ser pre- parada e o título de ligação do anticorpo em direção à IgA a ser deter- minado para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno teste em direção a IgA.
[0861] A ligação de uma molécula de ligação ao antígeno teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares, pode ser detectada usando um citômetro de flu-
xo. Os citômetros de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguin- tes dispositivos:
[0862] FACSCantoTM II
[0863] FACSAriaTM
[0864] FACSArrayTM
[0865] FACSVantageTM SE
[0866] FACSCaliburTM (todos são nomes comerciais da BD Bios- ciences)
[0867] EPICS ALTRA HyPerSort
[0868] Cytomics FC 500
[0869] EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
[0870] Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes comerciais da Beckman Coulter).
[0871] Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de liga- ção frente a um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno tes- te contendo um domínio de ligação ao antígeno contra IgE incluem, por exemplo, o seguinte método. Primeiro, células que expressam IgE são reagidas com uma molécula de ligação ao antígeno teste, e, en- tão, elas são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de ligação ao antígeno. A molécula de ligação ao antígeno teste é diluída apropriadamente um tampão ade- quado para preparar a molécula em uma concentração desejada. Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma concentração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCalibur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quanti- dade de anticorpo ligado às células. Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno teste, que é representada pela quantidade da molécula de ligação ao antígeno teste ligada, pode ser determinada mediante a medição do valor geométrico médio.
[0872] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IgA compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação ao antígeno com base na competição entre as duas moléculas pelo mesmo epítopo. A competição entre as moléculas de ligação ao antígeno pode ser detec- tada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de prefe- rência.
[0873] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína IgA imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré- incubada na presença ou ausência de uma molécula de ligação ao an- tígeno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação ao antígeno teste é adicionada a isso. A quantidade da molécula de liga- ção ao antígeno teste ligada à proteína IgA nos poços está correlacio- nada indiretamente com a capacidade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação ao antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno teste aos po- ços revestidos com a proteína IgA.
[0874] A quantidade da molécula de ligação ao antígeno teste li- gada aos poços através da proteína IgA pode ser facilmente determi- nada através de marcação da molécula de ligação ao antígeno anteci- padamente. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno mar- cada com biotina é medida usando um conjugado de avidina/pe- roxidase e um substrato adequado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de ligação ao antígeno tam- bém pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição. Especificamente, radiomarcadores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos.
[0875] Quando a molécula de ligação ao antígeno competidora candidata pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação ao antígeno teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IgA em pelo menos 20%, de preferência ao menos 20 a 50%, e mais preferen- cial pelo menos 50% em comparação à atividade de ligação em um experimento de controle conduzido na ausência da molécula de liga- ção ao antígeno competidora, é determinado que a molécula de liga- ção ao antígeno teste se liga substancialmente ao mesmo epítopo li- gado pela molécula de ligação ao antígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.
[0876] Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação ao antígeno teste contendo um domínio de ligação ao antí- geno de IgA já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno teste e controle compartilham um epítopo co- mum através da comparação das atividades de ligação das duas mo- léculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdu- ção de mutações de aminoácido no peptídeo que forma o epítopo.
[0877] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são comparadas no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a ati- vidade de ligação ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fazer as moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle fluírem na coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação ao antígeno eluída na solução de eluição. Os métodos para adsorver um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptídeo de fusão de GST, são conhecidos.
[0878] Alternativamente, quando o epítopo identificado em um an-
tígeno expresso em uma célula é um epítopo conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle compartilham um epítopo comum, por exemplo, por meio do seguinte método. Explicação é fornecida abaixo, usando o caso de IgE como um antígeno como exemplo. Primeiro, células que expressam IgE e células que expressam IgE com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas. As moléculas de ligação ao antígeno teste e de con- trole são adicionadas a uma suspensão de células preparada por sus- pender estas células em um tampão adequado, como PBS. A seguir, as suspensões de células são lavadas apropriadamente com um tam- pão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle é adicionado a elas. A inten- sidade de fluorescência e o número de células marcadas com o anti- corpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As molé- culas de ligação ao antígeno teste e de controle são diluídas apropria- damente usando um tampão adequado, e são usadas nas concentra- ções desejadas. Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concen- tração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluo- rescência é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticor- po marcado ligado às células. Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle, que são repre- sentadas pela quantidade de anticorpo marcado ligado, podem ser de- terminadas mediante a medição do valor geométrico médio.
[0879] No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de li- gação ao antígeno que "não se liga substancialmente às células que expressam IgE mutante", por exemplo, por meio do seguinte método. Primeiro, as moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle liga- das às células que expressam IgE mutante são marcadas com um an- ticorpo marcado. Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada. Quando FACSCalibur é usado para a detecção da fluo- rescência por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência de- terminada pode ser analisada usando o programa CELL QUEST. A partir dos valores médios geométricos na presença e na ausência do complexo de polipeptídeo, o valor de comparação (∆média-Geo) pode ser calculado de acordo com a seguinte fórmula para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resultado da ligação pela molécula de ligação ao antígeno.
[0880] ∆média-Geo=média-Geo (na presença do complexo de po- lipeptídeo)/média-Geo (na ausência do complexo de polipeptídeo)
[0881] O valor de comparação da média geométrica (valor da ∆- média-Geo para a molécula de IgE mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação ao antí- geno teste ligada às células que expressam IgE mutante, é comparado com o valor de comparação da ∆média-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação ao antígeno teste ligada às células que ex- pressam IgE. Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação ao antígeno teste usadas para determinar os valores de comparação da ∆média-Geo para células que expressam IgE e células que expres- sam IgE mutante são particularmente ajustadas, de preferência, para serem iguais ou substancialmente iguais. Uma molécula de ligação ao antígeno que foi confirmada como reconhecendo um epítopo em IgE é usada como uma molécula de ligação ao antígeno de controle.
[0882] Se o valor de comparação da ∆média-Geo de uma molécu- la de ligação ao antígeno teste para células que expressam o IgE mu- tante for menor que o valor de comparação da ∆média-Geo da molé- cula de ligação ao antígeno teste para células que expressam IgE em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais preferencial, 30%, e parti- cularmente, de preferência, 15% então, a molécula de ligação ao antí- geno teste "não se liga substancialmente às células que expressam
IgE mutante". A fórmula para determinar o valor da média-Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD biosciences). Quando a comparação mostra que os valo- res de comparação são substancialmente equivalentes, pode-se de- terminar que o epítopo para as moléculas de ligação ao antígeno teste e de controle é o mesmo. Domínio de ligação ao antígeno
[0883] Na presente invenção, um "domínio de ligação ao antígeno" pode ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antígeno de interesse. Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo:
[0884] regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anti- corpo;
[0885] um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado domínio A que está contido na proteína de membrana celular in vivo Avímero (Publicação Internacional No. WO 2004/044011, Publicação Interna- cional No.WO 2005/040229);
[0886] Adnectina contendo o domínio 10Fn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoproteína expressa sobre a mem- brana celular (Publicação Internacional No.WO 2002/032925);
[0887] Um aficorpo que é composto por um feixe de três hélices com 58 aminoácidos com base na estrutura do domínio de ligação à IgG da proteína A (Publicação Internacional No.WO 1995/001937);
[0888] Proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que são uma região exposta na superfície molecular das repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices antiparalelas, e um laço é repetidamente empilhada (Pu- blicação Internacional No.WO 2002/020565);
[0889] Anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro laços que suportam um lado de uma estrutura de cilindro composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente conservadas entre as moléculas de lipocalina como lipocali- na associada à gelatinase de neutrófilo (NGAL) (Publicação Interna- cional No.WO 2003/029462); e
[0890] A região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro da estrutura com formato de ferradura constituída por repeti- ções empilhadas do módulo de repetições ricas em leucina (LRR) do receptor de linfócito variável (VLR) que não tem a estrutura da imuno- globulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebra- dos sem mandíbulas como o peixe lampery e congro (WO 2008/016854). Os domínios de ligação ao antígeno preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo regiões variá- veis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo. Os exemplos preferenciais de domínios de ligação ao antígeno incluem "Fv de ca- deia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv 2 de cadeia única (scFv2)", "Fab", e "F(ab’)2".
[0891] Os domínios de ligação ao antígeno das moléculas de liga- ção ao antígeno da presente invenção podem se ligar a um epítopo idêntico. Tal epítopo idêntico pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Alternativamente, cada um dos domínios de ligação ao antí- geno das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção po- de se ligar a um epítopo diferente. Na presente invenção, o epítopo diferente pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Complexo imune
[0892] O complexo imune refere-se a uma estrutura relativamente estável produzida quando pelo menos um antígeno e pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno se ligam entre si para formar um complexo de maior peso molecular. Uma modalidade não limitante do complexo imune é, por exemplo, um agregado antígeno-anticorpo. Um método para avaliar a formação de complexos imunes que compreen- dem duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas será descrito depois neste relatório descritivo. Especificidade
[0893] "Específico" significa que uma das moléculas que a ligação especificamente não mostra qualquer ligação significativa a moléculas que não à única ou uma pluraridade de moléculas que se ligam a ela. Além disso, "específico" também é usado quando um domínio de liga- ção ao antígeno é específico para um epítopo particular dentre múlti- plos epítopos em um antígeno. Quando um epítopo ligado por um do- mínio de ligação ao antígeno está contido em múltiplos antígenos dife- rentes, as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antígenos que possuem o epítopo. Neste pedido, "não mostra que qualquer ligação significante" significa mostrar não mais do que 50%, geralmente não mais do que 30%, preferencialmente não mais do que 15%, particularmente prefe- rencialmente não mais do que 10%, e até mais preferencialmente não mais do que 5% da atividade de ligação a uma molécula de parceiro em direção a moléculas excetos a molécula de parceiro. Anticorpo
[0894] Na presente invenção, "anticorpo" se refere a uma imuno- globulina natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais co- mo plasma e soro de ocorrência natural, ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo. Alternativamente, os anticor- pos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas como recombinação genética. Os anticorpos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou subclasse de imunoglobulina que pertence a isso. As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. Destes isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Diversas se- quências de alótipos de regiões constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana devido a polimorfismos gêni- cos são descritas em "Sequences of proteins of immunological inte- rest", Publicação NIH No. 91-3242. Qualquer uma de tais sequências pode ser usada na presente invenção. Em particular, para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácidos nas posições 356 a 358 como indicado pela numeração EU pode ser DEL ou EEM. Várias se- quências de alótipos devido a polimorfismos genéticos foram descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", Publicação NIH No. 91-3242 para a região constante de Igκ (Kappa) humana e região constante de Igλ (Lambda) e qualquer uma das sequências pode ser usada na presente invenção.
[0895] Métodos para produzir um anticorpo com a atividade de li- gação desejada são conhecidos pelos especialistas na técnica. Abaixo está um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao IgA (anticorpo anti-IgA). Anticorpos que se ligam a antí- geno diferente de IgA também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a seguir.
[0896] Os anticorpos anti-IgA podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando métodos conhecidos. Os anticor- pos anti-IgA produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamífero incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que carreia um gene do anticorpo por técnicas de engenharia genética. Por sua vez, "anticorpos humanizados" ou "anticorpos quiméricos" estão inclu-
ídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.
[0897] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados por mé- todos de imunização convencionais usando uma proteína IgA como um antígeno de sensibilização. As células imunes resultantes são fun- didas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais. Então, os hibridomas que produzem um anticorpo anti- IgA podem ser selecionados por triagem das células produtoras de an- ticorpo monoclonal usando métodos de triagem convencionais.
[0898] Especificamente, a produção de anticorpo monoclonal é realizada, por exemplo, como mostrado abaixo. Por exemplo, uma pro- teína de IgA nativa purificada pode ser usada como um antígeno de sensibilização. Além disso, uma proteína recombinante compreenden- do uma sequência polipeptídica de IgA da SEQ ID NO: 2, que é regis- trada como L00022|IGHE*02 no IMGT/GENE-DB, é purificada para obter IgA solúvel do sobrenadante de cultura. Para expressar a proteí- na recombinante, em primeiro lugar, o gene de região constante da cadeia pesada de IgA da qual a sequência nucleotídica é descrita na SEQ ID NO: 3 pode ser expresso para obter a proteína de IgA mostra- da na SEQ ID NO: 2, que é usada como um antígeno de sensibilização para obter anticorpos. Isto é, células hospedeiras adequadas são transformadas inserindo uma sequência gênica que codifica IgA em um vetor de expressão conhecido. A proteína de IgA desejada é purifi- cada por métodos conhecidos das células hospedeiras ou do seu so- brenadante de cultura. Para a expressão do gene da região constante da cadeia pesada de IgA, a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 3 pode ser operacionalmente ligada à extremidade 3’ da sequên- cia sinal. Em outra modalidade não limitante, a sequência de polinu- cleotídeos da SEQ ID NO: 3 pode ser operacionalmente ligada à ex-
tremidade 3’ de uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência si- nal na extremidade 5’. Além disso, para purificar a proteína recombi- nante, um peptídeo marcador da purificação pode ser adicionado a- propriadamente ao terminal amino ou ao terminal carbóxi da SEQ ID NO: 2. GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 4) que é um marcador de Avi ligada via o ligante GGGGS (SEQ ID NO: 31) é um exemplo de uma modalidade não limitante deste. Um exemplo não limitante da produção de uma proteína recombinante similar a esta acima mencio- nado é um método como aquele descrito no Exemplo 1, onde uma pro- teína de IgA recombinante que foi expressa em combinação com uma cadeia leve é coletada da cultura de célula hospedeira recombinante, e em seguida purificada.
[0899] A proteína IgA purificada pode ser usada como um antígeno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo de IgA parcial pode, também, ser usada como um antígeno de sensibilização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese quí- mica com base na sequência de aminoácidos do IgA humana, ou por inserir um gene IgA parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido por degra- dar uma proteína IgA com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IgA parcial não se limitam a modalidades específicas. Uma região preferencial pode ser selecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. O número de amino- ácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptídeo com 8 a 50 resíduos, mais preferencial, 10 a 30 resíduos pode ser usado como um antígeno de sensibilização.
[0900] Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é pos-
sível usar uma proteína de fusão preparada por fundir um polipeptídeo ou peptídeo parcial desejado da proteína IgA com um polipeptídeo di- ferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antígenos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipep- tídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2ª ed. (Sambrook, J et al., Molecu- lar Cloning 2ª ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Os métodos para preparar IgA para ser usada como um antígeno de sensibilização, e métodos de imunização usando IgA são descritos es- pecificamente em PCT/JP2011/077619, e similares.
[0901] Não há limitação específica aos mamíferos a serem imuni- zados com o antígeno de sensibilização. Entretanto, é preferencial se- lecionar os mamíferos por considerar sua compatibilidade com as célu- las progenitoras a serem usadas para a fusão celular. Em geral, roedo- res como camundongos, ratos, e hamsters, coelhos, e macacos são preferencialmente usados.
[0902] Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibilização através de métodos conhecidos. Em geral, os métodos de imunização realizados incluem, por exemplo, a injeção intraperito- neal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos. Especificamente, um antígeno de sensibilização é diluído apropriada- mente com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução sali- na fisiológica, ou similares. Se for desejado, um adjuvante convencio- nal como adjuvante completo de Freund é misturado com o antígeno, e a mistura é emulsionada. A seguir, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 di-
as. Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antí- geno de sensibilização. Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, é algumas vezes desejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibili- zação a uma proteína carreadora como albumina ou hemocianina da lapa californiana para a imunização.
[0903] Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo desejado podem ser preparados usando imunização com DNA, como mencionado abaixo. A imunização com DNA é um método de imuniza- ção que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibilização em um animal imunizado como um resulta- do da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica a proteína do antígeno no animal. Em comparação aos métodos de imunização convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que a imunização com DNA seja superior em que:
[0904] - no caso em que o antígeno for uma proteína de membra- na, a estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se man- tém a estrutura da proteína membrânica como IgA; e
[0905] - não há necessidade de purificar o antígeno para imuniza- ção.
[0906] De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente invenção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que ex- pressa uma proteína IgA é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica IgA pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão ade- quado, e, então, ele é administrado a um animal a ser imunizado. De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponíveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de uma arma de genes para introduzir as partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imu- nizado. Os anticorpos que reconhecem IgA também podem ser produ- zidos pelos métodos descritos no PCT/JP2011/077619.
[0907] Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumento no título de um anticorpo de ligação a IgA é confirmado no soro. A seguir, as células imunes são coletadas do mamífero, e, então, submetidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes.
[0908] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas. As células de mieloma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado para triagem. Um marcador de seleção confere ca- racterísticas às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Deficiência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de HGPRT) e deficiência em timidina qui- nase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção. Célu- las com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipoxantina- aminopterina-timidina (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como sensibilidade à HAT). As células sensíveis à HAT não sintetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mor- tas. Entretanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.
[0909] As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK po- dem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8-
azaguanina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG), ou 5’-bromodeoxiuridina, respectivamente. As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimi- dina no seu DNA. Entretanto, células que são deficientes nestas enzi- mas podem sobreviver no meio de seleção, uma vez que elas não po- dem incorporar estes análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência à G418 fornecido pelo gene de re- sistência à neomicina confere resistência aos antibióticos de 2- desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de célu- las de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.
[0910] Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintes células podem ser preferencialmente usadas:
[0911] P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548- 1550);
[0912] P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immu- nology (1978)81, 1-7);
[0913] NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);
[0914] MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);
[0915] SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);
[0916] FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);
[0917] S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);
[0918] R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
[0919] Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por e- xemplo, um método de Kohler e Milstein e outros (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
[0920] Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular. Os agentes promotores de fusão incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila tam- bém é adicionada para aprimorar a eficiência da fusão.
[0921] A razão entre as células imunes e as células de mieloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Os meios de cultura a serem usados para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o cultivo de linhagens celulares de mi- eloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular. Além disso, su- plemento de soro como soro fetal bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura.
[0922] Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das cé- lulas imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima. A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) preaquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de gera lmente 30% a 60% (p/v). Isto é suavemente misturado para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A seguir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradualmente às células, e ele é cen- trifugado repetidamente para remover o sobrenadante. Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são desfavoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.
[0923] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um pe- ríodo de tempo suficiente. Tipicamente, o período é vários dias a vá- rias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo dese- jado são selecionados e clonados de modo único por métodos con-
vencionais de diluição limitante.
[0924] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados u- sando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuí- do pelo mieloma usado para a fusão celular. Por exemplo, células defi- cientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Especificamente, quando as células de mieloma sensíveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem-sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT a- cima por um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibri- domas desejados podem ser selecionados por cultura geralmente por vários dias até várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.
[0925] Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, sele- cionados e clonados isoladamente por métodos de triagem com base na reação antígeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, a atividade de um anticorpo de se ligar à IgA pode ser avaliada com base no princípio do ELISA. Por exemplo, IgA é imobilizada aos poços de uma placa de ELISA. Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas são colocados em contato com a IgA imobilizada nos poços, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticorpos ligados às cé- lulas podem ser detectados usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundongo. Os hibridomas que produzem um anticorpo desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pe- la triagem acima, e eles podem ser clonados por um método de dilui- ção limitante ou similares.
[0926] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assim preparados podem ser subcultivados em um meio de cultura conven- cional, e armazenados em nitrogênio líquido durante um longo perío- do.
[0927] Os hibridomas acima são cultivados por um método con- vencional, e os anticorpos monoclonais desejados podem ser prepara- dos a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibri- domas são administrados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos monoclonais são preparados a partir da ascite. O méto- do anterior é adequado para preparar anticorpos com alta pureza.
[0928] Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clo- nados a partir de células que produzem anticorpos como os hibrido- mas acima também podem ser preferencialmente usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor adequado, e ele é introduzi- do em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene. Os métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em veto- res, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por e- xemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767- 775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, conforme descrito abaixo.
[0929] Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (regi- ão V) de um anticorpo anti-IgA é preparado a partir de células de hibri- doma que produzem o anticorpo anti-IgA. Para este propósito, o RNA total é primeiro extraído dos hibridomas. Os métodos usados para a extração de mRNAs das células incluem, por exemplo:
[0930] - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemis- try (1979) 18(24), 5294-5299), e
[0931] - o método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156- 159)
[0932] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de purificação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares. Alter- nativamente, kits para extrair mRNA total diretamente das células, co- mo o kit de purificação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscien- ce) também são comercialmente disponíveis. Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibridomas que usam tais kits. Os cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma transcriptase reversa. Os cDNAs po- dem ser sintetizados usando o kit de síntese de cDNA primeira fita de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou similares. Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5’- RACE baseado em PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar cDNAs. Em tal processo de síntese de cDNA, os sítios de enzima de restrição ade- quados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as ex- tremidades de um cDNA.
[0933] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor. O vetor recombinante é então construído, e introduzido em E. coli ou si- milares. Após seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli formadora de colônia. A seguir, testa- se se o vetor recombinante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse por um método conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo didesóxi.
[0934] O método 5’-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA 5’- RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde. Um kit disponível para comer- cialização como o kit de amplificação de cDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a biblioteca de cDNA 5’-RACE.
[0935] O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblio- teca de cDNA 5’-RACE preparada como um molde. Iniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados 5 com base em sequências do gene do anticorpo conhecidas. As se- quências de nucleotídeos dos iniciadores variam dependendo da sub- classe de imunoglobulina. Portanto, é preferencial que a subclasse se- ja determinada com antecedência usando um kit disponível para co- mercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics).
[0936] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a amplificação de genes que codificam as cadeias pesadas γ1, γ2a, γ2b, e γ3 e as cadeias leves κ e γ são usados para isolar genes que codifi- cam IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que anela a um sítio da região constante próximo da região variável é usado como um inici- ador do lado 3’ para amplificar um gene da região variável de IgG. En- tretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de cDNA 5’ RACE é usado como um iniciador do lado 5’.
[0937] Os produtos de PCR assim amplificados são usados para reformar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de ca- deias pesadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação de IgA de uma imunoglobulina reforma- da como um indicador. Por exemplo, quando o objetivo é isolar um an- ticorpo contra IgA, é mais preferencial que a ligação do anticorpo a IgA seja específica. Um anticorpo ligação a IgA pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes etapas:
[0938] (1) colocar uma IgA em contato com um anticorpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibri- doma;
[0939] (2) detectar a ligação do anticorpo à IgA; e
[0940] (3) selecionar um anticorpo que se liga à IgA.
[0941] Métodos para detectar a ligação de um anticorpo à IgA são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo à IgA pode ser detectada pelas técnicas descritas acima como ELISA.
[0942] Os métodos de triagem de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de separação usando vetores de fago. Os métodos de tri- agem usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma população de células que ex- pressa um anticorpo policlonal. Os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante adequada para formar um Fv de cadeia úni- ca (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzidos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos são colocados em contato com um antígeno de interesse. Então, uma codificação de DNA scFv que tem a ativida- de de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido conforme ne- cessário para enriquecer o scFv que tem a atividade de ligação de interesse.
[0943] Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anti- corpo anti-IgA de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restri- ção que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. As enzimas de restrição preferenciais reco- nhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na se- quência de nucleotídeos do gene do anticorpo em uma baixa frequên- cia. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação corre-
ta. O cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IgA é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de expressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo. Nesse caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutu- ra na estrutura, um anticorpo quimérico é obtido. Na presente inven- ção, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Desta forma, em adição aos anti- corpos heteroquiméricos de camundongo/seres humanos, anticorpos aloquiméricos humano/humano estão incluídos nos anticorpos quimé- ricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo qui- mérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante. Especificamen- te, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropriada- mente colocada no lado 5’ de um vetor de expressão que carreia um DNA que codifica uma região constante (região C) desejada do anti- corpo. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.
[0944] Para produzir um anticorpo monoclonal anti-IgA, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os ge- nes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da ex- pressão. A região reguladora da expressão para expressão do anticor- po inclui, por exemplo, intensificadores e promotores. Além disso, uma sequência de sinal adequada pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das célu- las. Nos exemplos descritos abaixo, um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 5) pode ser usado como uma sequência de sinal. Entretanto, outras sequências de sinal adequadas podem ser ligadas. O polipeptídeo expresso é clivado na terminação carboxila da sequência acima, e o polipeptídeo resul- tante é secretado para o lado de fora das células como um polipeptí- deo maduro. Então, as células hospedeiras adequadas são transfor- madas com o vetor de expressão, e células recombinantes que ex- pressam o DNA que codifica o anticorpo anti-IgA são obtidas.
[0945] Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (ca- deia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes vetores de expressão para expressar o gene do anticorpo. Uma molécula de anticorpo que tem as cadeias H e L pode ser ex- pressa por co-transfectar a mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectiva- mente. Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transfor- madas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codifi- cam as cadeias H e L são inseridos (consulte a Publicação Internacio- nal No. WO 1994/011523).
[0946] Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de ex- pressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticorpos isolados em hospedeiros adequados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis ao isolamento dos anticorpos da presente invenção. As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células animais, células vegetais, e célu- las fúngicas. Especificamente, as células animais incluem, por exem- plo, as seguintes células.
[0947] células mamíferas: CHO (linhagem de célula de ovário de hamster chinesa), COS (Linhagem de célula de rim de macaco), mie- loma (Sp2/O, NS0, etc.), BHK (linhagem celular de rim de hamster de bebê), HEK293 (linhagem celular de rim embrionária humana com DNA de adenovírus cortado (Ad)5), célula PER.C6 (linhagem de célula retiniana embrionária humana transformada com genes E1A e E1B de
Adenovírus Tipo 5 (Ad5)), HeLa, Vero, HEK293 (linhagem de célula de rim embrionário humano com DNA de adenovírus cortado (Ad)5), ou esses (Current Protocols in Protein Science (maio de 2001, Unidade
5.9, Tabela 5.9.1));
[0948] células de anfíbio: oócitos de Xenopus, ou similares; e
[0949] células de inseto: sf9, sf21, Tn5, ou similares.
[0950] Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de ex- pressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Ni- cotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido. Células cultivadas do calo podem ser usadas apropriadamente para transformar células ve- getais.
[0951] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas:
[0952] leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces serevisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e
[0953] fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Aspergillus niger.
[0954] Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticor- po que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Por e- xemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Bacillus subtilis, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente invenção. Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de interesse são introduzidos nestas células por transfec- ção. As células transfectadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo de- sejado pode ser preparado a partir da cultura de células transforma- das.
[0955] Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgênicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante. Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um a- nimal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzi-
do. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por inserção na estrutura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseína de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Os anticorpos dese- jados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para au- mentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pe- la cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
[0956] Quando uma molécula de ligação ao antígeno aqui descrita é administrada a um ser humano, um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi modifi- cado artificialmente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e similares, pode ser usada apropriadamente como o do- mínio de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anti- corpos humanizados. Estes anticorpos modificados são produzidos apropriadamente por métodos conhecidos.
[0957] Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antí- geno aqui descrito é formada geralmente por três regiões determinan- tes de complementaridade (CDRs) que são separadas por quatro regi- ões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substanci- almente a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências de aminoácidos das CDRs são altamente diversas. Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm frequentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes especificidades de ligação. Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por en- xertia de CDR.
[0958] Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo humano reformado. Especificamente, os anticorpos humanizados pre- parados pela aplicação da tecnologia de enxertia da CDR, que enxerta as CDRs de um anticorpo animal não humano, como um anticorpo de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos. Técnicas de engenharia genética comuns para obter anticorpos hu- manizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR por extensão de sobreposição é conhecida como um método pa- ra enxertar uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR huma- na. Na PCR por extensão de sobreposição, uma sequência de nucleo- tídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser en- xertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs. Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para man- ter a função da CDR. Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de aminoácidos que tem alta identidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertada.
[0959] As sequências de nucleotídeos a serem ligadas são proje- tadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura. As FRs humanas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores. Como resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo é ligado aos DNAs que codificam a FR individual. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são projetadas para que elas se sobre- ponham umas com as outras. A seguir, uma reação de síntese de fita complementar é conduzida para anelar as regiões CDR sobrepostas dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo humano como molde. As FRs humanas são ligadas através das sequências de CDR de camundongo por esta reação.
[0960] O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5’ ou 3’, que são adi- cionados com sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura. Após o vetor re- combinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (vide publicação de Patente europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente inter nacional No. WO 1996/002576).
[0961] Por medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, podem-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação ao antígeno favorável quando ligados através das CDRs. Os resíduos de aminoácido nas FRs podem ser substituídos como neces- sário, para que as CDRs de um anticorpo humano reformado formem um sítio de ligação ao antígeno adequado. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas nas FRs por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações parciais na se- quência de nucleotídeos podem ser introduzidas em iniciadores que anelam à FR. Mutações na sequência de nucleotídeos são introduzi- das nas FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores. As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser selecionadas mediante a medição e avaliação da atividade do anticor- po mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método acima mencionado (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).
[0962] Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o repertório de genes de anticorpos humanos (consulte Publica- ções Internacionais Nos. WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.
[0963] Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por separação usando bibliotecas de anticorpos humanos também são co- nhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expres- sa como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície do fago pelo método de apresentação em fago. Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antí- geno pode ser determinada através da análise dos genes dos fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequên- cia da região V na estrutura com a sequência da região C de um anti- corpo humano desejado, e inserir isto em um vetor de expressão ade- quado. O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas células. Estes métodos já são conhecidos (consulte Publicações Internacionais Nos. WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
[0964] Em adição às técnicas descritas acima, técnicas de clona- gem de células B (identificação de cada sequência codificante do anti- corpo, clonagem e seu isolamento; uso na construção do vetor de ex- pressão de modo a preparar cada anticorpo (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, em particular); e similares) tal como descrito em Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) ou na Publicação Internacional No. WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo. Numeração EU e Numeração de Kabat
[0965] De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácido atribuídas à CDR e à FR do anticorpo são especificadas de acordo com a numeração de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Be- thesda, Md., 1987 e 1991)). Na presente invenção, quando uma molé- cula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, os aminoácidos da região variável são indicados de acordo com o sistema de numeração de Kabat (numeração Kabat), enquanto os aminoácidos da região constante são indicados de acordo com o sistema de numeração EU com base nas posições de aminoácido de Kabat. Condições de concentração de íon Condições de concentração de íon de metal
[0966] Em uma modalidade da presente invenção, a concentração de íon se refere a uma concentração de íon de metal. "Íons de metal" se refere a íons de elementos do grupo I exceto hidrogênio tais como metais alcalinos e elementos do grupo cobre, elementos do grupo II tais como metais alcalinoterrosos e elementos do grupo zinco, elemen- tos do grupo III exceto boro, elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tal como grupo ferro e elementos do grupo platina, elementos pertencentes ao subgrupo A de grupos V, VI e VII, e elementos de metal tais como antimônio, bismuto e polônio. Á- tomos de metal têm a propriedade de liberação de elétrons de valência para se tornarem cátions. Isso é referido como tendência à ionização. Metais com tendência à ionização forte são considerados ser quimi- camente atraentes.
[0967] Na presente invenção, íons de metal preferidos incluem, por exemplo, íon de cálcio. Íon de cálcio está envolvido em modulação de muitos fenômenos biológicos, incluindo contração de músculos tais como músculos esqueletal, liso e cardíaco; ativação de movimento, fagocitose e similar de leucócitos; ativação de mudança de formato, secreção e similar de plaquetas; ativação de linfócitos; ativação de mastócitos incluindo secreção de histamina; respostas celulares medi- adas por receptor α de catecolamina ou receptor de acetilcolina; exoci- tose; liberação de substâncias transmissoras dos terminais de neurô- nio; e fluxo axoplásmico em neurônios. Receptores de íon de cálcio intracelulares conhecidos incluem troponina C, calmodulina, parvalbu- mina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivados de uma origem comum em termos de evolução molecular. Há também muitos motivos de ligação de cálcio conhecidos. Tais motivos bem conhecidos incluem, por e- xemplo, domínios de caderina, EF-hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína cinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagula- ção sanguínea, lectinas tipo C de receptor aciaroglicoproteína e recep- tor de ligação à manose. Um domínio de receptores LDL, anexina, domínio tipo 3 de trombospondina e domínios tipo EGF.
[0968] Na presente invenção, quando o íon de metal é íon de cál-
cio, as condições de concentração de íon de cálcio incluem concentra- ções de íon de cálcio baixas e concentrações de íons de cálcio altas. "A atividade de ligação varia dependendo das concentrações de íons de cálcio" significa que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença nas condições entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma con- centração de íon de cálcio baixa. Alternativamente, a atividade de liga- ção a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio baixa do que uma concentra- ção de íon de cálcio alta.
[0969] Aqui, a concentração de íon de cálcio alta não é particular- mente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 100 M e 10 mM. Em outra mo- dalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 M e 5 mM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 400 M e 3 mM. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 M e 2 mM. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 400 M e 1 mM. Em particular, uma con- centração selecionada entre 500 M e 2,5 mM, que é próxima da con- centração de íon de cálcio no plasma (sangue) in vivo, é preferida.
[0970] Aqui, a concentração de íon de cálcio baixa não é particu- larmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 0,1 M e 30 M. Em outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,2 M e 20 M. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,5 M e 10 M. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 1 M e 5 M. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 2 M e 4 M. Em particular, uma concentração selecionada entre 1 M e 5 M, que é próxima da concentração de cálcio ionizado em endossomos iniciais in vivo, é preferida.
[0971] Aqui, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentra- ção de íon de cálcio selecionada entre 0,1 M e 30 M do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 100 M e 10 mM. Preferivelmente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentra- ção de íon de cálcio selecionada entre 0,5 M e 10 M do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 200 M e 5 mM. Ela significa particularmente preferivelmente que a atividade de ligação a antígeno na concentração de íon de cálcio no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que aquela na concentração de íon de cálcio no plas- ma in vivo; e especificamente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em concentração de íon de cálcio selecionada entre 1 M e 5 M do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 500 M e 2,5 mM.
[0972] Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mudada dependendo de concentrações de íon de metal pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Ativi- dade de Ligação" acima. Por exemplo, a fim de confirmar que a ativi- dade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno se torna maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa, a atividade de ligação a an- tígeno da molécula de ligação a antígeno em concentrações de íon de cálcio baixas e altas é comparada.
[0973] Na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" pode também ser ex- pressa como "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa". Na presente in- venção, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concen- tração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" é algumas vezes escrita como "a habilidade de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta". Também, "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa é reduzida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta" pode ser escrita como "a habilidade de ligação a antíge- no em uma concentração de íon de cálcio baixa é tornada mais fraca do que em uma concentração de íon de cálcio alta".
[0974] Quando determinando a atividade de ligação a antígeno, as condições outras que não concentração de íon de cálcio podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles especialistas na técnica e não são particularmente limitadas. Por exemplo, a atividade pode ser determinada a 37°C em tampão HEPES. Por exemplo, Bi acore (GE Healthcare) ou similar pode ser usado para a determinação. Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser avaliada fluindo o antí- geno como um analito sobre um chip no qual a molécula de ligação a antígeno é imobilizada. Quando o antígeno é um antígeno de mem- brana, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno para o antígeno de membrana pode ser avaliada fluindo a molécula de ligação a antígeno como um analito sobre um chip no qual o antígeno é imobilizado.
[0975] Uma vez que a atividade de ligação a antígeno de uma mo- lécula de ligação a antígeno da presente invenção é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentra- ção de íon de cálcio alta, a razão da atividade de ligação a antígeno entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta não é particularmen- te limitada. No entanto, a razão da KD (constante de dissociação) da molécula de ligação a antígeno para um antígeno em uma concentra- ção de íon de cálcio baixa com relação à KD em uma concentração de íon de cálcio alta, isto é, o valor de KD (3 M de Ca)/KD (2 mM de Ca), é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 10 ou mais e ainda mais preferivelmente 40 ou mais. O limite superior do valor KD (3 M de Ca)/KD (2 mM de Ca) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000 contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles espe- cialistas na técnica.
[0976] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a KD (constante de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de liga- ção a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, KD aparente (constante de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade. KD (constante de dissociação) e KD aparente (constante de dissociação aparente) podem ser determi- nadas através de métodos conhecidos daqueles especialistas na téc- nica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo.
[0977] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dis- sociação (kd) pode ser também preferivelmente usada como um índice para representar a razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção entre concentra- ções de cálcio baixa e alta. Quando a constante de taxa de dissocia- ção (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um índice para representar a razão de atividade de ligação, a razão da constante da taxa de dissociação (kd) entre concentrações de cálcio baixa e alta, isto é, o valor de kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta), é preferivelmente 2 ou mais, mais prefe- rivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente ainda 10 ou mais, e ainda mais preferivelmente 30 ou mais. O limite superior do valor de Kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200 contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles especialistas na técnica.
[0978] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a kd (constante da taxa de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a kd aparente (constante da taxa de dissociação apa- rente) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antí- geno. A kd (constante da taxa de dissociação) e a kd aparente (cons- tante da taxa de dissociação aparente) podem ser determinadas atra- vés de métodos conhecidos daqueles especialistas na técnica, por e- xemplo, usando Biacore (GE healthcare) ou citometria de fluxo. Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é determinada em concentrações de íon de cálcio diferentes, é preferencial usar as mesmas condições ex- ceto para concentrações de cálcio.
[0979] Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou molécu- la de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concen- tração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente inven- ção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo incluindo as etapas de:
[0980] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio baixa;
[0981] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e
[0982] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de cálcio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
[0983] Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concen- tração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente inven- ção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, incluindo as etapas de:
[0984] contato de um antígeno com um domínio de ligação a antí- geno ou molécula de ligação ao antígeno ou uma biblioteca do mesmo em uma concentração de cálcio alta;
[0985] incubação em uma concentração de cálcio baixa de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno na etapa (a); e
[0986] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou molé- cula de ligação ao antígeno dissociado na etapa (b).
[0987] Ainda, o domínio de ligação a antígeno ou molécula de li- gação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa que aquela em uma concen- tração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente inven- ção, pode ser obtido através de avaliação de domínios ou moléculas de ligação ao antígeno de ligação a antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, incluindo as etapas de:
[0988] contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno em uma con- centração de cálcio baixa;
[0989] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno que não se liga ao antígeno na etapa (a);
[0990] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno selecionado na etapa (c) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e
[0991] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou molé- cula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno na etapa (c).
[0992] Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentra- ção de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente inven- ção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreen- dendo as etapas de:
[0993] contato em uma concentração de cálcio alta de uma biblio- teca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno com uma coluna na qual um antígeno é imobilizado;
[0994] eluição de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno que se ligou à coluna na etapa (a) da coluna em uma concentração de cálcio baixa; e
[0995] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno eluído na etapa (b).
[0996] Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que aquela em uma con- centração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação com-
preendendo as etapas de:
[0997] permitir em uma concentração de cálcio baixa que uma bi- blioteca de domínio de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno passe por uma coluna na qual um antígeno é imobilizado;
[0998] coleta de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno que foi eluído sem ligação à coluna na etapa (a);
[0999] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno coletado na etapa (b) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e
[01000] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou molé- cula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno na etapa (c).
[01001] Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concen- tração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente inven- ção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreen- dendo as etapas de:
[01002] contato de uma molécula de ligação ao antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno em uma concentração de cálcio alta;
[01003] obtenção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno na etapa (a);
[01004] incubação em uma concentração de cálcio baixa do domí- nio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno obtido na etapa (b); e
[01005] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou molé- cula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o critério para a seleção da etapa (b).
[01006] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, os quais são obtidos através de métodos de avaliação que compreendem ainda a etapa de repetição duas ou mais vezes das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima. O número de ciclos das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) não é particularmente limitado, mas geral- mente é 10 ou menos.
[01007] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a ativida- de de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou mo- lécula de ligação ao antígeno em uma concentração de cálcio baixa não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizado entre 0,1 M e 30 M, mas preferivelmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 0,5 M e 10 M. Mais preferivelmente, ela é uma atividade de ligação a antígeno na concen- tração de cálcio ionizado no endossomo inicial in vivo, especificamente entre 1 M e 5 M. No entanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno em uma concentração de cálcio alta não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 100 M e 10 mM, mas preferi- velmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 200 M e 5 mM. Mais preferivelmente, ela é uma atividade de ligação a antígeno na concentração de cálcio ioniza- da em plasma in vivo, especificamente entre 0,5 mM e 2,5 mM.
[01008] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno pode ser medida atra- vés de métodos conhecidos daqueles especialistas na técnica. Condi- ções que não a concentração de cálcio ionizado podem ser determi-
nadas por aqueles especialistas na técnica. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno pode ser avaliada como uma constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD aparente), constante de taxa de dissociação (kd), constante de dissociação aparente (kd) apa- rente e similar. Essas podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles especialistas na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
[01009] Na presente invenção, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja ativida- de de ligação a antígeno é maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concentração de cálcio baixa é sinônimo da etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de cálcio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
[01010] Embora a atividade de ligação a antígeno seja maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concentração de cál- cio baixa, a diferença na atividade de ligação a antígeno entre concen- trações de cálcio alta e baixa não á particularmente limitada; no entan- to, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais do que em uma concentração de cálcio baixa.
[01011] Os domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção a serem avaliados através dos mé- todos de avaliação descritos acima podem ser quaisquer domínios de ligação a antígeno e moléculas de ligação ao antígeno. Por exemplo, é possível avaliar os domínios de ligação a antígeno e moléculas de li- gação ao antígeno descritos acima. Por exemplo, domínios de ligação a antígeno ou as moléculas de ligação ao antígeno tendo sequências naturais ou sequências de aminoácido substituídas podem ser avalia- dos. Bibliotecas
[01012] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser obtido de uma biblioteca que é principalmente composta de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno têm pelo me- nos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a an- tígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concen- trações de íon. As concentrações de íon incluem preferivelmente, por exemplo, concentração de íon de metal e concentração de próton.
[01013] Aqui, uma "biblioteca" se refere a uma pluralidade de molé- culas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando suas sequências. As sequências de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralida- de de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antíge- no em uma biblioteca não são idênticas, mas são diferentes uma das outras.
[01014] Aqui, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" na expressão "uma pluralidade de moléculas de ligação a antí- geno cujas sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca são diferentes umas das outras. Especificamente, em uma biblioteca, o número de sequências diferentes umas das outras reflete o número de clones independentes com sequências diferentes e pode também ser referido como "tamanho da biblioteca". O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago convencional varia de 106 a 1012.
O tamanho da biblioteca pode ser aumentado até 1014 através do uso de técnicas conhecidas tal como exibição de ribossomo. No entanto, o número real de partículas de fago usadas em seleção por "separação" de uma biblioteca de fago é em geral 10-10000 vezes maior do que o tamanho da biblioteca. Essa multiplicidade em excesso é também refe- rida como "o número de equivalentes de biblioteca" e significa que há a 10.000 clones individuais que têm mesma sequência de aminoá- cido. Desta maneira, na presente invenção, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de molé- culas de ligação a antígeno independentes em uma biblioteca, exclu- indo equivalentes de biblioteca, são diferentes umas das outras. Mais especificamente, o acima significa que há 106 a 1014 moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras, preferivelmente 107 a 102 moléculas, mais preferivelmente 108 a 1011 moléculas e particularmente preferivelmente 108 a 1010 moléculas cujas sequências são diferentes umas das outras.
[01015] Aqui, a expressão "uma pluralidade de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno" geralmente se refere a, no caso de, por exem- plo, moléculas de ligação a antígeno, polipeptídeos de fusão, molécu- las de polinucleotídeo, vetores ou vírus da presente invenção, um gru- po de dois ou mais tipos da substância. Por exemplo, quando duas ou mais substâncias são diferentes umas das outras em uma característi- ca particular, isso significa que há dois ou mais tipos da substância. Tais exemplos podem incluir, por exemplo, aminoácidos mutantes ob- servados em posições de aminoácido específicas em uma sequência de aminoácido. Por exemplo, quando há duas ou mais moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são subs- tancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos resíduos flexíveis ou exceto pelos aminoácidos mutantes particulares em posi-
ções hipervariáveis expostas na superfície, há uma pluralidade de mo- léculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em outro exem- plo, quando há duas ou mais moléculas de polinucleotídeo cujas se- quências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos nucleotídeos codificando resíduos flexíveis ou nucleotídeos codi- ficando aminoácidos mutantes das posições hipervariáveis expostos sobre a superfície, há uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.
[01016] Ainda, aqui, a expressão "composta principalmente de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralida- de de moléculas de ligação a antígeno" reflete o número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de- pendendo das concentrações de íon, dentre clones independentes com sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, é pre- ferencial que haja pelo menos 104 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação em uma biblioteca. Mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 105 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Mais preferivel- mente ainda, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 106 molé- culas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Particular- mente preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 107 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de li- gação. Ainda mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 108 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Alternativamente, isso pode ser também preferivelmente ex- presso como a razão do número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concentra- ções de íon com relação ao número de clones independentes tendo sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, os domí- nios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca em que moléculas de ligação a antígeno tendo tal ativi- dade de ligação são responsáveis por 0,1% a 80%, preferivelmente 50% a 60%, mais preferivelmente 1% a 40%, ainda mais preferivel- mente 2% a 20% e particularmente preferivelmente 4% a 10% de clo- nes independentes com sequências diferentes na biblioteca. No caso de polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo ou vetores, expressões similares podem ser possíveis usando o número de molé- culas ou a razão do número total de moléculas. No caso de vírus, ex- pressão similar pode também ser possível usando o número de vírions ou a razão para número total de vírions. Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domí- nios de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon.
[01017] Domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente invenção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descri- tos acima podem ser preparados de qualquer maneira. Por exemplo, quando o íon de metal é íon de cálcio, é possível usar moléculas de ligação ao antígeno preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de fago, etc.), moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas prepa- radas a partir de hibridomas obtidos através da imunização de animais ou a partir de células D de animais imunizados, moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas obtidos através da introdução de aminoáci- dos capazes de quelação de cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais nos anticor- pos ou bibliotecas descritos acima (aminoácidos quelatáveis com cál- cio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico), bibliotecas com teor alto de aminoácidos não naturais, bibliotecas preparadas através da introdução de aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais em posições particulares ou similar.
[01018] Exemplos dos aminoácidos que alteram a atividade de liga- ção a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme descrito acima podem ser quaisquer tipos de aminoácidos contanto que os aminoácidos formem um motivo de ligação de cálcio. Motivos de ligação de cálcio são bem conhecidos daqueles especialistas na técnica e foram descritos em detalhes (por exemplo, Springer e outros (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki e Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief e outros (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux e outros (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch e Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer e outros (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou e outros (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg e outros (Structure (2006) 14, 6, 1049-1058)). Especificamente, quais- quer motivos de ligação de cálcio conhecidos, incluindo lecitinas tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR e DC-SIGN, podem ser incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Exemplos pre- feridos de tais motivos de ligação de cálcio preferidos também inclu- em, em adição àqueles descritos acima, por exemplo, o motivo de li- gação de cálcio no domínio de ligação de antígeno de SEQ ID NO: 6.
[01019] Ainda, como aminoácidos que alteram a atividade de liga- ção a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio, por exemplo, aminoácidos tendo ativi- dade de quelação de metal podem ser também preferivelmente usa- dos. Exemplos de tais aminoácidos de quelação de metal incluem, por exemplo, serina (Ser(S)), treonina (Thr(R)), asparagina (Asn(N)), glu- tamina (Gln(Q)), ácido aspártico (Asp(D)) e ácido glutâmico (Glu(E)).
[01020] As posições nos domínios de ligação a antígeno nos quais os aminoácidos descritos acima estão contidos não são particularmen- te limitadas a posições particulares e podem ser quaisquer posições dentro da região variável de cadeia pesada ou região variável de ca- deia leve que forma um domínio de ligação a antígeno, contanto que elas alterem a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Especifi- camente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção po- dem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia pesada contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pe- sada contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de mo- léculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os ami- noácidos mencionados acima nas posições 95, 96, 100a e/ou 101 con- forme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[01021] Entretanto, em uma modalidade da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser ob- tidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das ou- tras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia leve contêm a- minoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de molécu- las de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca com- posta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas se- quências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente in- venção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta princi- palmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 30, 31 e/ou 32 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[01022] Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê bibliotecas compostas principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posi- ção 50 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[01023] Em ainda outra modalidade da presente invenção, os do- mínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obti- dos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de liga- ção a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cu- jos domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoá- cido mencionados acima. Em uma modalidade alternativa, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antíge-
no cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CD3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido menciona- dos acima na posição 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[01024] Ainda, em uma modalidade diferente da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e em que duas ou três CDRs selecionadas de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve descritas acima contêm os resíduos de aminoácido men- cionados acima. Além disso, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujas cadeias leves contêm os resí- duos de aminoácido mencionados acima em qualquer uma ou mais das posições 30, 31, 32, 50 e/ou 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[01025] Em uma modalidade particularmente preferida, as sequên- cias de estrutura principal da região variável de cadeia leve e/ou ca- deia pesada de uma molécula de ligação a antígeno contêm preferi- velmente sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, quando as sequências de estrutura principal são sequências comple- tamente humanas, é esperado que quando tal molécula de ligação a antígeno da presente invenção for administrada a seres humanos (por exemplo, para tratar doenças), ela induza pouca ou nenhum resposta imunogênica. No sentido acima, a expressão "contendo uma sequên- cia de linhagem germinativa" na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura principal da presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Por exemplo, quando a sequência FR2 de cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada de sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana diferentes, tal molécula é também uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção "contendo uma sequência de linhagem germina- tiva".
[01026] Exemplos preferidos das estruturas principais incluem, por exemplo, sequências de região de estrutura principal integralmente humanas atualmente conhecidas, que estão incluídas no website da V- Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) o outros. Essas sequências de região de estrutura principal podem ser apropriadamente usadas como uma sequência de linhagem germinativa contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser categorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson e outros, (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams e Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox e outros (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Sequências de linhagem germinativa apropriadas podem ser selecionadas de Vk, que é agrupada em sete subgrupos: Vλ, que é agrupada em dez subgrupos; e VH, que é agru- pada em sete subgrupos.
[01027] Sequências de VH integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, sequências VH de:
[01028] subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1- 18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69);
[01029] subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70);
[01030] subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74);
[01031] subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-39, VH4-59 e VH4-61);
[01032] subgrupo VH5 (VH5-51);
[01033] subgrupo VH6 (VH6-1); e
[01034] subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81).
[01035] Essas são também descritas em documentos conhecidos (Matsuda e outros, (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975) e similar e então, pessoas versadas na técnica podem apropriadamente projetar moléculas de ligação a antígeno da presente invenção com base na informação dessas sequências. É também preferencial usar outras es- truturas principais ou sub-regiões de estrutura principal integralmente humanas.
[01036] Sequências Vκ integralmente humanas incluem preferivel- mente, mas não estão limitadas a, por exemplo:
[01037] A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupados em subgrupo Vk1;
[01038] A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 E O11 agrupa- das em subgrupo Vk2;
[01039] A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25 agrupadas em sub- grupo Vk3;
[01040] B3 agrupada em subgrupo Vk4;
[01041] B2 (aqui também referida como Vk5-2) agrupada em sub- grupo Vk5; e
[01042] A10, A14 e A26 agrupadas em subgrupo Vk6
[01043] (Kawasaki e outros (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017- 1028); Schable e Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001- 1022); Bresing-Kuppers e outros (Gene (1997) 191, 173-181).
[01044] Sequências de Vλ integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo:
[01045] V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22 agrupados em subgrupo VL1;
[01046] V2-1, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2- 19 agrupadas no subgrupo VL1;
[01047] V3-2, V3-3 e V3-4 agrupadas em subgrupo VL3;
[01048] V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6 agrupados no subgrupo VL4; e
[01049] V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6 agrupadas no subgrupo VL5 (Ka- wasaki e outros (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
[01050] Normalmente, essas sequências de estrutura principal são diferentes umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácido. Essas sequências de estrutura principal podem ser usadas em combi- nação com "pelo menos um resíduo de aminoácido" que altera a ativi- dade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon" da presente invenção. Outros exemplos das estruturas principais integralmente humanas usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon" da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat e outros (1991) supra; Wu e ou- tros (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
[01051] Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, uma razão para a expectativa que o uso de sequências de linhagem germi- nativa precluda respostas imunes adversas na maioria dos indivíduos é acreditada ser como segue. Como um resultado do processo de ma- turação por afinidade durante respostas imunes normais, mutação so- mática ocorre frequentemente nas regiões variáveis de imunoglobuli- na. Tais mutações ocorrem principalmente em torno das CDRs cujas sequências são hipervariáveis, mas também afetam resíduos de regi-
ões de estrutura principal. Tais mutações de estrutura principal não existem nos genes da linhagem germinativa, e também elas são me- nos prováveis de ser imunogênicas em pacientes. Por outro lado, a população humana normal é exposta à maioria das sequências de es- trutura principal expressas a partir dos genes de linhagem germinativa. Como um resultado de imunotolerância, essas estruturas principais de linhagem germinativa são esperadas ter imunogenicidade baixa ou nenhuma em pacientes. Para maximizar a possibilidade de imunotole- rância, genes de codificação de região variável podem ser seleciona- dos de um grupo de genes de linhagem germinativa funcional de ocor- rência comum.
[01052] Métodos comuns tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente em- pregados para produzir as moléculas de ligação a antígeno da presen- te invenção em que as sequências de região variável, sequências de região variável pesada e leves, sequências de CDR, ou sequências de estrutura principal descritas acima contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio.
[01053] Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas se- quências são diferentes umas das outras pode ser construída combi- nando regiões variáveis de cadeia pesada preparada como uma biblio- teca de sequência de região variável aleatorizada com uma região va- riável de cadeia leve selecionada como uma sequência de estrutura principal originalmente contendo pelo menos um resíduo de aminoáci- do que altera a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Como um exemplo não limitante, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, a- quelas construídas através da combinação da sequência de região va- riável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 (Vk5-2) e a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada.
[01054] Alternativamente, uma sequência de região variável de ca- deia leve selecionada como uma região de estrutura principal conten- do originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno conforme acima mencionado pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido que não os resíduos de aminoácido acima. Aqui, tais resíduos são referidos como resíduos flexíveis. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, con- tanto que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo de concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 (Vk5-2) incluem os resíduos de aminoácido listados na Tabela 1 ou 2.
Tabela 1 Posição 70% do Total
[01056] (Posição indica numeração Kabat)
Tabela 2 Numeração 30% de aminoácidos do total Kabat
[01058] (Posição indica numeração Kabat)
[01059] Aqui, resíduos flexíveis se referem a variações de resíduo de aminoácido presentes em posições hipervariáveis nas quais vários aminoácidos diferentes estão presentes nas regiões variáveis de ca- deia leve e cadeia pesada quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou nativos ou domínios de ligação a antígeno são comparadas. Posições hipervariáveis estão em geral localizadas nas regiões de CDR. Em uma modalidade, os dados providos por Ka- bat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda, Md.) (1987 e 1991) são úteis para determinar po-
sições hipervariáveis em anticorpos conhecidos ou nativos. Ainda, banco de dados na internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) provê as sequências coletadas de muitas cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localiza- ções. A informação sobre as sequências e localizações é útil para de- terminar posições hipervariáveis na presente invenção. De acordo com a presente invenção, quando uma certa posição de aminoácido tem preferivelmente cerca de 20 a cerca de 20 variações de resíduo de a- minoácido possíveis, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 19, prefe- rivelmente cerca de 4 a cerca de 18, preferivelmente 5 a 17, preferi- velmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, preferivelmente 8 a 14, prefe- rivelmente 9 a 13 e preferivelmente 10 a 12 variações de resíduo de aminoácido possíveis, a posição é hipervariável. Em algumas modali- dades, uma certa posição de aminoácido pode ter preferivelmente pelo menos cerca de 2, preferivelmente pelo menos cerca de 4, preferivel- mente pelo menos cerca de 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, preferivelmente cerca de 10 e preferivelmente cerca de 12 variações de resíduo de aminoácido.
[01060] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas se- quências são diferentes umas das outras pode ser construída combi- nando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma bibli- oteca de sequência de região variável aleatorizada com regiões variá- veis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme menciona- do acima é introduzido. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem, por exemplo, bibliotecas em que regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável alea-
torizada são combinadas com sequências de região variável de cadeia leve em que um resíduo(s) particular em uma sequência de linhagem germinativa tal como SEQ ID NO: 7 (Vk1), SEQ ID NO: 8 (Vk2), SEQ ID NO: 9 (Vk3) ou SEQ ID NO: 10 (Vk4) foi substituído com pelo me- nos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a an- tígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concen- trações de íon de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR1 de cadeia leve. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido inclu- em resíduos de aminoácido em CDR2 de cadeia leve. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem resí- duos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve.
[01061] Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos em CDR1 de cadeia leve incluem aqueles nas posições 30, 31 e/ou 32 na CDR1 de região variável de cadeia leve conforme indi- cado por numeração EU. Ainda, exemplos não limitantes de tais resí- duos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem um re- síduo de aminoácido na posição 50 na CDR2 de região variável de ca- deia leve conforme indicado por numeração Kabat. Além disso, exem- plos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 92 na CDR3 de região variável de cadeia leve conforme indicado por nume- ração Kabat. Os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozi- nhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de liga- ção de cálcio e/ou contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentra- ções de íon de cálcio. Entretanto, como troponina C, calmodulina, par- valbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivadas de uma origem co- mum em termos de evolução molecular, são conhecidas, a CDR1,
CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve pode ser projetada para ter seus mo- tivos de ligação. Por exemplo, é possível usar domínios de caderina, EF hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína Cinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação de sangue, lectinas tipo C de receptor de aciaroglicoproteína e receptor de ligação de manose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio tipo 3 da trombos- podina e domínios tipo EGF de uma maneira apropriada para os pro- pósitos acima.
[01062] Quando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada e regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molé- cula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon foi introduzido são combinadas conforme descrito acima, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são particularmente limitados às modalidades particulares contanto que a atividade de ligação a an- tígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequên- cias de CDR e/ou sequências FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variá- vel de cadeia leve incluem os resíduos de aminoácido listados nas Ta- belas 1 e 2.
[01063] As regiões variáveis de cadeia pesada preferidas a serem combinadas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável alea- torizadas. Métodos conhecidos são combinados conforme apropriado para produzir uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infec- ções, pessoas com um título de anticorpo elevado no sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou pacientes com do- ença autoimune, pode ser preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
[01064] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética produzida substituindo as sequências de CDR de genes V em DNA genômico ou genes V remodelados funcionais com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também preferivelmente usada como uma biblioteca de região va- riável aleatorizada. Neste caso, uma vez que diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, é também possível substituir a sequência de CDR3 apenas. Um critério de con- cessão de origem à diversidade em aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é que esta diversidade é dada a resíduos de aminoácido em posições de superfície exposta na molécu- la de ligação a antígeno. A posição de superfície exposta se refere a uma posição que é considerada ser capaz de ser exposta na superfí- cie e/ou contatada com um antígeno, com base em estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno. Em geral, tais posições são CDRs. Preferivelmente, posi- ções de superfície exposta são determinadas usando coordenada de um modelo tridimensional de uma molécula de ligação a antígeno u- sando um programa de computador tal como o programa InsightII (Ac- celrys). Posições de superfície exposta podem ser determinadas u- sando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16,
548-558)). Determinação das posições de superfície exposta pode ser realizada usando software adequado para modelagem de proteína e informação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo. O softwa- re que pode ser usado para esses propósitos preferivelmente inclui SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates). Em geral ou preferivelmente, quando um algoritmo requer um parâmetro de tama- nho de registro de usuário, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstroms ou menor em raio. Ain- da, métodos para determinação de regiões e áreas de superfície ex- posta usando software para computadores pessoais são descritos por Pacios (Compu. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
[01065] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura, que é construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e cujo repertório consiste em sequências puras, que são sequências de anticorpo sem nenhuma predisposição, pode ser também particularmente preferivelmente usa- da como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e ou- tros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso e outros (Scand, J. Immunol. (2000) 51, 337-344). Aqui, uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência nativa se refere a uma sequência de aminoácido obtida de tal biblioteca pura.
[01066] Em uma modalidade da presente invenção, um domínio de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtido a partir de uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras, preparadas através da combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia pesada sele- cionada como uma sequência de estrutura principal que contém origi-
nalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a ativida- de de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno de- pendendo de concentrações de íon". Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais biblio- tecas incluem preferivelmente aquelas construídas através de combi- nação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma bi- blioteca de sequência de região variável aleatorizada com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 12 (6KC4-1#85-IgG1). Alternativamente, tal biblioteca pode ser construída através de seleção de regiões variáveis de cadeia leve apropriadas a partir daquelas tendo sequências de linhagem ger- minativa, ao invés de regiões variáveis de cadeia leve construídas co- mo uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada. Tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, aquelas em que a se- quência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 12 (6KC4-1#85-IgG1) é combinada com regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germi- nativa.
[01067] Alternativamente, a sequência de uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" conforme mencionado acima pode ser projetada para conter resíduos flexíveis. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon. Especificamente, as se- quências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de ca- deia pesada de SEQ ID NO: 11 (6RL#9-IgG1) incluem todos os resí- duos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resí- duos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições 95, 96 e/ou 100a. Alternativamente, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região va- riável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 12 (6KC4-1#85-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada exceto aque- les nas posições de aminoácido 95 e/ou 101.
[01068] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo se- quências de linhagem germinativa com regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido responsável pela mudança dependente da concentração de íons na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" foi introdu- zido como acima mencionado. Quando a concentração de íon é con- centração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas em que regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa são combinadas com a sequência de uma região variável de cadeia pesada em que um resíduo(s) particular foi substitu- ído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno depen- dendo de concentrações de íon de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada. Exemplos não limitantes adicionais de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoáci- do incluem também resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pe- sada. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido de C- DR3 de cadeia pesada incluem os aminoácidos das posições 95, 96, 100a e/ou 101 na CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme indicado pela numeração Kabat. Ainda, esses resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de cálcio.
[01069] Quando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequência de linhagem germinativa são combinadas com uma região variável de cadeia pesada na qual pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente de con- centrações de íon conforme mencionado acima foi introduzido, a se- quência da região variável de cadeia pesada pode ser também proje- tada para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particular- mente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie de- pendendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR de cadeia pesada e/ou FR podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Ainda, bibliotecas de região variável aleatorizada podem ser preferivelmente usadas como sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ao invés dos resíduos de aminoácido que alteram a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno. Quando sequências de linha- gem germinativa são usadas como regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes de tais sequências incluem aqueles de SEQ ID NO: 7 (Vk1), SEQ ID NO: 8 (Vk2), SEQ ID NO: 9 (Vk3) e SEQ ID NO: 10 (Vk4).
[01070] Qualquer um dos aminoácidos descritos acima que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente de concentração de íons de cálcio pode ser preferivelmen- te usado, contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio. Especificamente, tais aminoácidos incluem aminoácidos doadores de elétron. Exemplos preferidos de tais aminoácidos doadores de elétron incluem serina, treonina, asparagina, ácido glutâmico, ácido aspártico e ácido glutâmico. Condição de concentrações de prótons
[01071] Em uma modalidade da presente invenção, a condição de concentrações de íon se refere à condição de concentrações de próton ou condição de pH. Na presente invenção, a concentração de próton, isto é, o núcleo de átomos de hidrogênio, é tratada como sinônimo com índice de hidrogênio (pH). Quando a atividade de íon de hidrogê- nio em uma solução aquosa é representada como aH+, pH é definido como -log10aH+. Quando a resistência iônica da solução aquosa é baixa (por exemplo, menor do que 10-3), aH+ é quase igual à resistên- cia do próton. Por exemplo, o produto iônico de água a 25°C e 1 at- mosfera é Kw=aH+aOH=10-14 e então em água pura, aH+=aOH=10-
7. Neste caso, pH=7 é neutro; uma solução aquosa cujo pH é menor do que 7 é ácida ou cujo pH é maior do que 7 é alcalina.
[01072] Na presente invenção, quando a condição de pH é usada como a condição de concentração de íon, condições de pH incluem concentrações de próton altas ou pHs baixos, isto é, uma faixa de pH ácido, e concentrações de próton baixas ou pHs altos, isto é, uma fai-
xa de pH neutra. “A atividade de ligação varia dependendo da condi- ção de pH” significa que a atividade de ligação a antígeno de uma mo- lécula de ligação a antígeno varia devido à diferença em condições de uma concentração de próton alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) 5 e uma concentração de próton baixa ou pH alto (uma faixa de pH neu- tra). Isso inclui, por exemplo, o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH neutra do que em uma faixa de pH ácido e o caso em que a ati- vidade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH ácido do que em uma faixa de pH neutra.
[01073] No presente relatório, a faixa de pH neutra não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH 6,7 e pH 10,0. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 6,7 e pH 9,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH9,0. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser seleciona- do entre pH7,0 e pH8,0. Em particular, o pH preferido inclui pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo.
[01074] No presente relatório, uma faixa de pH ácido não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH4,0 e pH6,5. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH4,5 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH5,0 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser seleciona- do entre pH5,5 e pH6,5. Em particular, o pH preferido inclui pH 5,8, que está próximo da concentração de próton no endossomo inicial in vivo.
[01075] Na presente invenção, “a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de próton alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) é menor do que aquela em uma concentração de próton baixa ou pH alto (uma faixa de pH neu- tra)” significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,0 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH6,7 e pH10,0; preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,5 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado en- tre pH6,7 e pH9,5; mais preferivelmente, significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH5,0 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH7,0 e pH9,0; mais preferencial ainda significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH5,5 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH7,0 e pH8,0; particular- mente preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno no pH no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno no pH de plasma in vivo; e especificamente signifi- ca que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que a atividade de ligação a antí- geno em pH 7,4.
[01076] Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno mudou pela condição do pH pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" acima. Espe- cificamente, a atividade de ligação é medida sob condições de pH dife- rentes usando os métodos de medição descritos acima. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno é comparada sob as condições de faixa de pH ácido e faixa de pH neutra para confirmar que a atividade de ligação a antígeno da mo- lécula de ligação a antígeno muda para ser maior sob condição de fai- xa de pH neutra do que aquela sob condição de faixa de pH ácido.
[01077] Além disso, na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação ao antígeno em uma alta concentração de prótons ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH acídica, é mais baixa do que aquela em uma baixa concentração de prótons ou alto pH, isto é, em uma fai- xa de pH neutra" também pode ser expressa como "a atividade de li- gação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em uma baixa concentração de prótons ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutra, é mais alta do que aquela em uma alta concentração de pró- tons ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH acídica". Na presente invenção, "a atividade de ligação ao antígeno em uma alta concentra- ção de prótons ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH acídica, é mais baixa do que aquela em uma baixa concentração de prótons ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutra" pode ser descrito como "a atividade de ligação ao antígeno em uma alta concentração de prótons ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH acídica, é mais fraca do que a capacidade de ligação ao antígeno em uma baixa concentração de prótons ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutra". Alternativamen- te, "a atividade de ligação ao antígeno em uma alta concentração de prótons ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH acídica, é reduzida por ser mais baixa do que aquela em uma baixa concentração de pró- tons ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutra" pode ser descrito como "a atividade de ligação ao antígeno em uma alta concentração de prótons ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH acídica, é reduzida por ser mais fraca do que a capacidade de ligação ao antígeno em uma baixa concentração de prótons ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutra".
[01078] As condições que não concentração de prótons ou pH para medição da atividade de ligação a antígeno podem ser adequadamen- te selecionadas por aqueles especialistas na técnica e não são particu- larmente limitadas. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão HEPES. As medições podem ser rea lizadas, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare). Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser determinada através da avaliação da atividade de ligação para o antígeno solúvel ao despejar o antígeno como um analito em um chip imobilizado com a molécula de ligação a antígeno. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação ao antígeno de membrana pode ser avaliada despejando a molécula de ligação a antígeno como um analito em um chip imobili- zado com o antígeno.
[01079] Embora a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH baixo, seja mais fraca do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH al- to, isto é, em uma faixa de pH neutra, a razão da atividade de ligação a antígeno entre aquela em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, e em uma concentração de pró- tons baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutra, não é particular- mente limitada, e o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma concentra- ção de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para a KD em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, é preferivelmente 2 ou mais; mais preferivel- mente, o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 10 ou mais; e mais preferi- velmente ainda o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 40 ou mais. O limi- te superior de valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, con- tanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daque- les especialistas na técnica.
[01080] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de dissociação (KD) pode ser usada como o valor para atividade de liga-
ção a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de dissociação aparente (kd) pode ser usada. A constante de dissociação (KD) e constante de dissociação aparente (KD) podem ser medidas através de métodos conhecidos dos especia- listas na técnica e Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard, citome- tria de fluxo e similar podem ser usados.
[01081] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dis- sociação (kd) pode ser adequadamente usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécu- la de ligação a antígeno da presente invenção entre aquela em uma concentração de prótons alta e pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido e uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutra. Quando a kd (constante de taxa de dissociação ) é usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação ao invés de KD (constante de dissociação), o valor de kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutra), que é a razão de kd (constante de taxa de dissociação) para o antígeno em uma concen- tração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para kd (constante de taxa de dissociação) em uma concentração de prótons alta ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, é preferi- velmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivel- mente e ainda 10 ou mais, e sobretudo preferivelmente 30 ou mais. O valor do limite superior (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutra) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles especialistas na técnica.
[01082] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antígeno e quando o antígeno é um antígeno de membra- na, a constante de taxa de dissociação aparente (kd) pode ser usada.
A constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de taxa de dis- sociação aparente (kd) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles especialistas na técnica e Biacore (GE healthca- re), citometria de fluxo e similar podem ser usados. Na presente inven- ção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é medida em concentrações de íon de hidrogênio diferentes, isto é, pHs, condições outras que não a concentração de prótons, isto é, pH, são preferivelmente iguais.
[01083] Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticor- po cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de pró- tons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é uma modalidade provida pela pre- sente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno compreen- dendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[01084] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH ácido;
[01085] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH neutra; e
[01086] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutra.
[01087] Alternativamente, um domínio de ligação a antígeno ou an- ticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é uma modalidade provida pela pre- sente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[01088] contato de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, em uma faixa de pH neutra com um antígeno;
[01089] colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoligado ao antígeno na etapa (a); e
[01090] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo dissociado na etapa (b).
[01091] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antíge- no ou anticorpos, ou uma biblioteca dos mesmos, compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[01092] contato em uma faixa de pH ácido de um antígeno com uma biblioteca de domínio de ligação a antígeno ou anticorpos;
[01093] seleção do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoque não se liga ao antígeno na etapa (a);
[01094] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo selecionado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutra; e
[01095] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoligado ao antígeno na etapa (c).
[01096] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é ainda outra modalidade provida pela presente in-
venção, pode ser obtido através de um método de avaliação compre- endendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[01097] contato em uma faixa de pH neutra de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno com uma coluna imobilizada com um antígeno;
[01098] eluição em uma faixa de pH ácido a partir da coluna do do- mínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoligado à coluna na etapa (a); e
[01099] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído na etapa (b).
[01100] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[01101] permitir, em uma faixa de pH ácido, que uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno passe por uma coluna imobilizada com um antígeno;
[01102] coleta do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído sem ligação com a coluna na etapa (a);
[01103] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo coletado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutra; e
[01104] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoligado ao antígeno na etapa (c).
[01105] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, que é ainda outra modalidade provida pela presente in- venção, pode ser obtido através de um método de avaliação compre- endendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[01106] contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno em uma faixa de pH neutra;
[01107] obtenção do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoligado ao antígeno na etapa (a);
[01108] colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenoobtido na etapa (b); e
[01109] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o padrão selecionado na etapa (b).
[01110] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a antígeno e moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aque- la em uma faixa de pH neutra, que são obtidos através de um método de avaliação que compreende ainda as etapas de repetição das eta- pas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima. O número de vezes que as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, o número é 10 ou menos em geral.
[01111] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a ativida- de de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anti- corpo em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,0 e 6,5 e inclua a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,5 e 6,6 co-
mo o pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 5,0 e 6,5 e aquela em um pH entre 5,5 e 6,5 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH no endossomo inicial in vivo como o pH mais pre- ferido, e especificamente aquela em pH 5,8. Entretanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma fai- xa de pH neutra, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em pH entre 6,7 e 10, e inclui a ativi- dade de ligação a antígeno em um pH entre 6,7 e 9,5 como o pH pre- ferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 7,0 e 9,5 e aquela em um pH entre 7,0 e 8,0 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH de plasma in vivo como o pH mais preferido e, especificamente, aquela em pH 7,4.
[01112] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser medida através de métodos conheci- dos daqueles especialistas na técnica. Aqueles especialistas na técni- ca podem determinar adequadamente condições que não concentra- ção de cálcio ionizado. A atividade de ligação a antígeno de um domí- nio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser avaliada com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), constante de taxa de dissociação (kd), constante de taxa de dis- sociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser determinadas atra- vés de métodos conhecidos daqueles especialistas na técnica, por e- xemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
[01113] Aqui, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antí- geno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma con- centração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, é maior do que aquela em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é sinônimo da etapa com seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra.
[01114] Contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, seja maior do que aquela em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a diferença entre a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons bai- xa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutra, e aquela em uma con- centração de prótons alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 ve- zes ou mais do que aquela em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido.
[01115] O domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno da presente invenção avaliado através dos métodos de avali- ação descritos acima pode ser qualquer domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno, e por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo mencionado acima pode ser avaliado. Por exemplo, domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígenotendo a sequência nativa pode ser avaliado, e domínio de li- gação a antígeno ou anticorpo em que suas sequências de aminoáci- do foram substituídas pode ser avaliado.
[01116] O domínio de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno da presente invenção a ser avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser preparado de qualquer maneira. Por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno convencionais, biblio- tecas convencionais (biblioteca de fago, etc), moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas preparados através de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de animais de imuniza- ção, moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos com um pKa de cadeia late- ral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural em posições específicas, etc) obtidos atra- vés da introdução de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de a- minoácido não natural nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
[01117] Métodos para obtenção de um domínio de ligação a antíge- no ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concen- tração de prótons baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutra, é maior do que aquela em uma concentração de prótons alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a partir de domínios de liga- ção a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno preparados a par- tir de hibridomas obtidos através de imunização de animais ou de célu- las B de animais imunizados incluem preferivelmente, por exemplo, a molécula de ligação a antígeno ou molécula de ligação ao antígeno em que pelo menos um dos aminoácidos do domínio de ligação a antíge- no ou molécula de ligação ao antígenoé substituído com um aminoáci- do com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou uma mutação de aminoácido não natural, ou o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo inserido com um aminoá- cido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural, tais como aqueles descri- tos na publicação Internacional No. WO 2009/125825.
[01118] Os sítios de introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina ou ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais não são particularmente limi- tados, e podem ser qualquer posição contanto que a atividade de liga- ção a antígeno em uma faixa de pH ácido se torne mais fraca do que aquela em uma faixa de pH neutra (o valor de KD (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutra) ou kd (em uma faixa de pH á- cido)/kd (em uma faixa de pH neutra) é aumentado) comparado com antes da substituição ou inserção. Por exemplo, quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, a região variável de anticorpo e CDRs são adequadas. Aqueles especialistas na técnica podem deter- minar apropriadamente o número de aminoácidos a serem substituí- dos ou o número de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais a serem inseridos. É possível substituir um único aminoácido tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou um aminoácido não natural único; é possível inse- rir um aminoácido único tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural único; é possível substituir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de ca- deia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais; e é possível inserir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por e- xemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser deletados, adicionados, inseridos e/ou substituídos concomitantemente, com a exceção da substituição em aminoácidos tendo um pKa de cadeia late- ral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoáci-
dos não naturais ou a inserção de aminoácidos tendo um pKa de ca- deia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. Substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e áci- do glutâmico) ou aminoácidos não naturais pode ser realizada aleato- riamente através de métodos tal como varredura com histidina, em que a alanina de varredura de alanina conhecida daqueles especialistas na técnica é substituída com histidina. Moléculas de ligação a antígeno exibindo um valor de KD maior (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutra) ou kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutra) comparado com antes da mutação podem ser se- lecionadas de domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno introduzidos com inserções aleatórias ou mutações de substituição de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não natu- rais.
[01119] Exemplos preferidos de moléculas de ligação a antígeno contendo a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais conforme acima descrito e cuja atividade de ligação a antíge- no em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutra incluem moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH neutra após a mutação em aminoá- cidos com um pKa de cadeia lateral de 4,-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é comparável àquela antes da mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. Aqui, "uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por e- xemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais ten-
do uma atividade de ligação a antígeno comparável com aquela antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0- 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não na- turais" significa que, quando tomando a atividade de ligação a antíge- no de uma molécula de ligação a antígeno antes da mutação com a- minoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais como 100%, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia late- ral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoáci- dos não naturais é pelo menos 10% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais e ainda mais preferivelmente 90% ou mais.
A atividade de ligação a antígeno após a mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4 pode ser maior do que aquela antes da mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4. Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno for diminuí- da devido à inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a atividade de ligação a antígeno pode ser feita para ser comparável com aquela antes da inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não natu- rais, através da introdução de uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos da molécula de ligação a antíge- no.
A presente invenção também inclui moléculas de ligação a antíge- no cuja atividade de ligação foi ajustada para ser comparável através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoá-
cidos após substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
[01120] Entretanto, quando uma molécula de ligação a antígeno é uma substância contendo uma região constante de anticorpo, modali- dades preferidas de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutra incluem métodos em que as regiões cons- tantes de anticorpo contidas nas moléculas de ligação a antígeno fo- ram modificadas. Exemplos específicos de regiões constantes de anti- corpo modificadas incluem preferivelmente as regiões constantes de SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14.
[01121] Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domínio de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de prótons
[01122] Os domínios de ligação a antígeno ou moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção a serem avaliados através dos mé- todos de avaliação descritos acima podem ser preparados de qualquer maneira. Por exemplo, quando condição de concentração de íon é condição de concentração de prótons ou condição de pH, moléculas de ligação ao antígeno preexistente s, bibliotecas preexistente s (bibli- oteca de fago, etc.), moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas preparados a partir de células B de animais imunizados ou de hibrido- mas obtidos através de imunização de animais, moléculas de ligação ao antígeno ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e áci- do glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0- 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não na- turais em posições específicas, etc) obtidos através da introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
[01123] Em uma modalidade da presente invenção, uma biblioteca contendo moléculas de ligação a antígeno múltiplas da presente in- venção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser também construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada, produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável alea- torizada, com regiões variáveis de cadeia leve introduzidas com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da con- dição de concentração de prótons".
[01124] Tais resíduos de aminoácido incluem, mas não estão limita- dos a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de ca- deia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve.
[01125] Os resíduos de aminoácido descritos acima contidos na CDR1 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exem- plo, resíduos de aminoácido das posições 24, 27, 28, 31, 32 e/ou 34 de acordo com numeração Kabat na CDR1 de região variável de ca- deia leve. Entretanto, os resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido das posições 50,5 1, 52, 53, 54, 55 e/ou 56 de acordo com numeração Kabat na CDR2 de região variável de cadeia leve. A- inda, os resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido nas posições 89, 90, 91, 92, 93, 94 e/ou 95A de acordo com numeração
Kabat na CDR3 de região variável de cadeia leve. Além disso, os resí- duos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou podem estar contidos em combinação de dois ou mais aminoácidos contanto que eles permitam a mudança na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da concentração de pró- tons.
[01126] Mesmo quando a região variável de cadeia pesada produ- zida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada é combinada com a região variável de cadeia leve descrita acima in- troduzida com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a ati- vidade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de prótons", é possível pro- jetar de maneira que os resíduos flexíveis estejam contidos na se- quência da região variável de cadeia leve da mesma maneira que des- crito acima. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são par- ticularmente limitados a uma modalidade específica, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção mude dependendo da condição de concentração de prótons. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de ca- deia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexí- veis. Por exemplo, resíduos flexíveis a serem introduzidos nas se- quências das regiões variáveis de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, os resíduos de aminoácido listados nas Ta- belas 3 e 4. Entretanto, sequências de aminoácido de regiões variá- veis de cadeia leve que não os resíduos flexíveis e resíduos de ami- noácido que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécu- la de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de prótons adequadamente incluem, mas não estão limitadas a, sequên- cias de linhagem germinativa tais como Vk1 (SEQ ID NO: 7), Vk2 (SEQ ID NO: 8), Vk3 (SEQ ID NO: 9) e Vk4 (SEQ ID NO: 10).
Tabela 3 Posição Aminoácido ou ou
[01127] (Posição indica numeração Kabat)
Tabela 4 Posição Aminoácido
[01129] (Posição indica numeração Kabat)
[01130] Qualquer resíduo de aminoácido pode ser adequadamente usado como os resíduos de aminoácido descritos acima que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição da concentração de prótons. Especificamen- te, tais resíduos de aminoácido incluem aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0. Tais aminoácidos de liberação de elétron in- cluem preferivelmente, por exemplo, aminoácidos de ocorrência natu- ral tais como histidina e ácido glutâmico, bem como aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US2009/0035836), m-NO2- Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) e 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg.
Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768). Resíduos de aminoácido par- ticularmente preferidos incluem, por exemplo, aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 6,0-7,0. Tais resíduos de aminoácido de libe- ração de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, histidina.
[01131] Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de Extensão de sobreposição podem ser apropriadamente em- pregados para modificar os aminoácidos de domínios de ligação a an- tígeno. Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de modificação de aminoácido para substituição de aminoácidos com aqueles que não aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophyys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tra- dução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNas em que tRNA supressor âmbar, que é complementar a códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoáci- do não natural pode ser adequadamente usado.
[01132] A região variável de cadeia pesada preferida que é usada em combinação inclui, por exemplo, bibliotecas de região variável a- leatorizadas. Métodos conhecidos são apropriadamente combinados como um método para produção de uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo de- rivados de animais imunizados com antígenos específicos, pacientes com infecção ou pessoas com um título de anticorpo elevado em san- gue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou linfóci- tos de doenças autoimunes pode ser adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
[01133] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, da mesma maneira que descrito acima, uma biblioteca sintética em que as sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V reconstruídos funcionais são substituídas com um conjunto de oligo- nucleotídeos sintéticos contendo as sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também adequa- damente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Neste caso, a sequência de CDR3 somente pode ser substituída por- que variedade na sequência de gene de CDR3 de cadeia pesada é observada.
A base para dar origem a variações de aminoácido na re- gião variável de uma molécula de ligação a antígeno é gerar variações de resíduos de aminoácido das posições expostas à superfície da mo- lécula de ligação a antígeno.
A posição exposta à superfície se refere a uma posição em que um aminoácido é exposto na superfície e/ou con- tatado com um antígeno com base na conformação, conjunto estrutu- ral e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno e, em geral, tais posições são as CDRs.
As posições expostas à superfí- cie são preferivelmente determinadas usando as coordenadas deriva- das de um modelo tridimensional da molécula de ligação a antígeno usando programas de computador tal como o programa InsightII (Ac- celrys). As posições expostas à superfície podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Ri- chards (J.
Mol.
Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J.
Appl.
Cryst. (1983) 16, 548-558)). As posições expostas à superfície podem ser determinadas com base na informação na estrutura tridimensional de anticorpos usando software adequado para modelagem de proteína.
Software que é adequadamente usado para este propósito inclui o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Quan- do o algoritmo requer o parâmetro de tamanho de registro do usuário, o "tamanho" de sonda para uso em computação é geralmente ou pre- ferivelmente ajustado em cerca de 1,4 Angstrom ou menos de raio.
A- inda, um método para determinação de região e área expostas à su-
perfície usando software PCR é descrito por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; e J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
[01134] Em ainda outra modalidade não limitante da presente in- venção, uma biblioteca pura construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e consistindo em se- quências puras, que são repertório imparciais de sequências de anti- corpo, pode ser também particularmente adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Hu- man Antibodies (2002) 11, 121-129); e Cardoso e outros (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). Região de Fc
[01135] Uma região de Fc contém a sequência de aminoácidos de- rivada da região constante da cadeia pesada de um anticorpo. Uma região de Fc é uma porção da região constante da cadeia pesada de um anticorpo, que inicia da extremidade terminal N da região de do- bradiça, que corresponde ao sítio de clivagem de papaína em um ami- noácido em torno da posição 216 de acordo com o sistema de nume- ração EU e contém a dobradiça, domínios CH2 e CH3. Embora a regi- ão de Fc possa ser obtida de IgG1 humana, não é limitada a uma sub- classe particular de IgG. Como descrito a seguir, um exemplo favorá- vel da região de Fc é uma região de Fc que tem uma atividade de liga- ção de FcRn em uma faixa de pH acídica. Além disso, um exemplo favorável da região de Fc é uma região de Fc que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ como descrito depois. Uma modalidade não limitante de tal região de Fc é, por exemplo, a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas. FcRn
[01136] Diferentemente do receptor de Fcγ que pertence à super- família de imunoglobulina, FcRn humano é estruturalmente similar a polipeptídeos da classe I de complexo de histocompatibilidade princi- pal (MHC), exibindo identidade de sequência de 22% a 29% à molécu- la de MHC classe I (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592- 598). FcRn é expresso como um heterodímero consistindo em β solú- vel ou cadeia leve (β2 microglobulina) complexado com a transmem- brana α ou cadeia pesada. Como MHC, a cadeia α de FcRn compre- ende três domínios extracelulares (α1, α2, e α3) e seu domínio cito- plasmático curto ancora a proteína para a superfície celular. Os domí- nios α1 e α2 interagem com o domínio de ligação de FcRn da região de Fc do antígeno (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315).
[01137] FcRn é expresso na placenta maternal e no saco vitelino de mamíferos, e está envolvido transferência de IgG da mãe para o feto. Além disso, no intestino delgado neonatal de roedores, onde FcRn é expresso, FcRn está envolvido na transferência de IgG maternal atra- vés do epitélio de borda em escova do colostro ingerido ou leite. FcRn é expresso em uma variedade de outros tecidos e nos sistemas de cé- lula endotelial das várias espécies. FcRn também é expresso em en- dotélios humanos adultos, vasos sanguíneos musculares e tubos capi- lares senoidais hepáticos. Acredita-se que FcRn desempenhe um pa- pel na manutenção da concentração de IgG plasmática mediando a reciclagem de IgG ao soro mediante ligação à IgG. Tipicamente, a li- gação de FcRn a moléculas de IgG é estritamente dependente de pH. A ligação ótima é observada em uma faixa de pH acídica abaixo de 7,0.
[01138] FcRn humano cujo precursor é um polipeptídeo tendo a se- quência sinal da SEQ ID NO: 17 (o polipeptídeo com a sequência sinal é mostrado na SEQ ID NO: 18) forma um complexo com β2- microglobulina humana in vivo. FcRn humano solúvel complexado com β2-microglobulina é produzido usando técnicas de expressão recombi- nante convencionais. As regiões de FcRn da presente invenção podem ser avaliadas para sua atividade de ligação a FcRn humano solúvel complexado com β2-microglobulina. Neste pedido, a menos que de outra maneira especificado, FcRn humano refere-se a uma forma ca- paz de ligação a uma região de FcRn da presente invenção. Exemplos incluem um complexo entre FcRn humano e β2-microglobulina huma- na. Uma modalidade não limitante é exemplificada por um complexo formado entre um FcRn de camundongo (SEQ ID NO: 73) e uma β2- microglobulina de camundongo (SEQ ID NO: 74). Atividade de ligação da região de Fc a FcRn, especialmente, FcRn humano
[01139] A atividade de ligação de uma região de Fc da presente in- venção a FcRn, FcRn humano especialmente, pode ser medida por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, como descrito na seção "Atividade de ligação" acima. Os especialistas na técnica podem determinar apropriadamente as condições além do pH. A atividade de ligação ao antígeno e a atividade de ligação de FcRn humano de uma molécula de ligação ao antígeno podem ser avaliadas baseadas na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd) e similares. Estes podem ser medidos por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare), gráfi- co de Scatchard ou citômetro de fluxo podem ser usados.
[01140] Quando a atividade de ligação de FcRn humano de uma região de Fc da presente invenção é medida, condições além do pH não são particularmente limitadas e podem ser apropriadamente sele- cionadas pelos especialistas na técnica. As medidas podem ser reali- zadas, por exemplo, a 37°C usando tampão de MES, co mo descrito na Publicação Internacional WO No. 2009125825. Alternativamente, a ati- vidade de ligação de FcRn humano de uma região de Fc da presente invenção pode ser medida por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Heal- thcare) ou similares. A atividade de ligação de uma região de Fc da presente invenção a FcRn humano pode ser avaliada vertendo, como um analito, FcRn humano, de uma região de Fc ou uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo a região de Fc em um chip imobilizado com uma região de Fc, uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo a região de Fc ou FcRn humano.
[01141] Uma faixa de pH neutra como a condição onde a região de Fc contida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente in- venção tem a atividade de ligação de FcRn significa, em geral, pH 6,7 a pH 10,0. Preferencialmente, a faixa de pH neutra é uma faixa indica- da com valores de pH arbitrários entre pH 7,0 e pH 8,0, e é preferenci- almente selecionada a partir de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, e 8,0, e é particularmente preferencialmente pH 7,4 que está próximo do pH do plasma (sangue) in vivo. Quando a afinidade de li- gação entre o domínio de ligação de FcRn humano e FcRn humano em pH 7,4 é muito baixa para avaliar, pH 7,0 pode ser usado em vez de pH 7,4. Neste pedido, uma faixa de pH acídica como a condição onde a região de Fc contida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção tem atividade de ligação de FcRn significa, em geral, pH 4,0 a pH 6,5. Preferencialmente, a faixa de pH acídica signi- fica pH 5,5 para pH 6,5, particularmente preferencialmente pH 5,8 a pH 6,0 que está perto do pH no primeiro endossoma in vivo. Quanto à temperatura usada como a condição de medida, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação de FcRn humano e FcRn humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10°C e 50°C. Preferencial- mente, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação de FcRn hu- mano e FcRn humano pode ser determinada em 15°C a 4 0°C. Mais preferencialmente, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação de FcRn humano e FcRn humano pode ser determinada na mesma maneira em uma temperatura arbitrada entre 20°C e 3 5°C, como qual- quer temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, e 35°C. Em uma modalidade da presente inven ção, a tempera- tura inclui, mas não é limitada a, por exemplo, 25°C.
[01142] De acordo com o Journal of Immunology (2009) 182, 7663- 7671, a atividade de ligação de FcRn humano de IgG1 humana nativa em uma faixa de pH acídica (pH 6,0) é 1,7 M (KD), e a atividade é quase não detectável em uma faixa de pH neutra. Dessa forma, em uma modalidade preferencial, as moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano em uma faixa de pH acídica é 20 M (KD) ou mais forte podem ser rastreadas. Em uma modalidade mais preferencial, as mo- léculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano em uma faixa de pH ací- dica é 2,0 M (KD) ou mais forte podem ser rastreadas. Em uma mo- dalidade ainda mais preferencial, as moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano em uma faixa de pH acídica é 0,5 M (KD) ou mais forte podem ser rastreadas. Os valores de KD supracitados são determina- dos pelo método descrito no Journal of Immunology (2009) 182: 7663- 7671 (imobilizando a molécula de ligação ao antígeno sobre um chip e carregando FcRn humano como um analito).
[01143] Na presente invenção, as regiões de Fc preferenciais têm uma atividade de ligação de FcRn em uma condição de faixa de pH acídica. Quando uma região de Fc originalmente tem uma atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica, o domínio pode ser usado como é. Quando o domínio tem uma fraca ou nenhu- ma atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH a- cídica, uma região de Fc que tem uma atividade de ligação de FcRn desejada pode ser obtida modificando aminoácidos de uma molécula de ligação ao antígeno. As regiões de Fc que têm uma atividade de ligação de FcRn desejada ou aumentada sob uma condição de faixa de pH acídica também podem ser apropriadamente obtidas modifican- do os aminoácidos de uma região de Fc. As modificações de aminoá- cido de uma região de Fc que resultam em tal atividade de ligação de- sejada podem ser encontradas comparando a atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica antes e após modifica- ção de aminoácidos. Os especialistas na técnica podem modificar a- propriadamente os aminoácidos usando técnicas conhecidas similares às técnicas acima mencionadas usadas para modificar a atividade de ligação de receptor de Fcγ.
[01144] As regiões de Fc compreendidas nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, que têm uma atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica, pode ser obtido por qualquer método. Especificamente, os domínios de ligação de FcRn que têm uma atividade de ligação de FcRn ou uma atividade de liga- ção de FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH acídica po- dem ser obtidos modificando os aminoácidos de imunoglobulina hu- mana tipo IgG usada como uma região de Fc inicial. As regiões de Fc preferenciais de uma imunoglobulina tipo IgG para modificação inclu- em, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 e variantes destas). Embora a região de Fc tenha uma atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica ou pode aumentar a atividade de ligação de FcRn humano sob uma condição de faixa de pH acídica, os aminoácidos em qualquer posição podem ser modificados em outros aminoácidos. Quando a molécula de liga- ção ao antígeno contém a região de Fc de IgG1 humana como a regi- ão de Fc, é preferencial que a região de Fc resultante contenha uma modificação que resulte no efeito de aumentar a ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da região de Fc de IgG1 humana inicial. Os aminoácidos que permitem tal modificação incluem, por exemplo, aminoácidos das posi- ções 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433, e/ou 434 de acordo com a numeração EU e seus aminoácidos de combinação nas posições 253, 310, 435, e/ou 426 como descrito no WO 1997/034631. Exemplos fa- voráveis incluem aminoácidos das posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, e/ou 447 como indicado pela numeração EU como des- crito em WO 2000/042072. Exemplos similarmente favoráveis de ami- noácidos que permitem tal modificação incluem, os aminoácidos das posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, e/ou 436 de acordo com a numeração EU como descrito em WO 2002/060919. Além disso, os aminoácidos que permi- tem tal modificação incluem, por exemplo, aminoácidos das posições 250, 314, e 428 de acordo com a numeração EU como descrito no WO2004/092219. Além disso, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácidos das posições 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440, e/ou 442 como descrito no WO 2006/020114. Além disso, exemplos favorá- veis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoáci- dos das posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, e/ou 436 de acordo com a numeração EU como descrito no WO 2010/045193. A modificação destes aminoácidos aumenta a ligação de FcRn da região de Fc de uma imunoglobulina tipo IgG sob uma condição de faixa de pH acídica.
[01145] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana inclui pelo menos uma ou mais mo- dificações de aminoácido selecionadas a partir do grupo consistindo em:
[01146] Arg ou Leu para o aminoácido da posição 251;
[01147] Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[01148] Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254;
[01149] Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido da posição 255;
[01150] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu ou Thr para o aminoácido da posição 256;
[01151] Ile ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[01152] Pro para o aminoácido da posição 309;
[01153] Glu, Leu ou Ser para o aminoácido da posição 311;
[01154] Ala ou Asp para o aminoácido da posição 312;
[01155] Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314;
[01156] Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 385;
[01157] Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 386;
[01158] Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 387;
[01159] Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[01160] Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 428;
[01161] Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433;
[01162] His, Phe ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[01163] Arg, Asn, His, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posi-
ção 436, como indicado pela numeração EU. Entretanto, o número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em somente um sítio ou os aminoáci- dos podem ser modificados em dois ou mais sítios.
[01164] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn em uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Ile para o aminoácido da posição 308, Pro para o aminoácido da posição 309, e/ou Glu para o aminoácido da posição 311 de acordo com a nu- meração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Thr para o aminoácido da posição 308, Pro para o aminoácido da posição 309, Leu para o aminoácido da posição 311, Ala para o a- minoácido da posição 312 e/ou Ala para o aminoácido da posição 314. Além disso, outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Ile ou Thr para o aminoácido da posição 308, Pro para o amino- ácido da posição 309, Glu, Leu ou Ser para o aminoácido da posição 311, Ala para o aminoácido da posição 312, e/ou Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314. Outra modalidade não limitante desta mo- dificação pode incluir Thr para o aminoácido da posição 308, Pro para o aminoácido da posição 309, Ser para o aminoácido da posição 311, Asp para o aminoácido da posição 312, e/ou Leu para o aminoácido da posição 314.
[01165] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Leu para o aminoácido da posição 251, Tyr para o aminoácido da po-
sição 252, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254, Arg para o aminoácido da posição 255, e/ou Glu para o aminoácido da posição 256 de acordo com a numeração EU.
[01166] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Leu, Met, Phe, Ser, ou Thr para o aminoácido da posição 428, Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433, His, Phe, ou Tyr para o aminoácido da posição 434, e/ou Arg, Asn, His, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436 de acordo com a nume- ração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode in- cluir His ou Met para o aminoácido da posição 428, e/ou seu ou Met para o aminoácido da posição 434.
[01167] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Arg para o aminoácido da posição 385, Thr para o aminoácido da posição 386, Arg para o aminoácido da posição 387, e/ou Pro para o aminoáci- do da posição 389 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Asp para o aminoácido da posição 385, Pro para o aminoácido da posição 386, e/ou Ser para o aminoácido da posição 389.
[01168] Além disso, quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da região de Fc inicial de IgG1 humana inclui pelo menos uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em:
[01169] Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250; e
[01170] Leu ou Phe para o aminoácido da posição 428 de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em somente um sítio ou os aminoácidos podem ser modificados em dois sítios.
[01171] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Gln para o aminoácido da posição 250, e/ou Leu ou Phe para o aminoáci- do da posição 428 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Glu para o aminoácido da posição 250, e/ou Leu ou Phe para o aminoácido da posição 428.
[01172] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana inclui pelo menos duas ou mais modificações de aminoácido selecionadas a partir do grupo consistin- do em:
[01173] Asp ou Glu para o aminoácido da posição 251;
[01174] Tyr para o aminoácido da posição 252;
[01175] Gln para o aminoácido da posição 307;
[01176] Pro para o aminoácido da posição 308;
[01177] Val para o aminoácido da posição 378;
[01178] Ala para o aminoácido da posição 380;
[01179] Leu para o aminoácido da posição 428;
[01180] Ala ou Lys para o aminoácido da posição 430;
[01181] Ala, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[01182] Ile para o aminoácido da posição 436, como indicado pela numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado; e o aminoácido pode ser modificado em so- mente dois sítios ou os aminoácidos podem ser modificados em três ou mais sítios.
[01183] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Gln para o aminoácido da posição 307, e Ala ou Ser para o aminoácido da posição 434 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Pro para o aminoácido da po- sição 308, e Ala para o aminoácido da posição 434. Além disso, outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Tyr para o a- minoácido da posição 252, e Ala para o aminoácido da posição 434. Uma modalidade não limitante diferente desta modificação pode incluir Val para o aminoácido da posição 378, e Ala para o aminoácido da po- sição 434. Outra modalidade não limitante diferente desta modificação pode incluir Leu para o aminoácido da posição 428, e Ala para o ami- noácido da posição 434. Outra modalidade não limitante diferente des- ta modificação pode incluir Ala para o aminoácido da posição 434, e Ile para o aminoácido da posição 436. Além disso, outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Pro para o aminoácido da po- sição 308, e Tyr para o aminoácido da posição 434. Além disso, outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Gln para o aminoácido da posição 307, e Ile para o aminoácido da posição 436.
[01184] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo qualquer uma de Gln para o aminoácido da posição 307, Ala para o aminoácido da posição 380, e Ser para o aminoácido da posição 434 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Gln para o aminoácido da posição 307, Ala para o aminoácido da posição 380 e Ala para o aminoácido da posição
434. Além disso, outra modalidade não limitante desta modificação po- de incluir Tyr para o aminoácido da posição 252, Pro para o aminoáci- do da posição 308, e Tyr para o aminoácido da posição 434. Uma mo- dalidade não limitante diferente desta modificação pode incluir Asp pa- ra o aminoácido da posição 251, Gln para o aminoácido da posição 307, e His para o aminoácido da posição 434.
[01185] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana inclui a modificação de pelo menos dois ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em:
[01186] Leu para o aminoácido da posição 238;
[01187] Leu para o aminoácido da posição 244;
[01188] Arg para o aminoácido da posição 245;
[01189] Pro para o aminoácido da posição 249;
[01190] Tyr para o aminoácido da posição 252;
[01191] Pro para o aminoácido da posição 256;
[01192] Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido da posição 257;
[01193] Asp para o aminoácido da posição 258;
[01194] Ser para o aminoácido da posição 260;
[01195] Leu para o aminoácido da posição 262;
[01196] Lys para o aminoácido da posição 270;
[01197] Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272;
[01198] Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 279;
[01199] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 283;
[01200] Asn para o aminoácido da posição 285;
[01201] Phe para o aminoácido da posição 286;
[01202] Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288;
[01203] Val para o aminoácido da posição 293;
[01204] Ala, Glu, ou Met para o aminoácido da posição 307;
[01205] Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val ou Trp para o aminoácido da po- sição 311;
[01206] Pro para o aminoácido da posição 312;
[01207] Lys para o aminoácido da posição 316;
[01208] Pro para o aminoácido da posição 317;
[01209] Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318;
[01210] Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido da posição 332;
[01211] Asn, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 339;
[01212] Pro para o aminoácido da posição 341;
[01213] Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido da po- sição 343;
[01214] Arg para o aminoácido da posição 375;
[01215] Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido da posição
376;
[01216] Lys para o aminoácido da posição 377;
[01217] Asp ou Asn para o aminoácido da posição 378;
[01218] Asn, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 380;
[01219] Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 382;
[01220] Asn para o aminoácido da posição 423;
[01221] Asn para o aminoácido da posição 427;
[01222] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 430;
[01223] His ou Asn para o aminoácido da posição 431;
[01224] Phe, Gly, His, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434;
[01225] Ile, Leu ou Thr para o aminoácido da posição 436;
[01226] Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 438;
[01227] Lys para o aminoácido da posição 440; e
[01228] Lys para o aminoácido da posição 442 de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado e o aminoácido somente pode ser modificado em dois sítios e os aminoácidos em três ou mais sítios podem ser mo- dificados.
[01229] Quando a região de Fc de IgG1 humana é compreendida como a região de Fc, uma modalidade não limitante da modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica comparando com a atividade de ligação da re- gião de Fc inicial de IgG1 humana pode ser modificações incluindo Ile para o aminoácido da posição 257 e Ile para o aminoácido da posição 311 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Ile para o aminoácido da posição 257, e His para o aminoácido da posição 434. Outra modalidade não limitante desta modificação pode incluir Val para o aminoácido da posição 376,
e His para o aminoácido da posição 434.
[01230] Além disso, em outra modalidade não limitante, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc com a característica de ter uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra em vez da característica descrita de ter uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídi- ca. Em uma modalidade preferencial, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc cuja ativi- dade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra é 40 M (KD) ou mais forte. Em uma modalidade mais preferencial, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc cuja atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra é 15 M (KD) ou mais forte.
[01231] Além disso, em outra modalidade não limitante, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc com a característica de ter uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra além da característica descrita acima de ter uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica. Em uma modalidade preferencial, pode-se rastrear por molé- culas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc cuja atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra é 40 M (KD) ou mais forte. Em uma modalidade mais preferencial, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc cuja atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra é 15 M (KD) ou mais forte.
[01232] Na presente invenção, as regiões de Fc preferenciais têm uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra. Quando uma região de Fc originalmente tem uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra, pode ser usado como está. Quando uma região de Fc tem uma fraca ou nenhuma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra, as moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc que tem uma ativi- dade de ligação de FcRn humano desejada podem ser obtidas modifi- cando aminoácidos da região de Fc compreendida nas moléculas de ligação ao antígeno. As regiões de Fc que têm uma atividade de liga- ção de FcRn humano desejada na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra também podem ser apropriadamente obtidas modificando aminoácidos de uma região de Fc humano. Alternativamente, as molé- culas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc que tem uma atividade de ligação de FcRn humano desejada podem ser obtidas modificando aminoácidos de uma região de Fc que original- mente tem uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra. As modificações de aminoácido de uma região de Fc humano que resultam em tal atividade de ligação desejada podem ser encontradas comparando a atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica e/ou faixa de pH neutra antes e após modificação de aminoácidos. Os especialistas na técnica po- dem modificar apropriadamente aminoácidos usando métodos conhe- cidos.
[01233] Além disso, uma região de Fc alterada modificada de uma região de Fc inicial que já foi modificada também pode ser usada pre- ferencialmente como uma região de Fc alterada da presente invenção. A "região de Fc inicial" pode referir-se ao próprio polipeptídeo, uma composição que compreende a região de Fc inicial ou sequência de aminoácidos que codifica a região de Fc inicial. Regiões iniciais de Fc podem compreender uma região de Fc de anticorpo IgG conhecida produzida via recombinação descrita resumidamente na seção "Anti- corpos". A origem de regiões de Fc iniciais não é limitada, e pode ser obtida do ser humano ou qualquer organismo não humano. Tais orga-
nismos preferencialmente incluem camundongos, ratos, porquinhos da Índia, hamsteres, gerbos, gatos, coelhos, cães, cabras, ovelhas, bovi- nos, cavalos, camelos e organismos selecionados a partir de primatas não humanos. Em outra modalidade, regiões de Fc iniciais também podem ser obtidas de macacos cinomolgus, saguis, macacos rhesus, chimpanzés ou seres humanos. Regiões de Fc iniciais podem ser obti- das preferencialmente de IgG1 humana; entretanto, não são limitados a nenhuma subclasse particular de IgG. Isto significa que uma região de Fc representada por IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas pode ser usada apropriadamente como uma região de Fc inicial, e neste pedido também significa que uma região de Fc de uma classe de IgG arbitra- da ou subclasse derivada de qualquer organismo descrito acima pode ser preferencialmente usada como uma região de Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos em documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicação Internacional WO No. 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); entretanto, não são limitados aos exemplos.
[01234] Exemplos de alterações incluem aqueles com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações pela substituição de resíduos de aminoácidos diferentes de aminoácidos de regiões de Fc iniciais, pela inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos em regiões de Fc iniciais, ou pela deleção de um ou mais aminoácidos da região de Fc inicial. Preferencialmente, as sequências de aminoácidos de regiões de Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos de uma região de Fc não nativa. Tais variantes necessa- riamente têm a identidade ou similaridade de sequência menor que 100% à sua região de Fc inicial. Em uma modalidade preferencial, as variantes têm a identidade ou similaridade de sequência de aminoáci- dos aproximadamente 75% a menos de 100%, mais preferencialmente aproximadamente 80% a menos de 100%, até mais preferencialmente aproximadamente 85% a menos de 100%, ainda mais preferencial- mente aproximadamente 90% a menos de 100%, e ainda mais prefe- rencialmente aproximadamente 95% a menos de 100% à sequência de aminoácidos da sua região de Fc inicial. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região de Fc modificada da presente invenção e sua região de Fc inicial. A diferença de aminoácido entre uma região de Fc modi- ficada da presente invenção e sua região de Fc inicial também pode ser preferencialmente especificada baseada em diferenças de amino- ácido nas posições de aminoácidos particulares descritas acima de acordo com o sistema de numeração EU.
[01235] Métodos conhecidos como mutagênese sítio-dirigida (Kun- kel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de regiões de Fc. Além disso, vários métodos conhecidos também podem ser usados como um método de modificação de aminoácido para substituir aminoácidos por aqueles além dos aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução sem células (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNAs em que o tRNA supressor âmbar, que é complementar ao códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoácido não natural pode ser apropriadamente usado.
[01236] As regiões de Fc compreendidas nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção que têm uma atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica pode ser obtido por qualquer método. Especificamente, pode-se rastrear por moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica é 20 M (KD) ou mais forte; em uma modalidade mais favorável, uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica é 2,0 M (KD) ou mais forte; e em uma modalidade até mais favorável, uma região de Fc da qual a atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH acídica é 0,5 M (KD) ou mais forte em consequência da modificação de aminoácidos de imunoglobulina humana tipo IgG usa- da como uma região de Fc inicial. As regiões de Fc preferenciais de imunoglobulinas tipo IgG para modificação incluem, por exemplo, a- quelas de IgGs humanas como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 mostradas nas SEQ ID NOS: 13, 14, 15, e 15, respectivamente, e variantes des- tas.
[01237] Quando uma molécula de ligação ao antígeno compreende a região de Fc de IgG1 humana como a região de Fc, exemplos ade- quados dos aminoácidos que podem ser modificados para alcançar os efeitos desejados supracitados na ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH acídica pela modificação dos aminoácidos de imuno- globulina humana tipo IgG como uma região de Fc inicial, incluem a- minoácidos das posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, e/ou 447 de acordo com a numeração EU como descrito no WO 2000/042072. Exemplos similarmente favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácidos das posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, e/ou 436 de acordo com a numeração EU como descrito no WO 2002/060919. Além disso, os aminoácidos que permitem tal modifica- ção incluem, por exemplo, aminoácidos das posições 250, 314, e 428 de acordo com a numeração EU como descrito em WO2004/092219. Além disso, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal modificação incluem aminoácidos das posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, e/ou 436 de acordo com a numeração EU como descrito no WO 2010/045193. A modificação destes aminoácidos au- menta a ligação de FcRn da região de Fc de uma imunoglobulina tipo IgG sob uma condição de faixa de pH acídica.
[01238] As regiões de Fc que têm atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra também podem ser obtidas modificando os aminoácidos da imunoglobulina humana tipo IgG usados como a região de Fc inicial. As regiões de Fc de imunoglobulinas tipo IgG ade- quadas para a modificação incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente representa- das pelas SEQ ID NOs: 13, 14, 15, e 16, e formas modificadas destas. Os aminoácidos de qualquer posição podem ser modificados em ou- tros aminoácidos, embora regiões de Fc tenham atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra ou possam aumentar a ativi- dade de ligação de FcRn humano na faixa neutra. Quando a molécula de ligação ao antígeno contém a região de Fc de IgG1 humana como a região de Fc humano, é preferencial que a região de Fc resultante contenha uma modificação que resulta no efeito de aumentar ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra comparando com a atividade de ligação da região de Fc inicial de IgG1 humana. Os aminoácidos que permitem tal modificação incluem, por exemplo, um ou mais ami- noácidos selecionados a partir do grupo das posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440, e 442 de acordo com a numeração EU. A modificação destes aminoácidos aumenta a ligação de FcRn humano da região de Fc da imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neutra.
[01239] Dos descritos acima, as modificações que aumentam a li- gação de FcRn humano na faixa de pH neutra são apropriadamente selecionadas para o uso na presente invenção. Os aminoácidos parti- cularmente preferenciais das regiões de Fc modificadas incluem, por exemplo, aminoácidos das posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 de acordo com o sistema de numera- ção EU. A atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra da região de Fc contida em uma molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada substituindo pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos acima em um aminoácido diferente.
[01240] As modificações particularmente preferenciais incluem, por exemplo:
[01241] Met para o aminoácido da posição 237;
[01242] Ile para o aminoácido da posição 248;
[01243] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do da posição 250;
[01244] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252;
[01245] Thr para o aminoácido da posição 254;
[01246] Glu para o aminoácido da posição 255;
[01247] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
[01248] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257;
[01249] His para o aminoácido da posição 258:
[01250] Ala para o aminoácido da posição 265;
[01251] Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286;
[01252] His para o aminoácido da posição 289;
[01253] Ala para o aminoácido da posição 297;
[01254] Ala para o aminoácido da posição 303;
[01255] Ala para o aminoácido da posição 305;
[01256] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307;
[01257] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308;
[01258] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido da posição 309;
[01259] Ala, His ou Ile para o aminoácido da posição 311;
[01260] Ala ou His para o aminoácido da posição 312;
[01261] Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314;
[01262] Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315;
[01263] Ala para o aminoácido da posição 317;
[01264] Val para o aminoácido da posição 332;
[01265] Leu para o aminoácido da posição 334;
[01266] His para o aminoácido da posição 360;
[01267] Ala para o aminoácido da posição 376;
[01268] Ala para o aminoácido da posição 380;
[01269] Ala para o aminoácido da posição 382;
[01270] Ala para o aminoácido da posição 384;
[01271] Asp ou His para o aminoácido da posição 385;
[01272] Pro para o aminoácido da posição 386;
[01273] Glu para o aminoácido da posição 387;
[01274] Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389;
[01275] Ala para o aminoácido da posição 424;
[01276] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 428;
[01277] Lys para o aminoácido da posição 433;
[01278] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e
[01279] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436 da região de Fc de acordo com a numeração EU.
Entretanto, o número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado e o aminoácido em somente um sítio pode ser modificado e os aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser modificados.
As combi- nações destas modificações de aminoácido incluem, por exemplo, as modificações de aminoácido mostradas nas Tabelas 5-1 5-33.
Tabela 5-1 Variante Sítio de modificação de aminoácido
[01281] A tabela 5-2 é uma continuação da Tabela 5-1.
Tabela 5-2
[01283] A tabela 5-3 é uma continuação da Tabela 5-2.
Tabela 5-3
[01285] A tabela 5-4 é uma continuação da Tabela 5-3.
Tabela 5-4
[01287] A tabela 5-5 é uma continuação da Tabela 5-4.
Tabela 5-5
[01289] A tabela 5-6 é uma continuação da Tabela 5-5.
Tabela 5-6
[01291] A tabela 5-7 é uma continuação da Tabela 5-6.
Tabela 5-7
[01293] A tabela 5-8 é uma continuação da Tabela 5-7.
Tabela 5-8
[01295] A tabela 5-9 é uma continuação da Tabela 5-8.
Tabela 5-9
[01297] A tabela 5-10 é uma continuação da Tabela 5-9.
Tabela 5-10
[01299] A tabela 5-11 é uma continuação da Tabela 5-10.
Tabela 5-11
[01301] A tabela 5-12 é uma continuação da Tabela 5-11.
Tabela 5-12
[01303] A tabela 5-13 é uma continuação da Tabela 5-12.
Tabela 5-13
[01305] A tabela 5-14 é uma continuação da Tabela 5-13.
Tabela 5-14
[01307] A tabela 5-15 é uma continuação da Tabela 5-14.
Tabela 5-15
[01309] A tabela 5-16 é uma continuação da Tabela 5-15.
Tabela 5-16
[01311] A tabela 5-17 é uma continuação da Tabela 5-16.
Tabela 5-17
[01313] A tabela 5-18 é uma continuação da Tabela 5-17.
Tabela 5-18
[01315] A tabela 5-19 é uma continuação da Tabela 5-18.
Tabela 5-19
[01317] A tabela 5-20 é uma continuação da Tabela 5-19.
Tabela 5-20
[01319] A tabela 5-21 é uma continuação da Tabela 5-20.
Tabela 5-21
[01321] A tabela 5-22 é uma continuação da Tabela 5-21.
Tabela 5-22
[01323] A tabela 5-23 é uma continuação da Tabela 5-22.
Tabela 5-23
[01325] A tabela 5-24 é uma continuação da Tabela 5-23.
Tabela 5-24
[01327] A tabela 5-25 é uma continuação da Tabela 5-24.
Tabela 5-25
[01329] A tabela 5-26 é uma continuação da Tabela 5-25.
Tabela 5-26
[01331] A tabela 5-27 é uma continuação da Tabela 5-26.
Tabela 5-27
[01333] A tabela 5-28 é uma continuação da Tabela 5-27.
Tabela 5-28
[01335] A tabela 5-29 é uma continuação da Tabela 5-28.
Tabela 5-29
[01337] A tabela 5-30 é uma continuação da Tabela 5-29.
Tabela 5-30
[01339] A tabela 5-31 é uma continuação da Tabela 5-30.
Tabela 5-31
[01341] A tabela 5-32 é uma continuação da Tabela 5-31.
Tabela 5-32
[01343] A tabela 5-33 é uma continuação da Tabela 5-32.
Tabela 5-33
[01345] Receptor de Fcγ
[01346] O receptor de Fcγ (também descrito como FcγR) se refere a um receptor capaz da ligação à região de Fc de ainticorpos mono- clonais IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, e inclui todos os membros que per- tencem à família de proteínas substancialmente codificadas por um gene de receptor de Fcγ. No ser humano, a família inclui FcγRI (CD64) incluindo isoformas FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRII (CD32) incluindo isoformas FcγRIIa (incluindo os alótipos H131 e R131, isto é, FcγRIIa (H) e FcγRIIa (R)), FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2), e FcγRI- Ic; e FcγRIII (CD16) incluindo isoformas FcγRIIIa (incluindo os alótipos V158 e F158, isto é, FcγRIIIa (V) e FcγRIIIa (F)) e FcγRIIIb (incluindo os alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2); bem como todo os FcγRs humanos não identificados, isoformas de FcγR e alótipos destes. En- tretanto, o receptor de Fcγ não é limitado a estes exemplos. Sem ser limitado a estes, FcγR inclui os derivados de seres humanos, camun- dongos, ratos, coelhos e macacos. O FcγR pode ser derivado de qual- quer organismo. O FcγR de camundongo inclui, sem ser limitado a, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), e FcγRIII-2 (FcγRIV, CD16-2), bem como todo os FcγRs de camundongo não identificados, isoformas de FcγR e alótipos destes. Tais receptores de Fcγ preferen-
ciais incluem, por exemplo, FcγRI humano (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16), e/ou FcγRIIIb (CD16). A sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoácidos de FcγRI são mos- tradas nas SEQ ID NOS: 19 (NM_000566.3) e 20 (NP_000557.1), res- pectivamente; a sequência de polinucleotídeos e a sequência de ami- noácidos de FcγRIIa (alótipo H131) são mostradas nas SEQ ID NOS: 21 (BC020823.1) e 22 (AAH20823.1) (alótipo R131 é uma sequência na qual o aminoácido na posição 166 da SEQ ID NO: 22 é substituído por Arg), respectivamente; a sequência de polinucleotídeos e a se- quência de aminoácidos de FcγIIB são mostradas nas SEQ ID NOS: 23 (BC146678.1) e 24 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeos e a sequência de aminoácidos de FcγRIIIa são mos- tradas nas SEQ ID NOS: 25 (BC033678.1) e 26 (AAH33678.1), res- pectivamente; e a sequência de polinucleotídeos e a sequência de a- minoácidos de FcγRIIIb são mostradas nas SEQ ID NOS: 27 (BC128562.1) e 28 (AAI28563.1), respectivamente (o número de a- cesso RefSeq é mostrado em cada um dos parênteses). Por exemplo, como descrito como FcγRIIIaV quando o alótipo V158 é usado, a me- nos que de outra maneira especificado, o alótipo F158 é usado; entre- tanto, o alótipo da isoforma FcγRIIIa descrito neste pedido não deve ser interpretado como particularmente limitado.
[01347] Em FcγRI (CD64) incluindo FcγRIa, FcγRIb, e FcγRIc e FcγRIII (CD16) incluindo isoformas FcγRIIIa (incluindo os alótipos V158 e F158) e FcγRIIIb (incluindo os alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRII- Ib-NA2), a cadeia α que se liga à porção de Fc de IgG associa-se com a cadeia γ comum tendo ITAM responsável pela transdução do sinal de ativação intracelular. Entretanto, o domínio citoplasmático de FcγRII (CD32) incluindo isoformas FcγRIIa (incluindo os alótipos H131 e R131) e FcγRIIc contém ITAM. Estes receptores são expressos em muitas células imunes como macrófagos, mastócitos e células apre-
sentadoras de antígeno. O sinal de ativação transduzido mediante li- gação destes receptores à porção de Fc de IgG resulta no aumento da atividade fagocítica de macrófagos, produção de citocina inflamatória, desgranulação de mastócito e a função aumentada de células apre- sentadoras de antígeno. Os receptores de Fcγ tendo a capacidade de transduzir o sinal de ativação como descrito acima são também referi- dos como receptores de ativação de Fcγ.
[01348] Entretanto, o domínio intracitoplasmático de FcγRIIb (inclu- indo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2) contém ITIM responsável pela transdução de sinais inibitórios. Reticulação entre FcγRIIb e receptor de célula B (BCR) em células B suprime o sinal de ativação de BCR, que resulta na supressão da produção de anticorpo via BCR. Reticulação de Fcγ- RIII e FcγRIIb em macrófagos suprime a atividade fagocítica e produ- ção de citocina inflamatória. Os receptores de Fcγ que têm a capaci- dade de transduzir o sinal inibitório como descrito acima são também referidos como receptor inibitório de Fcγ. Atividade de ligação a FcγR da região de Fc
[01349] Como mencionado acima, as regiões de Fc tendo uma ati- vidade de ligação do receptor de Fcγ são os exemplos das regiões de Fc compreendidas nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Uma modalidade não limitante de tal região de Fc inclui a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas. Se um receptor de Fcγ tem atividade de ligação à região de Fc de um anticorpo mono- clonal para IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 pode ser avaliado pelo rastrea- mento ALPHA (Ensaio Homogêneo Amplificado de Proximidade Lumi- nescente), o método BIACORE baseado em ressonância de plásmons de superfície (SPR), e os outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010), além dos formatos de ELISA e FACS descritos acima.
[01350] O rastreamento ALPHA é realizado pela tecnologia ALPHA baseada no princípio descrito abaixo usando dois tipos de contas: con- tas doadoras e aceptoras. Um sinal luminescente é somente detectado quando as moléculas ligadas às contas doadoras interagem biologi- camente com moléculas ligadas às contas aceptoras e quando as du- as contas são localizadas em proximidade imediata. Excitados pelo raio laser, os fotossensibilizantes em um doador convertem o oxigênio em torno da conta no oxigênio excitado em singleto. Quando o oxigê- nio em singleto se difunde em torno das contas doadoras e alcança as contas aceptoras localizadas na proximidade imediata, uma reação quimioluminescente dentro das contas aceptoras é induzida. Esta rea- ção enfim resulta na emissão de luz. Se as moléculas ligadas às con- tas doadoras não interagirem com moléculas ligadas às contas acepto- ras, o oxigênio em singleto produzido por contas doadoras não alcan- ça as contas aceptoras e a reação quimioluminescente não ocorre.
[01351] Por exemplo, uma molécula marcada com biotina de liga- ção ao antígeno e compreende região de Fc é imobilizada às contas doadoras e receptor de Fcγ marcado com glutationa S-transferase (GST) é imobilizado às contas aceptoras. A ausência de uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma variante de região de Fc competitiva, o receptor de Fcγ interage com um complexo de polipep- tídeo compreendendo uma região de Fc selvagem, induzindo um sinal de 520 a 620 nm como resultado. A molécula de ligação ao antígeno tendo uma variante de região de Fc não marcada compete com a mo- lécula de ligação ao antígeno e compreende uma região de Fc nativa pela interação com o receptor de Fcγ. A afinidade de ligação relativa pode ser determinada quantificando a redução da fluorescência em consequência da competição. Métodos para biotinilar as moléculas de ligação ao antígeno como moléculas de ligação ao antígeno usando Sulfo-NHS-biotina ou similares são conhecidos. Métodos apropriados para adicionar o marcador GST a um receptor de Fcγ incluem métodos que envolvem polipeptídeos de fusão que codificam Fcγ e GST na es- trutura, expressando o gene fundido usando células introduzidas com um vetor ao qual o gene é operacionalmente ligado, e em seguida pu- rificando usando uma coluna de glutationa. O sinal induzido pode ser preferencialmente analisado, por exemplo, pelo ajuste a um modelo de competição de um sítio baseado na análise de regressão não linear usando um programa GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).
[01352] Uma das substâncias para observar sua interação é imobi- lizada como um ligante para a camada fina de ouro de um chip sensor. Quando a luz é emitida na superfície traseira do chip sensor para que a reflexão total ocorra na interface entre a camada fina de ouro e o vi- dro, a intensidade da luz refletida é parcialmente reduzida em um certo sítio (sinal de SPR). Outra substância para observar sua interação é injetada como um analito à superfície do chip sensor. A massa da mo- lécula de ligante imobilizada aumenta quando o analito se liga ao li- gante. Isto altera o índice de refração do solvente na superfície do chip sensor. A modificação no índice de refração causa um deslocamento posicional do sinal de SPR (de modo inverso, a dissociação desloca o sinal de volta à posição original). No sistema Biacore, a quantidade de deslocamento descrito acima (isto é, a modificação da massa na su- perfície do chip sensor) é traçado no eixo vertical, e dessa forma a modificação da massa ao longo do tempo é mostrada como dados medidos (sensorgrama). Os parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são de- terminados da curva do sensorgrama, e a afinidade (KD) é determina- da da proporção entre estas duas constantes. O ensaio de inibição é preferencialmente usado nos métodos BIACORE. Exemplos de tal en- saio de inibição são descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010.
[01353] Além da região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) huma- nas, uma região de Fc com ligação de FcγR modificada, que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que uma região de Fc de IgG humana nativa pode ser apropriadamente usada como uma região de Fc incluída na presente invenção. Neste pedido, "região de Fc de IgG humana nativa" refere-se a uma região de Fc na qual a cadeia de açúcar ligada à posição 297 (numeração EU) da região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas mostrada nas SEQ ID NOS: 13, 14, 15, ou 16 é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Tais regi- ões de Fc com a ligação de FcγR modificada podem ser produzidas modificando aminoácidos da região de Fc de IgG humana nativa. Se a atividade de ligação de FcγR de uma região de Fc com a ligação de FcγR modificada é mais alta do que aquela de uma região de Fc de IgG humana nativa pode ser determinada apropriadamente usando métodos descritos na seção supracitada na atividade de ligação.
[01354] Na presente invenção, "modificação de aminoácidos" ou "modificação de aminoácido" de uma região de Fc inclui a modificação em uma sequência de aminoácidos que é diferente daquela da região de Fc inicial. A região de Fc inicial pode ser qualquer região de Fc, en- quanto uma variante modificada da região de Fc inicial pode ligar-se ao receptor de Fcγ humano em uma faixa de pH neutra. Além disso, uma região de Fc modificada de uma região de Fc inicial que já tinha sido modificada também pode ser usada preferencialmente como uma região de Fc da presente invenção. A "região de Fc inicial" pode referir- se ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo a região de Fc inicial ou sequência de aminoácidos que codifica a região de Fc inicial. As regiões de Fc iniciais podem compreender regiões de Fc co- nhecidas produzidas via recombinação descrita resumidamente na se- ção "Anticorpos". A origem de regiões de Fc iniciais não é limitada, e pode ser obtida do ser humano ou qualquer organismo não humano. Tais organismos preferencialmente incluem camundongos, ratos, por- quinhos da Índia, hamsteres, gerbos, gatos, coelhos, cães, cabras, o- velhas, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados a partir de primatas não humanos. Em outra modalidade, regiões de Fc iniciais também podem ser obtidas de macacos cinomolgus, saguis, macacos rhesus, chimpanzés ou seres humanos. As regiões de Fc iniciais po- dem ser obtidas preferencialmente de IgG1 humana; entretanto, não são limitados a nenhuma classe particular de IgG. Isto significa que uma região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas pode ser u- sada apropriadamente como uma região de Fc inicial, e neste pedido também significa que uma região de Fc de uma classe ou subclasse de IgG arbitrada derivada de qualquer organismo descrito acima pode ser preferencialmente usada como uma região de Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos em documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicação Internacional WO No. 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); entretanto, não são limitados aos exemplos.
[01355] Exemplos de alterações incluem aqueles com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações pela substituição de resíduos de aminoácido diferentes de aminoácidos de regiões de Fc iniciais, pela inserção de um ou mais resíduos de aminoácido em regiões de Fc ini- ciais, ou pela deleção de um ou mais aminoácidos da região de Fc ini- cial. Preferencialmente, as sequências de aminoácidos de regiões de Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos de uma região de Fc não nativa. Tais variantes necessa- riamente têm a identidade ou similaridade de sequência menos de 100% à sua região de Fc inicial. Em uma modalidade preferencial, as variantes têm a identidade ou similaridade de sequência de aminoáci- dos de aproximadamente 75% a menos de 100%, mais preferencial- mente aproximadamente 80% a menos de 100%, até mais preferenci- almente aproximadamente 85% a menos de 100%, ainda mais prefe- rencialmente aproximadamente 90% a menos de 100%, e ainda mais preferencialmente aproximadamente 95% a menos de 100% à se- quência de aminoácidos da sua região de Fc inicial. Em uma modali- dade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre a região de Fc modificada de um de ligação de FcγR da presente invenção e sua região de Fc inicial. A diferença de amino- ácido entre uma região de Fc modificada de ligação de FcγR da pre- sente invenção e sua região de Fc inicial também pode ser preferenci- almente especificada baseada nas diferenças de aminoácido específi- cas nas posições de aminoácido específicas descritas acima de acor- do com o sistema de numeração EU.
[01356] Métodos conhecidos como mutagênese sítio-dirigida (Kun- kel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de regiões de Fc. Além disso, vários métodos conhecidos também podem ser usados como um método de modificação de aminoácido para substituir aminoácidos por aqueles além dos aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução sem células (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNAs em que o tRNA supressor âmbar, que é complementar ao códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado a um aminoácido não natural pode ser a- propriadamente usado.
[01357] Incluído nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, uma região de Fc com a ligação de FcγR modificada, que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que a- quela de uma região de Fc de IgG humana nativa, (uma região de Fc modificada de ligação de FcγR) pode ser obtida por qualquer método. Especificamente, a região de Fc com a ligação de FcγR modificada pode ser obtida modificando aminoácidos de imunoglobulina humana tipo IgG usada como uma região de Fc inicial. As regiões de Fc prefe- renciais das imunoglobulinas tipo IgG para modificação incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas mostradas nas SEQ ID NOS: 13, 14, 15, ou 16 (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, respectivamente, e variantes destas).
[01358] Os aminoácidos de qualquer posição podem ser modifica- dos em outros aminoácidos, enquanto a atividade de ligação em dire- ção ao receptor de Fcγ é mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa. Quando a molécula de ligação ao antígeno con- tém uma região de Fc de IgG1 humana como a região de Fc humano, preferencialmente contém uma modificação que produz o efeito de uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa, no qual a cadeia de açúcar li- gada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar con- tendo fucose. Tais modificações de aminoácido foram relatadas, por exemplo, em publicações internacionais como WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 e WO2006/023403.
[01359] Os exemplos de tais aminoácidos que podem ser modifica- dos incluem pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a par- tir do grupo consistindo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263,
264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU). Uma região de Fc (região de Fc com a ligação de FcγR modificada) tendo uma ati- vidade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela de uma região de Fc de IgG humana nativa pode ser obtida modificando estes aminoácidos.
[01360] Exemplos de modificações particularmente preferenciais para uso na presente invenção incluem pelo menos uma ou mais mo- dificações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em:
[01361] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[01362] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[01363] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[01364] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[01365] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[01366] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[01367] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[01368] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[01369] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[01370] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[01371] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[01372] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[01373] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln,
Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[01374] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[01375] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[01376] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[01377] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[01378] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[01379] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[01380] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[01381] His para o aminoácido da posição 244;
[01382] Ala para o aminoácido da posição 245;
[01383] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[01384] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[01385] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[01386] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[01387] Phe para o aminoácido da posição 251;
[01388] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[01389] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[01390] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[01391] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[01392] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[01393] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[01394] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[01395] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[01396] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[01397] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[01398] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[01399] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[01400] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[01401] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[01402] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[01403] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[01404] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[01405] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[01406] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[01407] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[01408] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[01409] Ala para o aminoácido da posição 279;
[01410] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[01411] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[01412] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição
282;
[01413] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[01414] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284;
[01415] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[01416] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[01417] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[01418] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[01419] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[01420] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[01421] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[01422] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[01423] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[01424] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[01425] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[01426] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[01427] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[01428] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[01429] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[01430] Ile para o aminoácido da posição 302;
[01431] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[01432] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[01433] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[01434] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311;
[01435] Phe para o aminoácido da posição 313;
[01436] Leu para o aminoácido da posição 315;
[01437] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[01438] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[01439] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[01440] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[01441] Ile para o aminoácido da posição 323;
[01442] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[01443] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[01444] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[01445] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[01446] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[01447] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[01448] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[01449] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[01450] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[01451] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[01452] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[01453] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[01454] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[01455] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[01456] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[01457] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[01458] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[01459] Asp para o aminoácido da posição 378;
[01460] Asn para o aminoácido da posição 379;
[01461] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[01462] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[01463] Glu para o aminoácido da posição 385;
[01464] Thr para o aminoácido da posição 392;
[01465] Leu para o aminoácido da posição 396;
[01466] Lys para o aminoácido da posição 421;
[01467] Asn para o aminoácido da posição 427;
[01468] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[01469] Met para o aminoácido da posição 429;
[01470] Trp para o aminoácido da posição 434;
[01471] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[01472] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[01473] como indicado pela numeração EU. O número de aminoá- cidos a serem modificados não é particularmente limitado; e o aminoá- cido pode ser modificado em somente um sítio ou os aminoácidos po- dem ser modificados em dois ou mais sítios. Exemplos de combina- ções de modificações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem os descritos na Tabela 6 (Tabelas 6-1 a 6-3).
Tabela 6-1
[01474] A tabela 6-2 é uma continuação da Tabela 6-1.
Tabela 6-2
[01475] A tabela 6-3 é uma continuação da Tabela 6-2.
Tabela 6-3
[01476] Para as condições de pH para medir a atividade de ligação da região de Fc e o receptor de Fcγ contido na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, as condições em uma faixa de pH ací- dica ou em uma faixa de pH neutra podem ser apropriadamente usa- das. A faixa de pH neutra, como uma condição para medir a atividade de ligação da região de Fc e o receptor de Fcγ contido na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, geralmente indica pH 6,7 a pH 10,0. Preferencialmente, é uma faixa indicada com valores de pH arbitrados entre pH 7,0 e pH 8,0; e preferencialmente, é selecionado a partir de pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9, e pH 8,0; e particularmente preferencialmente, é pH 7,4, que está perto do pH de plasma (sangue) in vivo. Neste pedi- do, a faixa de pH acídica, como uma condição para ter uma atividade de ligação da região de Fc e o receptor de Fcγ contido na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, geralmente indica pH 4,0 a pH 6,5. Preferencialmente, indica pH 5,5 a pH 6,5, e particularmente preferencialmente, indica pH 5,8 a pH 6,0, que está próximo do pH no primeiro endossoma in vivo. Quanto à temperatura usada como uma condição de medida, a afinidade de ligação entre uma região de Fc e um receptor de Fcγ pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10°C e 50°C. Preferencialmente, uma temperatura ent re 15°C e 40°C é usada para determinar a afinidade de ligação entre uma região de Fc e um receptor de Fcγ. Mais preferencialmente, qualquer temperatura entre 20°C e 35°C, como qualquer temperatura única de 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30° C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, e 35°C, pode ser similarmente usada par a determinar a afinidade de ligação entre uma região de Fc e um receptor de Fcγ. Uma temperatura de 25°C é um exemplo não limitante em uma moda- lidade da presente invenção.
[01477] Neste pedido, "a região de Fc com ligação de FcγR modifi- cada tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que a região de Fc nativa" significa que a atividade de ligação do re- ceptor de Fcγ humana da região de Fc com FcγR modificado que se liga em direção a qualquer um dos receptores de Fcγ humanos de FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa e/ou FcγRIIIb é mais alta do que a atividade de ligação da região de Fc nativa em direção a estes recep-
tores de Fcγ humanos. Por exemplo, significa que baseado em um método analítico descrito acima, em comparação com a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno contendo região de Fc de IgG humana nativa como um controle, a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno e compreende uma região de Fc com ligação de FcγR modificada é 105% ou mais, preferencialmente 110% ou mais, 115% ou mais, 120% ou mais, 125% ou mais, particularmente preferencialmente 130% ou mais, 135% ou mais, 140% ou mais, 145% ou mais, 150% ou mais, 155% ou mais, 160% ou mais, 165% ou mais, 170% ou mais, 175% ou mais, 180% ou mais, 185% ou mais, 190% ou mais, 195% ou mais, de 2 vezes ou mais, de 2,5 vezes ou mais, de 3 vezes ou mais, de 3,5 vezes ou mais, de 4 vezes ou mais, de 4,5 ve- zes ou mais, de 5 vezes ou mais, de 7,5 vezes ou mais, de 10 vezes ou mais, de 20 vezes ou mais, de 30 vezes ou mais, de 40 vezes ou mais, de 50 vezes ou mais, de 60 vezes ou mais, de 70 vezes ou mais, de 80 vezes ou mais, de 90 vezes ou mais, ou de 100 vezes ou mais. A região de Fc inicial pode ser usada como uma região de Fc nativa, e as regiões de Fc nativas de moléculas de ligação ao antígeno da mesma subclasse também podem ser usadas.
[01478] Na presente invenção, uma região de Fc de IgG humana nativa na qual a cadeia de açúcar ligada ao aminoácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, é a- propriadamente usada como uma região de Fc nativa de IgG humana a ser usada como um controle. Se a cadeia de açúcar ligada ao ami- noácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar con- tendo fucose, pode ser determinada usando a técnica descrita no Do- cumento não Patente 6. Por exemplo, é possível determinar se a ca- deia de açúcar ligada com região de Fc de IgG humana nativa é uma cadeia de açúcar contendo fucose por um método como aquele abai- xo. A cadeia de açúcar é dissociada de IgG humana nativa a ser testa-
da, reagindo uma IgG humana nativa teste com N-Glicosidase F (Ro- che diagnostics) (Weitzhandler et al. (J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675)). Após, um concentrado seco de uma solução de rea- ção da qual a proteína foi removida pela reação com etanol (Schenk et al. (J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)) é fluorescente- mente marcado com 2-aminopiridina ou de 2-aminobenzamida (Bigge et al. (Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)). Os reagentes são re- movidos pela extração sólida usando um cartucho de celulose, e a ca- deia de açúcar modificada com 2-AP ou 2-AB fluorescentemente mar- cada é analisada por cromatografia de fase normal. É possível deter- minar se a cadeia de açúcar ligada com a região de Fc nativa de IgG humana é uma cadeia de açúcar contendo fucose observando os pi- cos de cromatograma detectados.
[01479] Como uma molécula de ligação ao antígeno contendo uma região de Fc de um anticorpo nativo da mesma subclasse, que deve ser usada como um controle, uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma região de Fc de um anticorpo IgG monoclonal pode ser a- propriadamente usada. As estruturas das regiões de Fc são descritas na SEQ ID NO: 13 (A é adicionado ao terminal N do No. De Acesso de RefSeq AAC82527.1), SEQ ID NO: 14 (A é adicionado ao terminal N do No. De Acesso de RefSeq AAB59393.1), SEQ ID NO: 15 (No. De Acesso de RefSeq CAA27268.1) e SEQ ID NO: 16 (A é adicionado ao terminal N do No. De Acesso de RefSeq AAB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação ao antígeno contendo uma região de Fc de um isotipo particular de anticorpo é usada como a substância teste, o efeito da molécula de ligação ao antígeno contendo a região de Fc tes- te na atividade de ligação do receptor de Fcγ é testada usando como um controle uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma região de Fc de um anticorpo IgG monoclonal daquele isotipo particular. Deste modo, as moléculas de ligação ao antígeno contendo uma região de
Fc da qual a atividade de ligação do receptor de Fcγ é demonstrada ser alta são apropriadamente selecionadas. Regiões de Fc tendo uma atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcγ
[01480] Exemplos de regiões de Fc adequadas para o uso na pre- sente invenção incluem regiões de Fc tendo uma atividade de ligação mais alta a um receptor de Fcγ particular do que a outros receptores de Fcγ (regiões de Fc tendo uma atividade de ligação seletiva a um receptor de Fcγ). Quando um anticorpo é usado como a molécula de ligação ao antígeno, uma molécula de anticorpo única pode ligar-se somente a uma molécula de receptor de Fcγ única. Por isso, uma mo- lécula única de ligação ao antígeno não pode ligar-se a outros FcγRs de ativação em um estado ligado ao receptor de Fcγ, e não pode ligar- se a outros receptores de ativação de Fcγ ou receptores de Fcγ inibitó- rios em um estado ligado ao receptor de ativação de Fcγ.
[01481] Como descrito acima, exemplos adequados de receptores de Fcγ de ativação incluem FcγRI (CD64) que inclui FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRIII (CD16) que inclui as isoformas FcγRIIIa (incluindo os alótipos V158 ou F158) e FcγRIIIb (incluindo os alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2); e FcγRIIa (incluindo os alótipos H131 ou R131). En- tretanto, exemplos adequados de receptores de Fcγ inibitórios incluem FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 ou FcγRIIb-2).
[01482] A região de Fc compreendida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção que contém um domínio de ligação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno compreen- dendo esta região de Fc pode ter uma atividade de ligação mantida ou reduzida para FcγR de ativação (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa in- cluindo o alótipo V158, FcγRIIIa incluindo o alótipo F158, FcγRIIIb in- cluindo o alótipo FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb incluindo o alótipo FcγRIIIb- NA2, FcγRIIa incluindo o alótipo H131, FcγRIIa incluindo o alótipo
R131 e/ou FcγRIIc), quando comparada com a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas (a seguir designada por região de Fc selvagem) e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo esta região de Fc selvagem.
[01483] Em comparação com uma região de Fc selvagem e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma região de Fc selvagem, uma região de Fc compreendida em uma molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção que contém um domínio de li- gação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno com- preendendo esta região de Fc é reduzida na sua atividade de ligação a FcγR de ativação acima mencionada a um nível de, por exemplo, 99% ou menos, 98% ou menos, 97% ou menos, 96% ou menos, 95% ou menos, 94% ou menos, 93% ou menos, 92% ou menos, 91% ou me- nos, 90% ou menos, 88% ou menos, 86% ou menos, 84% ou menos, 82% ou menos, 80% ou menos, 78% ou menos, 76% ou menos, 74% ou menos, 72% ou menos, 70% ou menos, 68% ou menos, 66% ou menos, 64% ou menos, 62% ou menos, 60% ou menos, 58% ou me- nos, 56% ou menos, 54% ou menos, 52% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos, 0,5% ou menos, 0,4% ou menos, 0,3% ou menos, 0,2% ou menos, 0,1% ou menos, 0,05% ou menos, 0,01% ou menos ou 0,005% ou menos.
[01484] A região de Fc compreendida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo um domínio de ligação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo esta região de Fc pode ter uma atividade de ligação aumentada a FcγR inibitório (FcγRIIb-1 e/ou FcγRIIb-2) quando comparada com a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas (a seguir desig- nada por região de Fc selvagem), e uma molécula de ligação ao antí- geno compreendendo a região de Fc selvagem.
[01485] Em comparação com uma região de Fc selvagem e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma região de Fc selvagem, a região de Fc compreendida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo um domínio de ligação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo esta região de Fc, é aumentada na sua atividade de ligação ao FcγR inibitório acima mencionado a um nível de, por exemplo, 101% ou maior, 102% ou maior, 103% ou maior, 104% ou maior, 105% ou mai- or, 106% ou maior, 107% ou maior, 108% ou maior, 109% ou maior, 110% ou maior, 112% ou maior, 114% ou maior, 116% ou maior, 118% ou maior, 120% ou maior, 122% ou maior, 124% ou maior, 126% ou maior, 128% ou maior, 130% ou maior, 132% ou maior, 134% ou mai- or, 136% ou maior, 138% ou maior, 140% ou maior, 142% ou maior, 144% ou maior, 146% ou maior, 148% ou maior, 150% ou maior, 155% ou maior, 160% ou maior, 165% ou maior, 170% ou maior, 175% ou maior, 180% ou maior, 185% ou maior, 190% ou maior, 195% ou mai- or, de 2 vezes ou maior, de 3 vezes ou maior, de 4 vezes ou maior, de vezes ou maior, de 6 vezes ou maior, de 7 vezes ou maior, de 8 ve- zes ou maior, de 9 vezes ou maior, de 10 vezes ou maior, de 20 vezes ou maior, de 30 vezes ou maior, de 40 vezes ou maior, de 50 vezes ou maior, de 60 vezes ou maior, de 70 vezes ou maior, de 80 vezes ou maior, de 90 vezes ou maior, de 100 vezes ou maior, de 200 vezes ou maior, de 300 vezes ou maior, de 400 vezes ou maior, de 500 vezes ou maior, de 600 vezes ou maior, de 700 vezes ou maior, de 800 vezes ou maior, de 900 vezes ou maior, de 1000 vezes ou maior, de 10000 ve- zes ou maior, ou de 100000 vezes ou maior.
[01486] A região de Fc compreendida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo um domínio de ligação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo esta região de Fc pode ter
[01487] uma atividade de ligação mantida ou reduzida para FcγR de ativação (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa incluindo o alótipo V158, FcγRIIIa incluindo o alótipo F158, FcγRIIIb incluindo o alótipo FcγRIIIb- NA1, FcγRIIIb incluindo o alótipo FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa incluindo o alótipo H131, FcγRIIa incluindo o alótipo R131, e/ou FcγRIIc), quando comparada com a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas (a seguir designada por região de Fc selvagem), e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo a região de Fc selvagem; e
[01488] uma atividade de ligação aumentada para FcγR inibitório (FcγRIIb-1 e/ou FcγRIIb-2) quando comparada com a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas (a seguir designada por região de Fc selvagem), e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo a região de Fc selvagem.
[01489] Em comparação com a região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) humanas (a seguir designada por região de Fc selvagem) e uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo a região de Fc selvagem, a região de Fc compreendida em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção que contém um domínio de ligação de FcγR seletivo, e uma molécula de ligação ao antígeno compreen- dendo esta região de Fc, tem um nível mais alto do aumento na sua atividade de ligação a FcγR inibitório (FcγRIIb-1 e/ou FcγRIIb-2) do que o nível do aumento na sua atividade de ligação para receptor de Fcγ de ativação (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa incluindo o alótipo
V158, FcγRIIIa incluindo o alótipo F158, FcγRIIIb incluindo o alótipo FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb incluindo o alótipo FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa inclu- indo o alótipo H131, e FcγRIIa incluindo o alótipo R131).
[01490] Na presente invenção, é possível adicionar pelo menos ou- tra modificação à região de Fc cujo aminoácido na posição 238 (nume- ração EU) é Asp ou à região de Fc cujo aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu pelas modalidades e tal como descrito na se- ção acima em modificações de aminoácidos. Além destas modifica- ções, modificações adicionais também podem ser incluídas. Modifica- ções adicionais podem ser selecionadas, por exemplo, de qualquer uma de substituições, deleções, e modificações de aminoácidos e combinações destes. Por exemplo, modificações que aumentam a ati- vidade de ligação de FcγRIIb mantendo ou reduzindo a atividade de ligação a FcγRIIa (tipo H) e FcγRIIa (tipo R) podem ser adicionadas. A adição de tais modificações melhora a seletividade de ligação a FcγRI- Ib sobre FcγRIIa.
[01491] Além disso, se as atividades de ligação dos polipeptídeos da presente invenção em direção a vário FcγRs forem mantidas, au- mentadas ou diminuídas, podem ser determinadas do aumento ou da- redução daa quantidade da ligação de vários FcγRs aos polipeptídeos da presente invenção, que foram determinados de acordo com os e- xemplos descritos acima. Neste pedido, a quantidade da ligação de vários FcγRs aos polipeptídeos refere-se a valores obtidos determi- nando a diferença nos valores de RU de sensorgramas que se modifi- caram antes e após interação de vários FcγRs como o analito com ca- da polipeptídeo e divisão deles por diferenças nos valores de RU de sensorgramas que se modificaram antes e após capturar polipeptídeos nos chips sensores.
[01492] É possível determinar se a atividade de ligação de FcγRIIa (tipo R e tipo H) dos polipeptídeos da presente invenção é mantida ou reduzida, e se os peptídeos são peptídeos com a atividade de ligação de FcγRIIb aumentada podem ser determinados da quantidade de li- gação dos polipeptídeos a FcγRIIa e a quantidade de ligação dos poli- peptídeos a FcγRIIb seguindo os exemplos supracitados.
[01493] Um caso exemplar é quando a quantidade de um polipeptí- deo da presente invenção ligada a FcγRIIb é aumentada em compara- ção com a quantidade FcγRIIb de ligação do polipeptídeo parental, e a quantidade do polipeptídeo da presente invenção ligado a FcγRIIa (ti- po R e tipo H) é equivalente a (mantido) ou preferencialmente reduzido quanto à quantidade de ligação do polipeptídeo parental a FcγRIIa (ti- po R e tipo H). Também é possível determinar combinando apropria- damente a quantidade de FcγRIa de ligação e a quantidade de FcγRII- Ia de ligação do polipeptídeo determinado seguindo os exemplos su- pracitados.
[01494] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo de uma região de Fc tendo uma atividade de ligação do receptor de Fcγ inibitória mais alta do que uma atividade de ligação de receptor de Fcγ de ativação (tendo uma atividade de ligação seletiva em direção a um receptor inibitório de Fcγ) é a região de Fc apresen- tada no US2009/0136485 ou WO 2012/115241; e outro exemplo ade- quado é uma região de Fc na qual o aminoácido na posição 238 ou 328 como indicado pela numeração EU na região de Fc acima men- cionada foi modificado para um aminoácido diferente daquela da regi- ão de Fc nativa.
[01495] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo adequado de uma região de Fc que tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ (isto é, tendo uma atividade de ligação seletiva em direção a um receptor inibitório de Fcγ) é uma região de Fc com uma ou mais das seguintes modificações nos ami-
noácidos (indicado pela numeração EU) da região de Fc acima men- cionada: o aminoácido na posição 238 é modificado para Asp e o ami- noácido na posição 328 é modificado para Glu. As regiões de Fc e as modificações descritas no US2009/0136485 ou WO 2012/115241 po- dem ser selecionadas apropriadamente como a região de Fc tendo uma atividade de ligação seletiva a um receptor inibitório de Fcγ.
[01496] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo adequado é uma região de Fc na qual um ou mais dos aminoácidos indicados pela numeração EU nas posições 238 e 328 de acordo com a numeração EU são respectivamente modificados para Asp ou Glu na região de Fc acima mencionada.
[01497] Além disso, em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos adequados das regiões de Fc são aqueles com a substituição de Asp por Pro na posição 238 (numeração EU), e uma ou mais modificações selecionadas entre Trp para o aminoácido da posi- ção 237, Phe para o aminoácido da posição 237, Val para o aminoáci- do da posição 267, Gln para o aminoácido da posição 267, Asn para o aminoácido da posição 268, Gly para o aminoácido da posição 271, Leu para o aminoácido da posição 326, Gln para o aminoácido da po- sição 326, Glu para o aminoácido da posição 326, Met para o aminoá- cido da posição 326, Asp para o aminoácido da posição 239, Ala para o aminoácido da posição 267, Trp para o aminoácido da posição 234, Tyr para o aminoácido da posição 234, Ala para o aminoácido da posi- ção 237, Asp para o aminoácido da posição 237, Glu para o aminoáci- do da posição 237, Leu para o aminoácido da posição 237, Met para o aminoácido da posição 237, Tyr para o aminoácido da posição 237, Lys para o aminoácido da posição 330, Arg para o aminoácido da po- sição 330, Asp para o aminoácido da posição 233, Asp para o aminoá- cido da posição 268, Glu para o aminoácido da posição 268, Asp para o aminoácido da posição 326, Ser para o aminoácido da posição 326,
Thr para o aminoácido da posição 326, Ile para o aminoácido da posi- ção 323, Leu para o aminoácido da posição 323, Met para o aminoáci- do da posição 323, Asp para o aminoácido da posição 296, Ala para o aminoácido da posição 326, Asn para o aminoácido da posição 326, e Met para o aminoácido da posição 330, de acordo com a numeração EU. Molécula de ligação ao antígeno
[01498] Na presente invenção, uma "molécula de ligação ao antíge- no" é usada no sentido mais amplo para referir-se a uma molécula que contém um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc. Espe- cificamente, as moléculas de ligação ao antígeno incluem vários tipos de moléculas enquanto exibem a atividade de ligação ao antígeno. As moléculas nas quais um domínio de ligação ao antígeno é ligado a uma região de Fc incluem, por exemplo, anticorpos. Anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais únicos (incluindo anticorpos agonísticos e anticorpos antagonísticos), anticorpos humanos, anticorpos humani- zados, anticorpos quiméricos e tal. Alternativamente, quando usado como fragmentos de anticorpo, preferencialmente incluem domínios de ligação ao antígeno e fragmentos de ligação ao antígeno (por exem- plo, Fab, F(ab’)2, scFv e Fv). As moléculas de arcabouço onde estrutu- ras tridimensionais, tais como a já conhecida estrutura de proteína de barril α/β estável, são usadas como um arcabouço (base) e somente algumas porções das estruturas são feitas em bibliotecas para cons- truir domínios de ligação ao antígeno também estão incluídos em mo- léculas de ligação ao antígeno da presente invenção.
[01499] Uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode conter pelo menos algumas porções de uma região de Fc que medeia a ligação a FcRn e receptor de Fcγ. Em uma modalidade não limitante, a molécula de ligação ao antígeno inclui, por exemplo, anti- corpos e proteínas de fusão de Fc. Uma proteína de fusão refere-se a um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídeo que tem uma primeira sequência de aminoácidos que é ligada a um polipeptí- deo que tem uma segunda sequência de aminoácidos que não se liga- ria naturalmente na natureza. Por exemplo, uma proteína de fusão po- de compreender a sequência de aminoácidos de pelo menos uma por- ção de uma região de Fc (por exemplo, uma porção de uma região de Fc responsável pela ligação a FcRn ou uma porção de uma região de Fc responsável pela ligação ao receptor de Fcγ) e um polipeptídeo não imunoglobulina que contém, por exemplo, a sequência de aminoácidos do domínio de ligação ao ligante de um receptor ou um domínio de li- gação ao receptor de um ligante. As sequências de aminoácidos po- dem estar presentes em proteínas separadas que são transportadas em conjunto a uma proteína de fusão, ou geralmente podem estar pre- sentes em uma proteína única; entretanto, estão incluídos em um novo rearranjo em um polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, pela síntese química, ou por técnicas de recombinação genética para expressar um polinucleotídeo que codifica regiões de peptídeo em um arranjo desejado.
[01500] Cada um dos domínios do domínio de ligação ao antígeno, região de Rc, e similares da presente invenção pode ser ligado em conjunto através de ligantes ou diretamente através da ligação poli- peptídica. Os ligantes compreendem ligantes de peptídeo arbitrados que podem ser introduzidos por engenharia genética, ligantes sintéti- cos e ligantes descritos em, por exemplo, Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305. Entretanto, ligantes peptídicos são preferenciais na pre- sente invenção. O comprimento dos ligantes peptídicos não é particu- larmente limitado e pode ser apropriadamente selecionado pelos es- pecialistas na técnica de acordo com o objetivo. O comprimento é de preferencialmente cinco aminoácidos ou mais (sem particular limita- ção, o limite superior tem geralmente 30 aminoácidos ou menos, prefe-
rencialmente 20 aminoácidos ou menos), e particularmente preferenci- almente 15 aminoácidos.
[01501] Por exemplo, tais ligantes de peptídeo preferencialmente incluem:
[01502] Ser
[01503] Gly · Ser
[01504] Gly · Gly · Ser
[01505] Ser · Gly · Gly
[01506] Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 29)
[01507] Ser · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 30)
[01508] Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 31)
[01509] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 32)
[01510] Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 33)
[01511] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 34)
[01512] Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 35)
[01513] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 36)
[01514] (Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 31)) n
[01515] (Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 32)) n
[01516] onde n é um número inteiro de 1 ou maior. O comprimento ou sequências de ligantes peptídicos podem ser selecionados conse- quentemente pelos especialistas na técnica dependendo do objetivo.
[01517] Os ligantes sintéticos (agentes químicos de interligação) são rotineiramente usados para interligar peptídeos, e por exemplo:
[01518] N-hidróxi succinimida (NHS),
[01519] dissuccinimidil suberato (DSS),
[01520] bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3),
[01521] ditiobis (succinimidil propionato) (DSP),
[01522] ditiobis (sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP),
[01523] etilenoglicol bis(succinimidil succinato) (EGS),
[01524] etilenoglicol bis(sulfosuccinimidil succinato) (sulfo-EGS),
[01525] dissuccinimidil tartarato (DST), disulfosuccinimidil tartarato (sulfo-DST),
[01526] bis [2-(succinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (BSOCOES),
[01527] e bis [2-(sulfossuccinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (sulfo- BSOCOES). Estes agentes de interligação estão comercialmente dis- poníveis.
[01528] Quando múltiplos ligantes para ligar os respectivos domí- nios são usados, podem ser todos do mesmo tipo, ou podem ser de tipos diferentes.
[01529] Além dos ligantes exemplificados acima, ligantes com mar- cadores peptídicos como marcador His, marcador HA, marcador myc e marcador FLAG também podem ser apropriadamente usados. Além disso, ligação de hidrogênio, ligação de dissulfeto, ligação covalente, interação iônica e propriedades de ligação entre si em consequência da combinação destas podem ser apropriadamente usadas. Por e- xemplo, a afinidade entre CH1 e CL do anticorpo pode ser usada, e as regiões de Fc que se originam dos anticorpos biespecíficos descritos acima também podem ser usados para a associação de região de Fc hetero. Além disso, as ligações de dissulfeto formadas entre domínios também podem ser apropriadamente usadas.
[01530] A fim de ligar os respectivos domínios via ligação peptídica, polinucleotídeos que codificam os domínios são ligados em estrutura. Métodos conhecidos para ligar polinucleotídeos em estrutura incluem técnicas como a ligação de fragmentos de restrição, PCR de fusão, e PCR de sobreposição. Tais métodos podem ser apropriadamente usa- dos sozinhos ou em combinação para produzir as moléculas de liga- ção ao antígeno da presente invenção. Na presente invenção, os ter- mos "ligado" e "fundido", ou "ligação" e "fusão" são usados intercambi- avelmente. Estes termos significam que dois ou mais elementos ou componentes como polipeptídeos são ligados em conjunto para formar uma estrutura única por qualquer meio incluindo os meios de ligação químicos e técnicas de recombinação descritos acima. Quando dois ou mais domínios, elementos ou componentes são polipeptídeos, ligação em estrutura significa ligar duas ou mais unidades de fases de leitura para formar uma fase de leitura contínua mais longa mantendo as fa- ses de leitura corretas dos polipeptídeos. Quando duas moléculas de Fab são usadas como o domínio de ligação ao antígeno, um anticorpo que é uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção na qual o domínio de ligação ao antígeno é ligado em estrutura a uma re- gião de Fc por uma ligação de peptídeo e não via um ligante, pode ser usado como uma molécula adequada de ligação ao antígeno do pre- sente pedido de patente. Complexo contendo duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas
[01531] Como descrito no Exemplo 1 (como mostrado em WO 2011/122011), Fv4-IgG1, de que a atividade de ligação de sIL-6R mo- difica-se dependendo da condição de pH muito mais do que aquela de H54/L28-IgG1, acelera a eliminação de sIL-6R mas não acelera a eli- minação mais do que quando sIL-6R é usado sozinho. Para acelerar a eliminação mais do que quando sIL-6R é usado sozinho, moléculas de ligação ao antígeno compreendendo uma região de Fc com ligação de FcRn aumentado na faixa de pH neutra (por exemplo, Fv4-IgG1-v2 e similares do Exemplo 1) devem ser usadas.
[01532] Entretanto, surpreendentemente, GA2-IgG1, da qual a ati- vidade de ligação de IgA humana varia dependendo da concentração de íon Ca, foi revelada por acelerar a eliminação de IgA humana mais do que quando IgA humana é usada somente, embora contenha uma região de Fc derivada de IgG1 nativa, que a ligação de FcRn na faixa de pH neutra não é aumentada. Similarmente, clone 278 dos quais a atividade de ligação de IgE humana varia dependendo da condição de pH, foi revelado por acelerar a eliminação de IgE humana mais do que quando IgE humana é usada somente, embora contenha uma região de Fc derivada de IgG1 nativa, que não tem ligação de FcRn aumen- tada na faixa de pH neutra. Sem estar restringido a uma teoria particu- lar, pensa-se que o seguinte mecanismo exemplar considera o que aconteceu com GA2-IgG1 e clone 278.
[01533] Quando a unidade de ligação antigênica é uma unidade (is- to é, um homomonômero), tal como em sIL-6R, duas moléculas ((isto é, duas unidades de ligação antigênicas) de antígenos ligam-se a uma molécula de anticorpo única que contém um domínio divalente de liga- ção ao antígeno, e um complexo de uma molécula de anticorpo anti- sIL-6R e duas moléculas de antígeno que contêm duas unidades de ligação antigênicas é formado. Por isso, este tipo de complexo anticor- po-antígeno tem somente uma região de Fc (região de Fc de IgG1 na- tiva) como mostrado na Fig. 1. Uma vez que este complexo liga-se a duas moléculas de FcRn ou uma molécula de FcγR via uma região de Fc única, a afinidade em direção a estes receptores é a mesma como aquela de um anticorpo IgG geral, e pensa-se que a absorção em cé- lulas ocorre não especificamente na maior parte.
[01534] Por outro lado, quando a unidade de ligação antigênica são duas unidades como em IgA humana, que é um dímero de um hetero- complexo de cadeias pesadas e cadeias leves, há duas unidades de epítopos aos quais os domínios de ligação ao antígeno se ligarão na unidade de ligação antigênica. Entretanto, quando um anticorpo anti- IgA bivalente (isto é, domínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de anticorpo anti-IgA se ligam ao mesmo epítopo) se liga ao seu antígeno, IgA, acredita-se que a ligação de cada um dos domínios de ligação ao antígeno bivalentes contidos na molécula de anticorpo anti-IgA única a cada uma das duas unidades de epítopo presentes em uma molécula de IgA única é difícil em vista da posição dos epítopos. Como resultado, acredita-se que moléculas de anticorpo anti-IgA separadas se ligam a duas unidades de epítopo de ligação antigênicas presentes nas duas moléculas de IgA que se ligam aos domínios bivalente de ligação ao antígeno presentes em uma molécula de anticorpo anti-IgA única, e consequentemente, os complexos anti- corpo-antígeno (complexos imunes) contendo pelo menos quatro mo- léculas (isto é, duas moléculas de IgA que são a molécula de antígeno e duas moléculas de anticorpo anti-IgA que são moléculas de ligação ao antígeno) são formadas.
[01535] Quando uma molécula de ligação ao antígeno, como um anticorpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, forma um grande complexo i- mune que é pelo menos um tetrâmero, o complexo imune pode ligar- se fortemente com avidez por pelo menos duas ou mais regiões de Fc multivalentes a FcγR, FcRn, receptores de complemento e similares. Por isso, como mostrado na Fig. 7, o complexo é absorvido em células que expressam estes receptores com uma eficiência mais alta do que IgG1 nativa. Por outro lado, uma vez que a afinidade mediada pela re- gião de Fc em direção a estes receptores de complexos imunes for- mados de moléculas de antígeno e moléculas de ligação ao antígeno que, por exemplo, se ligam a moléculas de antígeno (monoméricas) contendo uma unidade de ligação antigênica é insuficiente como men- cionado acima, os complexos imunes são absorvidos na maior parte não especificamente (menos eficientemente comparando com a ab- sorção mediada pela avidez de ligação) em células que expressam estes receptores, como mostrado na Fig. 1. Dessa forma, a absorção é mais ineficiente do que a absorção mediada pela avidez de ligação.
[01536] Quando a molécula de ligação ao antígeno tal como um an- ticorpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas é um anticorpo que contém do-
mínios de ligação ao antígeno dos quais a ligação do antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica como ligação dependente de pH ou Ca e que forma um complexo anticorpo- antígeno (complexo imune) contendo pelo menos quatro moléculas (duas moléculas de antígeno e duas moléculas de anticorpo) no plas- ma, uma vez o complexo imune é absorvido nas células, os antígenos dissociam-se dos anticorpos nos endossomas onde as condições de concentração iônica são diferentes daquelas no plasma. Por isso, a formação de complexo imune é dissolvida nos endossomas de células que absorveram os complexos imunes. Uma vez que os antígenos dissociados não podem ligar-se a FcRn nos endossomas, são degra- dados após se deslocarem para os lisossomas. Por outro lado, pensa- se que anticorpos dissociados do antígeno são reciclados para o plasma após ligar-se a FcRn nos endossomas (Fig. 7).
[01537] Como descrito acima, se um anticorpo que contém uma re- gião constante tipo IgG1 nativa contra um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas e mostra liga- ção dependente de pH ou de Ca puder formar um grande complexo imune e ligar-se a FcγR, FcRn, receptores de complemento, e simila- res com avidez, acredita-se que a eliminação de antígeno sozinho po- de ser seletivamente e enormemente acelerada. Acredita-se que quando GA2-IgG1 que se liga a IgA humana é administrada, tais gran- des complexos imunes são formados. De fato, como mostrado no E- xemplo 3, GA2-IgG1- FcγR(-) formado pela introdução em modifica- ções de GA2-IgG1 que prejudicam a ligação ao FcγR de camundongo não pode acelerar substancialmente a eliminação de IgA humana co- mo GA2-IgG1 quando comparado com IgA humana somente, e mos- trou um nível equivalente de eliminação como IgA humana somente. Por isso, a razão que GA2-IgG1 pode acelerar a eliminação de IgA humana consiste em porque o complexo imune contendo GA2-IgG1 e
IgA humana, que é um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, se liga com avidez a FcγR e é rapi- damente absorvido nas células que expressam FcγR. A IgA que se dissocia do complexo imune nos endossomas de células que absorve- ram o complexo imune é degradado nos lisossomas. Ao mesmo tem- po, o anticorpo dissociado de IgA, que estava ligado a FcRn nos en- dossomas, é posteriormente reciclado ao plasma e pode ligar-se no- vamente à IgA no plasma. Pensa-se que a eliminação de IgA humana no plasma é muito acelerada nesta maneira. Um método usando uma variante do aminoácido da região de Fc que se liga a FcRn em faixa neutra de pH é descrito em WO2011/122011 como um método para acelerar a eliminação de antígenos do plasma. A presente invenção é útil como um método para acelerar a eliminação do plasma de antíge- nos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de ligação anti- gênicas sem usar as variantes supracitadas, e como mostrado usando GA2-N434W, pode acelerar ainda a eliminação dos antígenos multimé- ricos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas do plasma pela combinação com as variantes supracitadas. Método para avaliar a formação de complexos imunes compreendendo duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unida- des de ligação antigênicas
[01538] A fim de exibir o efeito da aceleração adicional da elimina- ção de antígenos multiméricos compreendendo duas ou mais unida- des de ligação antigênicas do plasma como descrito acima, considera- se preferencial que seja formado um grande complexo imune de molé- culas de ligação ao antígeno e antígenos, e as regiões de Fc compre- endidas nas moléculas de ligação ao antígeno fortemente ligam-se a FcγR e/ou FcRn com avidez. Quando o antígeno contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, um grande complexo imune que compreende duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas pode ser formado. Por isso, pelo rastreamento por moléculas de ligação ao antígeno das quais a atividade de ligação a antígenos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas se modifica segundo uma con- centração iônica e que se ligam com avidez aos receptores supracita- dos, as moléculas de ligação ao antígeno que ainda aceleram a elimi- nação de antígenos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas do plasma podem ser obtidas. Método para avaliação da formação de complexo
[01539] Exemplos de métodos para avaliação da formação de com- plexos imunes compreendendo moléculas de ligação ao antígeno e antígenos incluem técnicas na química analítica, incluindo métodos que utilizam a propriedade que os complexos imunes se tornam maio- res moléculas do que uma molécula de ligação ao antígeno somente ou uma molécula de antígeno somente como cromatografia por exclu- são de tamanho (filtração em gel), método de análise de ultracentrifu- gação, método de dispersão de luz, microscopia eletrônica e espec- trometria de massa (Molecular Immunology (2002), 39, 77-84; Molecu- lar Immunology (2009), 47, 357-364). Por exemplo, quando a cromato- grafia por exclusão de tamanho (filtração em gel) é usada como mos- trada na Fig. 9, se um complexo imune é formado é avaliado obser- vando se há espécies moleculares que são maiores do que aquelas em análises da molécula de antígeno somente ou molécula de ligação ao antígeno somente.
[01540] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno ou o antígeno têm uma região constante de imunoglobulina, exemplos in- cluem métodos imunoquímicos incluindo métodos que usam a proprie- dade do complexo imune de ligar-se mais fortemente a um receptor de Fc ou um componente de complemento do que a molécula de ligação ao antígeno somente ou o antígeno somente, como métodos de ELI-
SA, FACS ou SPR (por exemplo, usando métodos Biacore) (The Jour- nal of Biological Chemistry (2001) 276 (9), 6591-6604; Journal of Im- munological Methods (1982) 50, 109-114; Journal of Immunology (2010) 184 (4), 1968-1976; mAbs (2009) 1 (5) 491-504). Por exemplo, quando ELISA é realizado imobilizando um receptor de Fc, a formação de um complexo imune é avaliada observando se o sinal detectado é aumentado comparando quando um antígeno somente ou uma molé- cula de ligação ao antígeno somente são avaliados. Método para promoção da eliminação de antígenos monoméricos do plasma usando um coquetel de moléculas de ligação ao antígeno
[01541] Como descrito acima, quando o antígeno é um antígeno multimérico (um exemplo não limitante é uma imunoglobulina como IgA ou IgE ou um membro da superfamília de TNF como TNF ou CD154), um grande complexo imune que compreende duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas pode ser formado. Por outro lado, mesmo quando o antí- geno é monomérico, uma mistura de duas ou mais moléculas de liga- ção ao antígeno apropriadas em que cada uma se liga a um epítopo separado presente no antígeno monomérico, onde a ligação aos epí- topos varia dependendo de uma condição de concentração iônica (como pH ou concentração de Ca) também pode formar um grande complexo imune que contém duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas (antígenos monoméricos). Neste pedido, a mistura de duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno apropriadas em que cada uma se liga a um epíto- po separado presente em um antígeno monomérico, onde ligação aos epítopos varia dependendo de uma condição de concentração iônica (como pH ou concentração de Ca) é chamada de coquetel de molécu- la de ligação ao antígeno. Entre estas moléculas de ligação ao antíge- no, pelo menos uma (os domínios de ligação ao antígeno compreendi-
dos em) das moléculas de ligação ao antígeno que formam o comple- xo imune têm que ser um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica. Método para promoção de eliminação de antígenos monoméricos do plasma usando moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas
[01542] Mesmo no caso de um antígeno monomérico, uma molécu- la de ligação ao antígeno contendo domínios de ligação ao antígeno em que cada um se liga a um epítopo separado presente no antígeno monomérico, onde a ligação dos domínios de ligação ao antígeno aos respectivos epítopos varia dependendo de uma condição de concen- tração iônica (como pH ou concentração de Ca) também pode formar um grande complexo imune que contém duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais unidades de ligação antigênicas (antígenos monoméricos). Exemplos de uma modalidade não limitante de tal molécula de ligação ao antígeno são anticorpos multiparatópicos ou anticorpos multiespecíficos que contêm regiões variáveis apropria- das que se ligam aos epítopos presentes no antígeno monomérico que se diferenciam um do outro. Como uma modalidade não limitante de tais anticorpos multiespecíficos ou anticorpos multiparatópicos, molé- culas de ligação ao antígeno cujas regiões variáveis mostram ligação dependente de pH ou de Ca (anticorpos biespecíficos ou anticorpos biparatópicos que contêm uma região variável de braço direito que re- conhece o epítopo A e uma região variável de braço esquerdo que re- conhece o epítopo o B, como mostrado na Fig. 8) também pode formar um grande complexo imune que contém dois ou mais anticorpos e du- as ou mais unidades de ligação antigênicas (antígenos monoméricos).
[01543] As moléculas de ligação ao antígeno que ainda aceleram a eliminação de antígenos monoméricos do plasma podem ser obtidas pelo rastreamento por combinações de domínios de ligação ao antíge- no que visam epítopos diferentes de um antígeno monomérico, onde a atividade de ligação a cada um dos epítopos varia dependendo de uma condição de concentração iônica, e que pode ligar-se com avidez aos receptores supracitados.
A condição de concentração iônica que modifica a atividade de ligação de um domínio multiespecífico ou mul- tiparatópico de ligação ao antígeno em direção a cada um dos epíto- pos pode ser a mesma condição de concentração iônica ou uma con- dição de concentração iônica diferente.
Uma molécula de ligação ao antígeno contendo domínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos, onde a atividade de ligação do epítopo de um dos do- mínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos varia de- pendendo da condição de pH ou uma condição de concentração iônica metálica como a concentração de íon Ca, pode ser apresentada como um exemplo de uma modalidade não limitante das moléculas de liga- ção ao antígeno da presente invenção.
Além disso, uma molécula de ligação ao antígeno contendo domínios de ligação ao antígeno biespe- cíficos ou biparatópicos, onde a atividade de ligação do epítopo de um dos domínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos varia dependendo da condição de pH e a atividade de ligação do epí- topo de outro domínio de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica metálica como a concentração de íon Ca, também pode ser apresentado como um exemplo de uma modalidade não limitante das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção.
Uma molécula de ligação ao antígeno contendo domínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos, onde a atividade de ligação do epítopo de um dos domínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos varia dependendo da condição de pH e a atividade de ligação do epítopo de outro domínio de ligação ao antígeno também varia dependendo da condição de pH, também pode ser apresentado como um exemplo de uma modalidade não limi- tante das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Uma molécula de ligação ao antígeno contendo domínios de ligação ao antígeno biespecíficos ou biparatópicos, onde a atividade de liga- ção do epítopo de um dos domínios de ligação ao antígeno biespecífi- cos ou biparatópicos varia dependendo de uma condição de concen- tração iônica metálica como a concentração de íon Ca e a atividade de ligação do epítopo de outro domínio de ligação ao antígeno também varia dependendo de uma condição de concentração de íon metálico como a concentração de íon Ca, também pode ser apresentada como um exemplo de uma modalidade não limitante das moléculas de liga- ção ao antígeno da presente invenção. Moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas e anticorpos multi- paratópicas
[01544] Uma molécula de ligação ao antígeno contendo pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula de antígeno e pelo menos o outro dos domínios de ligação ao antígeno liga-se a um segundo epítopo na molécula de antígeno, é chamado de uma molécula multiespecífica de ligação ao antígeno do ponto de vista da sua especificidade de reação. Quando uma molécula única de ligação ao antígeno se liga a dois epítopos diferentes por dois tipos de domínios de ligação ao antígeno contidos na molécula de li- gação ao antígeno, esta molécula de ligação ao antígeno é chamada de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno. Quando uma molécula única de ligação ao antígeno se liga a três epítopos diferen- tes por três tipos de domínios de ligação ao antígeno contidos na mo- lécula de ligação ao antígeno, esta molécula de ligação ao antígeno é chamada de uma molécula triespecífica de ligação ao antígeno.
[01545] O parátopo em um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo na molécula de antígeno tem uma estrutura diferente daquele do parátopo em um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo que é estruturalmente diferente do primeiro epítopo. Por isso, uma molécula de ligação ao antígeno con- tendo pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula de antígeno e pelo menos o outro dos do- mínios de ligação ao antígeno liga-se a um segundo epítopo na molé- cula de antígeno, é chamado de uma molécula multiparatópica de liga- ção ao antígeno do ponto de vista da sua estrutura e especificidade. Quando uma molécula única de ligação ao antígeno se liga a dois epí- topos diferentes por dois tipos de domínios de ligação ao antígeno contidos na molécula de ligação ao antígeno, esta molécula de ligação ao antígeno é chamada de uma molécula biparatópica de ligação ao antígeno. Quando uma molécula única de ligação ao antígeno se liga a três epítopos diferentes por três tipos de domínios de ligação ao antí- geno contidos na molécula de ligação ao antígeno, esta molécula de ligação ao antígeno é chamada de uma molécula triparatópica de liga- ção ao antígeno.
[01546] As moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas multivalentes compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno e métodos para prepará-las foram descritas em Documentos Não Patentes como Conrath et al. (J.Biol. Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), Muyldermans (Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277- 302), e Kontermann R.E. (2011) Bispecific Antibodies (Springer-Verlag) e em Documentos Patentes como WO 1996/034103 e WO 1999/023221. As moléculas de ligação ao antígeno da presente inven- ção podem ser produzidas usando as moléculas de ligação ao antíge- no multiespecíficas ou multiparatópicas e métodos para prepará-las descritos nestes documentos.
Anticorpos biespecíficos e métodos de produção destes
[01547] Os anticorpos biespecíficos e os métodos da produção des- tes são apresentados abaixo como os exemplos da modalidade das moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas acima mencionadas e métodos da produção disso. Os anticorpos bi- específicos são anticorpos que compreendem dois tipos de regiões variáveis que se ligam especificamente a epítopos diferentes. Os anti- corpos biespecíficos tipo IgG podem ser secretados de um hibridoma híbrido (quadroma) produzido fundindo dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).
[01548] Quando um anticorpo biespecífico é produzido usando téc- nicas de recombinação como os descritos na seção supracitada em anticorpos, pode-se adotar um método que introduz genes que codifi- cam cadeias pesadas contendo os dois tipos de regiões variáveis de interesse em células para coexpressá-los. Entretanto, mesmo quando somente a combinação da cadeia pesada é considerada, tal método de coexpressão produzirá uma mistura de (i) uma combinação de um par de cadeias pesadas nas quais as cadeias pesadas contém uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e outra cadeia pesa- da contém uma região variável que se liga a um segundo epítopo, (ii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que incluem cadeias somente pesadas que contêm uma região variável que se liga ao pri- meiro epítopo, e (iii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que incluem cadeias somente pesadas que contêm uma região variá- vel que se liga ao segundo epítopo, que estão presentes em uma pro- porção molecular de 2:1:1. É difícil purificar moléculas de ligação ao antígeno que contêm a combinação desejada de cadeias pesadas da mistura de três tipos de combinações da cadeia pesada.
[01549] Ao produzir anticorpos biespecíficos usando tais técnicas de recombinação, anticorpos biespecíficos que contêm uma combina-
ção heteromérica de cadeias pesadas podem ser preferencialmente secretados adicionando substituições de aminoácido apropriadas nos domínios CH3 que constituem as cadeias pesadas. Especificamente, este método é conduzido substituindo um aminoácido que tem uma maior cadeia lateral (região globular (que significa que "protuberân- cia")) por um aminoácido no domínio CH3 de uma das cadeias pesa- das e substituição de um aminoácido que tem uma cadeia lateral me- nor (buraco (que significa "vazio")) por um aminoácido no domínio CH3 de outra cadeia pesada para que a região globular seja colocada no buraco. Isto promove a formação da cadeia pesada heteromérica e simultaneamente inibe a formação da cadeia pesada homomérica (Publicação Internacional WO No. 1996027011; Ridgway et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
[01550] Além disso, também há as técnicas conhecidas para produ- zir um anticorpo biespecífico aplicando métodos para controlar a asso- ciação de polipeptídeos ou associação de multímeros heteroméricos formados do polipeptídeo à associação entre cadeias pesadas. Espe- cificamente, os métodos para controlar a formação da cadeia pesada podem ser empregados para produzir um anticorpo biespecífico (Pu- blicação Internacional WO No. 2006/106905), no qual os resíduos de aminoácido que formam a interface entre as cadeias pesadas são alte- rados para inibir a associação entre as cadeias pesadas que têm a mesma sequência e permitir a formação de cadeias pesadas de se- quências diferentes. Tais métodos podem ser usados para gerar anti- corpos biespecíficos.
[01551] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc derivada de um anti- corpo biespecífico descrito acima podem ser apropriadamente usados como a região de Fc contida em uma molécula de ligação ao antígeno.
Mais especificamente, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc podem ser apropriadamente usados, no qual, da sequência de a- minoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 349 como indicado pela numeração EU é Cys e o aminoácido na posição 366 é Trp, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptí- deos, o aminoácido na posição 356 como indicado pela numeração EU é Cys, o aminoácido na posição 366 é Ser, o aminoácido na posição 368 é Ala, e o aminoácido na posição 407 é Val.
[01552] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequên- cia de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp, e da sequência de amino- ácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser apropriadamente usa- dos como a região de Fc. Na modalidade acima mencionada, o ami- noácido na posição 409 pode ser Glu em vez de Asp, e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg em vez de Lys. Além disso, além do ami- noácido Lys na posição 399, Asp pode ser apropriadamente adiciona- do como aminoácido na posição 360 ou Asp pode ser apropriadamen- te adicionado como aminoácido na posição 392.
[01553] Ainda em outra modalidade não limitante da presente in- venção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU é Lys, pode ser apropriadamente usado como a região de Fc.
[01554] Ainda em outra modalidade não limitante da presente in- venção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU é Glu, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser apropriadamen- te usados como a região de Fc.
[01555] Ainda em outra modalidade não limitante da presente in- venção, qualquer uma das modalidades indicadas abaixo, no qual os mencionados acima foram combinados, pode ser apropriadamente u- sados como a região de Fc:
[01556] dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 370 é Glu, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numera- ção EU é Lys e o aminoácido na posição 357 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU pode ser Asp em vez de Glu, e o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 370 de acordo com a numeração EU);
[01557] dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 439 é Glu, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numera- ção EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido Asp na posição 360 de acordo com a numeração EU, o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU, ou o aminoácido Asp na posição 439 de acordo com a numeração EU pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 439 de acordo com a numeração EU);
[01558] dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual,
da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numera- ção EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys; e
[01559] dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 370 é Glu, e o aminoácido na posição 439 é Glu, e da se- quência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys, o aminoácido na posição 357 é Lys, e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numera- ção EU não pode ser substituído de Glu e além disso, quando o ami- noácido na posição 370 não é substituído por Glu, o aminoácido na posição 439 pode ser Asp em vez de Glu, ou o aminoácido Asp na po- sição 392 pode ser usado em vez do aminoácido Glu na posição 439).
[01560] Ainda, em outra modalidade não limitante da presente in- venção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 435 de acordo com a numeração EU é Arg e o aminoácido na posição 439 é Glu, também podem ser apropriadamente usados.
[01561] Ainda em outra modalidade não limitante da presente in- venção, dois polipeptídeos que formam uma região de Fc, na qual, da sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 357 são Lys, e da sequência de aminoácidos dos outros dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numera-
ção EU é Glu, o aminoácido na posição 435 é Arg, e o aminoácido na posição 439 é Glu, também pode ser apropriadamente usado.
[01562] Além disso, além da técnica supracitada de associar cadei- as pesadas heterólogas, a tecnologia CrossMab que é conhecida co- mo uma tecnologia por associar cadeias leves heterólogas, em que uma cadeia leve que forma uma região variável que se liga a um pri- meiro epítopo e uma cadeia leve que forma uma região variável que se liga a um segundo epítopo associam-se respectivamente com uma ca- deia pesada que forma uma região variável que se liga ao primeiro epítopo e uma cadeia pesada que forma uma região variável que se liga ao segundo epítopo (Scaefer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 11187-11192)), também pode ser usado para produzir as moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas fornecidas pela presente invenção. O uso de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antíge- nos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas a partir do plasma
[01563] A presente invenção fornece o uso de uma molécula de li- gação ao antígeno compreendendo (i) uma região de Fc e (ii) um do- mínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antíge- no varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[01564] em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que compreende (a) duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e (b) duas ou mais moléculas de antígeno contan- to que os antígenos compreendam duas ou mais unidades de ligação antigênicas, para eliminar os antígenos do plasma.
[01565] Na presente invenção, as modalidades do uso de uma mo- lécula de ligação ao antígeno não são particularmente limitadas en- quanto os antígenos podem ser eliminados do plasma. Exemplos de uma modalidade não limitante de tal uso são composições farmacêuti-
cas que contêm uma molécula de ligação ao antígeno fornecida pela presente invenção e métodos que compreendem administração a um indivíduo de uma molécula de ligação ao antígeno fornecida pela pre- sente invenção. Um exemplo de outra modalidade não limitante é o uso da molécula de ligação ao antígeno em um método ex vivo para eliminar antígenos do plasma, que inclui colocar em contato com um complexo imune formado pelo contato de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção com o plasma isolado de um indivíduo, e contendo duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e dois ou mais antígenos (contanto que os antígenos incluam duas ou mais unidades de ligação antigênicas) com células expressam FcRn ou re- ceptor de Fcγ. Melhora da farmacocinética
[01566] Na presente invenção, a "capacidade de eliminar antígenos no plasma" refere-se à capacidade de eliminar dos antígenos plasmá- ticos que estão presentes no plasma quando as moléculas de ligação ao antígeno são administradas in vivo ou quando as moléculas de li- gação ao antígeno são secretadas in vivo. Dessa forma, na presente invenção, a frase "a capacidade de uma molécula de ligação ao antí- geno de eliminar um antígeno no plasma é aumentada" pode ser usa- da quando a taxa da eliminação de antígeno do plasma é acelerada quando a molécula de ligação ao antígeno é administrada, quando comparada com a administração de moléculas de ligação ao antígeno que não podem formar os complexos imunes descritos na presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno que contêm domínios de ligação ao antígeno dos quais a atividade de ligação ao antígeno é in- dependente da concentração iônica ou moléculas de ligação ao antí- geno que contêm regiões de Fc com a atividade de ligação comprome- tida em direção a FcγR ou FcRn. Se a capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno de eliminar um antígeno no plasma é aumenta-
da pode ser avaliada, por exemplo, pela administração de um antígeno solúvel e a molécula de ligação ao antígeno in vivo e medindo a con- centração plasmática do antígeno solúvel após administração.
Julga- se que a capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno de eli- minar um antígeno no plasma seja aumentada se a concentração de um antígeno solúvel no plasma for reduzida após administração do antígeno solúvel e a molécula de ligação ao antígeno que é uma molé- cula de ligação ao antígeno capaz de formar um complexo imune que contém duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno e antígenos com duas ou mais unidades de ligação antigênicas, e das quais a ati- vidade de ligação ao antígeno se modifica dependendo de concentra- ções iônicas como redução da atividade de ligação ao antígeno na fai- xa de pH acídica em comparação com na faixa de pH neutra (ou redu- ção da atividade de ligação ao antígeno em uma baixa concentração de íon cálcio em comparação com uma alta concentração de íon cál- cio). O antígeno solúvel pode ser um antígeno que está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno ou um antígeno que não está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno no plasma, e sua concentração pode ser determinada como uma "concentração plasmática do antíge- no ligado à molécula de ligação ao antígeno" ou como uma "concen- tração plasmática do antígeno não ligado à molécula de ligação ao an- tígeno", respectivamente (o último é sinônimo "à concentração de antí- geno livre no plasma"). A "concentração de antígeno total no plasma" significa a soma de concentrações de antígeno ligado à molécula de ligação ao antígeno e o antígeno não ligado por uma molécula de liga- ção ao antígeno ou "concentração de antígeno livre no plasma" que é a concentração do antígeno não ligado por uma molécula de ligação ao antígeno.
Dessa forma, a concentração de antígeno solúvel pode ser determinada como a "concentração de antígeno total no plasma". Vários métodos para medir a "concentração de antígeno total no plas-
ma" ou a "concentração de antígeno livre no plasma" são bem conhe- cidos na técnica como descrito depois disto.
[01567] Neste pedido, "aumento da farmacocinética", "melhora da farmacocinética", e "farmacocinética superior" podem ser declarados novamente como "aumento de retenção plasmática (sangue)", "melho- ra de retenção plasmática (sangue)", "retenção plasmática superior (sangue)", e "retenção plasmática prolongada (sangue)". Estes termos são sinônimos.
[01568] Neste pedido, "a melhora da farmacocinética" significa não somente o prolongamento do período até a eliminação do plasma (por exemplo, até que a molécula de ligação ao antígeno seja degradada intracelularmente ou similar e não pode voltar ao plasma) após admi- nistração da molécula de ligação ao antígeno a seres humanos ou a- nimais não humanos como camundongos, ratos, macacos, coelhos, e cães, mas também prolongamento da retenção plasmática da molécu- la de ligação ao antígeno em uma forma que permita a ligação do an- tígeno (por exemplo, em uma forma sem antígenos da molécula de ligação ao antígeno) durante o período da administração à eliminação devido à degradação. IgG humana que tem região de Fc selvagem pode ligar-se a FcRn de animais não humanos. Por exemplo, o ca- mundongo pode ser preferencialmente usado para ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação ao antígeno da invenção uma vez que IgG humana tendo a região de Fc selvagem pode ligar-se ao FcRn de camundongo mais forte do que ao FcRn hu- mano (Int. Immunol (2001) 13 (12): 1551-1559). Como outro exemplo, o camundongo no qual seus genes de FcRn nativos são interrompidos e um transgene do gene de FcRn humano é escondido para ser ex- presso (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) também pode ser prefe- rencialmente usado para ser administrado a fim de confirmam a pro- priedade da molécula de ligação ao antígeno da invenção descrita a seguir.
Especificamente, "melhora da farmacocinética" também inclui o prolongamento do período até que a eliminação devido à degradação da molécula de ligação ao antígeno não se ligasse a antígenos (a for- ma sem antígenos da molécula de ligação ao antígeno). A molécula de ligação ao antígeno no plasma não pode ligar-se a um novo antígeno se a molécula de ligação ao antígeno já tenha se ligado a um antíge- no.
Dessa forma, quanto mais longo o período que a molécula de liga- ção ao antígeno não está ligada a um antígeno, mais longo o período que pode ligar-se a um novo antígeno (mais alta a possibilidade de ligação a outro antígeno). Isto permite a redução do período de tempo que um antígeno está sem a molécula de ligação ao antígeno in vivo e prolongamento do período que um antígeno está ligado à molécula de ligação ao antígeno.
A concentração plasmática da forma sem antíge- nos da molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada e o perí- odo que o antígeno está ligado à molécula de ligação ao antígeno po- de ser prolongado acelerando a eliminação de antígeno do plasma pe- la administração da molécula de ligação ao antígeno.
Especificamente, neste pedido, "melhora da farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno", inclui a melhora de um parâmetro farmacocinético da forma sem antígenos da molécula de ligação ao antígeno (qualquer um de prolongamento da meia-vida no plasma, prolongamento do tempo de retenção médio no plasma, e prejuízo da depuração plasmática), pro- longamento do período que o antígeno está ligado à molécula de liga- ção ao antígeno após administração da molécula de ligação ao antí- geno e aceleração da eliminação de antígeno mediada por ligação do antígeno na molécula do plasma.
A melhora da farmacocinética da mo- lécula de ligação ao antígeno pode ser avaliada determinando qual- quer um dos parâmetros, meia-vida no plasma, tempo de retenção plasmático médio, e a depuração plasmática da molécula de ligação ao antígeno ou forma isenta de antígenos desta ("Pharmacokinectis:
Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por exemplo, a concentração plasmática da molécula de ligação ao antí- geno ou forma isenta de antígenos desta é determinado após adminis- tração da molécula de ligação ao antígeno a camundongos, ratos, ma- cacos, coelhos, cães ou seres humanos. Então, cada parâmetro é de- terminado. Quando a meia-vida plasmática ou tempo de retenção plasmático médio é prolongada, pode julgar-se que a farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno seja melhorada. Os parâmetros podem ser determinados por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Os parâmetros podem ser apropriadamente avaliados, por exemplo, pela análise não compartimental usando o programa de aná- lise de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções acrescentado. A concentração plasmática da molécula isenta antígenos de ligação ao antígeno pode ser determinada por mé- todos conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, usando o método de ensaio descrito em Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48 (4): 406-
417.
[01569] Neste pedido, "melhora da farmacocinética" também inclui o prolongamento do período que um antígeno está ligado a uma molé- cula de ligação ao antígeno após administração da molécula de liga- ção ao antígeno. Se o período que um antígeno está ligado à molécula de ligação ao antígeno após administração da molécula de ligação ao antígeno é prolongado pode ser avaliado determinando a concentra- ção plasmática do antígeno livre. O prolongamento pode ser julgado baseado na concentração plasmática determinada do antígeno livre ou o período de tempo requerido para um aumento na proporção da con- centração de antígeno livre à concentração de antígeno total.
[01570] A concentração plasmática do antígeno livre não ligado à molécula de ligação ao antígeno ou a proporção da concentração de antígeno livre à concentração de antígeno total pode ser determinada por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, pelo método usado em Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103. Alterna- tivamente, quando um antígeno exibe uma função particular in vivo, se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que neutraliza a função de antígeno (molécula antagonística) pode ser ava- liado testando se a função de antígeno é neutralizada. Se a função de antígeno é neutralizada pode ser avaliado analisando um marcador in vivo que reflete a função do antígeno. Se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que ativa a função de antígeno (mo- lécula agonística) pode ser avaliado analisando um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.
[01571] A determinação da concentração plasmática do antígeno livre e a proporção da quantidade do antígeno livre no plasma para a quantidade do antígeno total no plasma, ensaio de marcador in vivo e tais medidas não é particularmente limitada; entretanto, os ensaios são preferencialmente realizados depois que certo período de tempo pas- sou após administração da molécula de ligação ao antígeno. Na pre- sente invenção, o período depois que a administração da molécula de ligação ao antígeno não é particularmente limitada; os especialistas na técnica podem determinar o período apropriado dependendo das pro- priedades e similares da molécula administrada de ligação ao antíge- no. Tais períodos incluem, por exemplo, um dia após administração da molécula de ligação ao antígeno, três dias após administração da mo- lécula de ligação ao antígeno, sete dias após administração da molé- cula de ligação ao antígeno, 14 dias após administração da molécula de ligação ao antígeno, e 28 dias após administração da molécula de ligação ao antígeno. Neste pedido, o conceito "concentração plasmáti- ca de antígeno" compreende tanto "concentração de antígeno total no plasma" que é a soma da molécula de ligação ao antígeno ligada ao antígeno e concentração de antígeno não ligado ou "concentração de antígeno livre no plasma" que é a concentração de antígeno não ligado de molécula de ligação ao antígeno.
[01572] A concentração de antígeno total no plasma pode ser redu- zida pela administração, como molécula de ligação ao antígeno, da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção por 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 ve- zes, 1.000 vezes, ou até mais comparando com a administração de uma molécula de ligação ao antígeno contendo um domínio de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno é independente da concentração de íons ou uma molécula de ligação ao antígeno con- tendo uma região de Fc com uma atividade de ligação de FcγR preju- dicada, ou em comparação quando a molécula de domínio de ligação ao antígeno da presente invenção não é administrada.
[01573] A proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao an- tígeno pode ser calculada como mostrado abaixo:
[01574] valor A: a concentração molar de antígeno em cada ponto de tempo
[01575] valor B: a concentração molar da molécula de ligação ao antígeno em cada ponto de tempo
[01576] valor C: a concentração molar de antígeno por concentra- ção molar de molécula de ligação ao antígeno (proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno) em cada ponto de tempo C=A/B.
[01577] O menor valor C indica eficiência mais alta da eliminação de antígeno por molécula de ligação ao antígeno ao passo que o valor mais alto C indica a eficiência mais baixa da eliminação de antígeno por molécula de ligação ao antígeno.
[01578] A proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao an- tígeno pode ser calculada como descrito acima.
[01579] Administrar uma molécula de ligação ao antígeno da pre-
sente invenção pode abaixar a proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno por 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1000 vezes ou mais quando comparada com a administração de moléculas de ligação ao antígeno que não podem formar os complexos imunes descritos na presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno que contêm domínios de ligação ao antígeno dos quais a atividade de ligação ao antígeno é in- dependente de concentrações iônicas ou moléculas de ligação ao an- tígeno que contêm regiões de Fc com a atividade de ligação compro- metida em direção a FcγR ou FcRn.
[01580] Na presente invenção, como referência da comparação com as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, molé- culas de ligação ao antígeno que não podem formar os complexos i- munes descritos na presente invenção, moléculas de ligação ao antí- geno que contêm domínios de ligação ao antígeno dos quais a ativida- de de ligação ao antígeno é independente de concentrações iônicas ou moléculas de ligação ao antígeno que contêm regiões de Fc com a atividade de ligação comprometida em direção a FcγR ou FcRn.
[01581] Quando uma via mediada por FcRn é usada na incorpora- ção de moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção do plasma em células, a redução da concentração de antígeno total no plasma ou a proporção molar de antígeno/anticorpo também pode ser avaliada usando a linhagem 32 ou linhagem 276 de camundongo transgênico de FcRn humano (Jackson Laboratories, Methods Mol Bi- ol. 2010; 602: 93-104) pelo modelo de co-injeção anticorpo-antígeno ou modelo de infusão de antígeno modelar em estado permanente quando a molécula de ligação ao antígeno não reage de forma cruza- da com o antígeno da contraparte de camundongo. Quando a molécu- la de ligação ao antígeno reage de forma cruzada com a contraparte de camundongo, também pode ser avaliada injetando simplesmente a molécula de ligação ao antígeno na linhagem 32 ou linhagem 276 de camundongo transgênico de FcRn humano (Jackson Laboratories). No modelo de coinjeção, a mistura da molécula de ligação ao antígeno e antígeno é administrada a camundongos. No modelo de infusão de antígeno em estado permanente, a bomba de infusão enchida de uma solução de antígeno é introduzida em camundongos para alcançar uma concentração plasmática de antígeno constante, e em seguida a molécula de ligação ao antígeno é injetada nos camundongos. As mo- léculas de ligação ao antígeno teste são administradas na mesma do- sagem. A concentração de antígeno total no plasma, a concentração de antígeno livre no plasma e a concentração de molécula de ligação ao antígeno no plasma são medidas no método usando pontos de tempo apropriados conhecidos pelos especialistas na técnica.
[01582] Quando uma via mediada por FcγR é usada na incorpora- ção de moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção do plasma em células, a redução da concentração de antígeno total no plasma ou proporção molar de antígeno/anticorpo pode ser avaliada pelo modelo de co-injeção anticorpo-antígeno ou pelo modelo de infu- são de antígeno em estado permanente usando camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River Japan) quando a molécula de ligação ao antígeno não reage de forma cruzada com o antígeno da contraparte de camundongo. Se a molécula de ligação ao antígeno reagir de forma cruzada com a contraparte de camundongo, a avaliação pode ser realizada simplesmente injetando a molécula de ligação ao antígeno nos camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River Japan).
[01583] No modelo de coinjeção, uma mistura da molécula de liga- ção ao antígeno e antígeno é administrada a camundongos. No mode- lo de infusão de antígeno em estado permanente, uma bomba de infu- são enchida com uma solução de antígeno é introduzida em camun-
dongos para alcançar uma concentração plasmática de antígeno cons- tante, e em seguida a molécula de ligação ao antígeno é injetada nos camundongos. As moléculas de ligação ao antígeno teste são adminis- tradas na mesma dose. A concentração de antígeno total no plasma, a concentração de antígeno livre no plasma e a concentração de molé- cula de ligação ao antígeno no plasma são medidas em métodos u- sando pontos de tempo apropriados conhecidos pelos especialistas na técnica.
[01584] A concentração de antígeno total ou livre no plasma e pro- porção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno pode ser medida em 2, 4, 7, 14, 28, 56, ou 84 dias após administração para avaliar o efeito de longo prazo da presente invenção. Em outras pala- vras, uma concentração plasmática de antígeno de longo prazo é de- terminada medindo a concentração de antígeno total ou livre no plas- ma e proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno em 2, 4, 7, 14, 28, 56, ou 84 dias após a administração de uma molé- cula de ligação ao antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Se a redução de con- centração plasmática de antígeno ou proporção molar de antíge- no/molécula de ligação ao antígeno é alcançada pela molécula de li- gação ao antígeno descrita na presente invenção pode ser determina- do pela avaliação da redução em qualquer um ou mais dos pontos de tempo descritos acima.
[01585] A concentração de antígeno total ou livre no plasma e pro- porção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno pode ser medida em 15 min, 1, 2, 4, 8, 12, ou 24 horas após administração para avaliar o efeito a curto prazo da presente invenção. Em outras pala- vras, uma concentração plasmática de antígeno a curto prazo é de- terminada medindo a concentração de antígeno total ou livre no plas- ma e proporção molar de antígeno/molécula de ligação ao antígeno em 15 min, 1, 2, 4, 8, 12, ou 24 horas após a administração de uma molécula de ligação ao antígeno a fim de avaliar a propriedade da mo- lécula de ligação ao antígeno da presente invenção.
[01586] A via da administração de uma molécula de ligação ao antí- geno da presente invenção pode ser selecionada a partir de injeção intradérmica, intravenosa, intravitreal, subcutânea, intraperitonial, pa- renteral e intramuscular.
[01587] Na presente invenção, é preferencial que a farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno no ser humano seja melhorada. Quando a retenção plasmática no ser humano é difícil de determinar, pode ser predita baseada na retenção plasmática em camundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos transgênicos ex- pressando antígeno humano, camundongos transgênicos expressando FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos cinomolgus).
[01588] Neste pedido, "melhora da farmacocinética e retenção plasmática prolongada de uma molécula de ligação ao antígeno" signi- ficam a melhora de qualquer parâmetro farmacocinético (qualquer um de prolongamento da meia-vida no plasma, prolongamento do tempo de retenção médio em plasma, redução da depuração plasmática e biodisponibilidade) depois administração in vivo da molécula de liga- ção ao antígeno ou aumento na concentração da molécula de ligação ao antígeno no plasma em um tempo apropriado após administração. Pode ser determinado medindo qualquer parâmetro como meia-vida no plasma, tempo de retenção médio em plasma, depuração plasmáti- ca e biodisponibilidade da molécula de ligação ao antígeno (Pharma- cokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nan- zando), (Nanzando)). Por exemplo, quando uma molécula de ligação ao antígeno é administrada a camundongos (camundongos normais e camundongos transgênicos de FcRn humano), ratos, macacos, coe- lhos, cães, seres humanos, e similares, e a concentração da molécula de ligação ao antígeno no plasma é determinada e cada um dos pa- râmetros é calculado, pode-se julgar que a farmacocinética da molécu- la de ligação ao antígeno seja melhorada quando a meia-vida plasmá- tica ou tempo de retenção médio no plasma é prolongada. Estes pa- râmetros podem ser determinados por métodos conhecidos pelos es- pecialistas na técnica. Por exemplo, os parâmetros podem ser apropri- adamente avaliados pela análise não compartimental usando o pro- grama de análise de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções anexado.
[01589] Sem estar restrito a uma teoria particular, o seguinte meca- nismo é um exemplo de um mecanismo que permite a eliminação de unidades de ligação antigênicas do plasma por uma molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção que compreende (i) uma região de Fc e (ii) um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentra- ção iônica, em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que contém duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e antígenos que compreendem duas ou mais unidades de ligação antigênicas. Quando a unidade de ligação antigênica é uma unidade (isto é, um monômero), tal como em sIL-6R, duas moléculas ((isto é, duas unidades de ligação antigênicas) de antígenos ligam-se a uma molécula de anticorpo única que contém um domínio divalente de ligação ao antígeno, e um complexo de uma molécula de anticorpo anti-sIL-6R e duas moléculas de antígeno que contêm duas unidades de ligação antigênicas é formado. Por isso, este tipo de complexo anti- corpo-antígeno tem somente uma região de Fc (região de Fc de IgG1 nativa) como mostrado na Fig. 1. Uma vez que este complexo liga-se a duas moléculas de FcRn ou uma molécula de FcγR via uma região de Fc única, a afinidade em direção a estes receptores é a mesma como aquela de um anticorpo IgG geral, e pensa-se que a absorção em cé-
lulas ocorre não especificamente na maior parte.
[01590] Por outro lado, quando a unidade de ligação antigênica é duas unidades como em IgA humana, que é um dímero de um hetero- complexo de cadeias pesadas e cadeias leves, há duas unidades de epítopos aos quais os domínios de ligação ao antígeno se ligarão na unidade de ligação antigênica. Entretanto, quando um anticorpo anti- IgA bivalente (isto é, os domínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de anticorpo anti-IgA se ligam ao mesmo epítopo) se liga ao seu antígeno, IgA, acredita-se que a ligação de cada um dos domínios de ligação ao antígeno bivalentes contidos na molécula de anticorpo anti-IgA única a cada uma das duas unidades de epítopo presentes em uma molécula de IgA única é difícil em vista da posição dos epítopos. Como resultado, acredita-se que as moléculas de anti- corpo anti-IgA separadas se ligam a duas unidades de ligação antigê- nicas presentes nas duas moléculas de IgA que se ligam aos domínios bivalente de ligação ao antígeno presentes em uma molécula de anti- corpo anti-IgA única, e consequentemente, os complexos anticorpo- antígeno (complexos imunes) contendo pelo menos quatro moléculas (isto é, duas moléculas de IgA que são a molécula de antígeno e duas moléculas de anticorpo anti-IgA que são moléculas de ligação ao antí- geno) são formados.
[01591] Quando uma molécula de ligação ao antígeno como um anticorpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, forma um grande complexo i- mune que é pelo menos um tetrâmero, o complexo imune pode ligar- se fortemente com avidez por pelo menos duas ou mais regiões de Fc multivalentes a FcγR, FcRn, receptores de complemento e similares. Por isso, como mostrado na Fig. 7, o complexo é absorvido eficiente- mente em células que expressam estes receptores. Por outro lado, uma vez a afinidade mediada pela região de Fc em direção a estes receptores de complexos imunes formados de moléculas de antígeno e moléculas de ligação ao antígeno que, por exemplo, se ligam a mo- léculas de antígeno (monoméricas) que contêm uma unidade de liga- ção antigênica é insuficiente como mencionado acima, os complexos imunes são absorvidos não especificamente na maior parte (menos eficientemente quando comparados com a absorção mediada pela a- videz de ligação) em células que expressam estes receptores, como mostrado na Fig. 1. Dessa forma, a absorção é mais ineficiente do que a absorção mediada pela avidez de ligação.
[01592] Quando a molécula de ligação ao antígeno como um anti- corpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas é um anticorpo que contém do- mínios de ligação ao antígeno dos quais a ligação do antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica tal como ligação dependente de pH ou de Ca e que forma um complexo anticorpo- antígeno (complexo imune) contendo pelo menos quatro moléculas (duas moléculas de antígeno e duas moléculas de anticorpo) no plas- ma, uma vez que o complexo imune é absorvido nas células, os antí- genos dissociam-se dos anticorpos nos endossomas onde as condi- ções de concentração iônicas são diferentes daquelas no plasma. Por isso, a formação do complexo imune é dissolvida nos endossomas de células que absorveram os complexos imunes. Uma vez que os antí- genos dissociados não podem ligar-se a FcRn nos endossomas, são degradados após se deslocarem para os lisossomas. Por outro lado, pensa-se que os anticorpos dissociados do antígeno são reciclados para o plasma após ligção a FcRn nos endossomas (Fig. 7).
[01593] Como descrito acima, se um anticorpo que contém uma re- gião constante tipo IgG1 nativa contra um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas e mostra liga- ção dependente de pH ou de Ca puder formar um grande complexo imune e ligar-se a FcγR, FcRn, receptores de complemento, e simila- res com avidez, acredita-se que a eliminação de antígeno somente possa ser seletivamente e enormemente acelerada.
Acredita-se que quando GA2-IgG1 que se liga a IgA humana é administrado, tais gran- des complexos imunes sejam formados.
De fato, como mostrado no Exemplo 3, GA2-IgG1-FcγR(-) formado pela introdução em modifica- ções de GA2-IgG1 que prejudicam a ligação ao FcγR de camundongo não pode acelerar substancialmente a eliminação de IgA humana co- mo GA2-IgG1 quando comparada com IgA humana somente, e mos- trou um nível equivalente da eliminação como IgA humana somente.
Por isso, a razão que GA2-IgG1 poderia acelerar a eliminação de IgA humana consiste em que o complexo imune que contém GA2-IgG1 e IgA humana, que é um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, se liga com avidez a FcγR e é rapi- damente absorvido nas células que expressam FcγR.
A IgA que se dissocia do complexo imune nos endossomas de células que absorve- ram o complexo imune é degradado nos lisossomas.
Ao mesmo tem- po, o anticorpo dissociado de IgA, que estava ligado a FcRn nos en- dossomas, é posteriormente reciclado ao plasma e pode ligar-se no- vamente a IgA no plasma.
Pensa-se que a eliminação de IgA humana no plasma é muito acelerada nesta maneira.
Um método usando uma variante do aminoácido da região de Fc que se liga a FcRn na faixa neutra de pH é descrito em WO2011/122011 como um método para acelerar a eliminação de antígenos do plasma.
A presente invenção é útil como um método para acelerar a eliminação do plasma de antíge- nos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de ligação anti- gênicas sem usar as variantes supracitadas e pode acelerar mais a eliminação dos antígenos multiméricos que contêm duas ou mais uni- dades de ligação antigênicas do plasma pela combinação com as vari- antes supracitadas.
Método ex vivo para eliminação de antígenos do plasma
[01594] Um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação ao antígeno no método fornecido pela pre- sente invenção para eliminar antígenos do plasma inclui o uso da mo- lécula de ligação ao antígeno em um chamado método ex vivo para eliminar antígenos do plasma, que inclui a formação de um complexo imune que contém duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e duas ou mais moléculas de antígeno (contanto que os antígenos contenham duas ou mais unidades de ligação antigênicas) permitindo as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção entrar em contato com o plasma isolado de um indivíduo e permitindo o comple- xo imune entrar em contato com células que expressam FcRn e/ou receptores de Fcγ. A velocidade de eliminação de antígeno do plasma também pode ser promovida substituindo ou combinando um método para administrar moléculas de ligação ao antígeno in vivo com um chamado método ex vivo, em que o plasma que contém moléculas de ligação ao antígeno e antígenos que se ligam às moléculas de ligação ao antígeno é temporariamente absorvido fora do corpo e em seguida colocado em contato com células que expressam FcRn e/ou recepto- res de Fcγ por um certo período de tempo e o plasma que contém mo- léculas de ligação ao antígeno extracelularmente recicladas (ou re- secretadas ou re-circuladas) que não estão ligadas ao antígeno é de- volvido ao corpo.
[01595] Além disso, um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação ao antígeno no método fornecido pela presente invenção para eliminar antígenos do plasma inclui o uso da molécula de ligação ao antígeno em um chamado método ex vivo para eliminar antígenos do plasma, que inclui colocar em contato com um complexo imune que contém duas ou mais das moléculas de liga- ção ao antígeno e duas ou mais moléculas de antígeno (contanto que os antígenos compreendam duas ou mais unidades de ligação antigê- nicas) presentes no plasma isolado de um indivíduo a quem as molé- culas de ligação ao antígeno da presente invenção são administradas com células que expressam FcRn e/ou receptores de Fcγ.
[01596] Se um antígeno é eliminado do plasma pode ser confirma- do, por exemplo, avaliando se a velocidade da eliminação de antígeno do plasma mencionado acima é promovida usando como um controle, moléculas de ligação ao antígeno que não podem formar os comple- xos imunes descritos na presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno que contêm domínios de ligação ao antígeno com atividade de ligação ao antígeno independente da concentração iônica ou molé- culas de ligação ao antígeno que contêm uma região de Fc com ativi- dade de ligação prejudicada em direção a FcγR ou FcRn, em vez das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Método de rastreamento de moléculas de ligação ao antígeno que contêm uma região de Fc e um domínio de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno é dependente da concentração iônica
[01597] A presente invenção fornece um método de rastreamento de uma molécula de ligação ao antígeno e tem uma função de eliminar antígenos do plasma, o método compreendendo:
[01598] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[01599] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[01600] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[01601] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima;
[01602] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima;
[01603] colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno obti- da em (e) acima com um antígeno; e
[01604] avaliação da formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno.
[01605] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolar um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação ao antígeno cujas modificações de atividade de ligação dependendo da condição selecionada como descrito acima, o polinucleotídeo é inseri- do em um vetor de expressão apropriado. Por exemplo, quando o do- mínio de ligação ao antígeno é uma região variável de anticorpo, me- diante um cDNA que codifica a região variável é obtida, o cDNA é dige- rido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição inseridos nas duas extremidades do cDNA. Preferencialmente, as en- zimas de restrição reconhecem e digerem uma sequência nucleotídica que aparece em uma baixa frequência na sequência nucleotídica que compõe o gene da molécula de ligação ao antígeno. Além disso, as enzimas de restrição que fornecem extremidades coesivas são prefe- rencialmente inseridas para inserir uma cópia única de um fragmento digerido no vetor na orientação correta. O cDNA que codifica uma re- gião variável de uma molécula de ligação ao antígeno digerida como descrito acima é inserido em um vetor de expressão apropriado para obter um vetor de expressão da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Neste tempo, um gene que codifica uma região constante de anticorpo (região C) pode ser fundido na estrutura com o gene que codifica a região variável.
[01606] Para produzir uma molécula de ligação ao antígeno de inte- resse, um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antí- geno é inserido em uma maneira operacionalmente ligada a uma se- quência reguladora em um vetor de expressão. As sequências regula-
doras incluem, por exemplo, potencializadores e promotores. Além disso, uma sequência sinal apropriada pode ser ligada ao terminal N para que a molécula expressa de ligação ao antígeno seja secretada ao exterior das células. Como sequência sinal, por exemplo, um peptí- deo tendo a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 5) é usado; entretanto, também é possível ligar outras sequências sinal apropriadas. O polipeptídeo expresso é clivado no terminal carboxila da sequência descrita acima, e o polipeptídeo cliva- do é secretado como um polipeptídeo maduro para o exterior das célu- las. Então, as células hospedeiras apropriadas são transformadas com este vetor de expressão para que as células recombinantes que ex- pressam o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antí- geno de interesse possam ser obtidas. As moléculas de ligação ao an- tígeno da presente invenção podem ser produzidas das células re- combinantes seguindo os métodos descritos acima na seção em anti- corpos.
[01607] Para um ácido nucleico, "operacionalmente ligado" significa que o ácido nucleico tem uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA que codifica uma pré-sequência ou um líder secretório é operacionalmente ligado a DNA que codifica certo polipeptídeo se ele deve ser expresso como uma proteína pre- cursora envolvida na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou po- tencializador são operacionalmente ligados a uma sequência de codifi- cação se afetar a transcrição da sequência de codificação. Um sítio de ligação de ribossomo é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver em uma posição que facilite a tradução. Geral- mente, "operacionalmente ligado" significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas, e em caso de um líder secretório, significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas e em uma fase de leitu- ra. Entretanto, os potencializadores não têm que ser contíguos. A liga-
ção é realizada pela ligação em sítios de restrição adequados. Se tais sítios não existirem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usados conforme a prática convencional. Além disso, os ácidos nucleicos ligados podem ser produzidos pela técnica de PCR de extensão de sobreposição supracitada.
[01608] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolar um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condição selecionada, uma variante do polinucleotídeo é inserida em um vetor de expressão apropriado. Tais variantes preferencialmen- te incluem as preparadas via humanização baseada na sequência de polinucleotídeos que codifica uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção obtida pelo rastreamento como uma biblioteca de região variável aleatória, uma biblioteca sintética ou uma biblioteca i- mune construída se originando de animais não humanos. Os mesmos métodos como descritos acima para produzir as moléculas de ligação ao antígeno humanizadas descritas acima podem ser usados como um método para produzir variantes de molécula de ligação ao antígeno humanizadas.
[01609] Em outra modalidade, tais variantes preferencialmente in- cluem as obtidaos introduzindo uma alteração que aumenta a afinida- de por antígeno (maturação por afinidade) de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção em uma sequência de polinucleotí- deos isolada da molécula obtida por rastreamento usando uma biblio- teca sintética ou uma biblioteca naive como uma biblioteca de região variável aleatória. Tais variantes podem ser obtidas por vários proce- dimentos conhecidos para maturação por afinidade, incluindo mutagê- nese de CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), mistura de cadeia (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-
368)), mistura de DNA (Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), exibição de fago (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)), e PCR sexual (Clameri et al. (Nature (1998) 391, 288-291)).
[01610] Como descrito acima, as moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção da presente invenção incluem moléculas de ligação ao antígeno que têm uma região de Fc. Várias variantes podem ser usadas como regiões de Fc. Em uma mo- dalidade, as variantes da presente invenção preferencialmente incluem polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno que têm uma cadeia pesada na qual um polinucleotídeo que codifica uma variante de região de Fc como descrito acima é ligado em estrutura a um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação ao antígeno des- crito acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condi- ção selecionada.
[01611] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, as regiões de Fc preferencialmente incluem, por exemplo, regiões cons- tantes de Fc dos anticorpos tais como IgG1 da SEQ ID NO: 13 (Ala é adicionado ao terminal N de AAC82527.1), IgG2 da SEQ ID NO: 14 (Ala é adicionado ao terminal N de AAB59393.1), IgG3 da SEQ ID NO: (CAA27268.1) e IgG4 da SEQ ID NO: 16 (Ala é adicionado ao ter- minal N de AAB59394.1). A retenção plasmática de moléculas de IgG é relativamente longa (a eliminação do plasma é lenta) uma vez que F- cRn, particularmente FcRn humano, funciona como um receptor de salvamento de moléculas de IgG. As moléculas de IgG incorporadas em endossomas por PEGcitose ligam-se sob condição acídica endos- somal a FcRn, particularmente FcRn humano, expresso em endosso- mas. As moléculas de IgG que não podem ligar-se a FcRn, particular- mente FcRn humano, são transferidas para lisossomas e degradadas lá. Entretanto, as moléculas de IgG ligadas a FcRn, particularmente FcRn humano, são transferidas para a superfície celular, e em seguida voltam ao plasma em consequência da dissociação de FcRn, particu- larmente FcRn humano, sob condição neutra no plasma.
[01612] Uma vez que os anticorpos compreendendo uma região de Fc típica não têm uma atividade de ligação a FcRn, particularmente a FcRn humano, sob condição de faixa de pH neutra plasmática, anti- corpos típicos e complexos anticorpo-antígeno são incorporados em células por endocitose não específica e transferidos para a superfície celular ligando-se a FcRn, particularmente FcRn humano, na condição de faixa de pH acídica endossomal. FcRn, particularmente FcRn hu- mano, carreia anticorpos do endossoma para a superfície celular. Des- sa forma, pensa-se que quaisquer FcRn, particularmente FcRn huma- no, também estão presentes na superfície celular. Entretanto, os anti- corpos são reciclados para o plasma, uma vez que se dissociaram de FcRn, particularmente FcRn humano, na condição de faixa de pH neu- tra na superfície celular.
[01613] As regiões de Fc que têm atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra, que pode estar incluída nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, podem ser obtidas por qualquer método. Especificamente, as regiões de Fc que têm atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra podem ser obtidas alterando aminoácidos da imunoglobulina tipo IgG humana como uma região de Fc inicial. Regiões de Fc preferenciais da imunoglobulina tipo IgG humana para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 e variantes destas). Os ami- noácidos em qualquer posição podem ser alterados a outros aminoá- cidos enquanto as regiões resultantes têm a atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra ou aumentaram a atividade de ligação de FcRn humano na faixa neutra. Quando uma molécula de ligação ao antígeno compreende a região de Fc de IgG1 humana co- mo região de Fc humano, é preferencial que a região resultante com-
preenda uma alteração que resulta no efeito de aumentar FcRn huma- no que se liga na faixa de pH neutra quando comparada com a ativi- dade de ligação da região de Fc inicial de IgG1 humana. Os aminoáci- dos que permitem tais alterações incluem, por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo das posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440, e 442 (indicado pela numeração EU). Mais especificamente, tais alterações de aminoácido incluem as lista- das na Tabela 5. A alteração destes aminoácidos aumenta a ligação de FcRn humano da região de Fc da imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neutra.
[01614] Entre as descritas acima, alterações apropriadas que au- mentam FcRn humano que se liga na faixa de pH neutra são selecio- nadas para o uso na presente invenção. Aminoácidos particularmente preferenciais de tais variantes da região de Fc incluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (indicado pela numeração EU). A atividade de ligação de FcRn humano da região de Fc incluída em uma molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada na faixa de pH neutra substituindo pelo menos um aminoácido por um aminoácido diferente.
[01615] Alterações particularmente preferenciais na região de Fc incluem, por exemplo, pelo menos uma ou mais alterações de aminoá- cido selecionadas a partir do grupo de:
[01616] Met para o aminoácido na posição 237;
[01617] Ile para o aminoácido na posição 248;
[01618] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci-
do na posição 250;
[01619] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252;
[01620] Thr para o aminoácido na posição 254;
[01621] Glu para o aminoácido na posição 255;
[01622] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256;
[01623] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido na posição 257;
[01624] His para o aminoácido na posição 258;
[01625] Ala para o aminoácido na posição 265;
[01626] Ala ou Glu para o aminoácido na posição 286;
[01627] His para o aminoácido na posição 289;
[01628] Ala para o aminoácido na posição 297;
[01629] Ala para o aminoácido na posição 303;
[01630] Ala para o aminoácido na posição 305;
[01631] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307;
[01632] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308;
[01633] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido na posição 309;
[01634] Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311;
[01635] Ala ou His para o aminoácido na posição 312;
[01636] Lys ou Arg para o aminoácido na posição 314;
[01637] Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315;
[01638] Ala para o aminoácido na posição 317;
[01639] Val para o aminoácido na posição 332;
[01640] Leu para o aminoácido na posição 334;
[01641] His para o aminoácido na posição 360;
[01642] Ala para o aminoácido na posição 376;
[01643] Ala para o aminoácido na posição 380;
[01644] Ala para o aminoácido na posição 382;
[01645] Ala para o aminoácido na posição 384;
[01646] Asp ou His para o aminoácido na posição 385;
[01647] Pro para o aminoácido na posição 386;
[01648] Glu para o aminoácido na posição 387;
[01649] Ala ou Ser para o aminoácido na posição 389;
[01650] Ala para o aminoácido na posição 424;
[01651] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428;
[01652] Lys para o aminoácido na posição 433;
[01653] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e
[01654] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436 no sistema de numeração EU. Entretanto, o número de aminoáci- dos alterados não é particularmente limitado; tais alterações de ami- noácido incluem a alteração de aminoácido única e a alteração de a- minoácidos em dois ou mais sítios. As combinações de alterações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem, por exemplo, as descritas nas Tabelas 5-1 a 5-32.
[01655] Além da região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) huma- nas, como as regiões de Fc incluídas na presente invenção, regiões de Fc com a ligação de FcγR modificada, que têm uma atividade de liga- ção do receptor de Fcγ mais alta do que a região de Fc de IgG huma- na nativa na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numera- ção EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, podem ser apropri- adamente usadas. Tais regiões de Fc com a ligação de FcγR modifica- da podem ser produzidas modificando aminoácidos na região de Fc de IgG humana nativa. Se a atividade de ligação de FcγR de uma região de Fc é mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nati-
va, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, pode ser apropriadamente determinada usando métodos como os descritos acima.
[01656] Na presente invenção, "modificação de aminoácidos" ou "modificação de aminoácido" de uma região de Fc inclui a modificação em uma sequência de aminoácidos que é diferente daquela da região de Fc inicial. A região de Fc inicial pode ser qualquer região de Fc, en- quanto uma variante modificada da região de Fc inicial pode ligar-se ao receptor de Fcγ humano em uma faixa de pH neutra. Além disso, uma região de Fc modificada de uma região de Fc inicial que já tinha sido modificada também pode ser usada preferencialmente como uma região de Fc da presente invenção. A "região de Fc inicial" pode referir- se ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo a região de Fc inicial ou sequência de aminoácidos que codifica a região de Fc inicial. As regiões de Fc iniciais podem compreender uma região de Fc conhecida produzida via recombinação descrita resumidamente na se- ção "Anticorpos". A origem de regiões de Fc iniciais não é limitada, e pode ser obtida do ser humano ou qualquer organismo não humano. Tais organismos preferencialmente incluem camundongos, ratos, por- quinhos da Índia, hamsteres, gerbos, gatos, coelhos, cães, cabras, o- velhas, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados a partir de primatas não humanos. Em outra modalidade, regiões de Fc iniciais também podem ser obtidas de macacos cinomolgus, saguis, macacos rhesus, chimpanzés ou seres humanos. As regiões de Fc iniciais po- dem ser obtidas preferencialmente de IgG1 humana; entretanto, não são limitadas a nenhuma classe particular de IgG. Isto significa que uma região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas pode ser u- sada apropriadamente como uma região de Fc inicial, e neste pedido também significa que uma região de Fc de uma classe de IgG arbitra- da ou subclasse derivada de qualquer organismo descrito acima pode ser preferencialmente usada como uma região de Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos em documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicação Internacional WO No. 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); entretanto, não são limitados aos exemplos.
[01657] Exemplos de alterações incluem aqueles com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações pela substituição de resíduos de aminoácido diferentes por aminoácidos de regiões de Fc iniciais, pela inserção de um ou mais resíduos de aminoácido nas regiões de Fc iniciais, ou pela deleção de um ou mais aminoácidos na região de Fc inicial. Preferencialmente, as sequências de aminoácidos de regiões de Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos de uma região de Fc não nativa. Tais variantes necessa- riamente têm identidade ou similaridade de sequência de menos de 100% à sua região de Fc inicial. Em uma modalidade preferencial, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de aminoácidos de aproximadamente 75% a menos de 100%, mais preferencialmente de aproximadamente 80% a menos de 100%, até mais preferencial- mente de aproximadamente 85% a menos de 100%, ainda mais prefe- rencialmente de aproximadamente 90% a menos de 100%, e ainda mais preferencialmente de aproximadamente 95% a menos de 100% à sequência de aminoácidos da sua região de Fc inicial. Em uma moda- lidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região de Fc de ligação de FcγR modificada da presente invenção e sua região de Fc inicial. As diferenças de aminoá- cido entre uma região de Fc de ligação de FcγR modificada da presen- te invenção e sua região de Fc inicial também pode ser apropriada- mente especificada baseada nas diferenças de aminoácido nas posi-
ções de aminoácido particulares descritas acima especificadas pelo sistema de numeração EU.
[01658] A região de Fc com a ligação de FcγR modificada, que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa no qual a cadeia de açúcar li- gada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar con- tendo fucose, contida nas moléculas de ligação ao antígeno da pre- sente invenção pode ser obtida por qualquer método. Especificamente, a região de Fc com a ligação de FcγR modificada pode ser obtida mo- dificando aminoácidos em uma imunoglobulina tipo IgG humana e é usada como a região de Fc inicial. As regiões de Fc preferenciais de imunoglobulinas tipo IgG para modificação incluem, por exemplo, as regiões de Fc de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e variantes destas).
[01659] Os aminoácidos de qualquer posição podem ser modifica- dos em outros aminoácidos, enquanto a atividade de ligação em dire- ção ao receptor de Fcγ é mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Quando a molécula de ligação ao antígeno contém uma região de Fc de IgG1 humana como a região de Fc humano, preferencialmente contém uma modificação que produz o efeito de uma atividade de ligação do recep- tor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Tais modificações de aminoácido foram relatadas, por exemplo, nas publicações internacio- nais como WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 e WO2006/023403.
[01660] Exemplos de tais aminoácidos que podem ser modificados incluem pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU). A modificação destes aminoáci- dos pode produzir regiões de Fc (regiões de Fc com a ligação de FcγR modificada) tendo uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que a atividade de ligação do receptor de Fcγ de uma região de Fc de IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada na posi- ção 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01661] Exemplos de modificações particularmente preferenciais para uso na presente invenção incluem pelo menos uma ou mais mo- dificações de aminoácidos na região de Fc selecionada a partir do grupo de:
[01662] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[01663] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[01664] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[01665] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[01666] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[01667] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[01668] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[01669] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[01670] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[01671] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[01672] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[01673] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[01674] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[01675] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[01676] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[01677] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[01678] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[01679] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[01680] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[01681] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[01682] His para o aminoácido da posição 244;
[01683] Ala para o aminoácido da posição 245;
[01684] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[01685] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[01686] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[01687] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[01688] Phe para o aminoácido da posição 251;
[01689] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[01690] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[01691] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[01692] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[01693] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[01694] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[01695] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[01696] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[01697] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[01698] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[01699] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[01700] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[01701] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[01702] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[01703] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[01704] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[01705] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[01706] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[01707] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[01708] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[01709] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[01710] Ala para o aminoácido da posição 279;
[01711] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[01712] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[01713] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 282;
[01714] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[01715] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284;
[01716] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[01717] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[01718] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[01719] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[01720] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[01721] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[01722] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[01723] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[01724] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[01725] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[01726] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg,
Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[01727] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[01728] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[01729] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[01730] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[01731] Ile para o aminoácido da posição 302;
[01732] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[01733] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[01734] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[01735] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311;
[01736] Phe para o aminoácido da posição 313;
[01737] Leu para o aminoácido da posição 315;
[01738] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[01739] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[01740] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[01741] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[01742] Ile para o aminoácido da posição 323;
[01743] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[01744] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[01745] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val,
Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[01746] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[01747] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[01748] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[01749] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[01750] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[01751] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[01752] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[01753] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[01754] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[01755] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[01756] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[01757] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[01758] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[01759] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[01760] Asp para o aminoácido da posição 378;
[01761] Asn para o aminoácido da posição 379;
[01762] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[01763] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[01764] Glu para o aminoácido da posição 385;
[01765] Thr para o aminoácido da posição 392;
[01766] Leu para o aminoácido da posição 396;
[01767] Lys para o aminoácido da posição 421;
[01768] Asn para o aminoácido da posição 427;
[01769] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[01770] Met para o aminoácido da posição 429;
[01771] Trp para o aminoácido da posição 434;
[01772] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[01773] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[01774] como indicado pela numeração EU. Entretanto, o número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado, e um aminoácido em somente um sítio pode ser modificado ou os ami- noácidos em dois ou mais sítios podem ser modificados. Exemplos de combinações das modificações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem os descritos na Tabela 6 (Tabelas 6-1 a 6-3).
[01775] Entre as regiões de Fc adequadas para o uso na presente invenção, um exemplo adequado de uma região de Fc que tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ (isto é, tendo uma atividade de ligação seletiva em direção a um receptor inibitório de Fcγ), que é usado como uma modalidade não limitante de uma re- gião de Fc com a propriedade de ter uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor de Fcγ específico do que em direção a outros receptores de Fcγ (isto é, uma região de Fc que tem uma ativi- dade de ligação do receptor de Fcγ seletiva), é uma região de Fc com uma ou mais das seguintes modificações nos aminoácidos (indicado pela numeração EU) da região de Fc acima mencionada: o aminoácido na posição 238 é modificado para Asp e o aminoácido na posição 328 é modificado para Glu. As regiões de Fc e as modificações descritas em US2009/0136485 podem ser selecionadas apropriadamente como a região de Fc tendo uma atividade de ligação seletiva a um receptor inibitório de Fcγ.
[01776] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo adequado é uma região de Fc na qual um ou mais dos aminoácidos indicados pela numeração EU nas posições 238 e 328 de acordo com a numeração EU são respectivamente modificados para Asp ou Glu na região de Fc mencionada acima.
[01777] Além disso, em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos adequados das regiões de Fc são aqueles com a substituição de Asp por Pro na posição 238 (numeração EU), e uma ou mais modificações selecionadas entre Trp para o aminoácido da posi- ção 237, Phe para o aminoácido da posição 237, Val para o aminoáci- do da posição 267, Gln para o aminoácido da posição 267, Asn para o aminoácido da posição 268, Gly para o aminoácido da posição 271, Leu para o aminoácido da posição 326, Gln para o aminoácido da po- sição 326, Glu para o aminoácido da posição 326, Met para o aminoá- cido da posição 326, Asp para o aminoácido da posição 239, Ala para o aminoácido da posição 267, Trp para o aminoácido da posição 234, Tyr para o aminoácido da posição 234, Ala para o aminoácido da posi- ção 237, Asp para o aminoácido da posição 237, Glu para o aminoáci- do da posição 237, Leu para o aminoácido da posição 237, Met para o aminoácido da posição 237, Tyr para o aminoácido da posição 237, Lys para o aminoácido da posição 330, Arg para o aminoácido da po- sição 330, Asp para o aminoácido da posição 233, Asp para o aminoá- cido da posição 268, Glu para o aminoácido da posição 268, Asp para o aminoácido da posição 326, Ser para o aminoácido da posição 326, Thr para o aminoácido da posição 326, Ile para o aminoácido da posi- ção 323, Leu para o aminoácido da posição 323, Met para o aminoáci- do da posição 323, Asp para o aminoácido da posição 296, Ala para o aminoácido da posição 326, Asn para o aminoácido da posição 326, e
Met para o aminoácido da posição 330, de acordo com a numeração EU.
[01778] Métodos conhecidos como mutagênese sítio-dirigida (Kun- kel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de regiões de Fc. Além disso, vários métodos conhecidos também podem ser usados como um método de modificação de aminoácidos para substituir aminoácidos por aqueles além de aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução sem células (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNAs em que o tRNA supressor âmbar, que é complementar ao códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoácido não natural, pode ser apropriadamente usado.
[01779] Como descrito acima, as moléculas de ligação ao antígeno isoladas da solução de cultura de células hospedeiras que contêm ge- nes operacionalmente ligados que codificam as moléculas de ligação ao antígeno são colocadas em contato com antígenos no método de rastreamento da presente invenção. Em uma modalidade não limitante da etapa de contato, as condições descritas, por exemplo, na seção mencionada acima no antígeno, antígenos de ligação podem ser apro- priadamente empregados.
[01780] A seguir, se os complexos imunes contendo a molécula de ligação ao antígeno teste e o antígeno teste são formados e são avali- ados. Exemplos de métodos para avaliar a formação de complexos imunes que contêm as moléculas de ligação ao antígeno e antígenos incluem métodos que utilizam a propriedade que os complexos imunes se tornam moléculas maiores do que a molécula de ligação ao antíge- no somente ou a molécula de antígeno somente, como cromatografia por exclusão de tamanho (filtração em gel), método de análise em ul- tracentrífuga, método de dispersão de luz, microscopia eletrônica e espectrometria de massa (Molecular Immunology (2002), 39, 77-84; Molecular Immunology (2009), 47, 357-364). Por exemplo, quando a cromatografia por exclusão de tamanho (filtração em gel) é usada co- mo mostrado na Fig. 9, se os complexos imunes são formados são avaliados baseados em se as maiores espécies moleculares são ob- servadas quando comparadas com quando a molécula de antígeno somente ou a molécula de ligação ao antígeno somente são analisa- das.
[01781] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno ou o antígeno têm uma região constante de imunoglobulina, exemplos tam- bém incluem ELISA e FACS que usam a propriedade do complexo i- mune de ligar-se mais fortemente a um receptor de Fc ou um compo- nente de complemento do que a molécula de ligação ao antígeno so- zinha ou antígeno sozinho (The Journal of Biological Chemistry(2001) 276 (9), 6591-6604; Journal of Immunological Methods (1982) 50, 109- 114). Por exemplo, quando ELISA é realizado imobilizando um recep- tor de Fc, a formação de um complexo imune é avaliada observando se o sinal detectado é aumentado em comparação com quando um antígeno somente ou uma molécula de ligação ao antígeno somente são avaliados. Métodos para produzir uma molécula de ligação ao antígeno contendo uma região de Fc e um domínio de ligação ao antígeno mostrando ati- vidade de ligação ao antígeno dependente de concentração iônica
[01782] A presente invenção fornece um método para produzir mo- léculas de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminar antíge- nos do plasma, o método compreendendo:
[01783] colocar em contato um antígeno com uma molécula de liga- ção ao antígeno compreendendo uma região de Fc e dois ou mais domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domí- nios de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno que varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[01784] avaliação de formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno;
[01785] cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carreia um gene que codifica um domínio de ligação ao antígeno que é confirmado para formar um complexo imune em (b) acima; e
[01786] isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma so- lução de cultura obtida em (c) acima.
[01787] A presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminar antíge- nos do plasma, o método compreendendo:
[01788] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[01789] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[01790] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[01791] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima;
[01792] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima;
[01793] colocar em contato com a molécula de ligação ao antígeno obtida em (e) acima com um antígeno;
[01794] avaliação de formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno;
[01795] cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carreia um gene que codifica um domínio de ligação ao antígeno que é confirmado para formar um complexo imune em (g) acima; e
[01796] isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma so- lução de cultura obtida em (h) acima.
[01797] A presente invenção ainda fornece um método para produ- zir uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminar antígenos do plasma, o método compreendendo:
[01798] obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica;
[01799] obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima;
[01800] ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc;
[01801] cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima; e
[01802] isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima; e
[01803] em que o método compreende ainda colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno obtida pelo método de produção com um antígeno e avaliar a formação de um complexo imune compreen- dendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno.
[01804] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolar um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação ao antígeno cujas modificações de atividade de ligação dependendo da condição selecionada como descrito acima, o polinucleotídeo é inseri- do em um vetor de expressão apropriado. Por exemplo, quando o do- mínio de ligação ao antígeno é uma região variável de anticorpo, uma vez que um cDNA que codifica a região variável é obtido, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restri- ção inseridos nas duas extremidades do cDNA. Preferencialmente, as enzimas de restrição reconhecem e digerem uma sequência nucleotí- dica que aparece em uma baixa frequência na sequência nucleotídica que compõe o gene da molécula de ligação ao antígeno. Além disso, as enzimas de restrição que fornecem extremidades coesivas são pre- ferencialmente inseridas para inserir uma cópia única de um fragmento digerido no vetor na orientação correta. O cDNA que codifica uma re- gião variável de uma molécula de ligação ao antígeno digerida como descrito acima é inserido em um vetor de expressão apropriado para obter um vetor de expressão da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Neste tempo, um gene que codifica uma região constante de anticorpo (região C) pode ser fundida em estrutura com o gene que codifica a região variável.
[01805] Para produzir uma molécula de ligação ao antígeno de inte- resse, um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antí- geno é inserido de uma maneira operacionalmente ligada a uma se- quência reguladora em um vetor de expressão. As sequências regula- doras incluem, por exemplo, potencializadores e promotores. Além disso, uma sequência sinal apropriada pode ser ligada ao terminal N para que a molécula expressa de ligação ao antígeno seja secretada ao exterior das células. Como sequência sinal, por exemplo, um peptí- deo que tem a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 5) é usado; entretanto, também é possível ligar outras sequências sinal apropriadas. O polipeptídeo expresso é clivado no terminal carboxila da sequência descrita acima, e o polipeptídeo cliva- do é secretado como um polipeptídeo maduro para o exterior das célu- las. Então, células hospedeiras apropriadas são transformadas com este vetor de expressão para que as células recombinantes que ex- pressam o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antí- geno de interesse possam ser obtidas. As moléculas de ligação ao an- tígeno da presente invenção podem ser produzidas das células re-
combinantes pelo seguinte os métodos descritos acima na seção em anticorpos.
[01806] Para um ácido nucleico, "operacionalmente ligado" significa que o ácido nucleico tem uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um DNA que codifica uma pré- sequência ou um líder secretório é operacionalmente ligado a DNA que codifica um certo polipeptídeo se ele deve ser expresso como uma proteína precursora envolvida na secreção do polipeptídeo. Um pro- motor ou potencializador são operacionalmente ligados a uma se- quência de codificação se afetar a transcrição da sequência de codifi- cação. Um sítio de ligação de ribossomo é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver em uma posição que facilite a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que as se- quências de DNA ligadas são contíguas, e em caso de um líder secre- tório, significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas e em uma fase de leitura. Entretanto, os potencializadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada pela ligação em sítios de restrição a- dequados. Se tais sítios não existirem, os adaptadores de oligonucleo- tídeos sintéticos ou os ligantes são usados conforme a prática conven- cional. Além disso, os ácidos nucleicos ligados podem ser produzidos pela técnica de PCR de extensão de sobreposição supracitada.
[01807] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolar um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condição selecionada, uma variante do polinucleotídeo é inserida em um vetor de expressão apropriado. Tais variantes preferencialmen- te incluem as preparadas via humanização baseada na sequência de polinucleotídeos que codifica uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção obtida pelo rastreamento como uma biblioteca da região variável aleatória, uma biblioteca sintética ou uma biblioteca i-
mune construída se originando de animais não humanos. Os mesmos métodos que os descritos acima para produzir anticorpos humaniza- dos descritos acima podem ser usados como um método para produzir variantes de molécula de ligação ao antígeno humanizadas.
[01808] Em outra modalidade, tais variantes preferencialmente in- cluem as obtidas introduzindo uma alteração que aumenta a afinidade de antígeno (maturação por afinidade) de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção em uma sequência de polinucleotídeos isolada da molécula obtida rastreando usando uma biblioteca sintética ou uma biblioteca naive como uma biblioteca de região variável aleató- ria. Tais variantes podem ser obtidas por vários procedimentos conhe- cidos para a maturação por afinidade, incluindo a mutagênese de CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), mistura de cadeia (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), uso de cepas mu- tantes de E. coli (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368)), mistu- ra de DNA (Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), exibição de fago (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)), e PCR sexual (Clameri et al. (Nature (1998) 391, 288-291)).
[01809] Como descrito acima, as moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção da presente invenção incluem moléculas de ligação ao antígeno que têm uma região de Fc. Várias variantes podem ser usadas como regiões de Fc. Em uma mo- dalidade, as variantes da presente invenção preferencialmente incluem polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno que têm uma cadeia pesada na qual um polinucleotídeo que codifica uma variante de região de Fc como descrito acima é ligado em estrutura a um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condição selecionada.
[01810] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, as regiões de Fc preferencialmente incluem, por exemplo, regiões cons- tantes de Fc de anticorpos como IgG1 da SEQ ID NO: 13 (Ala é adi- cionado ao terminal N de AAC82527.1), IgG2 da SEQ ID NO: 14 (Ala é adicionado ao terminal N de AAB59393.1), IgG3 da SEQ ID NO: 15 (CAA27268.1) e IgG4 da SEQ ID NO: 16 (Ala é adicionado ao terminal N de AAB59394.1). A retenção plasmática de moléculas de IgG é rela- tivamente longa (a eliminação do plasma é lenta) uma vez que FcRn, particularmente FcRn humano, funciona como um receptor de salva- mento de moléculas de IgG. As moléculas de IgG incorporadas em endossomas por PEGcitose ligam-se sob condição acídica endosso- mal a FcRn, particularmente FcRn humano, expresso em endosso- mas. As moléculas de IgG que não podem ligar-se a FcRn, particular- mente FcRn humano, são transferidas para lisossomas e degradadas lá. Entretanto, as moléculas de IgG ligadas a FcRn, particularmente FcRn humano, são transferidas para a superfície celular, e em seguida voltam ao plasma em consequência da dissociação de FcRn, particu- larmente FcRn humano, sob condição neutra no plasma.
[01811] Uma vez que os anticorpos compreendendo uma região de Fc típica não têm uma atividade de ligação a FcRn, particularmente a FcRn humano, sob condição de faixa de pH neutra plasmática, os an- ticorpos típicos e os complexos anticorpo-antígeno são incorporados em células por endocitose não específica e transferidos para a super- fície celular ligando-se a FcRn, particularmente FcRn humano, na con- dição de faixa de pH acídica endossomal. FcRn, particularmente FcRn humano, carreia moléculas de ligação ao antígeno do endossoma para a superfície celular. Dessa forma, pensa-se que alguns FcRn, particu- larmente FcRn humano, também estão presentes na superfície celular. Entretanto, os anticorpos são reciclados para o plasma, uma vez que se dissociaram de FcRn, particularmente FcRn humano, na condição de faixa de pH neutra na superfície celular.
[01812] As regiões de Fc tendo atividade de ligação de FcRn hu- mano na faixa de pH neutra, que podem estar incluídas nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, podem ser obtidas por qualquer método. Especificamente, as regiões de Fc tendo atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra podem ser obtidas alterando aminoácidos da imunoglobulina tipo IgG humana como uma região de Fc inicial. As regiões de Fc preferenciais da imunoglobulina tipo IgG humana para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 e variantes destas). Os ami- noácidos em qualquer posição podem ser alterados por outros amino- ácidos embora as regiões resultantes tenham atividade de ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra ou atividade de ligação aumenta- da de FcRn humano na faixa neutra. Quando uma molécula de ligação ao antígeno compreende a região de Fc de IgG1 humana como região de Fc humano, é preferencial que a região resultante compreenda uma alteração que resulta no efeito de aumentar a ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra quando comparada com a atividade de ligação da região de Fc inicial de IgG1 humana. Os aminoácidos que permitem tais alterações incluem, por exemplo, pelo menos um aminoácido se- lecionado do grupo das posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440, e 442 (indicado pela numeração EU). Mais especificamente, tais alterações de aminoácido incluem os listados na Tabela 5. A alteração destes aminoácidos aumenta a ligação de FcRn humano da região de Fc da imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neutra.
[01813] Entre as descritas acima, alterações apropriadas que au- mentam a ligação de FcRn humano na faixa de pH neutra são selecio- nadas para o uso na presente invenção. Aminoácidos particularmente preferenciais de tais variantes de região de Fc incluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (indicado pela numeração EU). A atividade de ligação de FcRn humano da região de Fc incluída em uma molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada na faixa de pH neutra substituindo pelo menos um aminoácido por um aminoácido diferente.
[01814] Alterações particularmente preferenciais na região de Fc incluem, por exemplo, pelo menos uma ou mais alterações de aminoá- cidos selecionadas a partir do grupo de:
[01815] Met para o aminoácido na posição 237;
[01816] Ile para o aminoácido na posição 248;
[01817] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do na posição 250;
[01818] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252;
[01819] Thr para o aminoácido na posição 254;
[01820] Glu para o aminoácido na posição 255;
[01821] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256;
[01822] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido na posição 257;
[01823] His para o aminoácido na posição 258;
[01824] Ala para o aminoácido na posição 265;
[01825] Ala ou Glu para o aminoácido na posição 286;
[01826] His para o aminoácido na posição 289;
[01827] Ala para o aminoácido na posição 297;
[01828] Ala para o aminoácido na posição 303;
[01829] Ala para o aminoácido na posição 305;
[01830] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307;
[01831] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308;
[01832] Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido na posição 309;
[01833] Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311;
[01834] Ala ou His para o aminoácido na posição 312;
[01835] Lys ou Arg para o aminoácido na posição 314;
[01836] Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315;
[01837] Ala para o aminoácido na posição 317;
[01838] Val para o aminoácido na posição 332;
[01839] Leu para o aminoácido na posição 334;
[01840] His para o aminoácido na posição 360;
[01841] Ala para o aminoácido na posição 376;
[01842] Ala para o aminoácido na posição 380;
[01843] Ala para o aminoácido na posição 382;
[01844] Ala para o aminoácido na posição 384;
[01845] Asp ou His para o aminoácido na posição 385;
[01846] Pro para o aminoácido na posição 386;
[01847] Glu para o aminoácido na posição 387;
[01848] Ala ou Ser para o aminoácido na posição 389;
[01849] Ala para o aminoácido na posição 424;
[01850] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428;
[01851] Lys para o aminoácido na posição 433;
[01852] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e
[01853] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436 no sistema de numeração EU. Entretanto, o número de aminoáci- dos alterados não é particularmente limitado; tais alterações de ami- noácido incluem a alteração de aminoácido única e a alteração de a-
minoácidos em dois ou mais sítios. As combinações de alterações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem, por exemplo, as descritas nas Tabelas 5-1 a 5-33.
[01854] Além da região de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 13), IgG2 (SEQ ID NO: 14), IgG3 (SEQ ID NO: 15), ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) huma- nas, como as regiões de Fc incluídas na presente invenção, regiões de Fc com a ligação de FcγR modificada, que têm uma atividade de liga- ção do receptor de Fcγ mais alta do que a região de Fc de IgG huma- na nativa no qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numera- ção EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, podem ser apropri- adamente usadas. Tais regiões de Fc com a ligação de FcγR modifica- da podem ser produzidas modificando aminoácidos na região de Fc de IgG humana nativa. Se a atividade de ligação de FcγR de uma região de Fc é mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nati- va, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, pode ser apropriadamente determinada usando métodos como os descritos acima.
[01855] Na presente invenção, "modificação de aminoácidos" ou "modificação de aminoácido" de uma região de Fc incluem a modifica- ção em uma sequência de aminoácidos que é diferente daquela da região de Fc inicial. A região de Fc inicial pode ser qualquer região de Fc, enquanto uma variante modificada da região de Fc inicial pode li- gar-se ao receptor de Fcγ humano em uma faixa de pH neutra. Além disso, uma região de Fc modificada de uma região de Fc inicial que já tinha sido modificada também pode ser usada preferencialmente como uma região de Fc da presente invenção. A "região de Fc inicial" pode referir-se ao próprio polipeptídeo, uma composição que compreende a região de Fc inicial ou sequência de aminoácidos que codifica a região de Fc inicial. As regiões de Fc iniciais podem compreender regiões de Fc conhecidas produzidas via recombinação descrita resumidamente na seção "Anticorpos". A origem de regiões de Fc iniciais não é limita- da, e pode ser obtida do ser humano ou qualquer organismo não hu- mano. Tais organismos preferencialmente incluem camundongos, ra- tos, porquinhos-da-íÍndia, hamsteres, gerbos, gatos, coelhos, cães, cabras, ovelhas, bovinos, cavalos, camelos e organismos seleciona- dos a partir de primatas não humanos. Em outra modalidade, regiões de Fc iniciais também podem ser obtidas de macacos cinomolgus, sa- guis, macacos rhesus, chimpanzés ou seres humanos. As regiões de Fc iniciais podem ser obtidas preferencialmente de IgG1 humana; en- tretanto, não são limitadas a nenhuma classe particular de IgG. Isto significa que uma região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas pode ser usada apropriadamente como uma região de Fc inicial, e neste pedido também significa que uma região de Fc de uma classe ou subclasse de IgG arbitrada derivada de qualquer organismo descri- to acima pode ser preferencialmente usada como uma região de Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos em documentos publicados (Curr. Opin. Bio- technol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicação Internacional WO No. 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); entretanto, não são limitados aos exemplos.
[01856] Exemplos de alterações incluem aqueles com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações pela substituição de resíduos de aminoácidos diferentes de aminoácidos de regiões de Fc iniciais, pela inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos nas regiões de Fc iniciais, ou pela deleção de um ou mais aminoácidos na região de Fc inicial. Preferencialmente, as sequências de aminoácidos de regiões de Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos de uma região de Fc não nativa. Tais variantes necessa-
riamente têm a identidade ou similaridade de sequência menos de 100% à sua região de Fc inicial. Em uma modalidade preferencial, as variantes têm a identidade ou similaridade de sequência de aminoáci- dos aproximadamente 75% a menos de 100%, mais preferencialmente aproximadamente 80% a menos de 100%, até mais preferencialmente aproximadamente 85% a menos de 100%, ainda mais preferencial- mente aproximadamente 90% a menos de 100%, e ainda mais prefe- rencialmente aproximadamente 95% a menos de 100% à sequência de aminoácidos da sua região de Fc inicial. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre umaa região de Fc modificada de ligação de FcγR da presente invenção e sua região de Fc inicial. A diferença de aminoácidos entre uma região de Fc de ligação de FcγR modificada da presente invenção e sua região de Fc inicial também pode ser preferencialmente especifi- cada baseada nas diferenças de aminoácido específicas nas posições de aminoácido descritas acima específicas de acordo com o sistema de numeração EU.
[01857] A região de Fc com a ligação de FcγR modificada, que tem uma atividade de ligação do receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa no qual a cadeia de açúcar li- gada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar con- tendo fucose, contida nas moléculas de ligação ao antígeno da pre- sente invenção pode ser obtida por qualquer método. Especificamente, a região de Fc com a ligação de FcγR modificada pode ser obtida mo- dificando aminoácidos em uma imunoglobulina tipo IgG humana e é usada como a região de Fc inicial. As regiões de Fc preferenciais de imunoglobulinas tipo IgG da modificação incluem, por exemplo, regi- ões de Fc de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e variantes des- tas).
[01858] Os aminoácidos de qualquer posição podem ser modifica-
dos em outros aminoácidos, embora a atividade de ligação em direção ao receptor de Fcγ é mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Quando a molécula de ligação ao antígeno contém uma região de Fc de IgG1 humana como a região de Fc humano, preferencialmente contém uma modificação que produz o efeito de uma atividade de ligação do recep- tor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Tais modificações de aminoácido foram relatadas, por exemplo, em publicações internacio- nais como WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 e WO2006/023403.
[01859] Exemplos de tais aminoácidos que podem ser modificados incluem pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 (numeração EU). Pela modificação destes ami- noácidos, podem-se obter regiões de Fc (regiões de Fc com a ligação de FcγR modificada) com uma atividade de ligação mais alta em dire- ção ao receptor de Fcγ do que a atividade de ligação em direção ao receptor de Fcγ da região de Fc de IgG humana nativa, na qual a ca-
deia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01860] Exemplos de modificações particularmente preferenciais para uso na presente invenção incluem pelo menos uma ou mais mo- dificações de aminoácidos na região de Fc selecionada a partir do grupo de:
[01861] Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221;
[01862] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222;
[01863] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223;
[01864] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224;
[01865] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225;
[01866] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227;
[01867] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228;
[01868] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230;
[01869] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231;
[01870] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232;
[01871] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233;
[01872] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234;
[01873] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235;
[01874] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236;
[01875] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237;
[01876] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238;
[01877] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln,
Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239;
[01878] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240;
[01879] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 241;
[01880] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243;
[01881] His para o aminoácido da posição 244;
[01882] Ala para o aminoácido da posição 245;
[01883] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 246;
[01884] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247;
[01885] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249;
[01886] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250;
[01887] Phe para o aminoácido da posição 251;
[01888] Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254;
[01889] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255;
[01890] Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256;
[01891] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258;
[01892] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260;
[01893] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262;
[01894] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263;
[01895] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264;
[01896] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265;
[01897] Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266;
[01898] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267;
[01899] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268;
[01900] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
[01901] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270;
[01902] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271;
[01903] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272;
[01904] Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273;
[01905] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274;
[01906] Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275;
[01907] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276;
[01908] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278;
[01909] Ala para o aminoácido da posição 279;
[01910] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280;
[01911] Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281;
[01912] Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 282;
[01913] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283;
[01914] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284;
[01915] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285;
[01916] Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286;
[01917] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288;
[01918] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
[01919] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291;
[01920] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292;
[01921] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293;
[01922] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294;
[01923] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, T- hr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295;
[01924] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296;
[01925] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297;
[01926] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298;
[01927] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299;
[01928] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300;
[01929] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301;
[01930] Ile para o aminoácido da posição 302;
[01931] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303;
[01932] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304;
[01933] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305;
[01934] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição
311;
[01935] Phe para o aminoácido da posição 313;
[01936] Leu para o aminoácido da posição 315;
[01937] Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317;
[01938] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318;
[01939] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320;
[01940] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322;
[01941] Ile para o aminoácido da posição 323;
[01942] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324;
[01943] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325;
[01944] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326;
[01945] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327;
[01946] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328;
[01947] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329;
[01948] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330;
[01949] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331;
[01950] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332;
[01951] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333;
[01952] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
[01953] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335;
[01954] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336;
[01955] Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337;
[01956] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339;
[01957] Ala ou Val para o aminoácido da posição 376;
[01958] Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377;
[01959] Asp para o aminoácido da posição 378;
[01960] Asn para o aminoácido da posição 379;
[01961] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380;
[01962] Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382;
[01963] Glu para o aminoácido da posição 385;
[01964] Thr para o aminoácido da posição 392;
[01965] Leu para o aminoácido da posição 396;
[01966] Lys para o aminoácido da posição 421;
[01967] Asn para o aminoácido da posição 427;
[01968] Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428;
[01969] Met para o aminoácido da posição 429;
[01970] Trp para o aminoácido da posição 434;
[01971] Ile para o aminoácido da posição 436; e
[01972] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440;
[01973] como indicado pela numeração EU. Além disso, o número de aminoácidos a serem modificados não é particularmente limitado, e o aminoácido em somente um sítio pode ser modificado ou os aminoá- cidos em dois ou mais sítios podem ser modificados. Exemplos de combinações das modificações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem os descritos na Tabela 6 (Tabelas 6-1 a 6-3).
[01974] Entre as regiões de Fc adequadas para o uso na presente invenção, um exemplo adequado de uma região de Fc que tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor inibitório de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ (isto é, tendo uma atividade de ligação seletiva em direção a um receptor inibitório de Fcγ), que é usado como uma modalidade não limitante de uma re- gião de Fc com a propriedade de ter uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor de Fcγ específico do que em direção a outros receptores de Fcγ (isto é, uma região de Fc que tem uma ativi- dade de ligação do receptor de Fcγ seletiva), é uma região de Fc com uma ou mais das seguintes modificações nos aminoácidos (indicado pela numeração EU) da região de Fc acima mencionada: o aminoácido na posição 238 é modificado para Asp e o aminoácido na posição 328 é modificado para Glu. As regiões de Fc e as modificações descritas em US2009/0136485 ou WO 2012/115241 podem ser selecionadas apropriadamente como a região de Fc tendo uma atividade de ligação seletiva para um receptor inibitório de Fcγ.
[01975] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo adequado é uma região de Fc na qual um ou mais dos aminoácidos indicados pela numeração EU nas posições 238 e 328 de acordo com a numeração EU são respectivamente modificados para Asp ou Glu na região de Fc acima mencionada.
[01976] Além disso, em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos adequados das regiões de Fc são aqueles com a substituição de Asp por Pro na posição 238 (numeração EU), e uma ou mais modificações selecionadas entre Trp para o aminoácido da posi- ção 237, Phe para o aminoácido da posição 237, Val para o aminoáci- do da posição 267, Gln para o aminoácido da posição 267, Asn para o aminoácido da posição 268, Gly para o aminoácido da posição 271,
Leu para o aminoácido da posição 326, Gln para o aminoácido da po- sição 326, Glu para o aminoácido da posição 326, Met para o aminoá- cido da posição 326, Asp para o aminoácido da posição 239, Ala para o aminoácido da posição 267, Trp para o aminoácido da posição 234, Tyr para o aminoácido da posição 234, Ala para o aminoácido da posi- ção 237, Asp para o aminoácido da posição 237, Glu para o aminoáci- do da posição 237, Leu para o aminoácido da posição 237, Met para o aminoácido da posição 237, Tyr para o aminoácido da posição 237, Lys para o aminoácido da posição 330, Arg para o aminoácido da po- sição 330, Asp para o aminoácido da posição 233, Asp para o aminoá- cido da posição 268, Glu para o aminoácido da posição 268, Asp para o aminoácido da posição 326, Ser para o aminoácido da posição 326, Thr para o aminoácido da posição 326, Ile para o aminoácido da posi- ção 323, Leu para o aminoácido da posição 323, Met para o aminoáci- do da posição 323, Asp para o aminoácido da posição 296, Ala para o aminoácido da posição 326, Asn para o aminoácido da posição 326, e Met para o aminoácido da posição 330, de acordo com a numeração EU.
[01977] Métodos apropriados conhecidos como mutagênese sítio- dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser aplicados para alterar os aminoácidos de regiões de Fc. Além disso, vários métodos conhe- cidos também podem ser usados como um método de alteração de aminoácido para substituir aminoácidos por aqueles além de aminoá- cidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exem- plo, também é preferencial usar um sistema de tradução sem células (Clover Direct (Protein Express)) compreendendo tRNAs no qual um aminoácido não natural é ligado a um tRNA supressor âmbar, que é complementar ao códon de parada UAG (códon âmbar).
[01978] Em uma modalidade de variantes da presente invenção, polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno que têm uma cadeia pesada onde um polinucleotídeo que codifica uma re- gião de Fc modificada por ter uma mutação de aminoácido como des- crito acima é ligado em estrutura a um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação ao antígeno descrito acima cuja atividade de liga- ção varia dependendo de uma condição selecionada.
[01979] A presente invenção fornece métodos para produzir molé- culas de ligação ao antígeno, compreendendo a coleta das moléculas de ligação ao antígeno de meios de culturas de células introduzidas com vetores nos quais um polinucleotídeo que codifica uma região de Fc é operacionalmente ligado em estrutura a um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo da condição de concentração iônica. Além disso, a presente invenção também fornece métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno, compreendendo a coleta das moléculas de ligação ao antígeno de meios de culturas de células introduzidas com vetores construídos se ligando operacionalmente a um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação ao antígeno cuja atividade de liga- ção varia dependendo da condição de concentração iônica a um poli- nucleotídeo que codifica uma região de Fc que é com antecedência operacionalmente ligada a um vetor.
[01980] Nos métodos de produção da presente invenção, pode-se adicionar modificações adequadas ao domínio após obter um "domínio de ligação ao antígeno confirmado para formar um complexo imune", enquanto a formação do complexo imune é permitida. Além disso, um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno também é fornecido, que inclui a coleta da molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura de células que contêm um vetor que carreia um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno que tem uma cadeia pesada na qual um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação ao antígeno capaz de formar um complexo i- mune e modificado dessa forma é ligado em estrutura a um polinucleo- tídeo que codifica uma variante de região de Fc na qual as mutações de aminoácidos supracitadas foram adicionadas. Composições farmacêuticas
[01981] Quando um anticorpo de neutralização convencional contra um antígeno solúvel é administrado, a retenção no plasma do antígeno é esperada ser prolongada através de ligação ao anticorpo. Em geral, os anticorpos têm uma meia-vida longa (uma semana a três semanas) enquanto a meia-vida do antígeno é geralmente curta (um dia ou me- nos). Entretanto, antígenos ligados a anticorpo têm uma meia-vida significantemente mais longa no plasma comparado com quando os antígenos estão presentes sozinhos. Por esta razão, administração do anticorpo de neutralização existente resulta em uma concentração de antígeno no plasma aumentada. Tais casos foram relatados com vários anticorpos de neutralização que se direcionam a antígenos solúveis incluindo, por exemplo, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), be- ta amiloide (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEU- MATISM (2006) 54, 2387-2392), hepcidina (AAPS, J. (2010) 4, 646- 657) e receptor sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Administração de anticorpos de neutralização existentes foi relatada aumentar a con- centração de antígeno total no plasma para cerca de 10 a 1.000 vezes (o nível de aumento varia dependendo do antígeno) a linha de base. Aqui, a concentração de antígeno total no plasma se refere a uma concentração como uma quantidade total de antígeno no plasma, isto é, a soma de concentrações de antígenos ligados a anticorpo ligado e não ligados a anticorpo. Um aumento na concentração de antígeno no plasma total é indesejável para tais agentes farmacêuticos de anticor- po que se direcionam a um antígeno solúvel. A razão é que a concen-
tração de anticorpo tem que ser mais alta do que pelo menos a con- centração de antígeno no plasma total para neutralizar o antígeno so- lúvel. Especificamente, "a concentração de antígeno no plasma total é aumentada para 10 a 1.000 vezes" significa que, a fim de neutralizar o antígeno, a concentração de anticorpo no plasma (isto é, dose de anti- corpo) tem que ser 10 a 1.000 vezes maior comparado com quando aumento na concentração de antígeno no plasma total não ocorre. Por outro lado, se a concentração de antígeno no plasma total puder ser reduzida em 10 a 1.000 vezes comparado com o anticorpo de neutrali- zação existente, a dose de anticorpo pode ser também reduzida para grau similar. Desta maneira, anticorpos capazes de diminuição da con- centração de atnigeno no plasma total através da eliminação de antí- geno solúvel do plasma são altamente úteis comparado com anticor- pos de neutralização existentes.
[01982] Sem estar restrito a uma teoria particular, o seguinte meca- nismo é um exemplo de um mecanismo que pode causar a eliminação das unidades de ligação antigênicas do plasma por uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, que contém (i) uma região de Fc e (ii) um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentra- ção iônica, e onde a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que contém duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e antígenos que têm duas ou mais unidades de ligação antigênicas. Quando a unidade de ligação antigênica é uma unidade (isto é, um homomonômero), tal como em sIL-6R, duas moléculas (isto é, duas unidades de ligação antigênicas) de antígenos ligam-se a uma molécula de anticorpo única que contém um domínio divalente que se liga ao anticorpo, e um complexo de uma molécula de anticorpo anti- sIL-6R e duas moléculas de antígeno que contêm duas unidades de ligação antigênicas é formado. Por isso, este tipo do complexo anticor-
po-antígeno tem somente uma região de Fc (região de Fc de IgG1 na- tiva) como mostrado na Fig. 1. Uma vez que este complexo liga-se a duas moléculas de FcRn ou uma molécula de FcγR via uma região de Fc única, a afinidade em direção a estes receptores é a mesma como aquela de um anticorpo IgG geral, e pensa-se que a absorção em cé- lulas ocorre não especificamente na maior parte.
[01983] Por outro lado, quando a unidade de ligação antigênica são duas unidades como em IgA humana, que é um dímero de um hetero- complexo de cadeias pesadas e cadeias leves, há duas unidades de epítopos aos quais os domínios de ligação ao antígeno se ligarão na unidade de ligação antigênica. Entretanto, quando um anticorpo anti- IgA bivalente (isto é, os domínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de anticorpo anti-IgA se ligam ao mesmo epítopo) se liga ao seu antígeno, IgA, acredita-se que a ligação de cada um dos domínios de ligação ao antígeno bivalentes contidos na molécula de anticorpo anti-IgA única a cada uma das duas unidades de epítopo presentes em uma molécula de IgA única é difícil em vista da posição dos epítopos. Como resultado, acredita-se que as moléculas de anti- corpo anti-IgA separadas se ligam a duas unidades de ligação antigê- nicas presentes nas duas moléculas de IgA que se ligam aos domínios bivalentes de ligação ao antígeno presentes em uma molécula de anti- corpo anti-IgA única, e consequentemente, os complexos anticorpo- antígeno (complexos imunes) contendo pelo menos quatro moléculas (isto é, duas moléculas de IgA que são a molécula de antígeno e duas moléculas de anticorpo anti-IgA que são moléculas de ligação ao antí- geno) são formados.
[01984] Quando uma molécula de ligação ao antígeno como um anticorpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, forma um grande complexo i- mune que é pelo menos um tetrâmero, o complexo imune pode ligar-
se fortemente com avidez através de pelo menos duas ou mais regi- ões de Fc multivalentes a FcγR, FcRn, receptores de complemento e tal. Por isso, como mostrado na Fig. 7, o complexo é absorvido eficien- temente em células que expressam estes receptores. Por outro lado, uma vez que a afinidade mediada por região de Fc em direção a estes receptores de complexos imunes formados das moléculas de antígeno e moléculas de ligação ao antígeno que, por exemplo, se ligam a mo- léculas de antígeno (monoméricas) que contêm uma unidade de liga- ção antigênica é insuficiente como mencionado acima, os complexos imunes são absorvidos não especificamente na maior parte (menos eficientemente quando comparados com a absorção mediada pela a- videz de ligação) em células que expressam estes receptores, como mostrado na Fig. 1. Dessa forma, a absorção é mais ineficiente do que a absorção mediada pela avidez de ligação.
[01985] Quando a molécula de ligação ao antígeno como um anti- corpo que se liga a uma molécula de antígeno que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas é um anticorpo que contém do- mínios de ligação ao antígeno dos quais a ligação do antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica tal como ligação dependente de pH ou de Ca e que forma um complexo anticorpo- antígeno (complexo imune) contendo pelo menos quatro moléculas (duas moléculas de antígeno e duas moléculas de anticorpo) no plas- ma, uma vez que o complexo imune é absorvido nas células, os antí- genos dissociam-se dos anticorpos nos endossomas onde as condi- ções de concentração iônica são diferentes daquelas no plasma. Por isso, a formação de complexo imune é dissolvida nos endossomas de células que absorveram os complexos imunes. Uma vez que os antí- genos dissociados não podem ligar-se a FcRn nos endossomas, são degradados após se deslocarem para os lisossomas. Por outro lado, pensa-se que os anticorpos dissociados do antígeno são reciclados para o plasma após ligação a FcRn nos endossomas (Fig. 7).
[01986] Como descrito acima, se um anticorpo que contém uma re- gião constante tipo IgG1 nativa contra um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas e mostra liga- ção dependente de pH ou de Ca puder formar um grande complexo imune e ligar-se a FcγR, FcRn, receptores de complemento, e simila- res com avidez, acredita-se que a eliminação de antígeno somente possa ser seletivamente e enormemente acelerada. Acredita-se que quando GA2-IgG1 que se liga a IgA humana é administrado, tais gran- des complexos imunes são formados. De fato, como mostrado no E- xemplo 3, GA2-IgG1-FcγR(-) formado pela introdução em modifica- ções de GA2-IgG1 que prejudicam a ligação a FcγR de camundongo não pode acelerar substancialmente a eliminação de IgA humana co- mo GA2-IgG1 quando comparada com IgA humana somente, e mos- trou um nível equivalente da eliminação como IgA humana somente. Por isso, a razão que GA2-IgG1 poderia acelerar a eliminação de IgA humana consiste em porque o complexo imune contendo GA2-IgG1 e IgA humana, que é um antígeno multimérico que contém duas ou mais unidades de ligação antigênicas, se liga com avidez a FcγR e é rapi- damente absorvido nas células que expressam FcγR. A IgA que se dissocia do complexo imune nos endossomas de células que absorve- ram o complexo imune é degradada nos lisossomas. Ao mesmo tem- po, o anticorpo dissociado de IgA, que estava ligado a FcRn nos en- dossomas, é posteriormente reciclado para o plasma e pode ligar-se novamente a IgA no plasma. Pensa-se que a eliminação de IgA huma- na no plasma é muito acelerada desta maneira. Um método usando uma variante do aminoácido da região de Fc que se liga a FcRn na faixa de pH neutra é descrito em WO2011/122011 como um método para acelerar a eliminação de antígenos do plasma. A presente inven- ção é útil como um método para acelerar a eliminação do plasma de antígenos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas sem usar as variantes supracitadas, e como mostrado em GA2-N434W, pode acelerar mais a eliminação dos antígenos multimé- ricos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas do plasma pela combinação com as variantes supracitadas. Além disso, os antígenos multiméricos que contêm duas ou mais unidades de liga- ção antigênicas podem ser eliminados, além do plasma, do fluido in- tersticial, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido pleural, e fluido peri- cárdico, enquanto as células que entram em contato com fluido inters- ticial, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido pleural ou fluido pericárdi- co expressam FcγR ou FcRn. Uma modalidade não limitante de tais células inclui células imunes e similares presentes no fluido intersticial, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido pleural e fluido pericárdico.
[01987] Especificamente, a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, moléculas de ligação a antígeno pro- duzidas através de alteração dos métodos da presente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção. As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através de métodos de produção da presente invenção são úteis como composições farmacêuticas uma vez que elas, quando administradas, têm o efeito forte de reduzir a concentração de antígeno no plasma comparado com moléculas de ligação a antígeno típicas, e exibem a resposta imune in vivo, farmacocinética e outros aperfeiçoados em a- nimais administrados com as moléculas. As composições farmacêuti- cas da presente invenção podem compreender carreadores farmaceu- ticamente aceitáveis.
[01988] Na presente invenção, as composições farmacêuticas refe- rem-se geralmente a agentes para o tratamento ou para a prevenção ou para o teste e para o diagnóstico de doenças.
[01989] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser formuladas através de métodos conhecidos pelos especialis- tas na técnica. Por exemplo, elas podem ser utilizadas de forma paren- teral, na forma de injeções de soluções ou suspensões estéreis inclu- indo água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, tais composições podem ser formuladas através da mistura na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de medicamento geralmente aprovada através da combinação, de forma apropriada, com veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamen- te com água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emul- sificante, suspensão, tensoativo, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, veículo, conservante, aglutinante ou similar. Em tais formu- lações, a quantidade de ingrediente ativo é ajustada para a obtenção de uma quantidade apropriada em uma faixa predeterminada.
[01990] As composições estéreis para injeção podem ser formula- das utilizando veículos tal como água destilada para injeção, de acor- do com a prática de formulação padronizada.
[01991] As soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo dextrose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e clo- reto de sódio). É também possível utilizar em combinação solubilizan- tes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similares), polialcoóis (propileno glicol, polietileno glicol e similares), tensoativos não iônicos (polissorbato 80(TM), HCO-50 e similares).
[01992] Os óleos incluem óleo de gergelim e óleos de soja. O ben- zoato de benzila e/ou o álcool benzílico pode ser utilizado em combi- nação como solubilizantes. É também possível combinar tampões (por exemplo, tampão fosfato e tampão acetato de sódio), agentes suavi- zantes (por exemplo, cloridrato de procaína), estabilizantes (por exem-
plo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes. Ampolas apropriadas são cheias com as injeções preparadas.
[01993] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferencialmente administradas de forma parenteral. Por exemplo, as composições na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmi- ca são administradas. Por exemplo, elas podem ser administradas de forma sistêmica ou local através de injeção intravenosa, injeção intra- muscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar.
[01994] Os métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados considerando a idade e os sintomas do paciente. Uma dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de li- gação ao antígeno pode ser, por exemplo, de 0,0001 até 1.000 mg/kg para cada administração. Alternativamente, a dose pode ser, por e- xemplo, de 0,001 até 100.000 mg por paciente. Entretanto, a presente invenção não é limitada pelos valores numéricos descritos anterior- mente. As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso, da idade, dos sintomas do paciente e similares. Os especia- listas na técnica podem determinar doses e métodos de administração apropriados considerando os fatores descritos anteriormente.
[01995] Além disso, a presente invenção provê kits para uso nos métodos da presente invenção que compreendem pelo menos uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. Em adição ao acima, carreadores farmaceuticamente aceitáveis, meios, manuais de instrução descrevendo o uso do método e similar podem ser embala- dos nos kits.
[01996] Além disso, a presente invenção refere-se a agentes produ- tos farmacêuticos para eliminação, do plasma, de complexos que con- têm duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais mo- léculas de ligação ao antígeno presentes no plasma, que contêm como um ingrediente ativo as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção ou as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção.
[01997] A presente invenção refere-se a métodos para tratamento de uma doença, que inclui a administração em indivíduos (pacientes, seres humanos, etc.) das moléculas de ligação ao antígeno da presen- te invenção ou das moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção. Um exemplo não limitan- te da doença inclui câncer e doenças inflamatórias.
[01998] A presente invenção também se refere ao uso das molécu- las de ligação ao antígeno da presente invenção ou das moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presen- te invenção na produção de um agente farmacêutico para eliminar dos complexos plasmáticos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno presen- tes no plasma.
[01999] A presente invenção refere-se ainda ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção ou das moléculas de li- gação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presen- te invenção para eliminação, do plasma, de complexos que contêm duas ou mais unidades de ligação antigênicas e duas ou mais molécu- las de ligação ao antígeno presentes no plasma.
[02000] Ainda, a presente invenção refere-se a moléculas de liga- ção a antígeno da presente invenção e moléculas de ligação a antíge- no produzidas através dos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos da presente invenção.
[02001] Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoácidos da presente invenção podem ser modificados após a tradução (por e- xemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piro- glutâmico através da piroglutamilação é bem conhecida pelos especia-
listas na técnica). Naturalmente, tais aminoácidos modificados após a tradução são incluídos nas sequências de aminoácidos na presente invenção.
[02002] Todos os documentos da técnica anterior citados neste rela- tório descritivo estão aqui incorporados neste pedido por referência.
EXEMPLOS
[02003] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos exemplos, entretanto, não deve ser interpretada como sendo limitada aos estes. Exemplo 1 Preparação de moléculas de ligação ao antígeno que se ligam à IgA humana de uma maneira dependente de cálcio Preparação de IgA humana (hIgA)
[02004] IgA humana (a seguir também abreviada como "hIgA") foi preparada como um antígeno usando as seguintes técnicas recombi- nantes. A hIgA foi expressa cultivando células hospedeiras que carrei- am vetores recombinantes inseridos com H (WT)-IgA1 (SEQ ID NO: 49) e L (WT) (SEQ ID NO: 50) e purificadas por um método conhecido por aqueles especialistas na técnica usando cromatografia de troca iónica e cromatografia de filtração em gel. Moléculas de ligação ao antígeno com ligação dependente de cálcio
[02005] H54/L28-IgG1 descrito na Publicação Internacional WO No. 2009/125825 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado. Fv4- IgG1 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado que resulta H54/L28-IgG1 de conferência com a propriedade da ligação ao recep- tor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH (isto é, de ligação sob condição neutra e dissociação sob condição acídica). O teste in vivo descrito na Publicação Internacional WO No. 2009/125825 usando camundongos demonstrou que a eliminação do receptor de IL- 6 humano solúvel é muito acelerada em um grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno quando comparado com um grupo administrado com uma mistura de H54/L28-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como an- tígeno.
[02006] O receptor de IL-6 humano solúvel ligado a um anticorpo geral que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel é reciclado ao plasma junto com o anticorpo via FcRn. Entretanto, um anticorpo que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependen- te de pH se dissocia sob condições acídicas no endossoma do recep- tor de IL-6 humano solúvel que estava ligado ao anticorpo. O receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado no lisossoma. Dessa forma, isto pode acelerar muito a eliminação de receptor de IL-6 hu- mano solúvel do plasma. Além disso, o anticorpo que se liga ao recep- tor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH é reci- clado ao plasma via FcRn depois que se dissociou do receptor de IL-6 humano solúvel, para que o anticorpo reciclado possa ligar-se a um receptor de IL-6 humano solúvel novamente. Pela repetição deste ciclo (O anticorpo que se ligou aos antígenos é absorvido nas células > os antígenos são dissociados do anticorpo > os antígenos são degrada- dos e o anticorpo é reciclado de volta ao plasma), uma molécula de anticorpo única pode ligar-se repetidamente aos receptores de IL-6 humano solúvel múltiplos vezes (Fig. 1).
[02007] Entretanto, como descrito na Publicação Internacional WO No. 2009/125825, H54/L28-IgG1 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado e Fv4-IgG1 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humani- zado que resulta de H54/L28-IgG1 de conferência com a propriedade de ligação ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira de- pendente de pH (isto é, ligação sob condição neutra e dissociação sob condição acídica). O Fv4-IgG1-v2 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado no qual a ligação de FcRn é aumentada sobre Fv4-IgG1 sob condições neutras. O teste in vivo descrito na Publicação Interna-
cional WO No. 2011/122011 usando camundongos demonstrou que a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel é muito acelerada em um grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1-v2 e receptor de IL-6 humano solúvel como antígeno quando comparado com um grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como antígeno. Dessa forma, relatou-se que, aumentando a ligação em direção a FcRn sob condição neutra (pH 7,4) de um anti- corpo que se liga a antígenos de uma maneira dependente de pH, o efeito do anticorpo modificado aumentado de ligar-se repetidamente a antígenos e o efeito de promover a eliminação de antígenos do plasma pode ser melhorado mais, e os antígenos podem ser eliminados do plasma pela administração do anticorpo da Fig. 2.
[02008] Nas ações dos anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de pH mostrada nas Figs. 1 e 2, a propriedade dos anticorpos de ligar-se fortemente a antígenos no plasma e disso- ciar-se dos antígenos nos endossomas baseados na diferença ambi- ental entre o plasma e endossomas, isto é, diferença de pH (pH 7,4 no plasma; pH 6,0 nos endossomas), é usada. As propriedades de fatores ambientais no plasma e endossomas bem como o grau da sua dife- rença são importantes para uso de tais diferenças da capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo que se liga de uma maneira depen- dente de pH no plasma e endossomas. Uma diferença de pH corres- ponde a uma diferença na concentração de prótons. Especificamente, a concentração de prótons no plasma (pH 7,4) é aproximadamente 40 nM, enquanto a concentração de prótons no endossoma (pH 6,0) é aproximadamente 1.000 nM; dessa forma, a concentração de prótons que é considerada como um fator ambiental no plasma e endossoma diferencia-se até 25 vezes.
[02009] Além disso, os presentes inventores compreenderam que, a fim de alcançar as ações ilustradas nas Figuras 1 e 2 por modalidades diferentes ou alcançar estas modalidades em combinação, seria bené- fico usar um anticorpo que se liga a antígenos dependendo de um fa- tor ambiental com uma grande diferença no plasma e endossoma, a- lém da diferença na concentração de prótons. Dessa forma, os inven- tores procuraram um fator ambiental cuja concentração é considera- velmente diferente entre o plasma e o endossoma e como resultado, encontraram cálcio. A concentração de cálcio ionizada é aproximada- mente 1,1 mM a 1,3 mM no plasma e aproximadamente 3 M no en- dossoma; dessa forma, a diferença na concentração do íon de cálcio, que é considerado como um fator ambiental no plasma e endossoma, é aproximadamente 400 vezes e foi encontrada ser maior do que a diferença na concentração de prótons (25 vezes). Dessa forma, consi- derou-se que, usando um anticorpo que se liga a um antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio (1,1 mM a 1,3 mM) e se dissocia do antígeno sob uma condição de baixa concentração de cál- cio (3 M), o anticorpo pode dissociar-se do antígeno no endossoma em um equivalente ou de nível mais alto comparando com um anticor- po que se liga ao antígeno de uma maneira dependente de pH. Expressão e purificação de anticorpos que se ligam a hIgA
[02010] GA1-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 37; cadeia leve SEQ ID NO: 38) e GA2-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: da cadeia leve 40) são anticorpos que se ligam a hIgA. As se- quências de DNA que codificam GA1-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 37; cadeia leve SEQ ID NO: 38) e GA2-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: da cadeia leve 40) foram inseridas em plasmí- deos de expressão de célula animais por um método conhecido pelos especialistas na técnica. Os anticorpos foram expressos pelo método descrito abaixo. As células da linhagem derivada da célula renal fetal humana FreeStyle 293-F (Invitrogen) foram suspensas em Meio de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen). A suspensão celular foi semea-
da em uma placa de 6 poços (3 mL/poço) em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml. Então, os plasmídeos construídos foram in- troduzidos nas células por um método de lipofecção. As células foram cultivadas durante quatro dias em uma incubadora CO2 (37°C, CO 2 8%, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados dos sobrenadantes de cultura isolados por um método conhecido pelos especialistas na téc- nica usando rProtein Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). A absorvância (comprimento de onda: 280nm) do anticorpo purificado das soluções foi medida usando um espectrofotômetro. As concentra- ções de anticorpo foram determinadas dos valores medidos usando o coeficiente de absorção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). Avaliação de anticorpos obtidos para atividade de ligação de hIgA de- pendente de cálcio
[02011] Os anticorpos isolados como descrito em 1-3 foram avalia- dos para sua atividade de ligação de hIgA (constante de dissociação KD (M)) usando Biacore T200 (GE Healthcare). Tampões de corrida usados na medida foram:
[02012] tween20 0,05%/20 mmol/L ACES/150 mmol/L NaCl (pH 7,4 ou 5,8) contendo CaCl2 3 M ou 1,2 mM; e
[02013] tween20 0,05%/20 mmol/L ACES/150 mmol/L NaCl (pH 8,0) contendo CaCl2 0,1 M ou 10 mM.
[02014] O anticorpo foi deixado se ligar ao chip Sensor CM5 (GE Healthcare) imobilizado com uma quantidade adequada de Proteína A/G recombinante (Thermo Scientific) pelo método de amino acopla- mento. Então, uma concentração apropriada de hIgA (descrita em 1-1) foi injetada como um analito para permitir a interação com o anticorpo no chip sensor. A medida foi realizada a 37°C. Após medida, glicina- HCl 10 mmol/L (pH 1,5) foi injetada para regenerar o chip sensor. A constante de dissociação KD (M) foi calculada do resultado da medida por análise do ajuste de curva e análise de parâmetro de equilíbrio u- sando o Programa de Avaliação de Biacore T200 (GE Healthcare). O resultado e os sensorgramas obtidos são mostrados na Tabela 7 e Fig. 3, respectivamente. Foi revelado que GA2-IgG1 se ligou fortemente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM ao passo que o anti- corpo se ligou fracamente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 3 M. Além disso, em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM, mostrou-se que GA2-IgG1 se ligava a IgA humana fortemente em pH 7,4 mas fra- camente em pH 5,8. Mais especificamente, GA2-IgG1 foi revelado por ligar-se a IgA humana de uma maneira dependente de pH e cálcio. Tabela 7 Nome do Condições Ajuste ka kd KD[M] anticorpo GA1-IgG1 pH 8,0 Ca 10 mM Modelo de ligação 1:1 1,2E+06 1,2E-01 1,0E-07 pH 8,0 Ca 0,1 µM Modelo de ligação 1:1 1,1E+06 2,4E-01 2,2E-07 pH 7,4 Ca 1,2 mM Modelo de ligação 1:1 5,7E+05 8,4E-01 1,5E-07 pH 7,4 Ca 3 µM Modelo de ligação 1:1 6,4E+05 1,2E-01 1,9E-07 pH 5,8 Ca 1,2 mM Modelo de ligação 1:1 6,8E+05 9,9E-02 1,4E-07 pH 5,8 Ca 3 µM Modelo de ligação 1:1 7,1E+05 1,1E-01 1,5E-07 GA2-IgG1 pH 7,4 Ca 1,2 mM Modelo de ligação 1:1 4,0E+05 1,6E-02 3,9E-08 pH 7,4 Ca 3 µM Afinidade em estado permanente - 6,7E-06 pH 5,8 Ca 1,2 mM Afinidade em estado permanente - 4,0E-06 pH 5,8 Ca 13 µM Afinidade em estado permanente - 5,0E-06 [Exemplo 2] Preparação de anticorpos modificados que se ligam a hI- gA de uma maneira dependente de cálcio
[02015] A seguir, para aumentar mais a eliminação de antígeno (hI- gA) do plasma, GA2-N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: da cadeia leve 40) foi construído introduzindo a substituição de aminoácido N434W em GA2-IgG1, que se liga a hIgA de uma maneira dependente de cálcio, para potencializar a ligação ao FcRn de camun- dongo em pH 7,4. Além disso, GA2-FcγR(-) (cadeia pesada SEQ ID NO: 42; cadeia leve SEQ ID NO: 40) foi construído introduzindo as substituições de aminoácido L235R e S239K em GA2-IgG1 para elimi-
nar a afinidade de ligação de FcγR. Os anticorpos modificados foram expressos pelo método descrito acima usando plasmídeos de expres- são animal inseridos com sequências de DNA que codificam GA2- N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 41; cadeia leve SEQ ID NO: 40) e GA2-FcγR(-) (cadeia pesada SEQ ID NO: 42; cadeia leve SEQ ID NO: 40) por um método conhecido pelos especialistas na técnica. As con- centrações de anticorpo foram determinadas após purificação. GA2- FcγR (-) foi avaliado para sua ligação a vários FcγR de camundongo (mFcγRI, mFcγRII, mFcγRIII, e mFcγRIV). O resultado mostrou que GA2-FcγR (-) não se ligou a nenhum dos receptores. Exemplo 3 Avaliação do efeito de anticorpos de ligação à hIgA depen- dente de Ca em retenção plasmática de um antígeno usando camun- dongos normais 3-1. Teste in vivo usando camundongos normais
[02016] Cinética in vivo de hIgA e anticorpo anti-hIgA foi avaliada após administração de hIgA (IgA humana; preparada como descrito no Exemplo 1) sozinho ou em combinação com um anticorpo anti-hIgA para camundongos normais (camundongos C57BL/6J; Charles River Japan). Uma solução de hIgA (80 g/mL) ou uma mistura de hIgA e anticorpo anti-hIgA foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg via veia caudal. Os anticorpos anti-hIgA usados eram GA1- IgG1, GA2-IgG1, GA2-N434W e GA2-FcγR(-) descritos acima.
[02017] Em cada mistura, a concentração de hIgA era 80 g/mL. Entretanto, a concentração de anticorpo anti-hIgA variou dependendo da afinidade de anticorpo para hIgA. GA1-IgG1 foi preparado em 10 mg/mL; GA2-IgG1 em 2.69 mg/mL; GA2-N434W em 1 mg/mL; e GA2- FcγR (-) em 2,69 mg/mL. Sob as condições descritas acima, a maior parte de hIgA é predita se ligar ao anticorpo uma vez que o anticorpo anti-hIgA está presente suficientemente em excesso sobre hIgA. O sangue foi coletado dos camundongos cinco minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias, e sete dias após administração. O sangue co- letado foi imediatamente centrifugado em 12.000 rpm e 4°C por 15 mi- nutos para obter o plasma. O plasma separado foi armazenado em um refrigerador a -20°C ou abaixo até a medida. 3-2. Determinação de concentração de anticorpo anti-hIgA plasmática em camundongos normais por ELISA
[02018] As concentrações de anticorpo anti-hIgA no plasma de ca- mundongo foram determinadas por ELISA. Em primeiro lugar, as pla- cas imobilizadas de Anti-IgG humana foram preparadas por aliquota- ção de Fragmento F(ab’)2 do Anticorpo anti-IgG humana (cadeia γ es- pecífico) (SIGMA) a cada um dos poços da Placa Nunc-Immuno, Ma- xiSorp (Nalge nunc International) e deixando as placas repousarem a 4°C durante a noite. As amostras de curva padrão de anticorpo anti- hIgA preparadas como soluções padrão em concentrações plasmáti- cas de 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563, e 0,07813 g/mL e amostras de ensaio preparadas diluindo amostras de plasma de ca- mundongo de 100 vezes ou mais foram aliquotadas nas placas imobi- lizadas de anti-IgG humana, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma hora. A seguir, Conjugado de anti-Ig G humana de ca- bra (cadeia γ específico) Biotina (BIOT) (Southern Biotechnology As- sociates Inc.) foi aliquotado em cada um dos poços das placas, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma ho ra. Então, Es- treptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi adicionada a cada um dos poços das placas, após o qual as placas foram incubadas a 25°C por uma hora. A reação cromo gênica usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) foi extinta com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemi- cal), e em seguida a mistura de reação em cada um dos poços foi me- dida usando um leitor de microplaca para medir a absorvância em 450 nm. A concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma de camundongo foi calculada da absorvância da curva padrão usando o programa de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). O curso de tempo de concentrações de anticorpo plasmáticas de GA1-IgG1, GA2-IgG1, GA2-N434W, e GA2-FcγR(-) em camundongos normais, que foram determinados pelo método descrito acima, é mostrado na Fig. 4. 3-3. Determinação de concentração de hIgA em plasma por ELISA
[02019] As concentrações de hIgA no plasma de camundongo fo- ram medidas por ELISA. Em primeiro lugar, as placas imobilizadas de anti-IgA humana foram preparadas pela aliquotação de Anticorpo anti- IgA humana de Cabra (BETHYL) em cada um dos poços de Placa Nunc-Immuno, MaxiSorp (Nalge nunc International) e deixando as pla- cas repousarem a 4°C durante a noite. As amostras d e curva padrão de hIgA preparadas como soluções padrão em concentrações plasmá- ticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, e 0,00625 g/mL e amostras de ensaio preparadas diluindo amostras de plasma de camundongo de 100 vezes ou mais, foram aliquotadas em 100 L/poço nas placas i- mobilizadas de anti-IgA humana, após o qual hsIL-6R 500 ng/mL foi adicionado em 200 L/poço. As placas resultantes foram deixadas re- pousar à temperatura ambiente por uma hora. A seguir, após adição de Anticorpo Anti-IL-6R humano Biotinilado (R&D) em cada um dos poços das placas, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por uma hora. Então, após aliquotação de Estreptavidina-PolyHRP80 (Ste- reospecific Detection Technologies) em cada um dos poços das pla- cas, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por uma hora. A reação cromogênica usando como um substrato TMB One Compo- nent HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) foi extinta com á- cido sulfúrico 1N (Showa Chemical), e em seguida a mistura de reação em cada um dos poços foi medida usando um leitor de microplaca pa- ra medir a absorvância em 450 nm. A concentração no plasma de ca- mundongo foi calculada da absorvância da curva padrão usando o programa de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). O curso de tempo de concentrações plasmáticas de hIgA em camundongos nor- mais após administração intravenosa, como determinado pelo método descrito acima, é mostrado na Fig. 5.
[02020] O resultado mostrou que a eliminação de hIgA foi retardada quando hIgA foi administrada em combinação com GA1-IgG1, um anti- corpo que exibe fraca ligação dependente de Ca (o grau da depen- dência é baixo), quando comparado com quando hIgA foi administrada sozinha. Ao contrário, quando hIgA foi administrada em combinação com GA2-IgG1 cuja atividade de ligação dependente de Ca é 100 ou mais vezes maior, a eliminação de hIgA foi consideravelmente acele- rada, quando comparado com quando hIgA foi administrado sozinha. A concentração de hIgA livre no plasma foi determinada da concentração plasmática de anticorpo mostrada na Fig. 4, a concentração plasmáti- ca de hIgA mostrada na Fig. 5, e o valor de KD de cada anticorpo mos- trado na Tabela 7. O resultado é mostrado na Fig. 6. Como mostrado na Fig. 6, a concentração do antígeno livre (hIgA) no grupo adminis- trado com GA2-IgG1 que se liga à hIgA de uma maneira dependente de cálcio foi mais baixa do que aquela no grupo administrado com GA1-IgG1. Isto demonstra que o antígeno sem moléculas de ligação ao antígeno (hIgA) (forma não ligada do anticorpo) pode ser reduzido acelerando a eliminação de antígeno usando anticorpos que se ligam de uma maneira dependente de cálcio. Além disso, GA2-N434W com ligação de FcRn aumentada em pH 7,4 acelerou a eliminação de antí- geno mais do que GA2-IgG1 fez, e sete horas após a administração, a concentração plasmática de hIgA foi abaixo do limite de detecção. Exemplo 4 Preparação de anticorpo anti-IgE dependente de pH 4-1. Preparação de anticorpo anti-IgE humana
[02021] Preparar anticorpos anti-IgE humana dependentes de pH, IgE humana (cadeia pesada SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: da cadeia leve 44) (a região variável é derivada de um anticorpo anti-glipicano3 humano) como um antígeno foi expressa usando FreeStyle293 (Life Technologies). IgE humana foi preparada purificando IgE humana ex- pressa usando um método cromatográfico convencional conhecido pe- los especialistas na técnica.
[02022] Um anticorpo que se liga a IgE humana de uma maneira dependente de pH e forma um grande complexo imune consistindo em duas ou mais moléculas de anticorpo anti-IgE e duas ou mais molécu- las de IgE foi selecionado a partir de diversos anticorpos obtidos. O anticorpo anti-IgE humana selecionado foi expresso usando a região constante da cadeia pesada de IgG1 humana e a região constante da cadeia leve humana, e em seguida purificado. O anticorpo produzido foi denominado clone 278 (cadeia pesada SEQ ID NO: 45; cadeia leve SEQ ID NO: 46). 4-2. Avaliação de anticorpos anti-IgE humana para sua atividade de ligação e atividade de ligação dependente de pH
[02023] Os anticorpos capazes de dissociação de antígenos dentro do endossoma podem ser criados não somente projetando-os para ligar-se a antígenos de uma maneira dependente de pH, mas também projetando-os para ligar-se a antígenos de uma maneira dependente de Ca. Dessa forma, o clone 278 e o controle Xolair (omalizumabe; Novartis) cuja atividade de ligação à IgE não depende de pH/Ca foram avaliados para sua dependência de pH e a dependência de pH/Ca da atividade de ligação de IgE humana (hIgE).
[02024] Mais especificamente, as atividades de ligação à hIgE (constante de dissociação KD (M)) do clone 278 e Xolair foram avalia- das usando Biacore T200 (GE Healthcare). Os tampões de corrida u- sados no ensaio foram:
[02025] CaCl2 1,2 mmol/l / tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 7,4;
[02026] CaCl2 1,2 mmol/l / tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 5,8; e
[02027] CaCl2 3 mol/l / tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 5,8.
[02028] O peptídeo quimicamente sintetizado tendo uma sequência derivada da proteína glipicano 3 humano (SEQ ID NO: 47) cujo Lys C- terminal é biotinilado (a seguir abreviado como "peptídeo biotinilado GPC3") foi adicionado em uma quantidade apropriada e imobilizada para o chip Sensor SA (GE Healthcare) baseado na afinidade entre biotina e estreptavidina. IgE humana foi imobilizada no chip injetando-a em uma concentração apropriada para ser capturada pelo peptídeo GPC3 biotinilado. Como um analito, o clone 278 foi injetado em uma concentração apropriada e permitido interagir com IgE humana no chip sensor. Então, glicina-HCl 10 mmol/L (pH 1,5) foi injetada para regene- rar o chip sensor. A interação sempre era medida a 37°C. O resultado da medida foi analisado pelo ajuste de curva usando o Programa de Avaliação Biacore T200 (GE Healthcare) para calcular a constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s). A constante de dissociação KD (M) foi calculada das constantes descritas acima. Além disso, as proporções de KD em cada anticorpo sob as condições de [pH 5,8, Ca 1,2 mM] a [pH 7,4, Ca 1,2 mM] foi calculado para avaliar a ligação dependente de pH, enquanto as pro- porções KD em cada anticorpo sob as condições de [pH 5,8, Ca 3 M] a [pH 7,4, Ca 1,2 mM] foram calculadas para avaliar a ligação depen- dente de pH/Ca. O resultado é mostrado na Tabela 8.
Tabela 8 Nome do Condições de ka (1/M) kd (1/s) KD (M) Dependência de Dependência de anticorpo tampão pH pH/Ca (abreviação) KD (pH 5,8 Ca KD (pH 5,8 Ca 1,2 mM)/KD (pH 3 µM)/KD (pH 7,4 7,4 Ca 1,2 mM) Ca 1,2 mM) Clone 278 pH 7,4 Ca 1,2 mM 1,5E+06 3,6E-02 2,4E-09 842,5 1636,5 pH 5,8 Ca 1,2 mM 1,2E+05 2,3E-02 2,0E-06 pH 5,8 Ca 3 µM 6,2E+04 2,4E-02 3,9E-06 Xolair pH 7,4 Ca 1,2 mM 2,5E+06 1,1E-02 4,4E-09 2,3 2,9 pH 5,8 Ca 1,2 mM 2,4E+06 2,4E-02 9,9E-09 pH 5,8 Ca 3 µM 1,4E+06 1,7E-02 1,3E-08 4-3. Avaliação da formação de complexos imunes do clone 278
[02029] Se o clone 278 formas grandes complexos imunes de 2:2 ou mais com IgE humana sob condição neutra (pH 7,4) e se os com- plexos imunes se dissociam sob condição acídica (pH 5,8) foram ava- liados usando a cromatografia de filtração em gel. Clone 278 que foi dialisado contra NaCl 100 mM foi diluído usando um tampão Tris-HCl mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1,2 mM, pH 7,4 para amostras sob condi- ção neutra e usando um tampão Bis-tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, 3 M CaCl2, pH 5,8 para amostras sob condição acídica. As misturas nas quais hIgE(Asp6) 100 g/mL (0,60 M) que é IgE humana (prepa- rado no Exemplo 5) e o clone 278 foram misturadas em uma propor- ção molar de 1:1 ou 1:6 foram deixadas por duas horas ou mais à temperatura ambiente ou em um autoamostrador a 25°C e então foram analisadas pela cromatografia de filtração em gel. Uma fase móvel de Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, CaCl2 1,2 mM, pH 7,4 foi usada sob condição neutra e uma fase móvel de Bis-tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, CaCl2 3 M, pH 5,8 foi usada sob condição acídica. As análises foram realizadas usando uma coluna G4000SWxl (TOSOH) e sob condições de uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e 25°C . Os resultados são mostrados na Fig. 9. Como mostrado na Fig. 9, confirmou-se que o clone 278 e a IgE humana formou grandes complexos imunes con-
sistindo em tetrâmeros (supondo que uma molécula de anticorpo seja um monômero) ou maiores multímeros com um peso molecular apa- rente de aproximadamente 670 kDa sob condição neutra. Além disso, tais complexos imunes não foram observados sob condição acídica. Dessa forma, estes complexos imunes foram confirmados por dissoci- arem-se de uma maneira dependente de pH, similarmente como na avaliação descrita acima na ligação usando Biacore.
[02030] Destes resultados, considerou-se que o clone 278 foi capaz de acelerar a eliminação de IgE humana, similarmente ao anticorpo anti-IgA GA2-IgG1 mencionado acima. Exemplo 5 Avaliação in vivo do clone 278 e Xolair 5-1. Preparação de IgE humana (hIgE(Asp6)) para avaliação in vivo
[02031] hIgE(Asp6) (a região variável é derivada de um anticorpo antiglipicano3 humano), que é IgE humana para avaliação in vivo con- sistindo em uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 48) e uma cadeia leve (SEQ ID NO: 44), foi produzida pelo mesmo método que o descrito no Exemplo 1. hIgE(Asp6) é uma molécula modificada que resulta de alte- ração de asparagina por ácido aspártico em seis sítios de glicosilação N-ligados em IgE humana para que a heterogeneidade na cadeia de açúcar N-ligada de IgE humana não seja afetada por modificações de- pendentes do tempo na concentração plasmática de IgE humana co- mo um antígeno. 5-2. Avaliação do clone 278 e Xolair para o efeito de acelerar a elimi- nação de IgE humana usando camundongos normais
[02032] Cinética in vivo de hIgE(Asp6) e anticorpo anti-IgE humana foi avaliado após administração de hIgE(Asp6) sozinho ou em combi- nação com um anticorpo anti-hIgE (clone 278 e Xolair) a camundongos C57BL/6J (Charles River Japão). Uma solução de hIgE(Asp6) (20 - g/mL) ou uma mistura de hIgE(Asp6) e anticorpo anti-IgE humana (as concentrações são mostradas na Tabela 9) foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg via veia caudal. Sob as condições descritas acima, hIgE(Asp6) é predito ligar-se quase completamente ao anticor- po uma vez que cada anticorpo está presente suficientemente em ex- cesso sobre hIgE(Asp6). O sangue foi coletado dos camundongos cin- co minutos, duas horas, sete horas, um dia, dois dias, quatro ou cinco dias, sete dias, 14 dias, 21 dias, e 28 dias após a administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado em 15.000 rpm e 4°C por 5 minutos para obter o plasma. O plasma separado foi armazena- do em um refrigerador a -20°C ou abaixo até a medid a. Tabela 9 Anticorpo Concentração de hIgE(Asp6) Concentração de anticorpo anti-hIgE anti-hIgE na solução administrada ( g/mL) na solução administrada ( g/mL) Clone 278 20 100 Xolair 20 308 5-3. Determinação de concentração plasmática de hIgE(Asp6) em ca- mundongos normais
[02033] Concentrações de hIgE(Asp6) no plasma de camundongo foram determinadas por ELISA. Amostras de curva padrão foram pre- paradas em concentrações plasmáticas de 192, 96, 48, 24, 12, 6, e 3 ng/mL. Xolair (Novartis) foi adicionado em 10 g/mL às amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo para igualar o complexo imune de hIgE(Asp6) e anticorpo anti-hIgE. Após minutos de incubação à temperatura ambiente, as amostras de cur- va padrão e as amostras de ensaio de plasma de camundongo foram aliquotadas em imunoplacas (MABTECH) imobilizadas com o anticor- po anti-IgE humana ou imunoplacas (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)) imobilizadas com o anticorpo anti-IgE humana (clone 107; MABTECH). Permitiu-se que as placas repousassem à temperatura ambiente por duas horas ou a 4°C durant e a noite. Então, proteína principal GPC3 humana (SEQ ID NO: 51), anticorpo anti-
GPC3 biotinilado com NHS-PEG4-Biotina (Thermo Fisher Scientific) (preparado em Chugai pharmaceutical Co., Ltd.) e estreptavidina- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram reagidos sequencialmente por uma hora cada um. A reação cromogênica usan- do como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) foi extinta com ácido sulfúrico 1 N (Showa Che- mical), e em seguida a concentração no plasma de camundongo foi determinada por um método no qual o desenvolvimento de cor é avali- ado medindo a absorvância em 450 nm usando um leitor de micropla- ca ou um método no qual uma reação luminescente é realizada usan- do SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) como um substrato e a intensidade de luminescência é medida com um leitor de microplaca. A concentração no plasma de camundongo foi calculada da absorvância ou da intensidade de lumi- nescência da curva padrão usando o programa de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). O curso de tempo de concentração plasmá- tica de hIgE(Asp6) após administração intravenosa, que foi determina- da pelo método descrito acima, é mostrado na Fig. 11. 5-4. Determinação de concentração plasmática de anticorpo anti-IgE humana em camundongos normais
[02034] As concentrações de anticorpo anti-hIgE no plasma de ca- mundongo foram determinadas por ELISA. As amostras de curva pa- drão foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, e 0,00625 g/mL. hIgE(Asp6) foi adicionada em 1 g/mL às amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo para igualar o complexo imune de hIgE(Asp6) e anti- corpo anti-hIgE. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambien- te, as amostras de curva padrão e as amostras de ensaio de plasma de camundongo foram aliquotadas em imunoplacas (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International)) imobilizadas com o Anti-
corpo Anticadeia leve Kappa humana (Bethyl Laboratories). As placas foram deixadas repousando à temperatura ambiente por duas horas ou a 4°C durante a noite. Então, anticorpo Secundár io anti-IgG huma- na de Coelho (Fc), conjugado de Biotina (Pierce Biotechnology) e Es- treptavidina-Poly HRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi reagido sequencialmente por uma hora cada um. A reação cromogêni- ca usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) foi extinta com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), e em seguida a concentração no plasma de ca- mundongo foi determinada por um método no qual o desenvolvimento de cor é avaliado medindo a absorvância em 450 nm com um leitor de microplaca. A concentração no plasma de camundongo foi calculada da absorvância da curva-padrão usando o programa de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo da concen- tração plasmática de anticorpo após administração intravenosa, que foi determinada pelo método descrito acima, é mostrado na Fig. 10.
[02035] O resultado mostrou que a eliminação de IgE humana foi retardada quando IgE humana foi administrado em combinação com Xolair, um anticorpo anti-IgE controle, quando comparada com quando IgE humana foi administrada sozinha. Entretanto, a eliminação de IgE humana foi acentuadamente acelerada quando administrada em com- binação com o clone 278, que tem uma atividade de ligação à IgE hu- mana dependente de pH forte, quando comparado com quando IgE humana foi administrada sozinha. Especificamente, demonstrou-se que não somente em caso de IgA, mas também em caso de IgE, a e- liminação de antígeno foi acelerada administrando um anticorpo que forma um grande complexo imune quando comparado com quando o antígeno é administrado sozinho. Exemplo 6 Preparação de variantes de anticorpo que mostram ligação de hIgA dependente de cálcio
[02036] A seguir, para fins de aumentar mais a eliminação do antí- geno (hIgA) do plasma, Leu na posição 328 (numeração EU) em GA2- IgG1, que mostra ligação de hIgA dependente de cálcio, foi substituído por Tyr para aumentar sua ligação ao FcγR de camundongo, produzin- do GA2-F1087 (cadeia pesada SEQ ID NO: 52). Uma sequência de DNA que codifica GA2-F1087 (cadeia pesada SEQ ID NO: 52, e ca- deia leve SEQ ID NO: 40) foi inserida em um plasmídeo de expressão animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. Estas variantes de anticorpo foram expressas usando o plasmídeo de acordo com o método supracitado, e suas concentrações foram determinadas após purificação. Os anticorpos que contêm esta modificação mostra- ram ligação muito aumentada ao FcγR de camundongo como mostra- do no Exemplo de Referência 5. Exemplo 7 Avaliação do efeito sobre a retenção plasmática do antíge- no em camundongos normais administrado com anticorpos de ligação à hIgA dependente de Ca 7-1. teste in vivo usando camundongos normais
[02037] Camundongos normais (camundongo C57BL/6J; Charles River Japan) foram administrados com hIgA (IgA humana: produzido em Exemplo (1-1)) sozinha ou coadministrados com hIgA e um anti- corpo anti-hIgA, e em seguida avaliados para dinâmica in vivo de hIgA e o anticorpo anti-hIgA. Uma solução de hIgA (80 g/mL) ou solução misturada de hIgA e um anticorpo anti-hIgA foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg na veia da cauda. Os anticorpos anti-hIgA usados eram GA2-IgG1 e GA2-F1087 descritos acima.
[02038] A concentração de hIgA foi 80 g/mL em todos os casos, e a concentração de anticorpo anti-hIgA foi 2,69 mg/mL nas soluções misturadas. O anticorpo anti-hIgA estava suficientemente presente em excesso em relação a hIgA, e por isso foi considerado que quase todo hIgA estava ligada pelo anticorpo. Do grupo administrado com GA-
IgG1, o sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, e 7 dias após administração. Do grupo administrado com GA-F1087, o sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 1 dia, 3 dias, e 7 dias após administração. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas a 4°C e 12.000 rpm por 15 minutos para obter as amost ras plasmáticas. As amostras plasmáticas separadas foram armazenadas em um refri- gerador a -20°C ou abaixo até a medida. 7-2. Medida da concentração de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo normal por ELISA
[02039] A concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma de ca- mundongo foi determinada por ELISA. Em primeiro lugar, Fragmento do Anticorpo anti-IgG humana (cadeia γ específico) F(ab’)2 (SIGMA) foi dispensado em cada um dos poços de Placas Nunc-Immuno, Ma- xiSorp (Nalge nunc International), e deixado repousar durante a noite a 4°C para preparar placas imobilizadas Anti-IgG huma na. As amostras padrão de anticorpos anti-hIgA a serem usados como amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563, e 0,007813 g/mL; e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas e aliquotadas nas placas imobilizadas Anti-IgG humana supracitadas, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma hora. Então, Conjugado anti-IgG humana de Cabra (ca- deia γ específica) Biotina (BIOT) (Southern Biotechnology Associats Inc.) foi dispensado em cada um dos poços das placas acima mencio- nadas, e em seguida as placas foram incubadas para deixar a reação ocorrer a 25°C por uma hora. Então, Estreptavidina- PolyHRP80 (Ste- reospecific Detection Technologies) foi dispensada em cada um dos poços das placas acima mencionadas, e em seguida as placas foram incubadas para deixar a reação ocorrer a 25°C por u ma hora. Uma re-
ação de desenvolvimento de cor foi realizada usando TMB One Com- ponent HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um subs- trato. Após parar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorvância da solução de reação em cada um dos poços em 450 nm foi medida em um leitor de microplaca. A concentração de plasma de camundongo do anticorpo anti-hIgA foi calculada baseada na absor- vância da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de curso de tempo nas concentrações plasmáticas dos anticorpos GA2-IgG1 e GA2-F1087 em camundongos normais determinadas por este método após adminis- tração intravenosa são mostradas na Fig. 12. Os resultados confirma- ram que a concentração plasmática de anticorpo do clone GA2-IgG1, que tem uma forte atividade de ligação à hIgA dependente de pH e Ca, não diminui muito mesmo quando a ligação de FcγR é aumentada. 7-3. Determinação da concentração plasmática de hIgA por ELISA
[02040] A concentração de hIgA no plasma de camundongo foi de- terminada por ELISA. Em primeiro lugar, Anticorpo anti-IgA humana de Cabra (BETHYL) foi aliquotada em cada um dos poços de uma Placa Nunc-Immuno, MaxiSorp (Nalge nunc International). A placa foi deixa- da repousar a 4°C durante a noite para preparar uma placa imobilizada anti-IgA humana. As amostras padrão de hIgA a serem usadas como amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, e 0,00625 g/mL. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram preparadas em diluição de 100 vezes ou maior. 200 l de hsIL-6R 500 ng/ml foram a- dicionados a 100 L de cada uma das amostras de curva de calibração e amostras plasmáticas. As misturas resultantes foram deixadas re- pousar à temperatura ambiente por uma hora, e em seguida as solu- ções misturadas foram aliquotadas em 100 l na placa imobilizada an- ti-IgA humana supracitada; e esta foi deixada repousar à temperatura ambiente por uma hora. A seguir, um anticorpo Anti-IL-6R humano bio- tinilado (R&D) foi aliquotado em cada um dos poços da placa acima mencionada, e em seguida a placa foi incubada à temperatura ambien- te por uma hora para deixar a reação ocorrer. Além disso, Estreptavi- dina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi aliquotada em cada um dos poços da placa acima mencionada, e a placa foi in- cubada à temperatura ambiente por uma hora para deixar a reação ocorrer. Uma reação de desenvolvimento de cor foi realizada usando o TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato. Depois que a reação foi extinta com ácido sulfúri- co 1 N (Showa Chemical), a absorvância das soluções de reação em cada um dos poços em 450 nm foi medida usando um leitor de micro- placa. As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas baseadas na absorvância da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de cur- so de tempo na concentração plasmática de hIgA determinadas por este método em camundongos normais submetidos à administração intravenosa são mostradas na Fig. 13.
[02041] Os resultados mostraram que quando hIgA foi co-admi- nistrada a camundongos com GA2-IgG1, que exibe uma atividade de ligação dependente de Ca de 100 vezes ou mais, a eliminação de hIgA foi acelerada comparando com quando hIgA foi administrado sozinha. Além disso, quando hIgA e GA2-F1087, que aumentaram a ligação a FcγR, foram administrados a camundongos, a concentração plasmáti- ca de hIgA se reduziu abaixo da faixa de medida (0,006 g/mL ou mais) um dia após administração, e a eliminação de hIgA plasmática foi significativamente acelerada em comparação com quando GA-IgG1 foi administrado a camundongos. O mencionado acima indica que em camundongos administrados com um anticorpo anti-hIgA e hIgA for- mando um complexo imune, o efeito de um anticorpo com ligação de
FcγR aumentada na remoção de antígeno (hIgA) do plasma é aumen- tada em comparação com o efeito de remoção do antígeno (hIgA) por um anticorpo que serve como fonte de anticorpo com ligação de FcγR aumentada. [Exemplo 8] Preparação de variantes de anticorpo que mostram a liga- ção de IgE humana dependente de pH
[02042] A seguir, com o objetivo de aumentar mais a eliminação do antígeno (IgE humana) do plasma, Leu na posição 328 (numeração EU) no 278-IgG1, que mostra ligação de IgE humana dependente de pH, foi substituído por Tyr para aumentar sua ligação ao FcγR de ca- mundongo, produzindo 278-F1087 (cadeia pesada SEQ ID NO: 53 e cadeia leve SEQ ID NO: 46). Uma sequência de DNA que codifica 278-F1087 foi inserida em um plasmídeo de expressão animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. As variantes de anti- corpo foram expressas de acordo com o método supracitado usando células animais introduzidas com o plasmídeo, e suas concentrações foram determinadas após purificação. Exemplo 9 Avaliação in vivo de 278-IgG1 9-1. Preparação de IgE humana (hIgE(Asp6)) para avaliação in vivo
[02043] Um método similar ao método descrito no Exemplo 5-1 foi usado para preparar hIgE(Asp6) (na qual a região variável é aquela de anticorpo anti-Glipicano 3 humano), que é IgE humana para uso em avaliação in vivo. IgE(Asp6) humana é uma molécula na qual a aspa- ragina foi modificada para ácido aspártico em seis sítios de N- glicosilação de IgE humana, para que a heterogeneidade dos N- glicosídeos de IgE humana não seja afetada pela modificação na con- centração plasmática do antígeno IgE humana. 9-2. Verificação do efeito de remoção acelerada de hIgE humana do plasma de camundongo normal administrado com clone 278
[02044] Foi demonstrado no Exemplo 7 que a concentração plas-
mática de antígeno foi significativamente reduzida em camundongos administrados com uma molécula com a ligação aumentada ao FcγR de camundongo dependente de pH que se liga ao antígeno IgA huma- na. Quando a ligação de FcγR de camundongo é aumentada, para ve- rificar ainda se o efeito de eliminação sobre o antígeno solúvel no plasma pode ser similarmente observado em um organismo adminis- trado com um anticorpo que mostra ligação aumentada ao FcγR de camundongo e se liga de uma maneira dependente de pH a antígenos além de IgA humana, testes usando moléculas de ligação ao antígeno contra o antígeno IgE humana também foram realizados.
[02045] Camundongos C57BL/6J (Charles River Japan) foram ad- ministrados com hIgE(Asp6) sozinha ou co-administrados com hI- gE(Asp6) e um anticorpo anti-hIgE (278-IgG1 ou 278-F1087), e em seguida avaliados para dinâmica in vivo de hIgE(Asp6) e o anticorpo anti-IgE humana. Uma solução de hIgE(Asp6) (20 g/ml) ou uma solu- ção misturada de hIgE(Asp6) e um anticorpo anti-IgE humana (todas as concentrações de anticorpo foram ajustadas para serem as mes- mas concentrações que as mostradas na Tabela 10) foi administrada uma vez em 10 mL/kg na veia da cauda. Neste caso, uma vez que ca- da anticorpo estava suficientemente presente em excesso em relação a hIgE(Asp6), considerou-se que quase toda hIgE(Asp6) estava ligada pelo anticorpo. O sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 14 dias, e 21 dias após administração no grupo administrado com o clone 278 (278- IgG1). O sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 1 dia, 3 dias, 7 dias, 14 dias, e 21 dias após adminis- tração no grupo administrado com 278-F1087. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas a 4°C e 15.000 rpm por minutos para obter amostras plasmáticas. As amostras plasmáticas separadas foram armazenadas em um refrigerador ajustado a -20°C ou abaixo até que o ensaio fosse realizado. Tabela 10 Anticorpo Concentração de hIgE(Asp6) na Concentração de anticorpo anti-hIgE nti-hIgE solução administrada ( g/mL) na solução administrada ( g/mL) 278-IgG1 20 100 278-F1087 20 100 9-3. Determinação da concentração de anticorpo anti-IgE humana em plasma de camundongo normal
[02046] A concentração de anticorpo anti-hIgE no plasma de ca- mundongo foi determinada por ELISA. As amostras de curva de cali- bração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 g/mL. Para fazer o complexo imu- ne formado entre hIgE(Asp6) e o anticorpo anti-hIgE homogêneo, hI- gE(Asp6) foi adicionada em 1 g/mL às amostras de curva de calibra- ção e amostras de ensaio de plasma de camundongo; e o grupo admi- nistrado com 278-hIgG1 e as amostras de curva de calibração corres- pondentes foram deixados repousar à temperatura ambiente por 30 minutos. Além disso, o grupo administrado com 278-F1087 e as amos- tras de curva de calibração correspondentes foram agitados durante a noite a 37°C. As amostras de curva de calibração e a amostras de análise de plasma de camundongo que foram deixadas repousar ou agitadas foram aliquotadas na imunoplaca imobilizada de Anticorpo Anti-Cadeia Leve Kappa humana (Bethyl Laboratories) (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International)), e foram deixadas repou- sar/agitar à temperatura ambiente por duas horas (amostras do grupo administrado com 278-F1087 e amostras de curva de calibração de 278-F1087) ou deixado estar durante a noite a 4°C ( amostras do grupo administrado com 278-hIgG1 e as amostras de curva de calibração do 278-hIgG1). Então, o anticorpo Secundário anti-IgG humana de Coe- lho (Fc), conjugado de Biotina (Pierce Biotechnology) e Estreptavidina-
PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi cada um reagi- do sequencialmente por uma hora. Uma reação de desenvolvimento de cor foi realizada usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato. Depois que a rea- ção foi extinta com ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), a concentra- ção de plasma de camundongo foi determinada pelo desenvolvimento de cor medindo a absorvância em 450 nm em um leitor de microplaca. As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas base- adas na absorvância da curva de calibração usando o programa analí- tico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de curso de tempo nas concentrações plasmáticas de moléculas de ligação ao an- tígeno após administração intravenosa determinada por este método são mostradas na Fig. 14. Os resultados confirmaram que em camun- dongos administrados com uma variante produzida aumentando a li- gação de FcγR de 278-IgG1, que tem uma forte atividade de ligação dependente de pH a IgE humana, as concentrações de anticorpo no soro destes camundongos não muito são reduzidas mesmo quando são comparadas com aquelas de 278-IgG1. 9-4. Determinação da concentração de hIgE(Asp6) em plasma de ca- mundongo normal
[02047] A concentração de hIgE(Asp6) no plasma de camundongo foi determinado por ELISA. As amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 192, 96, 48, 24, 12, 6, e 3 ng/mL. Para fazer o complexo imune formado entre hIgE(Asp6) e o anticorpo anti-hIgE homogêneo, Xolair (Novartis) foi adicionado em 10 g/mL às amostras de curva de calibração e as amostras de ensaio de plasma de camundongo do grupo administrado com 278-hIgG1, e as amostras foram deixadas repousar à temperatura ambiente por 30 mi- nutos. No grupo administrado com 278-F1087, 278-F1022 (cadeia pe- sada SEQ ID NO: 54 e cadeia leve SEQ ID NO: 46, preparado de uma maneira similar ao Exemplo ou 278-F760 (cadeia pesada SEQ ID NO: 55 e cadeia leve SEQ ID NO: 46, preparado de uma maneira similar ao Exemplo 8) foi adicionado em 20 g/mL, e em seguida misturado a 37°C por 60 horas. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram aliquotadas na imunoplaca imobilizada de anti-IgE humana (MABTECH) ou imunoplaca imobilizada de anti-IgE humana (clone 107, MABTECH) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc Internatio- nal)); e as amostras foram deixadas repousar ou agitadas à temperatu- ra ambiente por duas horas, ou foram deixados repousar durante a noite a 4°C. Então, a proteína principal GPC3 human a (SEQ ID NO: 51), um anticorpo anti-GPC3 (preparado internamente) biotinilado com NHS-PEG4-Biotina (Thermo Fisher Scientific), e Estreptavidina- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi cada uma rea- gida sequencialmente por uma hora. A concentração no plasma de camundongo foi determinada pelo método da realização de uma rea- ção de desenvolvimento de cor usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato, parando a reação com ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), e em seguida medindo o desenvolvimento de cor pela absorvância em 450 nm me- dida em um leitor de microplaca; ou o método de realização de uma reação de desenvolvimento de cor usando SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) como um substrato, e em seguida medindo intensidade de luminescência em um leitor de microplaca. As concentrações no plasma de camundongo fo- ram calculadas da intensidade de luminescência ou baseadas na ab- sorvância da curva de calibração usando o programa analítico SOFT- max PRO (Molecular Devices). As modificações de curso de tempo na concentração plasmática de hIgE(Asp6) após administração intraveno- sa determinada por este método são mostradas na Fig. 15.
[02048] Como resultado, ao contrário da eliminação no caso de IgE humana somente, a eliminação de IgE humana foi acelerada em ca- mundongos coadministrados com IgE humana e 278-IgG1, que tem uma forte atividade de ligação dependente de pH, comparando com IgE humana somente. Além disso, a eliminação de IgE humana foi sig- nificativamente acelerada em camundongos administrados com IgE humana e 278-F1087, que é produzida pelo aumento da ligação de FcγR de 278-IgG1, em comparação com camundongos administrados com IgE humana somente e camundongos coadministrados com IgE humana e 278-IgG1. Isto é, mostrou-se que a eliminação de antígeno era acelerada não somente em camundongos administrados com anti- corpos anti-IgA com ligação de FcγR aumentada discutida até agora, mas também em camundongos administrados com anticorpos anti-IgE com a ligação de FcγR aumentada. Os resultados supracitados mos- traram que a eliminação de antígeno pode ser acelerada mais pelo aumento da ligação de FcγR em cada par do anticorpo formafor do complexo imune hIgA-anti-hIgA e par do anticorpo hIgE-anti-hIgE. Exemplo 10 Preparação de variantes de anticorpo que mostram liga- ção de hIgA dependente de cálcio
[02049] A seguir, com o objetivo de aumentar a eliminação do antí- geno (hIgA) do plasma, variantes com ligação aumentada ao FcRn de camundongo foram produzidas de GA2-IgG1, que mostra ligação de hIgA dependente de cálcio. Em primeiro lugar, com o objetivo de redu- zir a ligação de FcγR pela região de Fc, GA2-F760 (cadeia pesada SEQ ID NO: 57) foi produzido substituindo Arg por Leu na posição 235 e Lys por Ser na posição 239 como indicado pela numeração EU em GA2-IgG1. Além disso, GA2-F1331, uma variante mostrando ligação de FcRn mais forte em pH 7,4 do que GA2-F760, foi produzida intro- duzindo as seguintes substituições em GA2-F760: Arg por Gly na posi- ção 236, Tyr por Met na posição 252, Thr por Ser na posição 254, Glu por Thr na posição 256, Tyr por Asn na posição 434, Val por Tyr na po-
sição 436, Arg por Gln na posição 438, e Glu por Ser na posição 440 como indicado pela numeração EU. As sequências de DNA que codifi- cam GA2-F760 (cadeia pesada SEQ ID NO: 57, e cadeia leve SEQ ID NO: 40) e GA2-F1331 (cadeia pesada SEQ ID NO: 56 e cadeia leve SEQ ID NO: 40) foram inseridas em plasmídeos de expressão animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. Estes plas- mídeos foram usados para a expressão pelo método descrito acima, e as concentrações destas variantes de anticorpo foram determinadas após purificação. As atividades de ligação de GA2-F760 aos FcγRs de camundongo (mFcγRI, mFcγRII, mFcγRIII, e mFcγRIV) foram determi- nadas. Como resultado, GA2-F760 não mostrou ligação significante aos FcγRs de camundongo. Exemplo 11 Avaliação do efeito sobre a retenção plasmática do antí- geno em camundongos transgênicos de FcRn humano administrados com anticorpos de ligação à hIgA dependente de Ca 11-1. Teste in vivo usando camundongos transgênicos de FcRn huma- no
[02050] Camundongos transgênicos de FcRn humano (camundon- go linhagem B6.mFcRn -/-.hFcRn Tg 32 +/+, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104) foram administrados com hIgA (IgA humana: produzida no Exemplo (1-1)) sozinha ou co-administrada com hIgA e um anticorpo anti-hIgA; e em seguida dinâmica in vivo de hIgA e do anticorpo anti-hIgA foi avaliada. Uma solução de hIgA (80 g/mL) ou uma solução misturada de hIgA e de anticorpo anti-hIgA foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg na veia da cauda. Qualquer um dos GA2-IgG1, GA2-F760 e GA2-F1331 supracitados foi usado como um anticorpo anti-hIgA para administração.
[02051] A concentração de hIgA na solução misturada era 80 g/mL em todos os casos, e a concentração de anticorpo anti-hIgA era 2,69 mg/mL. Uma vez que o anticorpo anti-hIgA estava suficientemente presente em excesso em relação a hIgA, considerou-se que a maior parte de hIgA estava ligada pelo anticorpo. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, 1 hora, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 3 dias, 7 di- as, e 14 dias após administração do anticorpo. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas a 4°C e 12.000 rpm por minutos para obter as amostras plasmáticas. As amostras plasmáti- cas separadas foram armazenadas em um refrigerador a -20°C ou a- baixo até a medida. 11-2. Determinação de ELISA da concentração de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo transgênico de FcRn humano
[02052] A concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma de ca- mundongo foi determinada por ELISA. Em primeiro lugar, o Fragmento do Anticorpo anti-IgG humana (cadeia γ específico) F(ab’)2 (SIGMA) foi dispensado em cada um dos poços de Placas Nunc-Immuno, Ma- xiSorp (Nalge nunc International), e que foi deixado repousar durante a noite a 4°C para preparar placas imobilizadas Anti- IgG humana. As amostras padrão dos anticorpos anti-hIgA a serem usadas como a- mostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563, e 0,007813 g/mL; e as amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas e aliquotadas nas placas imobili- zadas Anti-IgG humana, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma hora. Então, Conjugado anti-IgG humana de Cabra (ca- deia γ específico) Biotina (BIOT) (Southern Biotechnology Associates Inc.) foi dispensado em cada um dos poços das placas acima mencio- nadas, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma hora para deixar a reação ocorrer. Então, Estreptavidina-PolyHRP80 (Ste- reospecific Detection Technologies) foi dispensada em cada um dos poços das placas acima mencionadas, e em seguida as placas foram incubadas a 25°C por uma hora para deixar a reação ocorrer. Uma re-
ação de desenvolvimento de cor foi realizada usando TMB One Com- ponent HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um subs- trato. Após parar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorvância da solução de reação em cada um dos poços em 450 nm foi medida em um leitor de microplaca. A concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma de camundongo foi calculada baseada na absor- vância da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de curso de tempo em concentrações plasmáticas do GA2-F1331 e anticorpo GA2-F760 em camundongos transgênicos de FcRn humano após administração in- travenosa determinada por este método são mostradas na Fig. 16. 11-3. Determinação da concentração plasmática de hIgA por ELISA
[02053] A concentração de hIgA no plasma de camundongo foi de- terminada por ELISA. Em primeiro lugar, o anticorpo anti-IgA humana de Cabra (BETHYL) foi aliquotado em cada um dos poços de uma Placa Nunc-Immuno, MaxiSorp (Nalge nunc International). A placa foi deixada repousar durante a noite a 4°C para prepara r uma placa imo- bilizada anti-IgA humana. As amostras padrão de hIgA a serem usadas como amostras de curva de calibração foram preparadas em concen- trações plasmáticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 - g/mL. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram prepa- radas em uma diluição de 100 vezes ou maior. 200 l de hsIL6R 500 ng/mL foram adicionados a 100 L de cada uma das amostras de cur- va de calibração e amostras plasmáticas. As misturas resultantes fo- ram deixadas repousar à temperatura ambiente por uma hora, e em seguida as soluções misturadas foram aliquotadas em 100 l na placa imobilizada anti-IgA humana supracitada; e a placa foi deixada repou- sar à temperatura ambiente por uma hora. A seguir, o Anticorpo Anti-IL- 6R Humano Biotinilado (R&D) foi aliquotado em cada um dos poços da placa acima mencionada, e em seguida a placa foi incubada em TA por uma hora para deixar a reação ocorrer. Além disso, Estreptavidina- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi aliquotada em cada um dos poços da placa acima mencionada, e em seguida a placa foi incubada à temperatura ambiente por uma hora para deixar a rea- ção ocorrer. Uma reação de desenvolvimento de cor foi realizada u- sando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Labora- tories) como um substrato. Após a reação ser extinta com ácido sulfú- rico 1 N (Showa Chemical), a absorvância da solução de reação em cada um dos poços em 450 nm foi medida usando um leitor de micro- placa. As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas baseadas na absorvância da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de cur- so de tempo na concentração plasmática de hIgA em camundongos transgênicos de FcRn humano determinadas por este método após administração intravenosa são mostradas na Fig. 17.
[02054] Os resultados mostraram que a eliminação de hIgA do plasma foi acentuadamente acelerada em camundongos co-adminis- trados com hIgA e GA2-F1331, que aumentou a ligação de FcRn hu- mano, em comparação com a eliminação plasmática de hIgA em ca- mundongos co-administrados com hIgA e GA2-F760, que tem uma baixa atividade de ligação de FcRn humano. Exemplo 12 Preparação de variantes de anticorpo que mostram liga- ção de IgE humana dependente de pH
[02055] A seguir, com o objetivo de aumentar a eliminação do antí- geno (IgE humana) do plasma, variantes com ligação aumentada ao FcRn de camundongo foram produzidas do 278-IgG1, que mostra a ligação de IgE humana dependente de pH. Em primeiro lugar, com o objetivo de diminuir a ligação de FcγR de camundongo, 278-F760 (SEQ ID NO: 55) foi produzido substituindo Arg por Leu na posição 235 e Lys por Ser na posição 239 como indicado pela numeração EU no 278-IgG1. Além disso, 278-F1331, uma variante mostrando ligação de FcRn mais forte em pH 7,4 do que 278-F760, foi produzido introdu- zindo as seguintes substituições no 278-F760: Arg por Gly na posição 236, Tyr por Met na posição 252, Thr por Ser na posição 254, Glu por Thr na posição 256, Tyr por Asn na posição 434, Val por Tyr na posi- ção 436, Arg por Gln na posição 438, e Glu por Ser na posição 440 como indicado pela numeração EU. Uma sequência de DNA que codi- fica 278-F1331 (cadeia pesada SEQ ID NO: 58, e cadeia leve SEQ ID NO: 46) ou 278-F760 (cadeia pesada SEQ ID NO: 55 e cadeia leve SEQ ID NO: 46) foi inserida em um plasmídeo de expressão animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. Estas varian- tes de anticorpo foram expressas pelo método supracitado usando cé- lulas animais introduzidas com o plasmídeo, e suas concentrações fo- ram determinadas após purificação. Exemplo 13 Avaliação do efeito sobre a retenção plasmática do antí- geno em camundongos transgênicos de FcRn humano administrado com um anticorpo de ligação à hIgE dependente de pH 13-1. Teste in vivo usando camundongos transgênicos de FcRn huma- no
[02056] Camundongos transgênicos de FcRn humano (camundon- go B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg linhagem 32 +/+, Jackson Laboratories; Me- thods Mol Biol. (2010) 602, 93-104) foram coadministrados com hI- gE(Asp6) (IgE humana (Asp6): produzida no Exemplo (5-1)), um anti- corpo anti-hIgE (278-F760 ou 278-F1331), e Sanglopor (imunoglobuli- na normal humana, CSL Behring); e em seguida dinâmica in vivo de hIgE (os Asp6) e do anticorpo anti-hIgE foi avaliada. Uma solução mis- turada de hIgE(Asp6), um anticorpo anti-hIgE e Sanglopor (as concen- trações são mostradas na Tabela 11) foi administrada uma vez em uma dose de 10 mL/kg na veia da cauda. Os 278-F760 ou 278-F1331 supracitados foram usados como o anticorpo anti-hIgE para adminis-
tração.
[02057] Uma vez que o anticorpo anti-hIgE estava suficientemente presente em excesso em relação a hIgE(Asp6), considerou-se que a maior parte de hIgE(Asp6) estava ligada pelo anticorpo. O sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, e 28 dias após administração do anticorpo. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas a 4°C e 12.000 rpm por 15 minutos par a obter amostras plasmáticas. As amostras plasmáticas separadas foram armazenadas em um refrigerador a -20°C ou abaixo até a medida. Tabela 11 Anticorpo Concentração de hIgE Concentração de anticor- Concentração de San- anti-hIgE (Asp6) na solução admi- po anti-hIgE na solução glopor na solução ad- nistrada ( g/mL) administrada ( g/mL) ministrada ( g/mL) 278-F760 20 100 100 278-F1331 20 100 100 13-2. Determinação da concentração de anticorpo anti-hIgE em plas- ma de camundongo transgênico de FcRn humano por ELISA
[02058] A concentração de anticorpo anti-hIgE no plasma de ca- mundongo foi determinada por ensaio de eletroquimioluminescência (ECL). As amostras padrão dos anticorpos anti-hIgE a serem usadass como amostras de curva de calibração foram preparadas em concen- trações plasmáticas de 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, e 0,25 g/mL. Cada uma das amostras de curva de calibração e amostras de plasma de ca- mundongo foi aliquotada em cada um dos poços da placa ECL com hIgE(Asp6) imobilizada, e em seguida a placa foi incubada a 4°C por uma hora / durante a noite para deixar a reação ocorrer. Então, Conju- gado de anti-IgG humana de Cabra (cadeia γ específico) Biotina (BI- OT) (Southern Biotechnology Associates Inc.) foi dispensado em cada um dos poços da placa acima mencionada, e em seguida a placa foi incubada a 25°C por uma hora para deixar a reação o correr. Além dis- so, Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi dispensada em cada um dos poços da placa acima mencionada, e em seguida a placa foi incubada a 25°C por uma hora para deixar a reação ocorrer. A seguir, cada solução de reação na placa foi deixada reagir com um anticorpo anticoelho de cabra marcado com SULFO (Meso Scale Discovery) à temperatura ambiente por uma hora. Final- mente, Tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foi dispensado em cada solução de reação, e isto foi imediatamente seguido da medi- da de luminescência da solução de reação usando o Leitor Sector I- mager 2400 (Meso Scale Discovery). A concentração de anticorpo anti- hIgE no plasma de camundongo foi calculada baseada na resposta da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Mo- lecular Devices). As modificações de curso de tempo nas concentra- ções plasmáticas dos anticorpos 278-F1331 e 278-F760 em camun- dongos transgênicos de FcRn humano determinados por este método após administração intravenosa são mostradas na Fig. 18. 13-3. Determinação da concentração plasmática de hIgE(Asp6) em camundongos transgênicos de FcRn humano
[02059] A concentração de hIgE(Asp6) no plasma de camundongo foi determinada por ELISA. As amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 192, 96, 48, 24, 12, 6, e 3 ng/mL. Para produzir o complexo imune formado entre hIgE(Asp6) e um anticorpo anti-hIgE homogêneo, amostras de curva de calibração e amostras de ensaio de plasma de camundongo foram preparados por adição de Xolair (Novartis) em 10 g/mL para o grupo administrado com 278-hIgG1, e as amostras foram deixadas repousar à temperatura ambiente por 30 minutos. As amostras de ensaio de plasma de ca- mundongo foram aliquotadas na imuno placa imobilizada anti-IgE hu- mana (MABTECH) ou imuno placa imobilizada anti-IgE humana (clone
107, MABTECH) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc Internatio- nal)), e as amostras foram deixadas repousar à temperatura ambiente por duas horas, ou a 4°C durante a noite. Então, a proteína principal GPC3 humana (SEQ ID NO: 51), um anticorpo anti-GPC3 (preparado internamente) biotinilado com NHS-PEG4-Biotina (Thermo Fisher Sci- entific), e Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Techno- logies) foi cada um reagido sequencialmente por uma hora. As concen- trações no plasma de camundongo foram determinadas pelo método de realização de uma reação de desenvolvimento de cor usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato, parando a reação com ácido sulfúrico 1 N (Showa Che- mical), e em seguida medindo o desenvolvimento de cor pela absor- vância em 450 nm medida em um leitor de microplaca; ou o método de realização de uma reação de luminescência usando SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) como um substrato, e em seguida medindo a intensidade de lumines- cência em um leitor de microplaca. As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas da intensidade de luminescência ou baseadas na absorvância da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de cur- so de tempo na concentração plasmática de hIgE(Asp6) determinado por este método após administração intravenosa são mostradas na Fig. 19.
[02060] Os resultados mostraram que a eliminação plasmática de hIgE de camundongo foi acentuadamente acelerada em camundongos co-administrados com hIgE e 278-F1331, que aumentou a ligação de FcRn humano, em comparação com a eliminação plasmática de hIgE em camundongos coadministrados com hIgE e 278-F760, que tem uma baixa atividade de ligação de FcγR em camundongo. Isto é, mostrou-se que a eliminação de antígeno era acelerada não somente em camun-
dongos administrados com anticorpos anti-IgE tendo ligação de FcRn aumentada discutido até o momento, mas também em camundongos administrados com anticorpos anti-IgE tendo ligação de FcRn aumen- tada. Os resultados supracitados mostraram que a eliminação de antí- geno pode ser acelerada mais aumentando a ligação de FcRn em ca- da um do par de anticorpo hIgA-anti-hIgA e par de anticorpo hIgE-anti- hIgE formador do complexo imune. Exemplo 14 Avaliação do efeito sobre retenção plasmática de antígeno em camundongos normais coadministrados com dois tipos de anticor- pos antirreceptor de IL6 humano 14-1. Preparação de dois tipos de anticorpos anti-IL6R
[02061] Fv4-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 59, e cadeia leve SEQ ID NO: 60) é um anticorpo antirreceptor de IL6 humano que tem a propriedade de ligação a IL6R humano de uma maneira dependente de pH (liga-se sob uma condição neutra e dissocia-se sob uma condi- ção acídica) como descrito no WO 2011/122011. PHX-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 61, e cadeia leve SEQ ID NO: 62) é um anticorpo de ligação a IL6R humano. Uma sequência de DNA que codifica Fv4- IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 59, e cadeia leve SEQ ID NO: 60), PHX-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 61, e cadeia leve SEQ ID NO: 62), ou PHX-F29 (cadeia pesada SEQ ID NO: 63, e cadeia leve SEQ ID NO: 62) produzido pela preparação de modificações de aminoáci- dos à região constante da cadeia pesada de PHX-IgG1 foi inserida em um plasmídeo de expressão animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. Estas variantes de anticorpo foram expressas pelo método acima mencionado (descrito no Exemplo 1) usando plas- mídeos, e suas concentrações foram determinadas após a purificação. 14-2. Avaliação de ligação do receptor de IL6 humano de PHX-IgG1
[02062] A interação entre IL-6R e PHX-IgG1 preparado em 14-1 foi analisada usando Biacore T200 (GE Healthcare) para calcular a cons-
tante de dissociação (KD). Um tampão ACES 10 mM, NaCl 150 mM e Tween20 0,05%, pH 7,4 foi usado como o tampão de corrida para ana- lisar interações a 37°C. Proteína A/G (Thermo Scien tific) foi imobiliza- da no chip Sensor CM4 Série S (GE Healthcare) por um método de acoplamento de amina, e permitiu-se que o chip capturasse um anti- corpo de interesse. Então, o tampão de corrida e IL-6R que foi diluído usando o tampão de corrida a 800, 400, 200, 100, 50, 25, e 12,5 nM foram deixados escoar sobre o chip com anticorpo capturado em uma taxa de fluxo de 2 L/min para permitir a interação ocorrer por 15 mi- nutos. Os anticorpos capturados para os chips foram lavados pela rea- ção com glicina-HCl 10 mM em pH 1,5; e os chips lavados foram rege- nerados e usados repetidamente para análises de interação.
[02063] A constante de dissociação KD (mol/L) de PHX-IgG1 de IL- 6R foi calculada realizando uma análise de afinidade em estado per- manente nos sensorgramas obtidos como resultados de medida Biaco- re usando o Programa de Avaliação Biacore. A constante de dissocia- ção (KD) de PHX-IgG1 de IL-6R em pH 7,4 calculada por este método foi 1,4 E-7 (M).
[02064] A seguir, a dependência de pH de PHX-IgG1 na ligação de hIL-6R foi avaliada usando Biacore T100. Um tampão ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween20 0,05%, pH 7,4 e um tampão ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween20 0,05%, pH 6,0 foram usados como tampões de corrida para determinar a ligação de PHX-IgG1 a hIL-6R a 37°C sob condições de pH 7,4 e pH 6,0, respectivamente. Proteína A/G (Thermo Scientific) foi imobilizada no chip Sensor CM4 Série S (GE Healthcare) por um método de acoplamento de amina, e permitiu-se que o chip capturasse um anticorpo de interesse. Então, permitiu-se que o tampão de corrida e IL-6R que foi diluído usando o tampão de corrida a 1000, 250, e 62,5 nM interagissem com o chip com anticorpo capturado.
[02065] Os sensorgramas obtidos por meio de medidas feitas por este método em pH 7,4 e pH 6,0 são mostrados na Fig. 20. A Fig. 20 mostra a fase hIL-6R ligada e a fase hIL-6R dissociada de PHX-IgG1 quando a quantidade de anticorpos capturados é normalizada a 100 RU. A comparação dos resultados mostrados na Fig. 20 indica que a ligação de PHX-IgG1 a hIl-6R é reduzida em pH 6,0 quando compara- da com o caso em pH 7,4. 14-3. Avaliação da propriedade de dois tipos de anticorpos para ligar- se simultaneamente ao mesmo antígeno por um método de eletro- quimioluminescência
[02066] Se dois tipos de moléculas de ligação ao antígeno podem ligar-se a um antígeno único simultaneamente foi avaliado por um mé- todo de eletro-quimioluminescência. Em primeiro lugar, Fv4-IgG1 (1 g/mL, 100 L) biotinilado usando EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina (Thermo SCIENTIFIC) foi adicionado à Placa de 96 poços Streptavidin Gold MULTI-ARRAY(r), e que foi incubado à temperatura ambiente por uma hora para deixar a reação ocorrer. Após lavagem, 100 L das soluções de hsIL-6R preparadas em 0, 0,2, 1, 5, e 25 g/mL foram adicionados, e permitiu-se que reagissem à temperatura ambiente por uma hora. Após outra lavagem, PHX-F29 submetido à marcação de rutênio u- sando SULFO-TAG NHS Éster (Meso Scale Discovery) (0, 0,2, 1, 5, 25, e 125 g/mL; 100 L) ou Fv4-IgG1 submetido a marcação de rutê- nio pelo mesmo método (5 g/mL; 100 L) foi adicionado e permitido reagir à temperatura ambiente por uma hora. Após lavagem, 150 L de Tampão Read T (x4) (Meso Scale Discovery) foram dispensados em cada um dos poços, e isto foi imediatamente seguido da medida de quimioluminescência usando o Leitor SECTOR IMAGER 2400 (Meso Scale Discovery).
[02067] Os resultados são mostrados na Fig. 21. Quando marcada com rutênio, permitiu-se que Fv4-IgG1 reagisse, a reação não foi ob-
servada apesar da concentração de antígeno. Por outro lado, quando marcada com rutênio, permitiu-se que PHX-F29 reagisse, a reação de antígeno (IL6R) dependente de concentração foi observada. Estes re- sultados mostram que PHX-F29 e Fv4-IgG1 se ligam simultaneamente a IL6R. Por isso, isto indica que o epítopo de IL6R reconhecido por PHX-F29 e o epítopo reconhecido por Fv4-IgG1 são diferentes; e u- sando anticorpos que carreiam a região variável de PHX-F29 e a regi- ão variável Fv4-IgG1, respectivamente, duas moléculas de ligação ao antígeno podem ligar-se a uma molécula de IL6R única. 14-4. Testes in vivo usando camundongos normais
[02068] Camundongos normais (camundongo C57BL/6J; Charles River Japan) foram administrados com hsIL-6R (receptor de IL-6 hu- mano solúvel: preparado no Exemplo de Referência 1) sozinho ou co- administrado com hsIL-6R e anticorpos antirreceptor de IL-6 humano, e em seguida avaliados para dinâmica in vivo de hsIL-6R e anticorpos antirreceptor de IL-6 humano. Uma solução de hsIL-6R (5 g/ml) ou uma solução misturada de hsIL-6R e um anticorpo antirreceptor de IL- 6 humano foi administrada uma vez em 10 mL/kg na veia da cauda. Os anticorpos antirreceptor de IL-6 humano usados foram Fv4-IgG1 e PHX-IgG1.
[02069] A concentração de hsIL-6R na solução misturada foi 5 - g/mL em cada caso e as concentrações de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foram diferentes para cada grupo de administração como mostrado na Tabela 12. Uma vez que o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano estava suficientemente presente em excesso em relação a hsIL-6R, considerou-se que a maior parte de hsIL-6R estava ligada pelo anticorpo. O sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 14 dias, e 21 dias após administra- ção. O sangue foi coletado do grupo administrado (#1) com Fv4-IgG1 (1 mg/kg) 5 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 15 dias, e 22 dias após administração do anticorpo. As amostras de sangue coleta- das foram imediatamente centrifugadas a 4°C e 12.00 0 rpm por 15 mi- nutos para obter as amostras plasmáticas. As amostras plasmáticas separadas foram armazenadas em um refrigerador a -20°C ou abaixo até a medida. Tabela 12 Grupo de adminis- Quantidade de Fv4-IgG1 Quantidade de PHX-IgG1 tração administrada (mg/kg) administrada (mg/kg) #1 1 0 #2 1 1 #3 1 5 #4 1 25 14-5. Determinação da concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano em plasma de camundongo normal por um método de eletro- quimioluminescência
[02070] A concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano no plasma de camundongo foi determinada por um método de eletro- quimioluminescência. Em primeiro lugar, um anticorpo de captura anti- kappa humano (Antibody Solutions) foi dispensado para placas de 96 poços MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) e misturado à tempera- tura ambiente por uma hora, e em seguida uma solução de PBS- Tween contendo BSA 5% (p/v) foi usada para bloquear à temperatura ambiente por duas horas para preparar placas com anti-IgG-humana imobilizada. As amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 40,0, 13,3, 4,44, 1,48, 0,494, 0,165, e 0,0549 g/mL; e as amostras de ensaio de plasma de camundongo preparadas em diluição de 500 vezes ou mais foram aliquotadas em cada um dos poços das placas com anti-IgG-humana imobilizada, e em seguida as placas foram agitadas por uma hora à temperatura am- biente. Então, um conjugado Biotina anticorpo de captura anticapa humano (Antibody Solutions) foi dispensado em cada um dos poços das placas acima mencionadas, e em seguida as placas foram agita- das à temperatura ambiente por uma hora para deixar a reação ocor- rer. Além disso, estreptavidina marcada com SULFO (Meso Scale Dis- covery) foi aliquotado em cada um dos poços das placas, e em segui- da as placas foram agitadas à temperatura ambiente por uma hora pa- ra deixar a reação ocorrer. Após lavar cada um dos poços, Tampão Read T (x1) (Meso Scale Discovery) foi dispensado nos poços, e a quimioluminescência das soluções de reação foi medida imediatamen- te usando o Leitor Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas baseadas na resposta da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). As modificações de curso de tempo na concentração de anticorpo anti-IL-6R humano são mostra- das na Fig. 22. 14-6. Determinação da concentração plasmática de hsIL-6R por um método de eletroquimioluminescência
[02071] A concentração de hsIL-6R no plasma de camundongo foi determinada por um método de eletroquimioluminescência. As amos- tras de curva de calibração de hsIL-6R foram preparadas em concen- trações plasmáticas de 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,781, 0,391, e 0,195 ng/mL. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram pre- paradas em diluição de 50 vezes ou maior. Uma solução misturada da amostra de hsIL-6R ou amostra de ensaio de plasma de camundongo, um anticorpo anti-IL-6R humano monoclonal (R&D) que foi marcado com rutênio usando marcador SULFO-NHS Éster (Meso Scale Disco- very), um anticorpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D), e permitiu-se que tocilizumabe (cadeia pesada SEQ ID NO: 64, cadeia leve SEQ ID NO: 65) reagisse durante a noite a 37°C. Então, uma solução de PBS- Tween contendo BSA 0,5% (p/v) foi usada para bloquear uma Placa multi-ARRAY Streptavidin Gold (Meso Scale Discovery) pela incubação a 5°C durante a noite, e a solução misturada foi al iquotada em cada um dos poços daquela placa. Após outra incubação de duas horas desta placa à temperatura ambiente para deixar a reação ocorrer, cada um dos poços da placa foi lavado, e em seguida Tampão Read T (x2) (Meso Scale Discovery) foi dispensado em cada um dos poços; e a quimioluminescência das soluções de reação foi medida imediatamen- te usando o Leitor SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). As concentrações de hsIL-6R foram calculadas baseadas na resposta da curva de calibração usando o programa analítico SOFTmax PRO (Mo- lecular Devices).
[02072] As modificações curso de tempo calculado na concentração de IL6R humano (que também é descrito como hsIL6R ou hsIL-6R e se refere à mesma proteína) são mostradas na Fig. 23. A eliminação de IL6R plasmático foi acelerada em camundongos administrados com PHX-IgG1 em conjunto com Fv4-IgG1 em comparação com camun- dongos administrados com Fv4-IgG1 sozinho.
[02073] Sem estar restrita a uma teoria particular, a seguinte expli- cação pode ser dada para aceleração supracitada da eliminação de antígeno plasmática. Mesmo quando administrado sozinho, Fv4-IgG1 estava presente em quantidade suficiente em relação a hsIL6R, e des- sa forma considerou-se que a maioria dos hsIL6R estavam ligados por Fv4-IgG1 no plasma. Quando PHX-IgG1, que tem um epítopo diferen- te daquele de Fv4-IgG1 e pode ligar-se a hsIL6R com Fv4-IgG1, é administrado, um complexo imune que compreende Fv4-IgG1 e PHX- IgG1 de uma molécula de hsIL6R única é formado. Como resultado, a absorção em células foi promovida pela ligação aumentada a um re- ceptor de Fcγ e/ou FcRn, e isto pode ter resultado na aceleração da eliminação de hsIL6R do plasma. Especificamente, a formação de grandes complexos imunes que compreendem dois ou mais anticorpos e duas ou mais unidades de ligação antigênicas (antígenos monoméri- cos) por anticorpos multiespecíficos compreendendo regiões variáveis apropriadas que se ligam a epítopos que são diferentes entre si e es- tão presentes em um antígeno monomérico ou anticorpos multiparató- picos em uma modalidade não limitante, que são anticorpos cujas re- giões variáveis mostram ligação dependente de pH ou de Ca (anticor- pos biespecíficos ou anticorpos biparatópicos que compreendem uma região variável de braço direito que reconhece o epítopo A e uma regi- ão variável de braço esquerdo que reconhece o epítopo o B, como mostrado na Fig. 8) permite a aceleração da eliminação de antígeno. Exemplo 15 Avaliação de ligação de um complexo imune com FcγR usando Biacore 15-1. Quanto a ligação de um complexo imune com FcγR
[02074] Como métodos para avaliar a formação de complexos imu- nes compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno e um antí- geno, cromatografia de filtração em gel (exclusão de tamanho) foi usa- da no Exemplo 4, e um método de eletroquimioluminescência (ECL) foi usado no Exemplo 14. Quando o antígeno ou a molécula de ligação ao antígeno compreendida em um complexo imune contêm um domínio de ligação de FcγR como uma região constante de imunoglobulina, o complexo imune liga-se a FcγR com avidez. Por isso, a formação de um complexo imune compreendendo um domínio de ligação de FcγR pode ser confirmada por um método que usa a propriedade da ligação de FcγR mais forte (especialmente, a propriedade da dissociação mais lenta) do que a molécula de ligação ao antígeno somente ou o antíge- no sozinho (The Journal of Biological Chemistry (2001) 276 (9), 6591- 6604, mAbs (2009) 1 (5), 491-504). 15-2. Preparação de anticorpos e antígenos para avaliação e FcγR IIIaV humano marcado com histidina
[02075] Xolair (Novartis), clone 278-IgG1 (preparado no Exemplo
4), GA2-IgG1 (preparado no Exemplo 1), Fv4-IgG1 (preparado no E- xemplo 14), e PHX-IgG1 (preparado no Exemplo 14) a serem usados para a avaliação da formação de complexo imune foram preparados pelos métodos acima mencionados.
[02076] A hIgE (hIgE(Asp6); preparada no Exemplo 5) e IL6R (E- xemplo de Referência 1) a serem usados para a avaliação foram pre- parados pelos métodos acima mencionados, respectivamente. Um re- combinante de IgA humana, hIgA-v2 (GC-hIgA), foi preparado pelo método abaixo. Um fragmento gênico que codifica GC-hIgA-MYC (ca- deia pesada SEQ ID NO: 66 e cadeia leve SEQ ID NO: 67) foi inserido em um vetor de expressão de célula animal. O vetor de plasmídeo construído foi introduzido em FreeStyle 293 (Invitrogen) usando 293Fectin (Invitrogen) junto com um gene de expressão de EBNA1. Então, as células transfectadas foram cultivadas a 37°C sob CO 2 8% por seis dias, e a proteína GC-hIgA foi secretada no sobrenadante de cultura. A cultura de células contendo GC-hIgA-MYC foi filtrada por um filtro de 0,22 m na boca da garrafa para obter o sobrenadante de cul- tura. GC-hIgA-MYC purificado foi obtido usando cromatografia de troca iónica e cromatografia de filtração em gel de acordo com os métodos conhecidos pelos especialistas na técnica.
[02077] FcγR IIIaV humano marcado com histidina foi preparado pelo método do Exemplo de Referência 2. 15-3. Avaliação de ligação de um complexo imune com FcγR
[02078] A ligação de um complexo imune anticorpo-antígeno com FcγR foi avaliada usando Biacore T200 (GE Healthcare).
[02079] Uma quantidade adequada de Anticorpo Penta-His (QIA- GEN) foi imobilizada no chip Sensor CM5 (GE Healthcare) por um mé- todo de acoplamento de amina; e uma concentração adequada de FcγR IIIaV humano marcado com His foi injetado. FcγR IIIaV humano foi imobilizado no chip permitindo o anticorpo penta-His imobilizado no chip capturar FcγR IIIaV humano. Uma solução contendo anticorpo 200 nM ou uma solução misturada contendo anticorpo 200 nM e antí- geno 200 nM foi injetada como o analito; e foi deixada interagir com FcγR IIIaV humano imobilizado no chip sensor. Posteriormente, uma solução de Glicina-HCl 10 mmol/L, pH 2,5 foi injetada para regenerar o chip sensor. Um tampão CaCl2 1,2 mmol/L / tween20 0,05%, ACES 20 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, pH 7,4 foi usado como tampão de corrida, e ligação entre o complexo imune anticorpo-antígeno e FcγR foi medida a 25°C.
[02080] Os resultados de análises de ligação de reação de uma so- lução contendo o anticorpo ou uma solução de anticorpo-antígeno mis- turados com FcγR IIIaV humano são mostrados na Fig. 24. Ao concen- trar-se na dissociação, a Fig. 24 mostra sensorgramas nos quais os níveis de ligação foram normalizados a 100. Embora Fv4-IgG1 se ligue a IL6R, não forma um complexo imune. Por isso, nenhuma diferença foi observada entre dissociação na reação de uma solução contendo anticorpo e FcγR e dissociação quando uma mistura anticorpo- antígeno foi usada. Entretanto, quando se permitiu que uma solução misturada de hIgE e Xolair (J. Pharmacol. Exp. Ther. (1996) 279 (2) 1000-1008), que foram relatados formar um complexo imune, se ligas- se a FcγR, foi observado que a dissociação de FcγR era mais lenta do que quando se permitiu que Xolair sozinho se ligasse a FcγR. Além disso, quanto ao clone 278-IgG1, que foi confirmado formar um com- plexo imune usando cromatografia de exclusão de tamanho (filtração em gel) no Exemplo 4, quando se permitiu que uma solução misturada do clone 278-IgG1 e um antígeno (hIgE) se ligasse a FcγR, a dissocia- ção de FcγR ficou mais lenta do que quando se permitiu que o clone 278-IgG1 sozinho se ligasse a FcγR. Além disso, quando se permitiu que uma solução misturada de GA2-IgG1 e hIgA se ligasse a FcγR, a dissociação de FcγR também ficou mais lenta do que quando GA2-
IgG1 sozinho foi permitido ligar-se a FcγR. Além disso, quando se permitiu que uma solução misturada de Fv4-IgG1, PHX-IgG1, e antí- geno (IL6R) se ligasse com FcγR, a dissociação de FcγR também fi- cou mais lenta do que quando se permitiu que Fv4-IgG1 ou PHX-IgG1 se ligassem a FcγR.
[02081] Consequentemente, quando o antígeno ou a molécula de ligação ao antígeno compreendida em um complexo imune contêm um domínio de ligação de FcγR como uma região constante de imunoglo- bulina, o complexo imune liga-se a FcγR com avidez. Por isso, desco- briu-se que um método para avaliar o retardo na dissociação de FcγR quando se permite que uma solução misturada de uma molécula de ligação ao antígeno contendo um domínio de ligação de FcγR ou simi- lares e seu antígeno se ligue a FcγR, ou quando se permite que uma solução misturada de um antígeno que contém um domínio de ligação de FcγR e uma molécula de ligação ao antígeno que se liga a este an- tígeno se ligue a FcγR, quando comparado com quando uma molécula que contém um domínio de ligação de FcγR como uma imunoglobulina se permite que a região constante se ligue por si mesmo a FcγR, era um método eficaz para avaliar a formação de complexos imunes que compreendem uma molécula de ligação ao antígeno e um antígeno. Mostrou-se que a avaliação supracitada de complexos imunes usando a dissociação de FcγR como critérios era eficaz em caso de comple- xos imunes formados por um anticorpo contra um antígeno ligado por uma pluralidade de monômeros, e também em caso de complexos i- munes formados por um antígeno monomérico e uma pluralidade de anticorpos que se ligam a epítopos diferentes. Exemplo 16 Avaliação de ligação de um complexo imune com FcRn usando Biacore 16-1. Quanto a ligação de um complexo imune com FcRn
[02082] Em um método para avaliar a formação de complexos imu-
nes que compreendem uma molécula de ligação ao antígeno e um an- tígeno, quando o antígeno ou a molécula de ligação ao antígeno com- preendida em um complexo imune contêm um domínio de ligação de FcRn como uma região constante de imunoglobulina, o complexo imu- ne liga-se a FcRn com avidez. Por isso, a formação de um complexo imune compreendendo um domínio de ligação de FcRn pode ser con- firmada por um método usando a propriedade da ligação de FcRn mais forte (em particular, a propriedade da dissociação mais lenta) do que a molécula de ligação ao antígeno somente ou o antígeno sozinho (Journal of Immunology (2010) 184 (4) 1968-1976). Entretanto, nos métodos informados até o momento, ligação entre FcRn e o domínio de ligação de FcRn foi avaliado sob condição de pH 6,0. Esta condição somente não é diferente da condição in vivo, mas também é imprópria para avaliar amostras das quais a avidez se modifica com a modifica- ção no pH. Tal condição pode ter sido usada porque ligação no pH 7,4 não pode ser avaliada devido à avidez muito baixa entre FcRn humano e IgG1 humana. Dessa forma, se a avaliação de complexos imunes sob uma condição pH 7,4, que é mais próxima da condição in vivo, é possível ser examinada. 16-2. Preparação de anticorpos e antígenos para avaliação e FcRn
[02083] Fv4-F22 usado na avaliação é uma variante da região cons- tante da cadeia pesada de Fv4-IgG1 (descrito no Exemplo 14). Xolair- F22 é uma variante da região constante da cadeia pesada de Xolair (Novartis). Uma sequência de DNA que codifica Fv4-F22 (cadeia pe- sada SEQ ID NO: 68, e cadeia leve SEQ ID NO: 60) e uma sequência de DNA que codifica Xolair-F22 (cadeia pesada SEQ ID NO: 69, e ca- deia leve SEQ ID NO: 70) foram inseridas em um plasmídeo de ex- pressão de célula animal por um método conhecido pelos especialistas na técnica. As variantes de anticorpo foram expressas de acordo com o método descrito acima (descrito no Exemplo 1) usando células ani-
mais introduzidas com o plasmídeo, e suas concentrações foram de- terminadas após purificação. Clone 278-IgG1 (preparado no Exemplo 4), Fv4-IgG1 (preparado no Exemplo 14), e PHX-IgG1 (preparado no Exemplo 14) foram preparados pelos métodos mencionados acima.
[02084] A hIgE (hIgE(Asp6), preparada no Exemplo 5) e IL6R (pre- parado no Exemplo de Referência 1) usados para a avaliação foram preparados pelos respectivos métodos acima mencionados.
[02085] FcRn humano e FcRn de camundongo foram preparados pelos métodos descritos nos Exemplos de Referência 3 e 4, respecti- vamente. 16-3. Avaliação de ligação de um complexo imune com FcRn humano
[02086] A ligação de um complexo imune anticorpo-antígeno com FcRn humano foi avaliada usando Biacore T100 (GE Healthcare).
[02087] Uma solução contendo um anticorpo sozinho ou uma solu- ção de anticorpo-antígeno misturados mostrada na Tabela 13 foram injetadas como um analito no chip Sensor CM4 (GE Healthcare) para o qual uma quantidade adequada de FcRn humano (hFcRn) tinha sido imobilizada por um método de acoplamento de amina, e permitiu-se que a interação se realizasse com hFcRn no chip sensor. Posterior- mente, uma solução de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 9,0 ou pH 9,5 foi injetada para regenerar o chip sensor. Um tampão Na-fosfato 50 mmol/L (ácido fosfórico), NaCl 150 mmol/L, Tween20 0,05%, pH 7,4 foi usado como o tampão de corrida, e ligação entre o complexo imune anticorpo-antígeno e FcRn foi medido a 25°C. Tabela 13 Nome da amostra Anticorpo Antígeno Fv4-F22 Fv4-F22 (10 µg/mL) - Fv4-F22 + IL6R Fv4-F22 (10 µg/mL) hsIL6R (2,5 µg/mL) Xolair-F22 Xolair-F22 (10 µg/mL) - Xolair-F22 + IgE Xolair-F22 (10 µg/mL) hIgE (Asp6) (11,2 µg/mL)
[02088] Os resultados de análises de ligação, quando se permitiu que uma solução contendo o anticorpo ou uma solução de anticorpo- antígeno misturados reagisse com hFcRn, são mostrados na Fig. 25. Ao concentrar-se na dissociação, a Fig. 25 mostra sensorgramas nos quais os níveis de ligação foram normalizados a 100. Embora Fv4-F22 se ligue com IL6R, não forma um complexo imune contendo uma plu- ralidade de moléculas que carreiam a regiões constantes de imuno- globulina; e dessa forma nenhuma diferença foi observada entre dis- sociação na reação de uma solução contendo anticorpo e FcRn e dis- sociação quando uma solução anticorpo-antígeno misturada foi usada.
Entretanto, foi relatado que quando uma solução misturada de hIgE e Xolair-F22 carreando a região variável de Xolair forma um complexo imune com hIgE (J.
Pharmacol.
Exp.
Ther. (1996) 279 (2) 1000-1008) foi permitido que se ligasse a FcRn, dissociação de FcRn foi observa- da ser mais lenta do que a dissociação de FcRn quando Xolair-F22 sozinho estava ligado a FcRn.
O acima mencionado mostrou que até sob condição do pH 7,4, hFcRn ligação pode ser detectado usando anticorpos com ligação aumentada a hFcRn.
Quando a molécula de ligação ao antígeno ou o antígeno compreendido em um complexo i- mune contêm um domínio de ligação de FcRn como uma região cons- tante de imunoglobulina, o complexo imune liga-se mais fortemente a FcRn.
Por isso, descobriu-se que um método para avaliar o retardo na dissociação de FcRn quando se permite que uma solução misturada de uma molécula de ligação ao antígeno contendo um domínio de li- gação de FcRn ou similares e seu antígeno se ligue a FcRn, ou quan- do se permite que uma solução misturada de um antígeno que contém um domínio de ligação de FcRn e uma molécula de ligação ao antíge- no que se liga a este antígeno se ligue a FcRn, comparando com quando uma molécula que contém um domínio de ligação de FcRn como uma imunoglobulina se permite que a região constante ou simi-
lares se liguem por si mesmo a FcRn, era um método eficaz para ava- liar a formação de complexos imunes compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno e um antígeno. 16-4. Avaliação de ligação de um complexo imune de FcRn usando Biacore
[02089] Em 16-3, a ligação de FcRn de complexos imunes conten- do variantes de regiões constantes de imunoglobulina com ligação de hFcRn aumentada foi avaliada. Uma vez que IgG humana nativa pode ligar-se mais fortemente a FcRn humano do que ao FcRn de camun- dongo (Int. Immunol. (2001) 13 (12), 1551-1559), ligação de um anti- corpo contendo região constante de IgG humana nativa ao FcRn de camundongo foi avaliado examinar se a avaliação de uma formação de complexo imune é possível sem modificar a região constante de imunoglobulina.
[02090] A ligação de um complexo anticorpo-antígeno imune com FcRn foi avaliada usando Biacore T100 (GE Healthcare). Uma solução contendo somente anticorpos ou uma solução de anticorpo-antígeno misturados como mostrada na Tabela 14 foi injetada como um analito para o chip Sensor CM4 (GE Healthcare) que foi imobilizado com uma quantidade adequada do FcRn de camundongo (mFcRn) por um mé- todo de acoplamento de amina, e permitiu-se que a interação se reali- zasse com mFcRn no chip sensor. Posteriormente, uma solução de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 9,0 ou pH 9,5 foi injetada para re- generar o chip sensor. Um tampão Na-fosfato 50 mmol/L (ácido fosfó- rico), NaCl 150 mmol/L, Tween20 0,05%, pH 7,4 foi usado como o tampão de corrida, e ligação entre o complexo imune anticorpo- antígeno e FcRn foi medida a 25°C.
Tabela 14 Nome da amostra Anticorpo Antígeno Xolair Xolair - IgG1 (50 µg/mL) - Xolair + hIgE (Asp6) Xolair - IgG1 (50 µg/mL) hIgE (Asp6) (56 µg/mL) Clone 278 278 Clone 278 - IgG1 gG1 (50 µg/mL) - Clone 278 278 + hIgE (Asp6) Clone 278 - IgG1 - F22 (50 µg/mL) hIgE (Asp6) (56 µg/mL) Fv4-IgG1 Fv4 - IgG1 (50 µg/mL) - Fv4-IgG1 + IL6R Fv4 - IgG1 (50 µg/mL) hsIL6R (12,5 µg/mL) PHX-IgG1 PHX - IgG1 (50 µg/mL) - PHX-IgG1 + IL6R PHX - IgG1 (50 µg/mL) hsIL6R (12,5 µg/mL) Fv4-IgG1 + PHX-IgG1 PHX - IgG1 (25 µg/mL) + Fv4 - IgG1 (25 - µg/mL) Fv4-IgG1 + PHX-IgG1+ IL6R PHX - IgG1 (25 µg/mL) + Fv4 - IgG1 (25 hsIL6R (12,5 µg/mL) µg/mL)
[02091] Os resultados de análises de ligação, quando se permitiu que uma solução contendo somente anticorpos ou uma solução de anticorpo-antígeno misturados reagissem com mFcRn, são mostrados nas Figs. 26 e 27. Ao concentrar-se na dissociação, as Figuras 26 e 27 mostram sensorgramas nos quais os níveis de ligação foram normali- zados a 100. Quando se permitiu que uma solução misturada de um antígeno (hIgE) e o clone 278-IgG1, que foi confirmado formar um complexo imune pela cromatografia de exclusão de tamanho (filtração em gel) no Exemplo 4, se ligasse com mFcRn, a dissociação de mF- cRn também ficou mais lenta do que quando se permitiu que o clone 278-IgG1 sozinho se ligasse a mFcRn. Além disso, quando se permitiu que uma solução misturada de hIgE e Xolair, que foi relatada formar um complexo imune (J. Pharmacol. Exp. Ther. (1996) 279 (2) 1000- 1008), se ligasse com mFcRn, foi observado que a dissociação de mFcRn ficava mais lenta do que quando se permitiu que Xolair sozinho se ligasse a mFcRn (Fig. 26). Por outro lado, diferença não foi obser- vada entre a dissociação de mFcRn quando se permitiu que uma solu- ção contendo Fv4-IgG1 se ligasse com mFcRn e dissociação de mF- cRn quando se permitiu que uma solução misturada de Fv4-IgG1 e
IL6R se ligasse com mFcRn. Além disso, a diferença não foi observa- da entre a dissociação de mFcRn quando se permitiu que uma solução que contém PHX-IgG1 se ligasse com mFcRn e dissociação de mF- cRn quando se permitiu que uma solução misturada de PHX-IgG1 e IL6R se ligasse com mFcRn (Fig. 27). Isto pode ser porque a unidade de ligação antigênica é uma em IL6R ao se ligar a uma região variável contida em Fv4-IgG1; e quando Fv4-IgG1 sozinho é usado como a molécula de ligação ao antígeno para IL6R, um complexo imune com- preendendo duas ou mais moléculas Fv4-IgG1 de uma molécula de IL6R não é formado. Uma vez que a unidade de ligação antigênica também é uma em IL6R ao ligar-se a uma região variável em PHX- IgG1, há somente um epítopo em IL6R; e por isso se acredita que quando PHX-IgG1 sozinho é usado como uma molécula de ligação ao antígeno e visa IL6R, um complexo imune compreendendo duas ou mais moléculas de PHX-IgG1 de uma molécula de IL6R não é forma- do. Neste pedido, quando se permitiu que uma solução misturada de IL6R, e Fv4-IgG1 e PHX-IgG1, que são encontrados no Exemplo 14 tendo epítopos que são diferentes entre si, se ligasse a mFcRn, a dis- sociação de mFcRn ficou mais lenta do que quando se permitiu que uma solução que contém o anticorpo Fv4-IgG1 e o anticorpo PHX- IgG1 (somente anticorpos) se ligasse com mFcRn. Tal fenômeno de dissociação mais lenta é similar ao fenômeno observado com o clone
278. Isto indica que quando um tipo único da molécula de ligação ao antígeno é usado para a molécula de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno alvo, mesmo se a unidade de ligação antigênica for uma, a unidade de ligação antigênica do antígeno pode ser modificada para duas ou mais usando uma combinação de moléculas de ligação ao anticorpo que têm epítopos diferentes entre si como moléculas de liga- ção ao antígeno que visam o antígeno; e como resultado, um comple- xo imune contendo duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno pode ser formado.
[02092] O mencionado acima mostrou que usando FcRn de ca- mundongo, até uma molécula de IgG1 humana nativa sem modifica- ções que afetariam a interação com FcRn pode ser avaliada para liga- ção de FcRn sob condição de pH 7,4 que é o mesmo como na condi- ção in vivo. Além disso, quando uma molécula de ligação ao antígeno ou um antígeno contêm um domínio de ligação de FcRn como uma região constante de imunoglobulina, o complexo imune liga-se forte- mente com FcRn; por isso, a formação de complexo imune pode ser confirmada avaliando o retardo na dissociação de FcRn de um com- plexo imune compreendendo uma pluralidade de moléculas contendo um domínio de ligação de FcRn como uma região constante de imu- noglobulina comparando com a dissociação de FcRn de uma molécula contendo um domínio de ligação de FcRn de uma região constante de imunoglobulina. Confirmou-se que a avaliação supracitada da forma- ção de complexo imune usando FcRn pode ser usado para verificar a formação tanto de um complexo imune formado de um antígeno com- preendendo uma pluralidade de monômeros ligados como de um anti- corpo que se liga a este antígeno e um complexo imune formado de um antígeno monomérico e uma pluralidade de anticorpos tendo epí- topos de ligação diferentes entre si que se ligam a este antígeno. Exemplo de Referência 1 Preparação de receptor de IL-6 humano so- lúvel (hsIL-6R)
[02093] Uma forma recombinante de receptor de IL-6 humano, que é um antígeno, foi preparada como se segue. Uma linhagem de CHO que constantemente expressa um receptor de IL-6 humano solúvel (a seguir designado como hsIL-6R) composto da sequência de aminoáci- dos do primeiro ao 357º aminoácido do terminal N como relatado em J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968 foi construído usando um método co- nhecido pelos especialistas na técnica. hsIL-6R foi expresso cultivando esta linhagem de CHO. hsIL-6R foi purificado do sobrenadante de cul- tura da linhagem de CHO resultante por um processo de etapa dupla que envolve cromatografia de coluna Blue Sepharose 6 FF e cromato- grafia de coluna de filtração em gel. A fração que eluiu como o pico principal na etapa final foi usada como o produto purificado do final. Exemplo de Referência 2 Preparação de FcγRIIIaV humano marcado com histidina
[02094] FcγRIIIaV humano marcado com histidina foi preparado pe- lo seguinte método. Em primeiro lugar, um gene do domínio extracelu- lar de FcγR foi sintetizado por um método bem conhecido pelos espe- cialistas na técnica. Então, a sequência de cada FcγR foi produzida baseada na informação registrada no NCBI. Especificamente, FcγRIIIa foi produzido baseado na sequência do No. de Acesso NCBI NM_001127593.1, e um marcador His foi ligado ao terminal C. Além disso, o polimorfismo é conhecido por FcγRIIIa; entretanto, a produção foi realizada referindo-se a J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcγRIIIa.
[02095] Os fragmentos gênicos obtidos foram inseridos em um ve- tor de expressão de células animais, e os vetores de expressão foram produzidos. Os vetores de expressão produzidos foram introduzidos transientemente em células FreeStyle293 derivadas da linhagem de células cancerosas de rim embrionário humano (Invitrogen) para ex- pressar as proteínas de interesse. As células foram cultivadas, e após coleta do sobrenadante de cultura obtido, que foi passado por um filtro de 0,22 m para obter o sobrenadante de cultura. Em princípio, os so- brenadantes de cultura obtidos foram purificados nas quatro etapas seguintes. As etapas realizadas foram cromatografia de coluna de tro- ca catiônica (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia de coluna de afinidade (HisTrap HP) para o marcador His na etapa 2, cromato- grafia de coluna de filtração em gel (Superdex200) na etapa 3 e cro-
matografia asséptica na etapa 4. As proteínas purificadas foram sub- metidas a medidas de absorvância em 280 nm usando um espectrofo- tômetro; e dos valores obtidos, as concentrações das proteínas purifi- cadas foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado usando métodos como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423). Exemplo de referência 3 Preparação de FcRn humano solúvel (hFcRn)
[02096] FcRn humano forma um complexo com β2-microglobulina. Os iniciadores de Oligo-DNA foram projetados baseados na sequência gênica de FcRn humano relatada (J Exp Med. 1994 Dec 1; 180 (6): 2377-81). Um cDNA foi amplificado por PCR de um cDNA humano (cDNA de Placenta Humana Marathon-Ready, Clontech) usando os iniciadores projetados. O cDNA amplificado que codifica o domínio ex- tracelular que contém a sequência sinal (Met1-Leu290) foi inserido em um vetor de expressão de célula animal. Similarmente, os iniciadores foram projetados para β2-microglobulina baseada na sequência de β2- microglobulina humana relatada, e o cDNA foi amplificado por PCR. O fragmento de cDNA Met1-Met119 contendo uma sequência sinal foi amplificado e inserido em um vetor de expressão de células animais.
[02097] FcRn humano solúvel (chamado de hFcRn) foi preparado de acordo com o procedimento abaixo. O vetor para expressar FcRn humano (SEQ ID NO: 71) e o vetor para expressar β2-microglobulina (SEQ ID NO: 72) foram transduzidos em células HEK293H (Invitrogen) pelo método de lipofecção usando PEI (Poliscience). As células trans- duzidas foram cultivadas, e a solução de cultura foi coletada. FcRn humano foi purificado da cultura coletada por cada um dos métodos cromatográficos, IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) e HiTrap Q HP (GE Healthcare) (J Immunol. 2002 Nov 1; 169 (9): 5171-80). Exemplo de referência 4 Preparação de FcRn solúvel de camundongo (mFcRn)
[02098] FcRn de camundongo solúvel foi preparado de uma manei- ra similar a FcRn humano solúvel. Em primeiro lugar, um gene que co- difica o domínio extracelular do FcRn de camundongo e um gene que codifica β2-microglobulina de camundongo foi sintetizado por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Para esta operação, se- quências de FcRn de camundongo e de β2-microglobulina camundon- go foram produzidas baseadas na informação registrada no NCBI. Es- pecificamente, para FcRn de camundongo, um fragmento gênico que codifica os aminoácidos das posições 1 a 290 contendo a sequência sinal foi produzido como o domínio extracelular baseado na sequência de acesso NCBI # NP_034319.2 (SEQ ID NO: 73). Além disso, para β2-microglobulina, um fragmento gênico foi produzido baseado na se- quência do acesso NCBI # NP_033865 (SEQ ID NO: 74). Um vetor de expressão foi produzido inserindo os fragmentos gênicos obtidos em um vetor de expressão de células animais. O vetor de expressão pro- duzido foi introduzido transientemente em células FreeStyle 293 deri- vadas de célula de carcinoma de rim embrionário humano (Invitrogen) para expressar a proteína de interesse. As células transduzidas foram cultivadas, e a solução de cultura foi coletada. O FcRn de camundon- go foi purificado da cultura coletada por cada um dos métodos croma- tográficos, IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) e Su- perdex 200 (GE Healthcare). Exemplo de referência 5 Produção de uma molécula de ligação ao an- tígeno com atividade mais alta de ligação de FcγR do que aquela de região de Fc de IgG humana nativa e atividade de ligação de FcRn humano aumentada sob uma condição de pH acídica (5-1) Produção de um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano com li- gação aumentada a FcγR de camundongo
[02099] VH3-IgG1-F1087 (SEQ ID NO: 75), que é formado substitu- indo Asp por Lys na posição 326 (numeração EU) em VH3-IgG1 e
VH3-IgG1-F1182 (SEQ ID NO: 76), que é formado substituindo Asp por Ser na posição 239, e Glu por Ile na posição 332 (numeração EU) em VH3-IgG1, foram produzidos como moléculas de ligação ao antígeno com ligação aumentada ao FcγR de camundongo. Fv4-IgG1-F1087 contendo VH3-IgG1-F1087 como cadeia pesada e VL3-CK (SEQ ID NO: 77) como cadeia leve e Fv4-IgG1-F1182 contendo VH3-IgG1- F1182 como cadeia pesada e VL3-CK como cadeia leve foram produ- zidos usando o método do Exemplo de Referência 2. (5-2) Confirmação de atividade de ligação de FcγR de camundongo
[02100] Foram produzidos VH3/L (WT)-IgG1-F1087 e VH3/L (WT)- IgG1-F1182, que contêm VH3-IgG1-F1087 e VH3-IgG1-F1182 respec- tivamente como a cadeia pesada e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 78) como a cadeia leve. As atividades de ligação de FcγR de camundongo des- tes anticorpos e VH3/L (WT)-IgG1-F1022 foram avaliadas, e os resul- tados é mostrado na Tabela 15. O número aumentado de vezes na ati- vidade de ligação de FcγR de camundongo de cada uma das variantes em comparação com aquela de IgG1 antes da modificação é mostrado na Tabela 16. Tabela 15 Nome da variante KD (M) mFc γ RI mFc γ RIIb mFc γ RIII mFc γ RIV IgG1 5,3E-08 9,8E-07 2,4E-06 8,6E-08 F1022 7,6E-09 1,0E-08 5,5E-09 1,4E-07 F1087 2,9E-08 5,6E-08 5,2E-08 3,3E-07 F1182 2,4E-09 1,1E-07 4,8E-07 5,3E-10 Tabela 16 Nome da variante Proporção de ligação à IgG1 mFc γ RI mFc γ RIIb mFc γ RIII mFc γ RIV IgG1 1,0 1,0 1,0 1,0 F1022 7,0 93,6 440,5 0,6 F1087 1,8 17,5 46,2 0,3 F1182 22,1 9,1 5,0 162,3 Aplicabilidade industrial
[02101] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção permitem a aceleração da eliminação de antígenos com duas ou mais unidades de ligação antigênicas do plasma, sendo equipadas do atri- buto de formar grandes complexos imunes que compreendem antíge- nos com duas ou mais unidades de ligação antigênicas (epítopos) e duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticor- pos). As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção tam- bém permitem aceleração adicional da eliminação dos antígenos equi- pados com uma atividade de ligação ao antígeno dependente de íons além dos atributos supracitados.
Equipado de tais atributos técnicos, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção tornam-se muito úteis como produtos farmacêuticos para tratar doenças ou sin- tomas (como câncer e doença inflamatória).

Claims (54)

REIVINDICAÇÕES
1. Uso de uma molécula de ligação ao antígeno que com- preende (i) uma região de Fc e (ii) dois ou mais domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domínios é um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica, e em que a molécula de ligação ao antígeno pode formar um complexo imune que compreende (a) duas ou mais das moléculas de ligação ao antígeno e (b) dois ou mais antígenos, em que os antígenos compre- endem duas ou mais unidades de ligação antigênica, o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medica- mento para eliminação dos antígenos do plasma.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condição de concentração iônica é uma condição de concentração de íon cálcio.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de íon cálcio que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de íon cálcio.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a condição de concentração iônica é uma condição de pH.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação de antígeno em uma faixa de pH acídica que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno em uma condição de faixa de pH neutra.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os antígenos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênica são multímeros.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o antígeno é qualquer um de GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP- 12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF- alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (li- gante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligan- te LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligan- te APT1), TNFSF7 (ligante de CD27 CD70), TNFSF8 (ligante de CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específica e IL-8.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os antígenos compreendendo duas ou mais unidades de ligação antigênica são monômeros.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ligação ao antígeno são uma molécula multiespecífica ou multiparatópica de ligação ao an- tígeno ou coquetel de moléculas de ligação ao antígeno.
10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH acídica em comparação com aquela da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é uma região de Fc com uma substitui- ção de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo dos aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447 (numera- ção EU) na sequência de aminoácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em: Leu para o aminoácido da posição 238; Leu para o aminoácido da posição 244; Arg para o aminoácido da posição 245; Pro para o aminoácido da posição 249; Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250; Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido da posição 251; Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 252; Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254; Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido da posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 256;
Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido da posição 257; Asp para o aminoácido da posição 258; Ser para o aminoácido da posição 260; Leu para o aminoácido da posição 262; Lys para o aminoácido da posição 270; Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 283; Asn para o aminoácido da posição 285; Phe para o aminoácido da posição 286; Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288; Val para o aminoácido da posição 293; Ala, Glu, Gln, ou Met para o aminoácido da posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoá- cido da posição 311; Pro para o aminoácido da posição 309; Ala, Asp, ou Pro para o aminoácido da posição 312; Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314; Lys para o aminoácido da posição 316; Pro para o aminoácido da posição 317; Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido da posição 332; Asn, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 339; Pro para o aminoácido da posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido da po- sição 343;
Arg para o aminoácido da posição 375; Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido da posição 376; Lys para o aminoácido da posição 377; Asp, Asn ou Val para o aminoácido da posição 378; Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 387; Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389; Asn para o aminoácido da posição 423; Asn para o aminoácido da posição 427; Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 430; His ou Asn para o aminoácido da posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da po- sição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436; Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido da posição 438; Lys para o aminoácido da posição 440; e
Lys para o aminoácido da posição 442; Ile, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 308; como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é uma região de Fc com uma atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH neutra em comparação com aquela da região de Fc re- presentada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é uma região de Fc com uma substitui- ção de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo das posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na sequência de aminoáci- dos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em: Met para o aminoácido da posição 237; Ile para o aminoácido da posição 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoáci- do da posição 250; Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252; Thr para o aminoácido da posição 254; Glu para o aminoácido da posição 255; Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257; His para o aminoácido da posição 258; Ala para o aminoácido da posição 265; Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286; His para o aminoácido da posição 289; Ala para o aminoácido da posição 297; Ala para o aminoácido da posição 303; Ala para o aminoácido da posição 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308; Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg para o aminoácido da posição 309; Ala, His ou Ile para o aminoácido da posição 311; Ala ou His para o aminoácido da posição 312; Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314; Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315; Ala para o aminoácido da posição 317; Val para o aminoácido da posição 332; Leu para o aminoácido da posição 334; His para o aminoácido da posição 360; Ala para o aminoácido da posição 376; Ala para o aminoácido da posição 380; Ala para o aminoácido da posição 382; Ala para o aminoácido da posição 384; Asp ou His para o aminoácido da posição 385; Pro para o aminoácido da posição 386; Glu para o aminoácido da posição 387;
Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389; Ala para o aminoácido da posição 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 428; Lys para o aminoácido da posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436; como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região de Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 13, 14, 15 e 16.
17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a região de Fc inclui uma região de Fc que tem uma atividade de ligação ao receptor de Fcγ mais alta do que aquela da região de Fc de IgG humana nativa.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos que são diferentes dos aminoácidos da região de Fc de IgG humana nativa selecionada a partir do grupo consistindo das posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 (numeração EU).
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compreende na sua sequência de aminoácidos pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222; Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224; Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228; Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230; Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 231; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239; Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 240; Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi-
ção 241; Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243; His para o aminoácido da posição 244; Ala para o aminoácido da posição 245; Asp, Glu, seu ou Tyr para o aminoácido da posição 246; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido da posição 247; Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249; Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250; Phe para o aminoácido da posição 251; Phe, Met, ou Tyr para o aminoácido da posição 254; Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255; Ala, Met, ou Pro para o aminoácido da posição 256; Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 260; Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262; Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 263; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264; Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265; Ala, Ile, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 266; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267; Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272; Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274; Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278; Ala para o aminoácido da posição 279; Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280; Asp, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 281; Glu, Gly, Lys, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 282; Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283; Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284; Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 285; Glu, Gly, Pro, ou Tyr para o aminoácido da posição 286; Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288; Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 290;
Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291; Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 292; Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 295; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido da posição 301; Ile para o aminoácido da posição 302; Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303; Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304; Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305; Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 311; Phe para o aminoácido da posição 313; Leu para o aminoácido da posição 315;
Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317; His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido da posição 318; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322; Ile para o aminoácido da posição 323; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325; Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329; Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330; Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido da posição 333; Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 334;
Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335; Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336; Glu, His ou Asn para o aminoácido da posição 337; Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339; Ala ou Val para o aminoácido da posição 376; Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377; Asp para o aminoácido da posição 378; Asn para o aminoácido da posição 379; Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380; Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382; Glu para o aminoácido da posição 385; Thr para o aminoácido da posição 392; Leu para o aminoácido da posição 396; Lys para o aminoácido da posição 421; Asn para o aminoácido da posição 427; Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428; Met para o aminoácido da posição 429; Trp para o aminoácido da posição 434; Ile para o aminoácido da posição 436; e Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440; como indicado pela numeração EU.
20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a região de Fc tem uma atividade de ligação mais alta em direção a um receptor de Fcγ inibitório do que em direção a um receptor de Fcγ ativador.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o receptor de Fcγ inibitório é FcγRIIb humano.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracteri-
zado pelo fato de que o receptor de Fcγ ativador é FcγRIa humano, FcγRIIa (R) humano, FcγRIIa (H) humano, FcγRIIIa (V) humano ou FcγRIIIa (F) humano.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 22, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) na região de Fc é diferente do aminoácido na região de Fc de IgG humana nativa.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 da região de Fc é Asp ou o aminoácido da posição 328 da região de Fc é Glu como indicado pela numeração EU.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da região de Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados a par- tir do grupo consistindo em: Asp para o aminoácido da posição 233; Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234; Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237; Asp para o aminoácido da posição 239; Ala, Gln ou Val para o aminoácido da posição 267; Asn, Asp ou Glu para o aminoácido da posição 268; Gly para o aminoácido da posição 271; Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido da posição 326; Arg, Lys, ou Met para o aminoácido da posição 330; Ile, Leu, ou Met para o aminoácido da posição 323; e Asp para o aminoácido da posição 296; como indicado pela numeração EU.
26. Método de rastreamento de uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminação de um antígeno do plasma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica; (b) obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima; (c) ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc; (d) cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima; (e) isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima; (f) contato da molécula de ligação ao antígeno obtida em (e) acima com um antígeno; e (g) avaliação da formação de um complexo imune que compreende a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno.
27. Método para produção de uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminação de um antígeno do plasma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contato de um antígeno com uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma região de Fc e dois ou mais domí- nios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno tem uma atividade de ligação ao antígeno que va- ria dependendo de uma condição de concentração iônica; (b) avaliação de formação de um complexo imune compre- endendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno; (c) cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carrega um gene que codifica uma molécula de ligação ao antígeno que é confirmada formar um complexo imune em (b) acima; e
(d) isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (c) acima.
28. Método para produção de uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminação de um antígeno do plasma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica; (b) obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima; (c) ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc; (d) cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima; (e) isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima; (f) contato da molécula de ligação ao antígeno obtida em (e) acima com um antígeno; (g) avaliação de formação de um complexo imune compre- endendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno; (h) cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor que carrega um gene que codifica uma molécula de ligação ao antígeno que é confirmada formar um complexo imune em (g) acima; e (i) isolamento da molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (h) acima.
29. Método para produção de uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma função de eliminação de um antígeno do plasma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de um domínio de ligação ao antígeno do qual a atividade de ligação ao antígeno varia dependendo de uma condição de concentração iônica; (b) obtenção de um gene que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (a) acima; (c) ligação operacional do gene obtido em (b) acima com um gene que codifica uma região de Fc; (d) cultura de uma célula hospedeira compreendendo os genes operacionalmente ligados em (c) acima; e (e) isolamento de uma molécula de ligação ao antígeno de uma solução de cultura obtida em (d) acima; e em que o método compreende ainda contato da molécula de ligação ao antígeno obtida pelo método de produção com um antí- geno e avaliação da formação de um complexo imune compreendendo a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 29, caracterizado pelo fato de que a condição de concentra- ção de íons é uma condição de concentração de íons de cálcio.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno possui uma ati- vidade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentra- ção em íon cálcio que é menor do que a atividade de ligação ao antí- geno sob uma condição elevada de concentração em íon cálcio.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 31, caracterizado pelo fato de que a condição de concentra- ção de íons é uma condição de pH.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno possui uma ati- vidade de ligação ao antígeno em um intervalo de pH ácido que é mais baixa do que a atividade de ligação ao antígeno em condição de inter- valo de pH neutro.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 26 a 33, caracterizado pelo fato de que os antígenos que com- preendem duas ou mais unidades de ligação antigênicas são multíme- ros.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que o antígeno é qualquer um de GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 ( BMP-13, CDMP-2), GDF- 7 (BMP-12, CDMP-3), a GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (),TNF, TNF-alfa MIC-1, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFSF10 (TRAIL ligando Apo-2, LT2), TNFSF11 (TRANCE/ligante RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 ligante, DR3 ligante), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13b (BAFF BLyS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM ligante, LTG), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR ligante AITR ligante, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conec- tin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTB TNFC, p33), TNFSF4 (gp34 ligante OX40, TXGP1), TNFSF5 (ligante de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas l ligante Apo 1-l ligante, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27, CD70), TNFSF8 (ligante CD30, ligante CD153), TNFSF9 (CD137 ligante 4-1BB), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan espe- cífico e IL-8.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 33, caracterizado pelo fato de que os antígenos que com- preendem duas ou mais unidades de ligação antigênicas são monô- meros.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 36, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ligação ao antígeno são molécula de ligação ao antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas, ou uma mistura de moléculas de ligação ao antígeno.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 37, caracterizado pelo fato de que a região Fc está repre-
sentada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 14, 15, e 16.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 37, caracterizado pelo fato de a região Fc é uma região Fc com uma atividade de ligação ao FcRn reforçada sob um intervalo de condição ácida de pH comparada com a da região Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 14, 15, e 16.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de a região Fc é uma região Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que con- siste em aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, e 447 (numeração da UE) na sequência de aminoácidos da região Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 14, 15, e 16.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Leu para o aminoácido da posição 238; Leu para o aminoácido da posição 244; Arg para o aminoácido da posição 245; Pro para o aminoácido da posição 249; Gln ou Glu para o aminoácido da posição 250; Arg, Asp, Glu, Leu ou para o aminoácido da posição 251; Phe, Ser, Thr, Tyr ou para o aminoácido da posição 252; Ser ou Thr para o aminoácido da posição 254; Arg, Gly, Ile, ou Leu para o aminoácido da posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 256; Ala, Ile, Met, Asn, Ser, ou Val para o aminoácido da posição 257; Asp para o aminoácido da posição 258; Ser para o aminoácido da posição 260; Leu para o aminoácido da posição 262; Lys para o aminoácido da posição 270; Leu ou Arg para o aminoácido da posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, ou Tyr para o aminoácido da posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, ou Tyr para o aminoácido da posição 283; Asn para o aminoácido da posição 285; Phe para o aminoácido da posição 286; Asn ou Pro para o aminoácido da posição 288; Val para o aminoácido da posição 293; Ala, Glu, Gln, ou Met para o aminoácido da posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Vai, ou Trp para o aminoá- cido da posição 311; Pro para o aminoácido da posição 309; Ala, Asp, ou Pro para o aminoácido da posição 312; Ala ou Leu para o aminoácido da posição 314; Lys para o aminoácido da posição 316; Pro para o aminoácido da posição 317; Asn ou Thr para o aminoácido da posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, ou Trp para o aminoácido da posição 332; Asn, Thr, ou Trp para o aminoácido da posição 339; Pro para o aminoácido da posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr, ou Tyr para o aminoácido da posição 343; Arg para o aminoácido da posição 375; Gly, lie, Met, Pro, Thr, Val ou para o aminoácido da posição 376; Lys para o aminoácido da posição 377; Asp, Asn, ou Val para o aminoácido da posição 378; Ala, Asn, Ser, ou Thr para o aminoácido da posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp, ou Tyr para o ácidoamino da posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser, ou Thr para o aminoácido da posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, ou Thr para o aminoácido da posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser, ou Thr para o aminoácido da posi- ção 387; Asn, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 389; Asn para o aminoácido da posição 423; Asn para o aminoácido da posição 427; Leu, Met, Phe, Ser, ou Thr para o aminoácido da posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, ou Tyr para o aminoácido da posição 430; His ou Asn para o aminoácido da posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ou Ser para o aminoácido da posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp, ou Tyr para o aminoácido da posição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met, ou Thr para o aminoácido da posição 436; Lys, Leu, Thr, ou Trp para o aminoácido da posição 438;
Lys para o aminoácido da posição 440; e Lys para o aminoácido da posição 442; Ile, Pro, ou Thr para o aminoácido da posição 308; como indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região Fc representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 14, 15, e 16.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 37, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc com uma atividade FcRn-ligação reforçada sob uma condição de intervalo de pH neutro em relação ao da região Fc representada por qualquer uma das SEQ ID Nos: 13, 14, 15 e 16.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc é uma região Fc com uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo con- sistindo em posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334 , 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região Fc representada por qualquer um das SEQ ID Nos: 13, 14, 15 e 16.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc inclui pelo menos um ou mais aminoá- cidos selecionados do grupo consistindo em: Met para o aminoácido da posição 237; Ile para o aminoácido da posição 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 250; PHE, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 252; Thr para o aminoácido da posição 254; Glu para o aminoácido da posição 255; ASP, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido da posição 256;
Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido da posição 257; His para o aminoácido da posição 258; Ala para o aminoácido da posição 265; Ala ou Glu para o aminoácido da posição 286; His para o aminoácido da posição 289; Ala para o aminoácido da posição 297; Ala para o aminoácido da posição 303; Ala para o aminoácido da posição 305; Ala, Asp, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido da posição 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido da posição 309; Ala, His, ou Ile para o aminoácido da posição 311; Ala ou His para o aminoácido da posição 312; Lys ou Arg para o aminoácido da posição 314; Ala, Asp ou His para o aminoácido da posição 315; Ala para o aminoácido da posição 317; Val para o aminoácido da posição 332; Leu para o aminoácido da posição 334; His para o aminoácido da posição 360; Ala para o aminoácido da posição 376; Ala para o aminoácido da posição 380; Ala para o aminoácido da posição 382; Ala para o aminoácido da posição 384; Asp ou His para o aminoácido da posição 385; Pro para o aminoácido da posição 386; Glu para o aminoácido da posição 387;
Ala ou Ser para o aminoácido da posição 389; Ala para o aminoácido da posição 424; Ala, Asp, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para a posição de amino acidof 428; Lys para o aminoácido da posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido da posição 436; conforme indicado pela numeração EU na sequência de aminoácidos da região Fc representada por qualquer uma das SEQ ID Nos: 13, 14, 15 e 16.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 41, caracterizado pelo fato de que a região Fc inclui uma região Fc que tem uma atividade de ligação ao receptor Fcg maior do que o da região Fc de uma IgG humana nativa.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc compreende em sua sequência de aminoácidos pelo menos um ou mais aminoácidos que são diferentes dos aminoácidos da região Fc de IgG humana nativa selecionada do grupo consistindo nas posições, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237 , 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315 , 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 (numeração EU).
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracteriza-
do pelo fato de que a região Fc compreende em sua sequência de aminoácidos pelo menos um aminoácido selecionado do grupo consis- tindo em: Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 221; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 222; Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido da posição 223; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 224; Glu, Lys ou Trp para o aminoácido da posição 225; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 227; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 228; Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 230; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido da posição 231; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 232; Ala, Asp, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 233; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para ácido theamino de posição 234; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 235; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 236; ASP, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 238; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 239; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido da posição 240; Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi-
ção 241; Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 243; His para o aminoácido da posição 244; Ala para o aminoácido da posição 245; ASP, Glu, His, ou Tyr para o aminoácido da posição 246; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val, ou Tyr para o aminoácido da posição 247; Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido da posição 249; Glu ou Gln para o aminoácido da posição 250; Phe para o aminoácido da posição 251; Phe, Met ou Tyr para o aminoácido da posição 254; Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 255; Ala, Met ou Pro para o aminoácido da posição 256; Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido da posição 258; Asp, Glu, His, ou Tyr para o aminoácido da posição 260; Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido da posição 262; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido da posição 263; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 264; Ala, Gly, Leu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 265; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido da posição 266; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 267; Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 268; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 269;
Phe, glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 270; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 271; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 272; Phe ou Ile para o aminoácido da posição 273; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 274; Leu ou Trp para o aminoácido da posição 275; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 276; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 278; Ala para o aminoácido da posição 279; Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido da posição 280; Asp, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido da posição 281; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido da posição 282; Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido da posição 283; Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 284; Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 285; Glu, Gly, Pro ou Tyr para o aminoácido da posição 286; Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido da posição 288; Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o amino- ácido da posição 290;
Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido da po- sição 291; Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 292; Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 293; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 294; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para a posição de amino acidof 295; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido da posição 296; Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 297; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 298; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 299; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido da posição 300; Asp, Glu, His, ou Tyr para o aminoácido da posição 301; Ile para o aminoácido da posição 302; Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido da posição 303; Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido da posição 304; Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido da posição 305; Ala, Asp, Asn, Thr, Val, ou Tyr para o aminoácido da posi- ção 311; Phe para o aminoácido da posição 313; Leu para o aminoácido da posição 315;
Glu ou Gln para o aminoácido da posição 317; His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, ou Tyr para o amino- ácido da posição 318; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 320; Ala, Asp, Phe Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr pa- ra o aminoácido da posição 322; Ile para o aminoácido da posição 323; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 324; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 325; Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 326; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 327; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 328; ASP, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 329; Cys, Phe, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 330; Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 331; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 332; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val, ou Tyr para o aminoácido da posição 333; Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro ou Thr para o aminoácido da posição 334;
ASP, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 335; Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido da posição 336; Glu, His, ou Asn para o aminoácido da posição 337; Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido da posição 339; Ala ou Val para o aminoácido da posição 376; Gly ou Lys para o aminoácido da posição 377; Asp para o aminoácido da posição 378; Asn para o aminoácido da posição 379; Ala, Asn ou Ser para o aminoácido da posição 380; Ala ou Ile para o aminoácido da posição 382; Glu para o aminoácido da posição 385; Thr para o aminoácido da posição 392; Leu para o aminoácido da posição 396; Lys para o aminoácido da posição 421; Asn para o aminoácido da posição 427; Phe ou Leu para o aminoácido da posição 428; Met para o aminoácido da posição 429; Trp para o aminoácido da posição 434; Ile para o aminoácido da posição 436; e Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido da posição 440; como indicado pela numeração EU.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 44, caracterizado pelo fato de que a região Fc tem uma maior atividade de ligação em direção a um receptor inibidor de Fcγ do que em direção a um receptor de ativação de Fcγ.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o receptor inibidor de Fcγ é FcγRIIb humana.
50. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49, carac-
terizado pelo fato de que o receptor de ativação de Fcγ é FcγRIa hu- mana, FcγRIIa (R)humana, FcγRIIa (H) humana, FcγRIIIa (V) humana ou FcγRIIIa (F) humana.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 48 a 50, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) na região Fc é diferente do aminoácido na região Fc de IgG humana nativa.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que o aminoácido na posição 238 da região Fc é Asp ou o aminoácido da posição 328 da região Fc é Glu, como indicado pela numeração EU.
53. Método de acordo com a reivindicação 51 ou 52, carac- terizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da região Fc é composta pelo menos por um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Asp para o aminoácido da posição 233; Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 234; Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido da posição 237; Asp para o aminoácido da posição 239; Ala, Gln ou Val para o aminoácido da posição 267; Asn, Asp ou Glu para o aminoácido da posição 268; Gly para o aminoácido da posição 271; Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido da posição 326; Arg, Lys ou Met para o aminoácido da posição 330; Ile, Leu ou Met para o aminoácido da posição 323; e Asp para o aminoácido da posição 296; como indicado pela numeração EU.
54. Invenção, caracterizada pelo fato de que está em quaisquer formas de suas concretizações (por exemplo, produto, mé- todo, uso, kit, composição, etc.) ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada, ou ilustrada no pedido de patente como um todo, incluindo os exem- plos ilustrativos do mesmo.
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