ES2668895T3

ES2668895T3 - Variantes de Fc

Info

Publication number: ES2668895T3
Application number: ES12711513.7T
Authority: ES
Inventors: Zhi Liu; Gunasekaran Kannan; Wei Yan
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2018-05-23
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: AU2012229048B2; JP5972915B2; MX2013010469A; US20140112926A1; EP2686345B1; US11198732B2; CA2830254C; JP2014509857A; MX348071B; WO2012125850A1; CA2830254A1; US20200010545A1; JP2016172729A; AU2012229048A1; EP2686345A1

Abstract

Una proteína que contiene Fc que comprende una región Fc de IgG1 o IgG3 humana y una región de unión, en la que la región Fc comprende una cadena A y una cadena B, que cada una comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos relativas a una cadena polipeptídica de Fc humano tipo silvestres, seleccionadas de las siguientes, las cuales se numeran según el sistema de UE: E233L, L234I, L234Y, L235S, G236Y, S239D, S239E, S239N, S239T, F243M, F243L, F243V, F243I, K246W, K246E, K246S, K246V, K248Y, K248L, M252D, I253V, I253K, R255S, R255N, T256V, T256Q, E258S, E258V, H268E, H268K, A287F, K288T, K288I, K290G, K290F, K290S, K290W, K290Q, K290Y, E294L, Y296W, Y296L, S298A, S298C, S298T, V302Q, T307P, T307S, T307E, T307G, L309C, L309S, L309K, L309E, Q311M, N315A, N315S, A330H, A330F, A330M, I332E, K334L, K334V, K334A, K334M y A339T, en la que al menos uno de estos sitios de sustitución de aminoácidos difiere entre las cadenas A y B, en la que la proteína que contiene Fc se une a FcγRIIIA-158F y/o FcγRIIIA-158V humano con una KD de menos de o igual a una quinta parte de la KD con la cual una segunda proteína se une a FcγRIIIA-158F y/o FcγRIIIA-158V humano, y en la que la segunda proteína es la misma que la proteína que contiene Fc excepto que contiene una región Fc de IgG1 o IgG3 humana tipo silvestre sin sustituciones.

Description

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Número listado de secuencia: Descripción de la secuencia

que contiene las sustituciones E356K, D399K, L234Y, E294L y Y296W (que codifica un polipéptido de Fc de las variantes M77, M138, M142, W157 y W160)

SEQ ID NO:10: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:11: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, E233L, Q311M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante M138)

SEQ ID NO:12: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:11

SEQ ID NO:13: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, L2341, Q311M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante M142)

SEQ ID NO:14: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:15: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S298T y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W23)

SEQ ID NO:16: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:15

SEQ ID NO:17: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones E356K, D399K, L234Y, K290Y y Y296W (que codifica un polipéptido de Fc de las variantes W23, W141, W144, W165, W168, W187 y W189)

SEQ ID NO:18: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:17

SEQ ID NO:19: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, A330M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W141)

SEQ ID NO:20: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:21: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, A330F y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W144)

SEQ ID NO:22: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:21

SEQ ID NO:23: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, Q311M, A330M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W157)

SEQ ID NO:24: Secuencia de aminoácidos de la región Fc codificada por la SEQ ID NO:23

SEQ ID NO:25: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, Q311M, A330F y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W160)

SEQ ID NO:26: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:25

SEQ ID NO:27: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S298T, A330M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W165)

SEQ ID NO:28: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:27

SEQ ID NO:29: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S298T, A330F y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W168)

Número listado de secuencia: Descripción de la secuencia

SEQ ID NO:30: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:29

SEQ ID NO:31: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S239D, A330M y K334V (que codifica un polipéptido de Fc de la variante W187)

SEQ ID NO:32: Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de Fc codificada por la SEQ ID NO:31

SEQ ID NO:33: Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de Fc de IgG1 humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S239D, S298T y K334V (que codifica un

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conducir a destrucción celular a través de la acción de una cascada de proteínas que pueden actuar a través de cualquiera de las dos rutas principales. Véase, por ejemplo, Liszewski and Atkinson, Cap. 26 en FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3º ed., Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993, pp. 917-940.

5 “ADCP” se refiere a un proceso denominado fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo. En este proceso mediado por receptor Fc, las células diana a las cuales se unen los anticuerpos son tragadas por células fagocíticas, tales como macrófagos, monocitos, neutrófilos y células dendríticas. Los receptores Fc múltiples están implicados en este proceso. Richards y col., Mol. Cancer Ther. 7(8):2.517-2.527 (2008) describen un ensayo in vitro para ADCP.

Un “anticuerpo”, como significa en el presente documento, es una proteína que contiene al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera, en muchos casos una región variable de cadena pesada o ligera. Por tanto, el término “anticuerpo” abarca anticuerpos Fv de cadena única (scFv, que contiene regiones variables de cadena pesada y ligera unidas a un enlazador), anticuerpos Fab, F(ab)2’, Fab’, scFv:Fc (como se 15 describe en Carayannopoulos and Capra, Cap. 9 en FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3º ed., Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993, pp. 284-286) o anticuerpos enteros que contienen dos cadenas pesadas enteras y dos cadenas ligeras enteras, tales como anticuerpos IgG de origen natural encontrados en mamíferos. Id. Tales anticuerpos IgG pueden ser del isótopo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 y pueden ser anticuerpos humanos. Además, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos diméricos que contienen dos cadenas pesadas y no cadenas ligeras tales como los anticuerpos de origen natural encontrados en camellos y otras especies de dromedarios y tiburones. Véase, por ejemplo, Muldermans y col., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter y col., 2001, J. Biol. Chem. 276:26.285-90; Streltsov y col. (2005), Protein Science 14:2.901-2.909. Un anticuerpo puede ser monoespecífico (es decir, que se une a solamente un tipo de antígeno) o multiespecífico (es decir, que se une a más de un tipo de antígeno). En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser biespecífico (es decir, que se une a dos tipos

25 diferentes de antígeno). Además, un anticuerpo puede ser monovalente, bivalente o multivalente, significando que se puede unir a una o dos o más moléculas de antígeno a la vez. Algunos de los posibles formatos para tales anticuerpos incluyen anticuerpos enteros monoespecíficos o biespecíficos, anticuerpos monovalentes monoespecíficos (como se describe en la Solicitud Internacional WO 2009/089004 y la publicación americana 2007/0105199) que pueden inhibir o activar la molécula a la que se unen, Fv-Fc dimérico monoespecífico o biespecífico bivalente, scFv-Fc o Fc diacuerpo, scFv-Fc/Fc monovalentes monoespecíficos, y las proteínas de unión multiespecíficas e inmunoglobulinas de dominio variables duales descritas en la publicación americana 2009/0311253, entre muchos otros formatos de anticuerpo posibles.

Una “proteína de fusión Fc”, como significa en el presente documento, es una proteína que contiene una cadena

35 polipeptídica de Fc fusionada a otro polipéptido, que comprende una región de unión que se une a una molécula diana, y que no comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo. La región de unión de una proteína de fusión Fc puede comprender un polipéptido de no inmunoglobulina tal como una porción soluble de un receptor o uno o más péptidos que se unen a una molécula diana (tal como, por ejemplo, un “dominio monómero” como se define en el documento de patente americana 7.820.790 que se une a una proteína diana, la cual se puede seleccionar como se discute en el documento de patente americana 7.820.790), u otros polipéptidos. Otros polipéptidos que pueden ser parte de una región de unión de una proteína de fusión Fc incluyen polipéptidos que comprenden dominios andamio que se han distribuido al azar en ciertas posiciones y se someten a selección para la unión a una cierta molécula diana. Tales dominios andamio incluyen, por ejemplo, proteína 4 asociada a linfocito T (CTLA-4; Nuttall y col. (1999), Proteins 36:217-227), el domino Z de la proteína 1 de estafilococo (Nord y col. (1995),

45 Protein Eng. 8:601-608), proteína verde fluorescente, y el décimo dominio tipo III de la fibronectina humana (FN3; Koide y col. (1998), J. Mol. Biol. 284:1.141-1.151; Karatan y col. (2004), Chem. & Biol. 11:835-844). Las proteínas de fusión Fc, como otras proteínas que contienen cadenas polipeptídicas de Fc generalmente forman multímeros, los cuales pueden ser dímeros. Puesto que las regiones Fc descritas en el presente documento son generalmente heterodiméricas, tales proteínas de fusión Fc pueden formar heterodímeros. En tal caso, el polipéptido fusionado a la cadena polipeptídica de Fc puede ser diferente en cada una de las cadenas polipeptídicas que, juntas forman el heterodímero. Por tanto, una proteína de fusión Fc puede ser heterodimérica y biespecífica o monoespecíficas o multiespecífica.

Una “región de unión”, como significa en el presente documento, es una región de una proteína que contiene Fc

55 como se describe en el presente documento que se une a una molécula diana, tal como, por ejemplo, una proteína que se expresa a niveles altos sobre una célula cancerosa, sobre una célula que media una afección autoinmune o inflamatoria, sobre una célula infectada, sobre un agente infeccioso, o sobre una célula que media una función efectora inmune, por ejemplo, una célula NK. Una región de unión puede contener una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera o un polipéptido de no inmunoglobulina.

Un “scFv-Fc”, como significa en el presente documento, es un polipéptido que consiste en una región variable de cadena pesada y una ligera de un anticuerpo unido por un enlazador, que está seguido por una cadena polipeptídica de Fc de un anticuerpo, opcionalmente la región Fc de un anticuerpo IgG humano, tal como un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

65 Una “cadena pesada” entera, como significa en el presente documento, comprende una región variable de cadena

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Más particularmente, las proteínas de la invención pueden comprender una región Fc en la que las cadenas A y B comprenden las siguientes sustituciones: (1) K334V en una cadena polipeptídica de Fc y Y296W más S298C en la otra; (2) K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (3) L235S, S239D y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (4) L235S, S239D y K334V en una cadena 5 polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (5) Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, F243V y Y296W en la otra; (6) Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, E294L y Y296W en la otra, como en, por ejemplo, la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:10, respectivamente; (7) Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (8) S239D y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (9) S239D y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (10) F243V y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (11) F243V y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (12) E294L y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (13) E294L y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y S298C en la otra; (14) K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (15) K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y S298C en la otra; (16) K334V en una cadena 15 polipeptídica de Fc y E294L y Y296W en la otra; (17) K334V y S298C en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (18) K334V y S298I en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (19) K334V y S298T en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (20) K334V y S298V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (21) K334V y S298C en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y K290Y en la otra; (22) K334V y S298I en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y K290Y en la otra; (23) K334V y S298T en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y K290Y en la otra; (24) K334V y S298V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, Y296W y K290Y en la otra; (25) S298T y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra, como en, por ejemplo, la SEQ ID NO:16 y la SEQ ID NO:18, respectivamente; (26) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (27) A330F y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (28) Q311M y 25 A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, E294L y Y296W en la otra; (29) Q311M y A330F y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, E294L y Y296W en la otra; (30) S298T y A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (31) S298T y A330F y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (32) S239D y A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (33) S239D y S298T y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (34) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y K290Y y Y296W en la otra; (35) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y E294L y Y296W en la otra; (36) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; (37) E233L y Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, E294L y Y296W en la otra; (38) L234I y Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, E294L y Y296W en la otra; (39) E233L y A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y

35 L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (40) L234I y Q311M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y, K290Y y Y296W en la otra; (41) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y L234Y y Y296W en la otra; o (42) A330M y K334V en una cadena polipeptídica de Fc y K290Y y Y296W en la otra. Cualquiera de las proteínas anteriores también puede comprender alteración de heterodimerización como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, además pueden comprender K392D y K409D en una cadena polipeptídica de Fc y E356K y D399K en la otra.

Ejemplos de secuencias de aminoácidos de cadenas polipeptídicas de Fc, como se describe en el presente documento, incluyen las SEQ ID NO:8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 37, 39 y 41. Estas secuencias contienen alteraciones de heterodimerización y sustituciones que aumentan la unión a FcγRIIIA.

45 Las proteínas que contienen Fc de la invención pueden contener regiones Fc de IgG1 humana heterodimérica. Es decir, las dos cadenas polipeptídicas de Fc que, juntas, componen la región Fc cada una tiene una secuencia de aminoácidos diferente. En algunas realizaciones una región Fc heterodimérica de la invención contiene alteraciones de heterodimerización (como se definió anteriormente), facilitando así mucho la producción de proteínas que contienen el Fc heterodiméricas.

Una región Fc de IgG generalmente está glicosilada en N297 cuando es producida por una célula de mamífero, y la ausencia de fucosa en este carbohidrato puede incrementar la unión a FcγRIIIA y la capacidad de un anticuerpo IgG de suscitar ADCC. Malphettes y col. (2010), Biotechnol. Bioeng. 106(5):774-783. Se han explorado un número de 55 planteamientos para la producción de anticuerpos desfucosilados que incluyen el uso de la línea celular CHO Lec13 para producir anticuerpos, el uso de una línea celular para la producción de anticuerpo en la cual se ha alterado el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) o el gen del transportador de GDP-fucosa (GFT), el uso de una línea celular para la producción de anticuerpo que contiene un pequeño ARN interferente frente al gen FUT8 o el gen de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa, o expresión conjunta en una línea celular productora de anticuerpo de β-1,4-Nacetilglucoaminiltransferasa III (GnT-III)y α-manosidasa de Golgi II (ManII). Ishiguro y col. (2010), Cancer Sci 101:2.227-2.233. Las proteínas que contienen Fc, incluyendo anticuerpos y proteínas de fusión Fc, descritas en el presente documento pueden estar “desfucosiladas”, es decir, básicamente libres de fucosa o conteniendo solamente cantidades menores de fucosa. Como significa en el presente documento, al menos aproximadamente 85 %, 90 % o 95 % de los glicanos liberados de una preparación de proteína desfucosilada no contiene fucosa. Los términos 65 “desfucosilado” y “afucosilado” se usan intercambiablemente en el presente documento. Tales proteínas se pueden producir como se describió anteriormente, por ejemplo, en células FUT8-/-o GFT-/-. Los contenidos de fucosa de una

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incluyendo múltiples veces por día, diaria, cada dos días, dos veces a la semana, tres veces a la semana, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres, cuatro, cinco o seis meses, entre otros posibles regímenes de dosis. La periodicidad del tratamiento puede o no puede ser constante a lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento se puede dar inicialmente en

5 intervalos semanales y después darse cada dos semanas o en intervalos más largos como se mencionó anteriormente. Los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas, meses o años son abarcados por la invención. El tratamiento puede ser discontinuo y, a continuación, reiniciado. La dosis de mantenimiento se puede administrar después de un tratamiento inicial.

La dosis se puede medir como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie de piel (mg/m2) o como una dosis fijada, independientemente de la altura o el peso. Todas estas son unidades de dosis estándar en la técnica. El área superficial de piel de una persona se calcula a partir de su altura y peso usando una fórmula estándar. Con respecto a las proteínas que contienen una región Fc alterada descritas en el presente documento, la dosis puede oscilar de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 70 15 mg/kg, opcionalmente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2,5 mg/kg. Alternativamente, los pacientes de todos los tamaños pueden recibir la misma dosis, que oscila de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, opcionalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, o de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg. Alternativamente, la dosis puede ser de aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 800 mg/m2, de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 600 mg/m2, o de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 500 mg/m2. La dosis puede o no puede ser constante a lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, la dosis puede intensificarse continuamente a lo largo de la duración del tratamiento. Alternativamente, una primera dosis puede ser mayor que

25 las dosis posteriores. Como alternativa adicional, la dosis se puede reducir en fases posteriores del tratamiento.

La descripción anterior de las realizaciones específicas revela la naturaleza general de la invención de manera que otros pueden modificar fácilmente y/o adaptar tales realizaciones para diversas aplicaciones sin desviarse de los conceptos genéricos presentados en el presente documento. Cualquiera de tales adaptaciones o modificaciones se pretende que estén aceptadas dentro del significado y el intervalo de los equivalentes de las realizaciones descritas. Los siguientes ejemplos pretenden ser ejemplares y no pretenden limitar el alcance de la invención. La fraseología y la terminología empleada en estos ejemplos son con el propósito de descripción y no limitación.

Ejemplos

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Ejemplo 1: Construcción y cribado de genotecas de regiones Fc alteradas como heterodímeros de Fc

Construcción de genoteca y cribado primario

Las genotecas de ácidos nucleicos que codifican o bien un scFv-Fc que contiene las sustituciones de par de carga E356K y D399K o una cadena polipeptídica de Fc (“Fc simulado”) que contiene las sustituciones de par de carga K392D y K409D, con alteraciones adicionales en sitios seleccionados dentro de las regiones codificantes de Fc, se crearon usando PCR. Para cada sitio dentro de la Fc seleccionada para la sustitución, el ácido nucleico se cambió de modo que se generarían las regiones Fc con todos los veintes aminoácidos diferentes en el sitio seleccionado. 45 Cada codón en el ácido nucleico se distribuyó al azar independientemente de manera que las moléculas de ácido nucleico en la genoteca resultante se modificaron potencialmente cada una dentro de solamente un codón. Un grupo de sitios estaban enteramente dentro de la región bisagra inferior (residuos 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237 y 238; véase la Figura 2). La genoteca que contiene los ácidos nucleicos con mutaciones en los sitios codificantes de estos residuos se refirió como la genoteca “Tier 1”. Otro grupo de sitios estaban dentro de la región CH2 y o bien estaban cerca o eran parte del área que contacta con FcγRIIIA (239, 241, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 290, 294, 295, 296, 298, 300, 307, 309, 315, 326, 327, 328, 330, 332, 333, 334, 337 y 339; véase la figura 2). La genoteca que contiene ácidos nucleicos con mutaciones en sitios codificantes de estos residuos se refirió como la genoteca “Tier 2”. Un tercer grupo incluía sitios dentro de la región CH2 que estaban expuestos a disolvente, pero no estaban cerca de o eran parte del área que contacta con FcγRIIIA (243, 246, 248,

55 249, 251, 252, 253, 254, 260, 274, 275, 278, 279, 282, 283, 284, 287, 288, 289, 292, 293, 301, 302, 303, 305, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 320, 322, 324, 335, 336, 338 y 340; véase la Figura 2). La genoteca que contiene ácidos nucleicos con mutaciones en los sitios codificantes de estos residuos se refirió como la genoteca “Tier 3”. La Figura 2 muestra las posiciones de estos sitios dentro de una región Fc de IgG1 humana.

A más detalle, se subclonó un fragmento de ADN que codifica el scFv del anticuerpo M315 (un anticuerpo anti NKG2D de ratón de rata) fusionado a un polipéptido de Fc de IgG1 humana con las mutaciones de par de carga E356K y D399K en el dominio CH3 en el vector de expresión de mamífero pTT5. Zhang y col. (2009), Protein Expression and Purification 65(1):77-82. Un fragmento de ADN que codifica un polipéptido de Fc de hulgG1 con las mutaciones de par de carga K392D y K409D en el dominio CH3 también se subclonó en pTT5. Las seis genotecas 65 de Fc pequeñas anteriormente descritas se produjeron usando empalme por extensión de solapamiento por la reacción en cadena de polimerasa (SOE por PCR) como se describe más adelante. Véase, por ejemplo, Warrens y

imagen15

Tabla 1: Aciertos (hits) positivos primarios de genotecas de scFv-Fv

1ª ronda de cribado primario: 2ª ronda de cribado 1ª ronda de cribado

Tier: Sustitución Señal alfa % inhibición Señal alfa % inhibición Señal alfa % inhibición

No sustitución: 76003 0,0 80429 0,0 78582 0,0

1: L234Y 55075 27,5 45915 42,9 50495 35,7

1: L235S 7789 89,8 6262 92,2 7025 91,1

1: G236Y 64581 15,0 61733 23,2 62157 20,9

2: S239D 24347 68,0 16863 79,0 21421 72,7

2: S239N 31926 58,0 26111 67,5 24500 68,8

3: F243L 46048 39,4 57412 28,6 55205 29,7

3: F243V 41730 45,1 42089 47,7 40375 48,6

3: F2431 29972 60,6 21670 73,1 21364 72,8

3: 1253K 57394 24,5 52131 35,2 51343 34,7

2: T256Q 26517 65,1 19094 76,3 20846 73,5

2: E258V 23310 69,3 19494 75,8 22403 71,5

2: H268E 54810 27,9 56630 29,6 57069 27,4

2: H268K 60627 20,2 62217 22,6 61602 21,6

3: A287F 39907 47,5 33473 58,4 25468 67,6

3: K2881 56406 25,8 57487 28,5 57289 27,1

2: K290G 52396 31,1 53843 33,1 55724 29,1

2: K290S 57139 24,8 55906 30,5 54625 30,5

2: K290W 53869 29,1 52574 34,6 59537 24,2

2: K290Q 37430 50,8 36682 54,4 40252 48,8

2: K290Y 9168 87,9 7893 90,2 10215 87,0

2: E294L 24347 68,0 22911 71,5 18221 76,8

2: Y296W 25317 66,7 21765 72,9 24756 68,5

2: Y296L 58469 23,1 60581 24,7 64317 18,2

2: S298A 17868 76,5 25331 68,5 27486 65,0

2: S298C 12163 84,0 10352 87,1 13443 82,9

2: T307S 44581 41,3 46542 42,1 51427 34,6

2: T307E 21667 71,5 18943 76,4 25776 67,2

2: T307G 32517 57,2 36732 54,3 38498 51,0

2: L309S 60518 20,4 61549 23,5 63542 19,1

2: L309K 23426 69,2 18876 76,5 27215 65,4

2: L309E 25050 67,0 21115 73,7 25441 67,6

2: N315A 23792 68,7 19723 75,5 28619 63,6

2: N315S 25958 65,8 19461 75,8 28793 63,4

2: A330M 55444 27,1 50996 36,6 57992 26,2

2: 1332E 18900 75,1 20396 74,6 18450 76,5

2: K334A 51677 32,0 54810 31,9 56456 28,2

2: K334M 22262 70,7 19782 75,4 24376 69,0

Tabla 2: Aciertos positivos primarios de genotecas de Fc simulado

1ª ronda de cribado primario: 2ª ronda de cribado 3ª ronda de cribado

No sustitución: 76003 0,0 80429 0,0 78582 0,0

2: S239D 6120 91,9 6155 92,3 9874 87,4

2: S239E 32510 57,2 34836 56,7 33673 57,1

2: S239E+K340N 11484 84,9 11757 85,4 26132 66,7

3: F243M 43121 43,3 37720 53,1 32424 58,7

3: F243L 20563 72,9 18203 77,4 18794 76,1

3: F243V 38776 49,0 32101 60,1 29266 62,8

3: F2431 29808 60,8 25768 68,0 23762 69,8

3+2: F243V+S239T 11564 84,8 13705 83,0 12525 84,1

3: K246W 60773 20,0 57107 29,0 51701 34,2

3: K246E 58947 22,4 62557 22,2 53343 32,1

3: K246S 45132 40,6 42377 47,3 37902 51,8

1ª ronda de cribado primario: 2ª ronda de cribado 3ª ronda de cribado

3: K246V 43826 42,3 44452 44,7 42791 45,5

3: K248Y 52092 31,5 51035 36,5 46986 40,2

3: K248L 24674 67,5 23108 71,3 24831 68,4

3: M252D 60526 20,4 58066 27,8 60269 23,3

3: I253V 58498 23,0 61503 23,5 58403 25,7

2: R255S 59331 21,9 49837 38,0 61045 22,3

2: R255N 47547 37,4 48542 39,6 44532 43,3

2: T256V 30486 59,9 31764 60,5 28809 63,3

2: E258S 60338 20,6 57893 28,0 61591 21,6

3: K288T 55695 26,7 53102 34,0 50325 36,0

2: K290G 20557 73,0 20088 75,0 38478 51,0

2: K290F 58476 23,1 55435 31,1 60116 23,5

2: E294L 30129 60,4 35365 56,0 32178 59,1

3: V302Q 40294 47,0 35937 55,3 33446 57,4

2: T307P 18993 75,0 20019 75,1 14102 82,1

2: L309C 59701 21,4 55632 30,8 61787 21,4

3: Q311M 13143 82,7 11115 86,2 9798 87,5

2: A330V 56425 25,8 54114 32,7 58445 25,6

2: I332E 10781 85,8 9879 87,7 11532 85,3

2: K334L 26701 64,9 23400 70,9 25092 68,1

2: K334V 27080 64,4 26926 66,5 30164 61,6

2: K334V+D413N 20192 73,4 21412 73,4 25438 67,6

2: A339T 56391 25,8 58448 27,3 49783 36,6

Mediante el cálculo, se incluyeron un total de aproximadamente 1.640 variantes diferentes en las genotecas Tier 1, 2 y 3 codificantes de scFv-Fc combinadas. El mismo número de variantes estaban incluidas en las genotecas Tier 1, 2 y 3 codificantes de Fc simulado combinadas. Dado el número de variantes ensayadas, era probable que todas las

5 variantes estuvieran representadas al menos una vez entre los transfectantes ensayados. Sin embargo, solamente 37 scFv-Fc diferentes y 34 Fc simulados diferentes dieron una señal positiva en este primer cribado. Muchas de estas variantes se recuperaron múltiples veces. Por tanto, en total, solamente aproximadamente el 2 % de las 1.640 variantes diferentes incluidas en las genotecas produjeron una señal positiva.

10 Cribado combinatorio de aciertos positivos

Todas las sustituciones identificadas en el cribado primario en las genotecas de Fc simulado (como se muestra en la Tabla 2) se combinaron con todas las sustituciones identificadas en el cribado primario de las genotecas de scFc-Fc (como se muestra en la Tabla 1) para identificar combinaciones que se podrían unir a FcγRIIIA más eficazmente. 15 Por tanto, se ensayaron 37x34=1.258 combinaciones en total. Sorprendentemente, solamente las siguientes 21 de las 1.258 combinaciones ensayadas mostraron competición fuerte a la interacción biotina-hulgG1/FcγRIIIA en un ensayo AlphaLISA®: (1) E294L en el Fc simulado y E294L en el scFv-Fc; (2) E294L en el Fc simulado y Y296L en el scFv-Fc; (3) E294L en el Fc simulado y K290G en el scFv-Fc; (4) E294L en el Fc simulado y K290S en el scFv-Fc;

(5) E294L en el Fc simulado y S298A en el scFv-Fc; (6) E294L en el Fc simulado y T307G en el scFv-Fc; (7) T307P

20 en el Fc simulado y T307G en el scFv-Fc; (8) T307P en el Fc simulado y K290G en el scFv-Fc; (9) T307P en el Fc simulado y Y296L en el scFv-Fc; (10) T307P en el Fc simulado y K290S en el scFvFc; (11) R255S en el Fc simulado y S298C en el scFv-Fc; (12) T307P en el Fc simulado y S298C en el scFv-Fc; (13) E294L en el Fc simulado y S298C en el scFv-Fc; (14) K334V en el Fc simulado y K290Y en el scFv-Fc; (15) T307P en el Fc simulado y L309E en el scFv-Fc; (16) E294L en el Fc simulado y L309E en el scFv-Fc; (17) T307P en el Fc simulado y L234Y en el scFv-Fc;

25 (18) E294L en el Fc simulado y L234Y en el scFv-Fc; (19) Q311M en el Fc simulado y Y296W en el scFv-Fc; (20) Q311M en el Fc simulado y L234Y en el scFv-Fc; y (21) K334V en el Fc simulado y Y296W en el scFv-Fc. Por tanto, solamente un muy pequeño número de las combinaciones de mutantes de Fc ensayados mostraron una unión altamente sinérgica a FcγRIIIA.

30 Ejemplo 2: Construcción y caracterización de variantes de combinación en formato IgG

Para determinar si los anticuerpos enteros que contienen sustituciones en sus regiones Fc funcionarían para unirse más eficazmente a FcγRIIIA, se realizaron combinaciones de sustituciones en un anticuerpo IgG1 anti-proteína X humana entero usando las técnicas anteriormente descritas. Todos los aciertos primarios (véase las Tablas 1 y 2) se 35 mapearon sobre la estructura de cocristal de Fc:FcγRIIIB usando el ”Molecular Operating Environment” (MOE), un programa de modelado molecular de Chemical Computing Group, Inc. Montreal CA. Véase el código 1T83 del “Protein Data Bank”. Como se indica en la leyenda de la Figura 1 anterior, la región extracelular de FcγRIIIB que está en esta estructura (mostrada en la Figura 1) es muy similar en la secuencia de aminoácidos primaria a

imagen16

Tabla 3: unión a FcγRIIIA y actividad de ADCC de anticuerpos IgG1 humanos que contienen variantes de Fc

Alias: Cadena negativa/negativa (K392D, K409D) Cadena positiva/positiva (E356K, D399K) FcγRIIIA (158F) CE50 (nM) ADCC CE50 (pM)

M01: Tipo silvestre (no sustituciones de par de carga) Tipo silvestre (no sustitución de par de carga) 103,2 75,00

M04: solamente sustituciones de par de carga solamente sustituciones de par de carga 86,97 55,50

M64: K334V Y296W+S298C 18,3 0,75

M68: K334V L234Y+Y296W+S298C 5,44 0,82

M70: L235S+S239D+K334V L234Y+K290Y+Y296W 5,28 1,54

M71: L235S+S239D+K334V L234Y+Y296W+S298C 4,82 0,63

M75: Q311M+K334V (SEQ ID NO:8) L234Y+F243V+Y296W 7,94 1,01

M77: Q311M+K334V (SEQ ID NO:8) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 7,07 1,47

M78: Q311M+K334V (SEQ ID NO:8) L234Y+Y296W+S298C 5,84 0,53

M79: S239D+K334V L234Y+K290Y+Y296W 5,04 0,97

M81: S239D+K334V L234Y+Y296W+S298C 4,25 0,31

M83: F243V+K334V L234Y+K290Y+Y296W 7,85 2,42

M84: F243V+K334V L234Y+Y296W+S298C 5,77 0,79

M85: E294L+K334V L234Y+K290Y+Y296W 5,66 1,71

M86: E294L+K334V L234Y+Y296W+S298C 5,57 0,79

W23: S298T+K334V (SEQ ID NO:16) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 5,23 0,68

Tabla 4: unión a FcγRIIIA de anticuerpos IgG1 humanos que contienen variantes de Fc

Alias: Cadena negativa/negativa (K392D, K409D) Cadena positiva/positiva (E356K, D399K) FcγRIIIA (158F) CE50 (nM) FcγRIIIA (158V) CE50 (nM)

M77: Q311M+K334V (SEQ ID NO:8) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 13,2 10,87

M138: E233L+Q311M+K334V (SEQ ID NO:12) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 12,74 8,45

M142: L234I+Q311M+K334V (SEQ ID NO:14) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 10,37 8,25

W23: S298T+K334V (SEQ ID NO:16) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 5,94 6,80

W117: A330M+K334V (SEQ ID NO:37) L234Y+Y296W (SEQ ID NO:39) 28,92 40,04

W125: A330M+K334V (SEQ ID NO:37) K290Y+Y296W (SEQ ID NO:41) 59,32 76,92

W141: A330M+K334V (SEQ ID NO:20) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 4,30 7,02

W144: A330F+K334V (SEQ ID NO:22) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 4,44 6,77

W157: Q311M+A330M+K334V (SEQ ID NO:24) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 6,76 9,10

W160: Q311M+A330F+K334V (SEQ ID NO:26) L234Y+E294L+Y296W (SEQ ID NO:10) 7,04 8,42

W165: S298T+A330M+K334V (SEQ ID NO:28) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 5,24 7,56

W168: S298T+A330F+K334V (SEQ ID NO:30) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 5,54 8,41

W187: S239D+A330M+K334V (SEQ ID NO:32) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18) 2,25 4,69

W189: S239D+S298T+K334V (SEQ ID NO:34) L234Y+K290Y+Y296W (SEQ ID NO:18 4,14 5,41

La unión de alguna de las variantes de Fc a FcyR humanos y murinos recombinantes se ensayó usando la

tecnología Biacore™ capturando FcyR etiquetados con His usando un anticuerpo anti-His murino unido a un Chip

Sensor CM5 (Biacore). En experimentos separados, se ensayaron FcγRIIIA con una histidina en la posición 131, 10 FcγRIIIA con una valina en la posición 158, y FcγRIIIA con una fenilalanina en la posición 158. Se inyectaron

anticuerpos IgG1 humanos que contenían regiones Fc variantes sobre la superficie del Chip Sensor CM5 al cual se

une el receptor Fcγ y se dejó asociarse y disociarse del receptor Fcγ por veces definidas. Estos datos se usaron

para determinar las constantes de unión, es decir, kon (1/Ms), Koff (1/s) y KD (nM), las cuales se calcularon a partir de

pruebas globales usando el modelo de unión de cinética 1:1 en el programa informático BIAevaluation™. 15 Generalmente, los anticuerpos que contienen regiones Fc alteradas tenían valores de KD en el dígito doble bajo nM

para tanto los alelos 158F como 158V de FcγRIIIA.

imagen17

Estos datos indican que la introducción de las sustituciones de par de carga no produjo diferencia detectable en la constante de disociación de equilibrio (KD) para la unión a cualquiera de los FcyR ensayados. Comparar fila M01 con fila M04. Además, las diversas alteraciones de Fc asimétricas ensayadas redujeron drásticamente (más de diez veces en todos los casos) la KD para la unión a ambas variantes alélicas de FcγRIIIA, pero tenían poco o no efecto

5 sobre la KD para la unión a FcγRIIA o FcγRIIB. Por tanto, las sustituciones en las regiones Fc de los anticuerpos IgG1 variantes enumerados en la Tabla 5 incrementaron drásticamente la avidez de unión de estas regiones Fc a FcγRIIIA.

Ejemplo 3: Ensayos de competición de variantes de Fc adicionales

Para determinar la relativa afinidad de unión a las variantes alélicas 158V y 158L de FcγRIIIA de un número de variantes de Fc adicionales, se realizaron ensayos AlphaLISA® básicamente como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Los anticuerpos IgG1 anti Proteína X humana enteros ensayados se purificaron a partir de sobrenadantes de células HEK 293 transfectadas. En algunos casos las preparaciones de anticuerpo carecían de

15 fucosa. Los resultados se muestran en las Figuras 10 (para la variante alélica 158F de FcγRIIIA) y 11 (para la variante alélica 158V de FcγRIIIA).

Estos datos indican que todos los anticuerpos ensayados que comprenden variantes de Fc compitieron con IgG1 biotinilada para la unión a FcγRIIIA más eficazmente que un anticuerpo que comprende un Fc tipo silvestre. Por ejemplo, la Figura 10 muestra que un Fc de IgG1 tipo silvestre humana (M01) inhibe la unión de IgG1 a FcγRIIIA (158F) mediante solamente aproximadamente 25 % a la concentración más alta ensayada (360 nM). M04, un anticuerpo IgG1 que contiene alteraciones de heterodimerización (K392D+K409D en una cadena polipeptídica de Fc y E356K+D399K en otra), era solamente ligeramente más eficaz que M01. En comparación con M01 y M04, W117, W125 y una IgG1 humana tipo silvestre afucosilada compitió mucho más fuertemente, como se evidencia por un

25 desplazamiento a la izquierda en las curvas. Véase W117, W125 y AFUCO-M01 en la Figura 10. Las preparaciones afucosiladas de W117 y W125 (AFUCO-W117 y AFUCO-W125) mostraron una afinidad muy alta para el FcγRIIIA 158F humano, puesto que estas dos preparaciones produjeron las curvas más a la izquierda en la Figura 10. Las variantes de Fc W157 y W165 también mostraron fuerte competición.

En la Figura 11 se muestran resultados similares para la unión a FcγRIIIA (158V). M01 y M04 presentaron competición débil para la unión a FcγRIIIA (158V). Como en la Figura 10, AFUCO-W117 y AFUCO-W125 eran los competidores más eficaces, seguido de W157 y W165. W117 y AFUCO-IgG1, seguido de W125, eran menos eficaces, pero aún más eficaces que M01 y M04. Estos datos muestran que se puede alcanzar un mejoramiento sinérgico de unión a FcγRIIIA usando preparaciones desfucosiladas de variantes heterodiméricas de IgG1.

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Ejemplo 4: Ensayo de ADCC de anticuerpos que contienen regiones Fc variantes

Para determinar la actividad de ADCC de los anticuerpos anti Proteína X humana enteros que contienen regiones Fc variantes adicionales, los ensayos de ADCC basados en célula se llevaron a cabo usando dos líneas celulares diferentes anteriormente mencionadas como células diana, una que expresa altos niveles de Proteína X (SKBR3) y la otra que expresa niveles moderados de Proteína X (JIMT1). Los ensayos se realizaron como se describe en el Ejemplo 2. Las Figuras 12 y 13 muestran los resultados obtenidos usando células SKBR3.

Los anticuerpos control M01 (que tienen una región Fc tipo silvestre) y M04 (que tienen una región Fc que contiene

45 solamente alteraciones de heterodimerización) presentaron aproximadamente 60 % y 75 % de destrucción a la concentración más alta de anticuerpo ensayado (2.667 pM). La destrucción celular descendió muchísimo a concentraciones de anticuerpo inferiores de M01 y M04. Sin embargo, los anticuerpos que contienen regiones Fc variantes, incluyendo W23, W117, W125, W141, W144, W165, W168 y W187, presentaron niveles más altos de destrucción celular que o bien M01 o M04 a las mayores concentraciones de anticuerpo. La variante W187 presentó la actividad más alta en este ensayo, que se correlaciona con el hecho de que también presenta la afinidad más alta a FcγRIIIA humano. Tabla 4. Las variantes W117, W125, W165 y W168 también suscitaron potente actividad de ADCC en este ensayo.

La Figura 14 muestra los resultados (porcentaje lisis celular específica) de un ensayo de ADCC hecho usando 55 anticuerpos anti Proteína X de IgG1 humana enteros y células JIMT1, que expresan niveles moderados de Proteína

X. Los anticuerpos M01 (que contienen una región Fc tipo silvestre) alcanzaron solamente aproximadamente el 64 por ciento de lisis celular a la mayor concentración de anticuerpo ensayada, y la CE50 de un anticuerpo M01 en este ensayo era de 98 pM. Una preparación desfucosilada de un anticuerpo M01 alcanzó el 86 % de lisis celular específica a la mayor concentración ensayada y tenía una CE50 de 0,274 pM en este ensayo. Un anticuerpo que contenía la variante de Fc W117 presentó destrucción por ADCC aumentada en comparación con el anticuerpo M01, alcanzando una lisis específica máxima de aproximadamente 85 % y unas 85,5 veces menor de CE50 (1,15 pM). Una preparación desfucosilada del mismo anticuerpo (AFUCOW117) mostró incluso mayor actividad de destrucción y tenía una CE50 muy baja (0,015 pM) en este ensayo. Figura 14, panel superior.

65 Se observó un incremento similar en la actividad de ADCC en una preparación desfucosilada de un anticuerpo que contenía una región Fc variante W125 (CE50 era de 0,061 pM) en comparación con una preparación fucosilada (CE50

era de 3,99 pM). Figura 14, panel inferior. Puesto que las versiones desfucosiladas de los anticuerpos IgG1 que contenían o bien una región Fc W117 o una W125 ambas tenían actividad mucho mayor que las versiones fucosiladas de estos anticuerpos, estos datos indican un mejoramiento sinérgico en la actividad de ADCC cuando la región Fc de un anticuerpo IgG1 está desfucosilada y también contiene cambios de aminoácidos que incrementan su

5 afinidad a FcγRIIIA.

Ejemplo 5: Constantes de unión de anticuerpos que contienen regiones Fc variantes adicionales

Las tasas de asociación (on) y disociación (off) para la unión de un número de anticuerpos IgG1 humanos que tienen

10 regiones Fc variantes adicionales a las variantes alélicas 158V y 158F de FcγRIIIA humano y a FcγRIV murino se determinaron usando la tecnología de Biacore™ como se describe en el Ejemplo 2. En resumen, los FcyR, los cuales se etiquetaron con poli histidina, se capturaron sobre un Chip Sensor CM5 (Biacore™). Los anticuerpos IgG1 humanos se inyectaron sobre la superficie del chip CM5 al cual se unen los FcyR y se dejan asociarse y disociarse de los Fcy por veces definidas. Los datos resultantes se usaron para determinar las constantes de unión publicadas

15 en la Tabla 6 a partir del programa informático BIAevaluation™. Estos datos se muestran en la Tabla 6 de a continuación.

Tabla 6: Tasas de asociación y disociación de anticuerpos IgG1 humanos que contienen regiones Fc variantes

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Afinidad cinética: huFcγRIIIa-158V huFcγRIIIa-158F muFcγR IV

Muestra: Kon (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM) Kon (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM) Kon (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)

huIgG1 (W23 Fc): 1,6 x 105 4,8 x 10-3 30 1,3 x 105 7,7 x 10-3 61 1,8 x 105 1,4 x 10-2 75

huIgG1 (W141 Fc): 1,4 x 105 4,8 x 10-3 34 1,1 x 105 6,4 x 10-3 59 1,6 x 105 1,2 x 10-2 72

huIgG1 (W144 Fc): 1,5 x 105 4,6 x 10-3 32 1,0 x 105 6,3 x 10-3 62 1,0 x 105 1,3 x 10-2 128

huIgG1 (W157 Fc): 1,2 x 105 4,3 x 10-3 35 9,8 x 104 5,5 x 10-3 56 1,1 x 105 8,4 x 10-3 78

huIgG1 (W165 Fc): 1,6 x 105 4,8 x 10-3 30 1,1 x 105 6,1 x 10-3 54 1,7 x 105 1,2 x 10-2 69

huIgG1 (W168 Fc): 1,7 x 105 4,5 x 10-3 27 1,2 x 105 6,0 x 10-3 48 1,2 x 105 1,1 x 10-2 97

huIgG1 (W187 Fc): 2,9 x 105 4,8 x 10-3 16 2,2 x 105 4,9 x 10-3 22 2,9 x 105 8,0 x 10-3 28

huIgG1 (B50 Fc)*: 1,0 x 105 4,5 x 10-3 44 8,2 x 104 6,4 x 10-3 78 4,9 x 104 1,5 1,5 x 10-2 301

huIgG1 (W117 Fc): 1,5 x 105 6,6 x 10-3 43 1,1 x 105 1,1 x 10-2 105 2,5 x 105 2,2 x 10-2 90

huIgG1 (W125 Fc): 1,3 x 105 7,1 x 10-3 57 5,5 x 104 7,9 x 10-3 143 1,4 x 105 1,3 x 10-2 89

huIgG1 (afuco W117 Fc): 3,9 x 105 2,5 x 10-3 6,4 3,5 x 105 3,2 x 10-3 9,0 3,1 x 105 4,6 x 10-3 15

huIgG1 (afuco W125 Fc): 3,6 x 105 3,1 x 10-3 8,8 3,0 x 105 4,4 x 10-3 15 2,7 x 105 4,9 x 10-3 18

* La región Fc variante B50 tiene las alteraciones K392D, K409D, L234I, A330M y K334V en un polipéptido de Fc y E356K, D399K, L234Y, K290Y y Y296W en el otro.

Los anticuerpos que contienen regiones Fc variantes tenían valores KD para la unión a FcγRIIIA humano, incluyendo las variantes alélicas 158F y 158V, que oscilaban de 6,4 nM a 143 nM. Estos datos, combinados con el ensayo de ADCC anteriormente discutido, muestran que la destrucción celular incrementada en un ensayo de ADCC por 25 preparaciones desfucosiladas de anticuerpos que contenían una región Fc W125 o una W117, en comparación con las preparaciones fucosiladas, se correlacionan con tasas de asociación incrementadas y tasas de disociación disminuidas, es decir, una KD disminuida. Tomándolo junto con los datos en el Ejemplo 4, un descenso de aproximadamente 10 veces en KD para la unión a FcγRIIIA humano (158F) para anticuerpo W125 desfucosilado en comparación con fucosilado (comparar 15,0 nM con 143 nM) se correlacionó con un descenso de aproximadamente 30 50 veces en CE50 en el ensayo de ADCC descrito en el Ejemplo 4 (comparar 0,061 pM con 3,99 pM). Igualmente, para un anticuerpo W117, una preparación desfucosilada tenía una KD para la unión a FcγRIIIA humano (158F) aproximadamente once veces menor que la de una preparación fucosilada (comparar 9,0 nM con 105 nM) y tenía una CE50 en el ensayo de ADCC descrito en el Ejemplo 4 que era aproximadamente 100 veces menor (comparar

Claims

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