CN110997712B - 特异性结合pd-1的抗体及其使用方法 - Google Patents

特异性结合pd-1的抗体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110997712B
CN110997712B CN201880050979.XA CN201880050979A CN110997712B CN 110997712 B CN110997712 B CN 110997712B CN 201880050979 A CN201880050979 A CN 201880050979A CN 110997712 B CN110997712 B CN 110997712B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
antigen
antibodies
binding fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880050979.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110997712A (zh
Inventor
Q.陈
S.科尔
K.达菲
D.加德纳
Y.郭
D.哈默尔
S.希奇柯克
A.拉孔布
J.罗
R.马拉维亚
Y.奥尔洛夫斯基
P.索鲁什
M.希维切
D.威尔金森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of CN110997712A publication Critical patent/CN110997712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110997712B publication Critical patent/CN110997712B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明提供了特异性结合PD‑1的抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或片段的多核苷酸及其制备和使用方法，上述物质可用于治疗炎性或免疫障碍。

Description

特异性结合PD-1的抗体及其使用方法
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。2018年5月30日创建的所述ASCII副本命名为JBI5131WOPCT_ST25.txt，并且大小为220千字节。
技术领域
本发明涉及特异性结合PD-1的抗体、编码该抗体或抗原结合片段的多核苷酸以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
PD-1(程序性死亡-1；PDCD1)是属于CD28/CTLA-4家族的抑制受体。PD-1是I型跨膜糖蛋白，该I型跨膜糖蛋白包含单个胞外域以及包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)两者的胞质域。PD-1在活化的T细胞、B细胞、NK细胞和胸腺细胞上表达，并且在静息记忆T细胞(包括滤泡辅助性T细胞(TFH)和外周辅助性T细胞(TPH))上表达。PD-1在接合其配体PD-L1或PD-L2时，通过多种机制抑制T细胞功能(Pauken&Wherry，2015年，Trends in Immunology，第36卷第4期，第265-276页)。PD-1接合通过与TCR共定位并随后诱导TCR近端信号分子的去磷酸化、抑制Ras/MEK/ERK途径来直接抑制T细胞受体(TCR)信号转导，从而通过抑制PI3K/AKT途径而致使细胞周期进展和T细胞增殖受抑制、细胞生长和存活受抑制以及T细胞代谢重编程，使得BATF转录因子上调，并且调节了调节性T细胞的发育、维持和功能。PD-1也被提出提高T细胞运动性并限制T细胞与靶细胞之间相互作用的持续时间，从而降低T细胞活化程度(Honda等人，(2014)Immunity 40(2)：235-47)。
对PD-1缺陷小鼠的研究已表明，该途径对于中枢耐受性和外周耐受性都是重要的。C57B1/6背景下的PD-1缺陷小鼠可罹患自发的自身免疫性疾病症状，包括产生自身抗体、肾小球肾炎和关节炎(Nishimura等人，Immunity，1999年)。这些数据表明PD-1负向调节免疫应答。
抗PD-1和PD-L1的单克隆抗体是用于治疗癌症诸如晚期黑素瘤、晚期非小细胞肺癌和经典型霍奇金淋巴瘤的认可疗法。已发现，PD-L1在许多不同的肿瘤类型中上调，并且能够抑制肿瘤浸润性PD-1+T细胞。拮抗剂PD-1或PD-L1单克隆抗体逆转这种抑制，从而允许T细胞活化并攻击肿瘤。因此，免疫检查点阻断提供了一种增强抗肿瘤免疫应答的方式。
虽然可利用生物抗炎治疗剂，但仍需要改善的抗炎药物，该改善的抗炎药物可有效抑制炎症以治疗各种免疫障碍(例如类风湿性关节炎)，其中大部分患者仍未对治疗作出充分反应。
发明内容
本发明提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、165、4、166、6和7的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ D NO：8、9或10的VH和SEQ ID NO：14、15或16的VL；以及/或者SEQ IDNO：20、21或22的重链(HC)和SEQ D NO：26、27或28的轻链(LC)。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ D NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；以及/或者SEQ ID NO：150的HC和SEQ ID NO：28的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；以及/或者SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：28的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；以及/或者SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：28的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、3、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；以及/或者SEQ ID NO：22的HC和SEQ ID NO：153的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ D NO：2、3、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；以及/或者SEQ ID NO：22的HC和SEQ ID NO：154的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；以及/或者SEQ ID NO：150的HC和SEQ ID NO：153的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；以及/或者SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：153的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；以及/或者SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：153的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；以及/或者SEQ ID NO：150的HC和SEQ ID NO：154的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；以及/或者SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：154的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL；以及/或者SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：154的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SFQ ID NO：32、124、40、41、42和43的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、33、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：44或45的VH和SEQ ID NO：60、61或62的VL；以及/或者SEQID NO：66或67的HC和SEQ ID NO：82、83或84的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、34、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：68的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、35、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：69的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、36、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：70的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、37、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：71的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、38、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：72的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、39、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL；以及/或者SEQ ID NO：73的HC和SEQ ID NO：83的LC。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：88、89、90、91、92和93的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与本发明的抗体竞争结合PD-1。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合与本发明的抗体相同的PD-1表位。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体VH和抗体VL或者抗体HC和抗体LC由本文所述的某些多核苷酸编码。
本发明还提供了一种编码本发明的抗体的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，该载体包含本发明的至少一种多核苷酸。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在表达抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的宿主细胞，以及分离抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种包含本发明的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本发明还提供了一种包含本定明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
本发明还提供了一种抑制受试者中的表达PD-1的T细胞活化的方法，该方法包括向受试者施用本发明的分离抗体或其抗原结合片段达足以抑制表达PD-1的T细胞活化的时间。
本发明还提供了一种下调免疫应答的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段达足以下调免疫应答的时间。
本发明还提供了一种治疗免疫障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段达足以治疗免疫障碍的时间。
本发明还提供了一种特异性结合本发明的抗体或抗原结合片段的抗独特型抗体。
本发明还提供了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含缀合至异源分子的本发明的抗体或抗原结合片段。
附图说明
图1A示出了在CMV回忆测定中选择产生的抗体以超过50％或更高的水平抑制T细胞活化。CNTO3930：同种型对照。PD1B199：拮抗性PD-1mAb。
图1B示出了在CMV回忆测定中选择产生的抗体以超过50％或更高的水平抑制T细胞活化。CNTO3930：同种型对照。PD1B199：拮抗性PD-1mAb。
图2A示出了PD1B505 mAb谱系VH区PD1H93(SEQ ID NO：8)、PD1H384(SEQ ID NO：9)、PD1H405(SEQ ID NO：10)、PD1H585(SEQ ID NO：140)、PD1H586(SEQ ID NO：141)和PD1H587(SEQ ID NO：142)的比对。CDR区标有下划线。VH链的SEQ ID NO：在图中的链名之后示出(例如，PD1H93_8；_8表示SEQ ID NO：8)
图2B示出了PD1B505 mAb谱系VL区PD1L30(SEQ ID NO：14)、PD1L468(SEQ ID NO：15)、PD1L469(SEQ ID NO：16)、PD1L651(SEQ ID NO：143)和PD1L652(SEQ ID NO：144)的比对。CDR区标有下划线。VL链的SEQ ID NO：在图中的链名之后示出(例如，PD1L30_14；_14表示SEQ ID NO：14)
图3A示出了PD1B506 mAb谱系VH区PD1H90(SEQ ID NO：44)、PD1H388(SEQ ID NO：45)、PD1H399(SEQ ID NO：46)、PD1H400(SEQ ID NO：47)、PD1H401(SEQ ID NO：48)、PD1H402(SEQ ID NO：49)、PD1H403(SEQ ID NO：50)和PD1H404(SEQ ID NO：51)的比对。CDR区标有下划线。
图3B示出了PD1B506 mAb谱系VL区PD1L28(SEQ ID NO：60)、PD1L470(SEQ ID NO：61)和PD1L471(SEQ ID NO：62)的比对。CDR区标有下划线。
图4A示出了PD1B512 mAb谱系VH区PD1H81(SEQ D NO：94)和PD1H389(SEQ ID NO：95)的比对。CDR区标有下划线。
图4B示出了PD1B512 mAb谱系VL区PD1L43(SEQ ID NO：98)、PD1L472(SEQ ID NO：99)和PD1L473(SEQ ID NO：100)的比对。CDR区标有下划线。
图5A示出了PD1B505和PD1B506抑制抗原特异性T细胞的活化。该图示出了在CMV回忆测定中T细胞增殖的平均抑制％和标准偏差。IgG1：同种型对照。
图5B示出了PD1B743、PD1B750和PD1B756抑制抗原特异性T细胞的活化。该图示出了在CMV回忆测定中T细胞增殖的平均抑制％和标准偏差。IgG1：同种型对照。
图5C示出了PD1B878和PD1B849在CMV特异性回忆测定中抑制抗原特异性T细胞的活化。该图示出了在CMV回忆测定中T细胞增殖的平均抑制％和标准偏差。IgG1：同种型对照。
图6A示出了在评估表达PD-1和PD-L1的细胞的聚集程度的测定中，使用双阳性事件百分比(％)作为聚集的读数，在存在或不存在所指示抗体的情况下，PD1B743和PD1B756未阻断PD-L1结合PD-1，而PD1B750阻断相互作用。阳性对照mAb阻断PD-L1/PD-1相互作用。
图6B示出了在评估表达PD-1和PD-L2的细胞的聚集程度的测定中，使用双阳性事件百分比(％)作为聚集的读数，在存在或不存在所指示抗体的情况下，PD1B743和PD1B756未阻断PD-L2结合PD-1，而PD1B750阻断相互作用。阳性对照mAb阻断PD-L2/PD-1相互作用。
图7示出了所产生的PD-1抗体的五个不同表位仓的示意图。仓5mAb阻断PD-L1/PD-1相互作用，而仓1-4内的mAb未阻断该相互作用。
图8A示出了相比于被TT刺激的T细胞(插图，荧光强度几何平均值)，PD-1表达在被CMV刺激的CD4+CD45RO+或CD8+CD45RO+记忆T细胞上更高。PD-1抗体：实线；同种型对照：虚线。
图8B示出了PD1B878和PD1B849在CMV特异性回忆测定中抑制CMV特异性T细胞的活化。该图示出了在测定中T细胞增殖的平均抑制百分比(％)和标准偏差。
图9A示出了在存在NK细胞作为效应细胞的情况下，PD1B849和PD1B878引起活化的记忆T细胞的ADCC。低岩藻糖(LF)形式的抗体(PD1B849-LF和PD1B878-LF)表现出增强的ADCC活性。
图9B示出了在存在PBMC作为效应细胞的情况下，PD1B849和PD1B878引起活化的记忆T细胞的ADCC。低岩藻糖(LF)形式的抗体(PD1B849-LF和PD1B878-LF)表现出增强的ADCC活性。
图10A示出了在存在NK细胞作为效应细胞的情况下，在表达低水平PD1的静息记忆T细胞中缺乏PD1B849和PD1B878介导的ADCC。低岩藻糖(LF)形式的抗体(PD1B849-LF和PD1B878-LF)介导某些ADCC。
图10B示出了在存在PBMC作为效应细胞的情况下，在表达低水平PD1的静息记忆T细胞中缺乏PD1B849和PD1B878介导的ADCC。低岩藻糖(LF)形式的抗体(PD1B849-LF和PD1B878-LF)介导某些ADCC。
图11示出了使用兔补体，PD1B849和PD1B878不介导活化的T细胞的可测量CDC。OKT3：小鼠抗人CD3抗体(阳性对照)；huIgG1：同种型对照，muIgG2a：同种型对照。
图12示出了PD1B878、PD1B1090和PD1B1094不阻断PD-L1在细胞上结合PD1。
图13A示出了PD1B505-mIgG2a和PD1B506-mIgG2a阻止移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中的疾病发展。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天和第18天以10mg/kg腹腔注射抗体，并且随时间推移记录临床分数。
图13B示出了PD1B505-mIgG2a和PD1B506-mIgG2a mAb(mIgG2a)阻止GvHD小鼠模型中的体重减轻。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天和第18天以10mg/kg腹腔注射抗体。
图14A示出了PD1B849-mIgG2a和PD1B878-mIgG2a阻止移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中的疾病发展。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天和第18天以10mg/kg腹腔注射抗体，并且随时间推移记录临床分数。
图14B示出了PD1B849-mIgG2a和PD1B878-mIgG2a阻止GvHD小鼠模型中的体重减轻。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天和第18天以10mg/kg腹腔注射抗体。
图15示出了PD1B849-mIgG2a和PD1B878-mIgG2a提高了GvHD小鼠模型的脾中的调节性T细胞(Treg)的频率。
图16示出了选择的抗PD1抗体耗尽TFH/TPH群体。LF：低岩藻糖。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。
除非上下文另外清楚要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“包括”等理解为具有包含意义，而不是排他性或穷举性意义；也就是说，“包括但不仅限于”的意义。
“特异性地结合”、“特异性结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常，抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小，或者约1×10-12M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位，通常KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至少百分之一。可使用标准程序来测量KD。然而，特异性结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
“激动剂”或“激动性”是指在结合PD-1时诱导由PD-1配体PD-L1诱导的至少一种生物活性的抗体。当至少一种生物活性被诱导超过在不存在激动剂的情况下(例如，阴性对照)被诱导的至少一种生物活性的至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时或当与不存在激动剂情况下的诱导相比该诱导具有统计意义上的显著性时，抗体为激动剂。由PD-L1结合PD-1诱导的典型生物活性为抑制抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞，从而导致免疫应答的抑制。
PD-1是指人程序性细胞死亡蛋白1，即PD-1。PD-1也称为CD279或PDCD1。成熟的人PD-1(无信号序列)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：131中。胞外域跨越SEQ ID NO：1的残基1-150，跨膜域跨越残基151-171，并且胞质域跨越残基172-268。在整个说明书中，“人PD-1的胞外域”或“huPD1-ECD”是指具有SEQ ID NO：1的残基1-150的氨基酸序列的蛋白质。
“抗体”广义上是指并包括属于任何类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或子类别IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的免疫球蛋白分子，并且包括(κ)和(λ)轻链。抗体包括单克隆抗体，全长抗体，抗原结合片段，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体，结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合片段的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH和VL可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，其从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”是结合抗原的抗体区域。VH中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且VL中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，1970年，J Exp Med，第132卷，第211-250页)(Kabat等人，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1991年)、Chothia(Chothia等人，1987年，J MolBiol，第196卷，第901-917页)、IMGT(Lefranc等人，2003年，Dev Comp Immunol，第27卷，第55-77页)和AbM(Martin和Thornton，J Bmol Biol，第263卷，第800-815页，1996年)。描述了各种描绘和可变区域编号之间的对应关系(参见例如，Lefranc等人，2003年，Dev Comphnmunol，第27卷，第55-77页；Honegger和Pluckthun，J Mol Biol，2001年，第309卷，第657-670页；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；Web资源，http://www_imgt_org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则本文所用的术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。
“抗原结合片段”是指结合抗原的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合片段可以是合成的、可通过酶促方法获得的或经遗传工程化的多肽，包括VH、VL、VH和VL、Fab、F(ab’)2、Fd和Fv片段，由一个VH域或一个VL域组成的域抗体(dAb)，鲨可变IgNAR域，骆驼化VH域，由模仿抗体的CDR的氨基酸残基组成的最小识别单元诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中所描述的。
“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体获得的抗体，即包含该群体的各个抗体是相同的，不同的是可能的熟知改变，诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸或翻译后修饰诸如氨基酸异构化或脱酰胺基、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺基。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。
“分离的”是指已经与分子产生于其中的系统(诸如重组细胞)中的其他组分基本上分离和/或从其中纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或蛋白质，诸如抗体)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的抗体”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的抗体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、93％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“抗体”包括使用各种技术产生的抗体，包括由免疫动物诸如小鼠、大鼠、兔子或鸡产生的抗体或从如本文所述的噬菌体或哺乳动物展示文库中鉴定的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区来源于人种系免疫球蛋白序列。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。
如果人抗体的可变区从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得，则人抗体包含“来源于”人种系免疫球蛋白序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体或哺乳动物细胞上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠、大鼠或鸡。由于用于获得抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异、天然存在的体细胞突变的引入、有意将置换引入框架或CDR，“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常含有氨基酸差异。“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸序列通常具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含源于人框架序列分析的共有框架序列，例如(Knappik等人2000年，J MolBiol，第296卷，第57-86页)中所述；或结合到噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3，例如(Shi等人，2010年，J Mol Biol，第397卷，第385-396页)和国际专利公布No.WO2009/085462中所述)。“人抗体”的定义中不包括CDR来源于非人物种的抗体。
“重组体”是指以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的蛋白质，诸如抗体。多特异性蛋白质可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)或狨猴(Callithrixjacchus)(common marmoset，marmoset))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的蛋白质，诸如抗体。双特异性蛋白质可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“与……组合”意指将药物或治疗剂以在混合物中一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受试者诸如人。
“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受检者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或障碍的个体以及易患病症或障碍的个体或者要预防病症或障碍的个体。
“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可取决于以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。
“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子的产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括受T细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子反应性细胞(例如巨噬细胞)的活化。
“下调”是指相比于不存在治疗或化合物时受试者中的应答水平，和/或相比于在其他方面相同但未治疗的受试者中的应答水平，受试者中的免疫应答水平的可检测降低。
“免疫障碍”是指由免疫系统的活性引起的任何疾病、障碍或疾病症状，包括自身免疫疾病、炎性疾病和过敏。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受治疗者”和“患者”在本文中可互换使用。
“载体”意指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
“表达载体”意指可用于生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链共价连接的核苷酸链或其他等同共价化学物的合成分子。cDNA是示例性合成多核苷酸。
“多肽”或“蛋白质”意指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。
“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表1.
氨基酸 三字母代码 单字母代码 氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A 亮氨酸 Leu L
精氨酸 Arg R 赖氨酸 Lys K
天冬酰胺 Asn N 甲硫氨酸 Met M
天冬氨酸 Asp D 苯丙氨酸 Phe F
半胱氨酸 Cys C 脯氨酸 Pro P
谷氨酸 Gln E 丝氨酸 Ser S
谷氨酰胺 Glu Q 苏氨酸 Thr T
甘氨酸 Gly G 色氨酸 Trp W
组氨酸 His H 酪氨酸 Tyr Y
异亮氨酸 Ile I 缬氨酸 Val V
物质的组成
本文提供了特异性结合PD-1或其抗原结合片段的抗体、编码本文提供的抗体的多核苷酸、载体、宿主细胞以及制备和使用抗体的方法。抗体或其抗原结合片段可以是激动性抗体。
用包括PD-1拮抗剂在内的免疫检查点抑制剂治疗的一些癌症患者罹患自身免疫相关的不良事件，诸如关节炎、结肠炎或牛皮癣的症状。解释这种观察的一种假设是，这些患者中的自反应性T细胞正通过PD-1被主动抑制，并且在存在PD-1拮抗剂的情况下被“释放”。然后，合理的是将这种假设倒过来，认为在患有自身免疫疾病的患者中，可通过PD-1连接/激动抑制“已经释放的”T细胞。
已发现，PD-1基因PDCD1中的SNP与多种自身免疫疾病相关，这些自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、狼疮和强直性脊柱炎(综述于Zamani等人，Cell Immunol，2016年，第310卷，第27-41页)。虽然尚未阐明PD-1 SNP的功能，但这些关联可指示，PD-1活性降低可导致T细胞抑制的降低，这可增加对自身免疫疾病的易感性。
需要治疗剂以抑制自身免疫疾病中的自身反应性T细胞。已在来自患有包括类风湿性关节炎和干燥综合症在内的自身免疫疾病的患者的组织中发现PD-1+ T细胞(Wan等人，JImmunol，2006年，第177卷第12期，第8844-8850页；Kobayashi等人，J Rheumatol，2005年，第32卷第11期，第2156-2163页)。能够使PD-1激动的抗体可用于抑制T细胞增殖和细胞因子释放，以限制组织内的损伤并恢复免疫稳态。PD-1激动剂mAb将靶向活化的而不是静息的初始和记忆T细胞和B细胞。这样，治疗剂将抑制对自身免疫疾病患者中的自身抗原的免疫应答，而不损害对病原体的免疫记忆应答。表达高水平PD-1、TFH和TPH的两种T细胞类型促进B细胞应答和抗体产生(Rao等人，Nature，2017年，第542卷，第110-114页)。在通过产生自身抗体驱动的包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和干燥综合症在内的自身免疫疾病中，这些细胞的频率增加(Rao等人，Nature，2017年，第542卷，第110-114页；He等人，Immunity，2013年，第39卷，第770-781页；Verstappen等人，Arthr&Rheum，2017年；第69卷第9期，第1850-1861页)。除了提供活化的T细胞的抑制之外，本发明的抗体还可选择性地耗尽表现出高PD-1表达的细胞，诸如TFH和TPH细胞。
本发明提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含抗体PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PD1B512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PDIB1092、PD1B1093、PD1B1094或PD1B1095中任一者的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和/或LCDR3。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含抗体PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PD1B512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094或PD1B1095中任一者的重链可变区(VH)框架和/或轻链可变区(VL)框架。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含抗体PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PDlB512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094或PD1B1095中任一者的VH和/或VL。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是激动性抗体。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段介导表达PD-1的细胞的ADCC。
在一些实施方案中，表达PD-1的细胞是活化的记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞(TFH)或外周辅助性T细胞(TPH)，或它们的任何组合。TFH细胞可被标识为：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+；
TPH细胞可被标识为：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+；TFH/TPH细胞的组合可被标识为：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1+。记忆T细胞可被标识为CD4+ CD45RO+或CD8+ CD45RO+。
PD1B505谱系抗体
mAb PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B108R、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094或PD1B1095是PD1B505 mAb谱系的示例性抗体。这些mAb具有相同的CDR区，不同的是一些抗体在HCDR2中具有一个氨基酸差异并且在LCDR1中具有一个或两个氨基酸差异。VH区同一性在82-100％之间并且VL区同一性在78-100％之间。PD1B505谱系mAb是配体非阻断的。
谱系的特征在于分别为SEQ ID NO：2、165、4、166、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及在于SEQ ID NO：118的VH属序列和SEQ ID NO：119的VL属序列。
SEQ ID NO：165(HCDR2属)
WINIETGXPT；
其中X为E、Y、H或W。
SEQ ID NO：166(LCDR1属)
TASSSX1X2SSYLH；
其中
X1为V或F；并且
X2为S或P。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、165、4、166、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO：3、145、146或147的HCDR2和/或SEQ ID NO：5、148或149的LCDR1。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个：
不阻断PD-L1结合PD-1，其中缺乏阻断通过如实施例1所述的抗体不能抑制表达PD-L1的细胞和表达PD-1的细胞的聚集进行测量；
以约5×10-8M或更小的平衡解离常数(KD)结合PD-1，其中KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以约3×104 1/Ms或更大的缔合常数(ka)结合PD-1，其中ka使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以约3×10-3 1/s或更小的解离常数(kd)结合PD-1，其中kd使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；或
抑制抗原特异性T细胞的增殖；其中在CMV-PBMC测定中评定增殖。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV7-4-1*1(SEQ ID NO：125)的VH框架。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGKV3D-20*1(SEQ ID NO：126)的VL框架。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV7-4-1*1(SEQ ID NO：125)的VH框架和来源于IGKV3D-20*1(SEQ ID NO：126)的VL框架。
SEQ ID NO：125IGHV7-4-1*1
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAFDTAVYYCAR
SEQ ID NO：126IGKV3D-20*1
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCGASQSVSSSYLAWYQQKPGLAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：118的重链可变区(VH)。SEQ ID NO：118是PD1B505谱系mAb的VH属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：119的轻链可变区(VL)。SEQ ID NO：118是PD1B505谱系mAb的VL属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：118的VH和SEQ ID NO：119的VL。CDR在SEQ ID NO：118和SEQ D NO：119中以粗体示出。
SEQ ID NO：118(PD1B505谱系VH属)
X1VQLX2X3SGX4ELKKPGX5X6VKX7SCKASGYTFTDYSMHWVX8QAPGX9GLX10WMGWINIETGX11PTYAX12X13FX14GRFX15FSLX16TSX17STAYLQIX18X19LKX20EDTAX21YFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTX22X23TVSS；
其中
X1为D或Q；
X2为Q或V；
X3为E或Q；
X4为P或S；
X5为E或A；
X6为T或S；
X7为I或V；
X8为K或R；
X9为K或Q；
X10为K或E；
X11为E、Y、H或W；
X12为D或Q；
X13为D或G；
X14为K或T；
X15为A或V；
X16为E或D；
X17为A或V；
X18为N、C或S；
X19为N或S；
X20为N或A；
X21为T或V；
X22为T或L；或
X23为L或V。
SEQ ID NO：119(PD1B505谱系VL属)
X1IVLTQSPAX2X3SX4SX5GERX6TX7X8CTASSSX9X10SSYLHWYQQKPGX11X12PX13LX14IYSTSNLASGX15PX16RFSGSGSGTX17X18X19LTISX20X21EX22EDX23AX24YYCH_QYHRSPLTFGX25GTKLEX26K；其中
X1为Q或E；
X2为I或T；
X3为M或L；
X4为A或L；
X5为L或P；
X6为V或A；
X7为M或L；
X8为T或S；
X9为V或F；
X10为S或P；
X11为S或L；
X12为S或A；
X13为K或R；
X14为W或L；
X15为V或I；
X16为A或D；
X17为S或D；
X18为Y或F；
X19为S或T；
X20为S或R；
X21为M或L；
X22为A或P；
X23为A或F；
X24为T或V；
X25为A或Q；并且
X26为L或I。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：8、9、10、140、141或142的VH。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：14、15、16、143或144的VL。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：8、9、10、140、141或142的VH和SEQ ID NO：14、15、16、143或144的VL。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：8、9或10的VH和SEQ ID NO：14、15或16的VL。
在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：20、21或22的重链(Hc)和SEQ ID NO：26、27和28的轻链(LC)。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：150的HC和SEQ ID NO：28的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：28的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、5、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：28的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、3、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ D NO：22的HC和SEQ ID NO：153的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、3、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：1 0的VH和SEQ ID NO：144的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：22的HC和SEQ ID NO：154的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ D NO：140的VH和SEQ D NO：143的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ D NO：150的HC和SEQ ID NO：153的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：153的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、148、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：153的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、145、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：150的HC和SEQ ID NO：154的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、146、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：151的HC和SEQ ID NO：154的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：2、147、4、149、6和7的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：152的HC和SEQ ID NO：154的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是激动性抗体。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与包含下列的抗体或抗原结合片段竞争结合PD-1：
SEQ ID NO：8的VH和SEQ ID NO：14的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：15的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；或
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL。
本发明此处还提供了特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合由包含下列的抗体结合的相同表位：
SEQ ID NO：8的VH和SEQ ID NO：14的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：15的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；或
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段的VH和VL或HC和LC由包含下列的多核苷酸序列的多核苷酸编码：
分别为SEQ ID NO：11和17；
分别为SEQ ID NO：12和18；
分别为SEQ ID NO：12和19；
分别为SEQ ID NO：13和19；
分别为SEQ ID NO：23和29；
分别为SEQ ID NO：24和30；
分别为SEQ ID NO：24和31；
分别为SEQ ID NO：25和31；
分别为SEQ ID NO：132和133；或
分别为SEQ ID NO：134和135；
分别为SEQ ID NO：155和19；
分别为SEQ ID NO：156和19；
分别为SEQ ID NO：157和19；
分别为SEQ ID NO：13和158；
分别为SEQ ID NO：13和159；
分别为SEQ ID NO：155和158；
分别为SEQ ID NO：156和158；
分别为SEQ ID NO：157和158；
分别为SEQ ID NO：155和159；
分别为SEQ ID NO：156和159；
分别为SEQ ID NO：157和159；
分别为SEQ ID NO：160和31；
分别为SEQ ID NO：161和31；
分别为SEQ ID NO：162和31；
分别为SEQ ID NO：25和163；
分别为SEQ ID NO：25和164；
分别为SEQ ID NO：160和163；
分别为SEQ ID NO：161和163；
分别为SEQ ID NO：162和163；
分别为SEQ ID NO：160和164；
分别为SEQ ID NO：161和164；或
分别为SEQ ID NO：162和164。
PD1B506谱系抗体
mAb PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849和PD1B850是PD1B506 mAb谱系的示例性抗体。这些mAb具有相同的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3以及变体HCDR2。VH区同一性在80-100％之间并且VL区同一性为约98％。PD1B506谱系mAb是配体阻断的。谱系的特征在于分别为SEQ ID NO：32、124、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及在于SEQ ID NO：120的VH属序列和SEQ ID NO：121的VL属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、124、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：124(PD1B506谱系HCDR2属)
EINPNX1X2GIN；其中
X1为N、D、Q、K或E；并且
X2为G、A或I。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO：33、34、35、36、37、38或39的HCDR2。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个：
阻断PD-L1结合PD-1，其中阻断通过如实施例1所述的抗体抑制表达PD-L1的细胞和表达PD-1的细胞的聚集的能力进行测量；
以约5×10-8M或更小的平衡解离常数(KD)结合PD-1，其中KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以约4×105 1/Ms或更大的缔合常数(ka)结合PD-1，其中ka使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以约1×10-2 1/s或更小的解离常数(kd)结合PD-1，其中kd使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；或
抑制抗原特异性T细胞的增殖；其中如实施例1所述在CMV-PBMC测定中评定增殖。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV1-2*02(SEQ ID NO：127)的VH框架。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGKV1D-16*1(SEQ ID NO：128)的VL框架。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV1-2*02(SEQ ID NO：127)的VH框架和来源于IG IGKV1D-16*1(SEQ ID NO：128)的VL框架。
SEQ ID NO：127IGHV1-2*02
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
SEQ ID NO：128IGKV1D-16*1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：120的重链可变区(VH)。SEQ ID NO：120是PD1B506谱系mAb的VH属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：121的轻链可变区(VL)。SEQ ID NO：121是PD1B506谱系mAb的VL属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：120的VH和SEQ ID NO：121的VL。CDR在SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121中是粗体。
SEQ ID NO：120(PD1B506谱系VH属)
QVQLX1QX2GAEX3X4KPGASVKX5SCKASGYTFTTYWMHWVX6QX7PGQGLEWX8GEINPNX9X10GINYX11X12KFX13X14X15X16TLTVDKSX17STAYMX18LSX19LX20SX21DX22AVYYCTIDYYDYGGYWGQGTX23X24TVSS；其中
X1为Q或V；
X2为S或P；
X3为L或V；
X4为V或K；
X5为L或V；
X6为K或R；
X7为R或A；
X8为I或M；
X9为N、D、Q、K或E；
X10为G、A或I；
X11为N或A；
X12为E或Q；
X13为K或Q；
X14为K或G；
X15为K或R；
X16为A或V；
X17为S或I；
X18为Q或E；
X19为S或R；
X20为T或R；
X21为E或D；
X22为S或T；
X23为T或L；并且
X24为L或V。
SEQ ID NO：121(PD1B506谱系VL属)
DIX1MTQSX2X3X4X5SX6SVX7DRVX8X9TCKASQNVGTNVAWYQQKPX10X11X12PKX13LIYSASYRYSGVPX14RFX15GSGSGTDFTLTIX16X17X18QX19EDX20AX21YX22CQQYNIYPYTFGX23GTKLEX24K；其中
X1为V或Q；
X2为Q或P；
X3为K或S；
X4为F或S；
X5为M或L；
X6为T或A；
X7为R或G；
X8为S或T；
X9为V或I；
X10为G或E；
X11为Q或K；
X12为S或A；
X13为A或S；
X14为D或S；
X15为T或S；
X16为T或S；
X17为N或S；
X18为V或L；
X19为S或P；
X20为L或F；
X21为E或T；
X22为F或Y；
X23为S或Q；并且
X24为M或I。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50或51的VH。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：60、61或62的VL。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50或51的VH和SEQ ID NO：60、61或62的VL。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、33、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：44或45的VH和SEQ IDNO：60、61或62的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：66或67的HC和SEQ ID NO：82、83或84的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、34、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：68的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、35、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：69的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、36、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：70的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、37、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：71的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、38、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：72的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：32、39、40、41、42和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：73的HC和SEQ ID NO：83的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，该抗体是激动性抗体。
本发明在此处还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与包含下列的抗体或抗原结合片段竞争结合PD-1：
SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：60的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：62的VL；
SEQ HDNO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；或
SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL。
本发明此处还提供了特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合由包含下列的抗体结合的相同表位：
SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：60的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：62的VL；
SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；或
SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段的VH和VL或HC和LC由包含下列的多核苷酸序列的多核苷酸编码：
分别为SEQ ID NO：52和63；
分别为SEQ ID NO：53和64；
分别为SEQ ID NO：53和65；
分别为SEQ ID NO：54和64；
分别为SEQ ID NO：55和64；
分别为SEQ ID NO：56和64；
分别为SEQ ID NO：57和64；
分别为SEQ ID NO：58和64；
分别为SEQ ID NO：59和64；
分别为SEQ ID NO：74和85；
分别为SEQ ID NO：75和86；
分别为SEQ ID NO：75和87；
分别为SEQ ID NO：76和86；
分别为SEQ ID NO：77和86；
分别为SEQ ID NO：78和86；
分别为SEQ ID NO：79和86；
分别为SEQ ID NO：80和86；
分别为SEQ ID NO：81和86；
分别为SEQ ID NO：136和137；或
分别为SEQ ID NO：138和139。
PD1B512谱系抗体
mAb PD1B505、PD1B756和PD1B757是PD1B512mAb谱系的示例性抗体。这些mAb具有相同的CDR区，其中VH区同一性为约84％并且VL区同一性在90-99％之间。PD1B512谱系mAb是配体非阻断的。谱系的特征在于分别为SEQ ID NO：88、89、90、91、92和93的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及在于SEQ ID NO：122的VH属序列和SEQ ID NO：123的VL属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO：88、89、90、91、92和93的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段不阻断PD-L1结合PD-1，其中缺乏阻断通过如实施例1所述的抗体不能抑制表达PD-L1的细胞和表达PD-1的细胞的聚集进行测量。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV2-5*04(SEQ ID NO：129)的VH框架。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGKV2-28*01(SEQ ID NO：130)的VL框架。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含来源于IGHV2-5*04(SEQ ID NO：129)的VH框架和来源于IGKV2-28*01(SEQ ID NO：130)的VL框架。
SEQ ID NO：129IGHV2-5*04
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCV
SEQ ID NO：130IGKV2-28*01
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：122的重链可变区(VH)。SEQ ID NO：122是PD1B512谱系mAb的VH属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：123的轻链可变区(VL)。SEQ ID NO：123是PD1B512谱系mAb的VL属序列。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：122的VH和SEQ ID NO：123的VL。CDR在SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123中是粗体。
SEQ ID NO：122(PD1B112谱系VH属)
QX1TLKESGPX2LX3X4PX5QTLX6LTCX7FSGFSLSTSGMGVSWIRQPX8GKX9LEWLAHIYWDDDKRYX1 0PSLKSRLTIX11KDTSX12NQVX13LX14X15TX16X17DX18X19DTGTYYCVRKGYYDYGYVMDYWGQGTX20VTVSS，其中
X1为V或I；
X2为G或T；
X3为L或V；
X4为Q或K；
X5为S或T；
X6为S或T；
X7为S或T；
X8为S或P；
X9为G或A；
X10为N或S；
X11为S或T；
X12为S或K；
X13为F或V；
X14为K或T；
X15为I或M；
X16为S或N；
X17为V或M；
X18为T或P；
X19为A或V；并且
X20为T或L。
SEQ ID NO：123(PD1B112谱系VL属)
DIVMTQX1X2LSX3PVTX4GX5X6ASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSX7SGSGTDFTLX8ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGX9GTKX10EX11K，其中
X1为A或S；
X2为A或P；
X3为N或L；
X4为L或P；
X5为T或E；
X6为S或P；
X7为S或G；
X8为R或K；
X9为S或G；
X10为L或V；并且
X11为M或I。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：94或95的VH。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：98、99或100的VL。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：94或95的VH和SEQ ID NO：98、99或100的VL。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：104的HC和SEQ ID NO：108的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：105的HC和SEQ ID NO：109的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：105的HC和SEQ ID NO：110的LC。该抗体还被提供用于治疗，诸如用于治疗免疫障碍、类风湿性关节炎、狼疮、系统性红斑狼疮或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，该抗体是激动性抗体。
本发明在此处还提供了一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与包含下列的抗体或抗原结合片段竞争结合PD-1：
SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL；
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL；或
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。
本发明此处还提供了特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合由包含下列的抗体结合的相同表位：
SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL；
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL；或
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段的VH和VL或HC和LC由包含下列的多核苷酸序列的多核苷酸编码：
分别为SEQ ID NO：96和101；
分别为SEQ ID NO：97和102；
分别为SEQ ID NO：97和103；
分别为SEQ ID NO：106和111；
分别为SEQ ID NO：107和112；或
分别为SEQ ID NO：107和113。
同源抗体和具有保守突变的抗体
本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段的变体在本发明的范围内。例如，变体可在VH和/或VL中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸置换，只要变体抗体在相比于亲本抗体时保持或具有改善的功能特性即可。在一些实施方案中，与本发明的VH和/或VL氨基酸序列的序列同一性可为约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，变异在框架区中。在一些实施方案中，变体通过保守置换产生。
例如，PD1B505谱系抗体可包含在VH残基位置1、5、6、9、16、17、20、38、43、46、57、62、63、65、69、73、76、84、85、88、93、116和/或117(残基根据SEQ ID NO：8进行编号)处以及在VL残基位置1、10、11、13、15、19、21、22、29、30、43、44、46、48、59、61、71、72、73、78、79、81、84、86、101和/或107(残基根据SEQ ID NO：14进行编号)处的置换。PD1B506谱系抗体可包含在VH残基位置5、7、11、12、20、38、40、48、55、56、61、62、65、66、67、68、76、82、85、87、89、91、112和/或113(残基根据SEQ ID NO：44进行编号)处以及在VL残基位置3、8、9、10、11、13、16、20、21、41、42、43、46、60、63、76、77、78、80、83、85、87、100和/或106(残基根据SEQ ID NO：60进行编号)处的置换。PD1B512谱系抗体可包含在VH残基位置2、10、12、13、15、19、23、43、46、62、72、77、81、83、84、86、87、89、90和/或117处以及在VL残基位置7、8、11、15、17、18、69、79、105、109和/或111处的置换。保守置换可在任何指示的位置处进行，并且在本文所述的测定法中测试所得变体抗体的期望特性。另选地，一个谱系mAb中的置换可通过用存在于谱系内的其他抗体中的特定位置处的对应氨基酸置换，在指示的位置处进行。
还提供了特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，该VH和VL与下列VH和VL具有至少80％的同一性：
SEQ ID NO：8的VH和SEQ ID NO：14的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：15的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：60的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：62的VL；
SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL；
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL；或
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。
在一些实施方案中，该同一性为85％。在一些实施方案中，该同一性为90％。在一些实施方案中，该同一性为91％。在一些实施方案中，该同一性为91％。在一些实施方案中，该同一性为92％。在一些实施方案中，该同一性为93％。在一些实施方案中，该同一性为94％。在一些实施方案中，该同一性为94％。在一些实施方案中，该同一性为96％。在一些实施方案中，该同一性为97％。在一些实施方案中，该同一性为98％。在一些实施方案中，该同一性为99％。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以采用E.Meyers和W.Miller(ComputAppl Biosci 4：11-17(1988))的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J Mol Biol，第48卷，第444-453页，1970年)的算法(该算法已并入GCG软件包(可在http_//_www_gcg_com获得)的GAP程序中)，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
在一些实施方案中，变体抗体在任何CDR区中包含一个或两个保守置换，其中抗体保留亲本抗体的期望功能特性。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守氨基酸置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可用丙氨酸来置换，如先前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35：1-24)。对本发明的抗体的氨基酸置换可通过已知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
工程化和修饰抗体
本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段可被进一步工程化以产生修饰抗体，在相比于亲本抗体时该修饰抗体具有类似或改变的特性。可在本发明的抗体中工程化VH、VL、VH和VL、恒定区、重链框架、轻链框架，或任意或全部六个CDR。
特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段可通过CDR接枝被工程化。可将本发明的抗体中的一个或多个CDR序列接枝到不同的框架序列上。CDR接枝可使用已知方法和本文所述的方法进行。
可使用的框架序列可获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的已出版参考文献。例如，人重链和轻链可变域基因的种系DNA和编码蛋白质序列可见于theinternational ImMunoGeneTics information />http_//www-imgt_org。能够被用来置换本发明抗体的现有框架序列的框架序列可为显示在VH或VL的整个长度上或在FR1、FR2、FR3和FR4的长度上与亲本可变域的百分比(％)同一性最高的那些。此外，合适的框架可基于VH和VL CDR1以及CDR2长度或相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR2规范结构来进一步选择。合适的框架可使用已知的方法进行选择，例如美国专利8,748,356所述的人框架改型或美国专利7,709,226的超人源化。
亲本和工程化抗体的框架序列还可例如通过回复突变来修饰，以恢复和/或改善所产生抗体对抗原的结合，如例如在美国专利6,180,370中有所描述。亲本或工程化抗体的框架序列还可通过使框架区内(或另选地一个或多个CDR区内)的一个或多个残基突变来修饰，以移除T-细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”并且在美国专利公开US20070014796中进一步详述。
可使本文提供的抗体或其抗原结合片段的CDR残基突变，以改善抗体对PD-1的亲和力。
可使本文提供的抗体或其抗原结合片段的CDR残基突变，以最大程度降低翻译后修饰的风险。脱氨基化(NS)、酸催化的水解(DP)、异构化(DS)或氧化(W)中的推定基序的氨基酸残基可被任何天然存在的氨基酸置换以诱变基序，并且可使用本文所述的方法测定所得抗体的功能性和稳定性。
可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他期望的生物学或生物物理学特性的本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，(2001)J Mol Biol 305：989-1010)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，(2000)Biopharm 13：36-46)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，(2003)AAPS PharmSci 5E8；Zhang等人，(2004)J Pharm Sci 93：3076-89；Maa等人，(1996)Iht J Pharm 140：155-68；Bedu-Addo等人，(2004)Pharm Res21：1353-61；Remmele等人，(1997)Pharm Res 15：200-8)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。
抗体同种型、同种异型和Fc工程化抗体
本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段可具有野生型或工程化Fc的任何已知的同种型或同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是IgG3同种型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型。
可通过在血流中内源性循环羧肽酶从注射的抗体中移除C-末端赖氨酸(CTL)(Cai等人，(2011)Biotechnol Bioeng 108：404-412)。在制备期间，可通过控制细胞外Zn2+、EDTA或EDTA-Fe3+的浓度，将CTL移除控制到小于最大水平，如美国专利公开US20140273092中有所描述。抗体中的CTL含量可使用已知方法测定。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段具有约10％至约90％的C-末端赖氨酸含量。在一些实施方案中，C-末端赖氨酸含量为约20％至约80％。在一些实施方案中，C-末端赖氨酸含量为约40％至约70％。在一些实施方案中，C-末端赖氨酸含量为约55％至约70％。在一些实施方案中，C-末端赖氨酸含量为约60％。
治疗性抗体的免疫原性与增大的输液反应风险和减小的治疗反应持续时间相关联(Baert等人，(2003)N Engl J Med 348：602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分通过抗体的同种异型来测定(Stickler等人，(2011)Genes and Immunity12：213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变异相关。表2示出选择的IgG1、IgG2和IgG4同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是G2m(n)同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是G2m(n-)同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是G2m(n)/(n-)同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是nG4m(a)同种异型。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是G1m(17，1)同种异型。
表2.
/>
可使本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段发生Fc突变，以调节抗体效应子功能，诸如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或药代动力学特性。这可通过将一种或多种突变引入Fc中来实现，该突变调节突变Fc与活化FcγRs(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)、抑制性FcγRIIb和/或与FcRn的结合。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含抗体Fc中的至少一种突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段在Fc中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五种突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含Fc中的至少一种突变，该突变调节抗体与FcRn的结合。
可发生突变以调节抗体半衰期(例如结合FcRn)的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合进行的示例性突变为突变T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可用于延长本文提供的抗体半衰期的示例性单独或组合突变为突变M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可用于缩短本文提供的抗体半衰期的示例性单独或组合突变为突变H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含突变M252Y/S254T/T256E。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段在抗体Fc中包含至少一种突变，该至少一种突变降低抗体与活化Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者降低Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可发生突变以降低抗体与活化FcγR的结合并随后降低效应子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合发生的示例性突变为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突变K214T、E233P、L234V、L234A、G236的缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。导致ADCC减小的抗体的示例性组合突变为如下突变：IgG1上的L234A/L235A、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同种型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgGl上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
导致CDC降低的抗体的示例性突变是K322A突变。
公知的S228P突变可在IgG4抗体中发生，以增强IgG4稳定性。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段在至少一个残基位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、322、327、328、329、330、331或365处包含突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个突变：K214T、E233P、L234V、L234A、G236的缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、K322、A330S和P331S。
在一些实施方案中，特异性结合PD一1的抗体或其抗原结合片段包含在至少一个残基位置228、234、235、237、238、268、322、330或331处的突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含K322A突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含S228P突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段在抗体Fc中包含至少一种突变，该至少一种突变增强抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者增强Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或吞噬作用(ADCP)。
可发生突变以增加抗体与活化FcγR的结合并且/或者增强抗体效应子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(残基根据EU索引进行编号)。可单独地或组合发生的示例性突变为G236A突变、S239D突变、F243L突变、T256A突变、K290A突变、R292P突变、S298A突变、Y300L突变、V305L突变、K326A突变、A330K突变、I332E突变、E333A突变、K334A突变、A339T突变和P396L突变。导致ADCC或ADCP增大的抗体的示例性组合突变为IgG1上的S239D/I332E突变、S298A/E333A/K334A突变、F243L/R292P/Y300L突变、F243L/R292P/Y300L/P396L突变、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变和G236A/S239D/I332E突变。
可发生突变以增强抗体的CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合发生的示例性突变为S267E突变、F1268F突变、S324T突变、K326A突变、K326W突变、E333A突变、E345K突变、E345Q突变、E345R突变、E345Y突变、E430S突变、E430F突变和E430T突变。导致CDC增大的抗体的示例性组合突变为IgG1上的K326A/E333A突变、K326W/E333A突变、H268F/S324T突变、S267E/H268F突变、S267E/S324T突变和S267E/H268F/S324T突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含Fc区中的至少一种突变，该至少一种突变增强抗体与FcγRIIb的结合。与FcγRIIb的结合增强可导致FcγRIIb+B细胞减少，并且/或者导致抗体的聚集和PD-1下游信号传导途径的后续激活。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含S267E突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含S267D突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含S267E/I332E突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含S267E/L328F突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含G236D/S267E突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R突变。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含P238D突变。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗体的ADCC活性可使用体外测定，使用表达PD-1的细胞作为靶细胞和NK细胞作为效应细胞进行评定。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。在示例性测定中，可以按1个靶细胞与4个效应细胞的比率使用靶细胞。将靶细胞用BATDA预先标记并与效应细胞和测试抗体组合。将样本温育2小时，并且通过测量释放到上清液中的BATDA来测量细胞裂解。使数据针对使用0.67％Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的BATDA自发释放测定的最小对照标准化。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。ADCP可通过如下方式评估：使用单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞，并使用Daudi细胞(CCL-213TM)或者任何其他表达PD-1的细胞作为被工程化为表达GFP或其他标记分子的靶细胞。在示例性测定中，效应细胞：靶细胞比例可为例如4∶1。可在含或不含本发明抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记的抗-CD11b抗体和抗-CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。可例如通过如下方式测量细胞的CDC：将Daudi细胞以1×105个细胞/孔(50μL/孔)接种到RPMI-B(补充有1％BSA的RPMI)中，将50μL测试抗体以0-100μg/mL之间的最终浓度加入到孔中，将反应在室温下温育15分钟，将11μL的混合人血清加入到孔中，并且将反应在37℃下温育45分钟。可使用标准方法在FACS测定法中检测碘化丙啶染色细胞％作为裂解细胞百分比(％)。
可使用流式细胞术在经工程化以表达每个受体的细胞上评定抗体与FcγR或FcRn的结合。在示例性结合测定中，将2×105个细胞/孔接种到96孔板中并在BSA染色缓冲液(美国圣何塞的BD Biosciences(BD Biosciences，San Jose，USA))中于4℃封闭30分钟。将细胞与测试抗体在冰上在4℃下温育1.5小时。在用BSA染色缓冲液洗涤两次之后，将细胞与R-PE标记的抗人IgG二级抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)于4℃一起温育45分钟。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μL的含有1∶200稀释的DRAQ7活/死染色剂的染色缓冲液(Cell Signaling Technology，Danvers，USA)中。分别使用B2和B4通道，通过Miltenyi MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec，Auburn，USA)检测经染色细胞的PE和DRAQ7信号。在DRAQ7排除条件下对活细胞进行门控，并确定至少10,000个活事件的几何平均荧光信号。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。将数据绘制成抗体浓度的对数与平均荧光信号的关系。执行非线性回归分析。
“增强”或“增强的”是指在相比于无突变的亲本抗体时，增强的效应子功能(例如，ADCC、CDC和/或ADCP)或增强的与在Fc区中具有至少一种突变的本发明抗体的Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。“增强的”可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的增强，或具有统计意义上显著性的增强。
“降低”或“降低的”是指在相比于无突变的亲本抗体时，降低的效应子功能(例如，ADCC、CDC和/或ADCP)或降低的与在Fc区中具有至少一种突变的本发明抗体的Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。“降低的”可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的降低，或具有统计意义上显著性的降低。
“调节”是指在相比于无突变的亲本抗体时，增强的或降低的效应子功能(例如，ADCC、CDC和/或ADCP)或者增强的或降低的与在Fc区中具有至少一种突变的本发明抗体的Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。
糖工程化抗体
单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过改造其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的FcγRIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用所报告的能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，第64卷，第249-265页，2012年)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem，第277卷，第26733-26740页，2002年)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs，第2卷第4期，第405-415页，2010年，PMID：20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem，第278卷，第3466-3473页，2003年)，引入特异性针对α-1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng，第88卷，第901-908页，2004年)，或共表达β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或有效的α-甘露糖苷酶I抑制剂、几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem，第281卷，第5032-5036页，2006年；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng，第93卷，第851-861页，2006年；Xhou等人，Biotechnol Bioeng，第99卷，第652-665页，2008年)。
在本文所述的一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约1％至约15％(例如约15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的双分枝聚糖结构。在一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的聚糖结构。
“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样本(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布WO2008/077546 2中所述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)进行检测/定量；3)在用或不用Endo S或其它酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其它酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行裂解，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；5)通过用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化将mAb低聚糖与mAb蛋白质分离。可通过各种互补技术对因此释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。
如本文所用，“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量约介于1％-15％之间。
如本文所用，“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量大约高于50％，通常大约高于80％或高于85％。
抗独特型抗体
抗独特型抗体是与本文所公开的特异性结合PD-1的抗体特异性结合的抗体。
本发明还提供了一种与本文提供的特异性结合PD-1的抗体特异性结合的抗独特型抗体。
本发明还提供了一种特异性结合包含下列的抗体的抗独特型抗体：
SEQ ID NO：8的VH和SEQ ID NO：14的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：15的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：60的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：62的VL；
SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：6l的VL；
SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL；
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL；或
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。
抗独特型(Id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或CDR)的抗体。Id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原封闭性Id可用于检测样本中的游离抗体(例如本文所述的本发明抗PD-1抗体)。非封闭性Id可用于检测样本中的总抗体(游离，部分结合于抗原，或完全结合于抗原的抗体)。Id抗体可通过用抗体对正在制备抗Id的动物免疫来制备。
抗Id抗体还可以用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗Id抗体可与诱导抗-Id的初始单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体，可以识别出表达相同特异性抗体的其它克隆。抗Id抗体可以改变(从而产生抗Id抗体变体)并且/或者通过任何合适的技术衍生化，例如在本文其他地方针对特异性结合PD-1的抗体所述的那些。
本文提供的特异性结合PD-1的抗体的缀合物
本发明还提供了一种包含分离抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，该分离抗体或其抗原结合片段特异性结合PD-1并与异源分子缀合。
在一些实施方案中，异源分子是可检测的标签或细胞毒素剂。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1并与可检测标签缀合的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种特异性结合PD-1并与细胞毒素剂缀合的抗体或其抗原结合片段。
结合PD-1的抗体或其抗原结合片段可用于使治疗剂定向至表达PD-1的细胞。可用特异性结合PD-1并与细胞毒素剂缀合的抗体靶向过表达PD-1的细胞诸如活化T细胞，该细胞毒素剂在PD-1抗体内化时杀死细胞。另选地，可用连接至治疗剂的PD-1抗体靶向表达PD-1的细胞，该治疗剂旨在一旦内化就改变细胞功能。
在一些实施方案中，可检测标签也是细胞毒素剂。
本文提供的特异性结合PD-1并与可检测标签缀合的分离抗体或其抗原结合片段可用于评估多种样本上PD-1的表达。
可检测标签包括当缀合至本文提供的特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段时使得该抗体可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的组合物。
示例性的可检测标签包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶状粒子、荧光染料、电子高密度试剂、酶(例如，如常用于ELISA)、生物素、地高辛、半抗原、发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、着色分子、放射性同位素、闪烁体(scintillates)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯和比色底物。
例如当可检测标签为放射性同位素时，可检测标签可自发地发射信号。在其他情况下，可检测标签由于被外场刺激而发射信号。
示例性的放射性同位素可为发射γ射线、发射俄歇电子(Auger)、发射β射线、发射α射线或发射正电子的放射性同位素。示例性的放射性同位素包括3H、11C、13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、94mTc、99mTc、115In、123l、124l、125I、131l、211At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac和227Ac。
示例性的金属原子是原子序数大于20的金属，诸如钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子、或铹原子。
在一些实施方案中，金属原子可以是原子序数大于二十的碱土金属。
在一些实施方案中，金属原子可为镧系元素。
在一些实施方案中，金属原子可为锕系元素。
在一些实施方案中，金属原子可为过渡金属。
在一些实施方案中，金属原子可为贫金属。
在一些实施方案中，金属原子可为金原子、铋原子、钽原子和钆原子。
在一些实施方案中，金属原子可以是原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属。
在一些实施方案中，金属原子可为适于磁共振成像的原子。
金属原子可为+1、+2或+3氧化态形式的金属离子，诸如Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+和Zn2+。金属原子可包括金属氧化物，诸如氧化铁、氧化锰或氧化钆。
合适的染料包括任何可商购染料，诸如例如5(6)-羧基荧光素、IRDye680RD马来酰亚胺或IRDye 800CW、钌多吡啶染料等。
合适的荧光团是异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素氨基硫脲、罗丹明、德克萨斯红、CyDye(例如Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluors(例如Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647)、近红外(NIR)(700-900nm)荧光染料、以及羰花青和氨基苯乙烯基染料。
本文提供的特异性结合PD-1并与可检测标签缀合的分离抗体或其抗原结合片段可用作成像剂。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒素剂。
在一些实施方案中，细胞毒素剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
在一些实施方案中，细胞毒素剂是道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、细菌毒素(诸如，白喉毒素)、蓖麻毒素、格尔德霉素、美登木素生物碱或卡里奇霉素。细胞毒素剂可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制引发其细胞毒素和细胞抑制效应。
在一些实施方案中，细胞毒素剂是酶促活性毒素，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
在一些实施方案中，细胞毒素剂是放射性核素，诸如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
在一些实施方案中，细胞毒素剂是多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物、奥瑞司他汀或单甲基奥瑞司他汀苯丙氨酸。示例性分子在美国专利5,635,483和5,780,588中公开。多拉司他汀和奥瑞司他汀已被证实可干扰微管动力学、GTP水解以及细胞核和细胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)，并且具有抗癌和抗真菌活性。多拉司他汀和奥瑞司他汀的药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端(WO02/088172)或者经由工程化到抗体中的任何半胱氨酸连接到本发明的抗体。
可使用已知的方法将本文提供的特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段缀合至可检测标签。
在一些实施方案中，将可检测标签与螯合剂复合。
在一些实施方案中，通过接头将可检测标签缀合至本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
可使用已知的方法将可检测标签或细胞毒性部分直接或间接地连接至本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。合适的接头在本领域中是已知的，并且包括例如辅基、非酚类接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸盐衍生物；十二硼酸盐)、大环和无环螯合剂两者的螯合部分，诸如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10，四乙酸(DOTA)衍生物、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)衍生物、S-2-(4-异硫氰酸酯基苄基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)衍生物以及1，4，8，11-四氮杂环十二烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)衍生物、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、二叠氮基化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、以及二活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)及其它螯合部分。合适的肽接头是公知的。
在一些实施方案中，经由肾清除从血液移除本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
试剂盒
本发明还提供了一种包含本文所公开的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测样本中PD-1的存在。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段以及用于检测抗体的试剂。试剂盒可包含一个或多个其它元件，包含：使用说明；其它试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其它方式偶联的试剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受试者施用的装置或其它材料。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文在容器中提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段以及试剂盒的使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒中的抗体被标记。
在一些实施方案中，试剂盒包含特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO：8的VH和SEQ ID NO：14的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：15的VL；
SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：16的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：143的VL；
SEQ ID NO：140的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：141的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：142的VH和SEQ ID NO：144的VL；
SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：60的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：45的VH和SEQ ID NO：62的VL；
SEQ ID NO：46的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：47的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：48的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：49的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：51的VH和SEQ ID NO：61的VL；
SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：98的VL；
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：99的VL；或
SEQ ID NO：95的VH和SEQ ID NO：100的VL。
检测PD-1的方法
本发明还提供了一种检测样本中的PD-1的方法，该方法包括：获得样本，使样本与本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段接触，并且检测与样本中的PD-1结合的抗体。
在一些实施方案中，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、滑液、循环细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
可使用已知的方法检测结合PD-1的本发明的抗体或其抗原结合片段。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和染料。
本发明的抗体可用于多种测定以检测样本中的PD-1。示例性的测定为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
生成抗体的方法
可使用各种技术产生本文提供的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。例如，可使用Kohler和Milstein的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用人和/或食蟹猕猴PD-1抗原(诸如PD-1的胞外域)来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或鸡)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。可筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的细胞集落，以用于制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性、抗原的亲和力，以及功能性诸如激动活性)的抗体。
包括选择人受体框架的示例性人源化技术包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Padlan，(1991)Mol Immunol 28：489-499)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公开2010/0261620)、人框架改型(美国专利8,748,356)或超人源化(美国专利7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的CDR或CDR残基的子集被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于CDR长度的相似性或规范结构同一性或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公开WO1090/007861和W01992/22653中所述的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何CDR处引入变体例如来改善抗体的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠、大鼠或鸡)可用于生成抗PD-1的抗体，这在例如美国专利6,150,584、国际专利公布WO1999/45962、国际专利公布WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478和WO1990/04036中有所描述。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物的基因组中。可邀请诸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology，Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。
抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397：385-96和国际专利公开WO09/085462中所述。可从文库中筛选结合到人和/或食蟹猕猴PD-1的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离Fab，并将其表达为全长IgG。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是多特异性抗体。
本文提供的特异性结合PD-1的单特异性抗体可被工程化成双特异性抗体，该双特异性抗体也涵盖于本发明的范围内。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换，交换一对重链-轻链)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。
双特异性抗体也可使用诸如Triomab/Quadroma(Trion Pharma/FreseniusBiotech)、钮扣结构(Genentech)、CrossMAb(Roche)和静电诱导的CH3相互作用(Chugai、Amgen、NovoNordisk、Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程结构域体(SEEDbody)(EMDSerono)、Biclonic(Merus)和诸如Products(Genmab A/S)的设计产生。
可使用Triomab quadroma技术产生全长双特异性抗体。Triomab技术促进两种亲本嵌合抗体(一种亲本mAb具有IgG2a，另一种亲本mAb具有大鼠IgG2b恒定区)之间的Fab臂交换，从而产生嵌合双特异性抗体。
可使用“钮扣结构”策略产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3取代对(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
可使用CrossMAb技术产生全长双特异性抗体。除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，CrossMAb在半臂之一中具有交换的CH1和CL域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
可使用其他交换策略如下产生全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变域或恒定域或这两种域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中有所描述。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布号US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的取代(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布号US2013/0195849中所述。
LUZ-Y技术可用于产生双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链加入CH3域的C末端，以驱动由亲本mAb装配异源二聚体，该亲本mAb经后纯化移除。
SEEDbody技术可用于产生双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定域中具有所选择的经IgA残基取代的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中有所描述。
根据国际专利公布No.WO2011/131746(DuoBody technology)所述的方法，双特异性抗体可在无细胞环境中，通过在两个单特异性同源二聚抗体的CH3区域中导入非对称突变并由两个亲本单特异性同源二聚抗体在还原条件下形成双特异性异源二聚抗体而体外生成，该还原条件允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。可使用的置换是IgG1抗体中一条重链中的F405L和另一条重链中的K409R。在IgG4抗体中，一条重链可为在位置405处具有F并且在位置409处具有R的野生型IgG4，并且另一条重链可具有F405L和R409K置换。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含：重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白或载体分子融合。
通常使用标准方法以DNA水平到分子水平(诸如抗体的恒定域)上进行置换。
本发明的抗体可被工程化为各种公知的抗体形式。
例如，可使用本文所述的PD-1抗体的VH/VL域和已公布的抗CD3抗体的任何VH/VL域来产生双特异性PD-1/CD3抗体。
本发明的另一个实施方案是包含结合PD-1的第一域和结合CD3的第二域的双特异性抗体。
表征抗体的方法
激动性抗体
由本文提供的激动性抗体诱导的典型生物活性是抑制(例如压制)抗原特异性CD4+或CD8+ T细胞。可使用多种读数来评定本文提供的抗体的激动性，诸如通过抗原特异性CD4+或CD8+ T细胞所致干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-2、IL-6、IL-22、IL-23或GM-CSF增殖的减少或产生的减少。在示例性测定中，使用抗体对经异源树突状细胞或特异性抗原(诸如破伤风类毒素或CMV)刺激的正常供体的T细胞的影响。以此设定，在抗体处理情况下，T细胞功能变化可通过测量上清液细胞因子水平或T细胞活化的标记物进行检测。在示例性测定中，使用经确定对CMV抗原有反应性的PBMC作为抗原特异性CD4+或CD8+ T细胞的来源。将1.5×106个细胞/mL或2×106个细胞/mL的CMV-反应性PBMC接种到培养板上，并将0.1-0.2μg/mL CMV肽添加到培养物中。CMV肽可例如从JPT Technologies购得。以10μg/mL的单剂量添加测试抗体，将板温育6天，并且通过添加1μCi/孔的甲基-3H-胸苷(PerkinElmer)评定6小时内的细胞增殖，并且在每个样本中测量放射性。另选地，使用ELISA或已知的多重测定法测量细胞产生的细胞因子。
阻断PD-L1和/或PD-L2结合PD-1的抗体
本文提供的本发明抗体(诸如特异性结合PD-1的激动性抗体)可以是配体阻断的或配体非阻断的。可利用竞争测定法诸如细胞聚集测定法评定本文提供的激动性抗体的能力，即它们阻断配体(例如PD-L1或PD-L2或这两者)的能力。
在示例性测定法中，以1∶1比率混合过表达PD-1或PD-L1(或PD-L2)的有差别地标记的HEK细胞，并且定量抗体抑制表达PD-1和PD-L1的细胞或者表达PD-1和PD-L2的细胞聚集的能力。过表达人PD-1的细胞可用Violet Cell Trace染色剂标记，并且过表达PD-L1或PD-L2的细胞可用Far Red Cell Trace染色剂标记(Life Technologies)。将表达PD-1的细胞与测试抗体混合，并且在短暂温育之后将表达PD-L1的细胞添加到该混合物中。将该混合物温育一小时，并且使用流式细胞术评估双阳性事件(例如，对Violet Cell Trace染色剂和Far Rd Cell Trace染色剂呈阳性的细胞群)的百分比。聚集水平由双阳性事件的百分比来测量，并且将在存在测试抗体的情况下聚集的百分比与阳性和阴性同种型对照抗体进行比较。当与使用p值≤0.01作为显著性量度的同种型对照进行比较时，当抗体以统计意义上显著的方式抑制表达PD-1和PD-L1(或PD-L2)的细胞的双阳性事件时，本文提供的抗体阻断PD-L1(或PD-L2)结合PD-1。当抗体以统计意义上不显著的方式例如p＞0.01抑制PD-1和PD-L1(或PD-L2)的双阳性事件时，本文提供的抗体不阻断PD-L1(或PD-L2)结合PD-1。
抗体亲和力测量
抗体对人或非人诸如食蟹猕猴PD-1的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。这类方法可以采用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定抗体/PD-1相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文在实施例1中所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将理解，使用例如Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5％-33％内。因此，KD背景下的术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD最多为±0.33×10-9M。
抗体与参考抗体竞争结合PD-1
可在Octet Red384平台(Forte Bio)上在体外测定与包含某些VH和VL序列的本发明抗体(例如，参考抗体)结合PD-1之间的竞争。将组氨酸标记的PD1抗原装载到HIS传感器上，并且将传感器暴露于20μg/mL参考抗-PD1抗体，然后暴露于相等浓度的测试抗-PD1抗体。在用参考抗体饱和后被测试抗体附加结合指示这两种抗体同时结合PD-1，这指示参考抗体和测试抗体不竞争结合PD-1。另选地，不被测试抗体附加结合指示这两种抗体竞争结合PD-1。
可如下产生与参考抗体竞争结合PD-1的抗体：使用噬菌体展示文库，分离特异性结合PD-1的抗体，并筛选出所产生的能够与上述参考抗体竞争结合PD-1的抗体。
当测试抗体在参考抗体的饱和浓度下结合PD-1时，测试抗体与参考抗体竞争结合PD-1。可通过记录由于结合的抗体随时间推移增加生物传感器尖端的光密度而导致的波长偏移，使用生物层干涉测量法(诸如Octet)检测结合。
抗体表位
本发明的抗体结合的PD-1表位可例如使用氢/氘交换(H/D交换)或通过分析与PD-1复合的抗体的晶体结构来解析。当通过H/D交换具有至少5％氘代水平差异的受抗体保护的约70％或更多的PD-1氨基酸残基在两种抗体之间相同时，或者当确定在抗体和PD-1的复合物的晶体结构中结合抗体的70％或更多PD-1表面暴露的氨基酸残基在两种抗体之间相同时，这两种PD-1抗体“结合PD-1上的相同表位”。在抗体与PD-1的复合物的晶体结构中，表位残基是位于距抗体CDR残基中的任一种距离之内或更小的那些PD-1残基。
在H/D交换测定中，将PD-1蛋白质在存在或不存在抗体情况下于氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用LC-MS分析肽片段。在一个示例性测定中，将5μL的测试抗体(10μg)或5μL的PD-1与测试抗体的复合物(分别10μg&7.35μg)用120μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)温育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过添加63μL的5M盐酸胍对氘交换进行淬灭，并且最终pH为2.5。使淬灭的样本经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化和LC-MS分析。对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化，通过添加63μL的5M盐酸胍(最终pH为2.5)使含5μg样本的125μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)变性并温育混合物3分钟。然后，使混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化并且用UPLC-MS系统分析所得的肽，该系统由连接至QExactiveTM混合四极-轨道阱质谱议(Thermo)的Waters Acquity UPLC构成。用HDX WorkBench软件处理原始MS数据，以分析H/D交换MS数据。使用氘代肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差来计算氘水平。通过采用Mascot，针对PD-1序列搜索MS/MS数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为20ppm和0.05Da。
对于X射线结晶学，使用标准方案对PD-1和测试抗体进行表达和纯化。将PD-1/测试抗体复合物在4℃下温育过夜，浓缩，并使用尺寸排阻色谱法从未复合的物类中分离。通过蒸气扩散法从各种已知的测试溶液，例如包含PEG3350、柠檬酸铵和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的溶液中结晶该复合物。
可通过下列方式产生结合PD-1上的相同表位的抗体，作为参考抗体：使用噬菌体展示文库分离结合PD-1的抗体，选择与参考抗体100％竞争结合PD-1的那些抗体，并且通过H/D交换或通过X射线晶体学鉴定抗体表位。
另选地，可使用包含表位残基的肽对小鼠或兔子进行免疫，并且可对所生成的抗体在所述区域内的结合进行评估。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本发明还提供了一种编码本发明的抗体中的任一者的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码抗体重链可变区中的任一者、抗体轻链可变区中的任一者，或本发明的抗体重链和/或抗体轻链中的任一者的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：8、9、10、140、141或142的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：14、15、16、143或144的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：8、9、10、140、141或142的VH以及SEQ ID NO：14、15、16、143或144的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：20、21、22、150、151或152的重链(HC)的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：26、27、28、153或154的轻链(LC)的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：20、21、22、150、151或152的HC以及SEQ IDNO：26、27、28、153或154的LC的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种包含SEQ ID NO：11、12、13、17、18、19、23、24、25、29、30、31、132、133、134、135、155、156、157、158、159、160、161、162、163或164的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50或51的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：60、61或62的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50或51的VH以及SEQID NO：60、61或62的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：66、67、68、69、70、71、72或73的重链的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：82、83或84的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：66、67、68、69、70、71、72或73的HC以及SEQID NO：82、83或84的LC的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种包含SEQ ID NO：52、53、54、55、56、57、58、59、63、64、65、74、75、76、77、78、79、80、81、85、86、87、136、137、138或139的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：94或95的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：98、99或100的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：94或95的VH以及SEQ ID NO：98、99或100的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：104或105的HC的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：108、109或110的LC的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种编码SEQ ID NO：104或105的HC以及SEQ ID NO：108、109或110的LC的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种包含SEQ ID NO：96、97、101、102、103、106、107、111、112或113的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
编码本发明抗体的VH和/或VL或其抗原结合片段，或本发明抗体的重链和/或轻链的多核苷酸序列能够有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，该调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中的表达。
多核苷酸可为cDNA。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。轻链和/或重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。可将编码VH、VL、HC和/或LC或其抗原结合片段的DNA片段有效连接至一个或多个表达载体中的控制序列，以确保多肽的表达。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：11的多核苷酸和/或SEQ ID NO：17的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：12的多核苷酸和/或SEQ ID NO：18的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：12的多核苷酸和/或SEQ ID NO：19的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：13的多核苷酸和/或SEQ ID NO：19的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：52的多核苷酸和/或SEQ ID NO：63的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：53的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：53的多核苷酸和/或SEQ ID NO：65的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：54的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：55的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：56的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：57的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：58的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：59的多核苷酸和/或SEQ ID NO：64的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：96的多核苷酸和/或SEQ ID NO：101的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：97的多核苷酸和/或SEQ ID NO：102的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：97的多核苷酸和/或SEQ ID NO：103的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：132的多核苷酸和/或SEQ ID NO：133的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：134的多核苷酸和/或SEQ ID NO：135的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：136的多核苷酸和/或SEQ ID NO：137的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：138的多核苷酸和/或SEQ ID NO：139的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：155的多核苷酸和/或SEQ ID NO：19的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：156的多核苷酸和/或SEQ ID NO：19的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：157的多核苷酸和/或SEQ ID NO：19的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：13的多核苷酸和/或SEQ ID NO：158的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：13的多核苷酸和/或SEQ ID NO：159的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：155的多核苷酸和/或SEQ ID NO：158的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：156的多核苷酸和/或SEQ ID NO：158的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：157的多核苷酸和/或SEQ ID NO：158的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：155的多核苷酸和/或SEQ ID NO：159的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：156的多核苷酸和/或SEQ ID NO：159的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：157的多核苷酸和/或SEQ ID NO：159的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：160的多核苷酸和/或SEQ ID NO：31的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：161的多核苷酸和/或SEQ ID NO：31的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：162的多核苷酸和/或SEQ ID NO：31的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：25的多核苷酸和/或SEQ ID NO：163的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：25的多核苷酸和/或SEQ ID NO：164的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：160的多核苷酸和/或SEQ ID NO：163的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：161的多核苷酸和/或SEQ ID NO：163的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：162的多核苷酸和/或SEQID NO：163的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：160的多核苷酸和/或SEQID NO：164的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：161的多核苷酸和/或SEQ ID NO：164的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：162的多核苷酸和/或SEQID NO：164的多核苷酸。
合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体DNA的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。谷氨酰胺合成酶系统可用于在细胞中表达重组蛋白质诸如抗体。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在真核细胞中表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。选择适当的载体和启动子在本领域普通技术人员的水平范围内。
许多合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多可商购获得以产生重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌载体：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，Calif.，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核载体：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)以及pEE6.1和pEE14.1(Lonza)。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的一个或多个载体。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NSO(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(LonzaBiologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在表达抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是公知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和/或重链、或者其它抗体片段诸如VH和/或VI，可以根据标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generally Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。受试者抗体可以是基本上纯的，例如，至少约80％至85％纯、至少约85％至90％纯、至少约90％至95％纯，或者至少约98％至99％纯，或者更纯，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受试者抗体之外的大分子等。
本发明还提供了一种用于制备特异性结合PD-1的抗体的方法，该方法包括：
将编码抗体的VH的第一多核苷酸和编码抗体的VL的第二多核苷酸引入表达载体中；
用表达载体转化宿主细胞；
在使VL和VH表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
可使用标准分子生物方法将编码本发明的特定VH或VI序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
药物组合物/施用
本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。就治疗性用途而言，可将本发明的抗体制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体或其抗原结合片段的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％改变，且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Troy，D.B.编辑，LipincottWilliams and Wilkins，Philadelphia，PA 2006，第5部分，PharmaceuticalManufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
用于本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗性用途的施用模式可以是将抗体递送至受试者的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部，经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：瘤内、胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
本发明的抗体或其抗原结合片段也可预防性施用，从而降低罹患自身免疫疾病的风险和/或延迟症状发作。
本发明的抗体或其抗原结合片段可冻干以便于储存，使用之前可在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
方法和用途
本发明的抗体或其抗原结合片段具有在体外和体内进行诊断，以及治疗和预防的用途。例如，可将本发明的抗体或其抗原结合片段在体外施用于培养中的细胞，或施用给受试者以治疗、预防和/或诊断各种疾病(诸如免疫障碍)或期望表达PD-1的T细胞活性减弱和/或免疫应答下调的任何病症。
本发明还提供了一种抑制受试者中的表达PD-1的T细胞活化的方法，该方法包括向受试者施用本发明的分离抗体或其抗原结合片段达足以抑制表达PD-1的T细胞活化的时间。
在一些实施方案中，表达PD-1的T细胞是抗原特异性CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，表达PD-1的T细胞是抗原特异性CD8+ T细胞。
“抑制活化”是指本文提供的抗体抑制表达PD-1的T细胞活化的能力，例如抑制抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞增殖或产生IFN-γ。当抗体抑制的抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞增殖或产生IFN-γ超过在不存在抗体的情况下(例如，阴性对照)20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，或当与不存在抗体情况下的抑制相比该抑制具有统计意义上的显著性时，抗体抑制表达PD-1的T细胞的活化。
表达PD-1的T细胞可位于不适当炎性应答的附近。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过下列方式抑制表达PD-1的T细胞的活化：扩大PD-1下游信号，从而导致TCR信号的抑制和T细胞活化、增殖和/或存活的抑制。本发明的抗体可另选地通过抗体介导的效应子功能ADCC、ADCP和/或CDC介导PD-1阳性T细胞的杀死。
还提供了一种下调免疫应答的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段以下调免疫应答。
还提供了一种治疗免疫障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段以治疗免疫障碍。
免疫障碍可以是慢性或急性的，诸如慢性炎性疾病或急性炎性疾病。
在一些实施方案中，免疫障碍为关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、盆腔炎、阿尔茨海默病、炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泄、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、狼疮(诸如系统性红斑狼疮)、格-巴二氏综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维性肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、其他自身免疫性障碍、胰腺炎、创伤(外科手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、包括缺血性心脏病诸如心肌梗死以及动脉粥样硬化在内的心脏病、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎和胃酸过少、与缺乏母胎界面耐受性相关的不孕症、干燥综合症、白癜风、重症肌无力或系统性硬化病。
在一些实施方案中，免疫障碍是类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，免疫障碍是关节炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是哮喘。
在一些实施方案中，免疫障碍为COPD。
在一些实施方案中，免疫障碍是盆腔炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是阿尔茨海默病。
在一些实施方案中，免疫障碍是炎性肠病。
在一些实施方案中，免疫障碍是克罗恩氏病。
在一些实施方案中，免疫障碍是溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是佩罗尼氏病。
在一些实施方案中，免疫障碍是乳糜泄。
在一些实施方案中，免疫障碍是胆囊疾病。
在一些实施方案中，免疫障碍是藏毛病。
在一些实施方案中，免疫障碍是腹膜炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是牛皮癣。
在一些实施方案中，免疫障碍是牛皮癣关节炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是血管炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是手术粘连。
在一些实施方案中，免疫障碍是中风。
在一些实施方案中，免疫障碍是I型糖尿病。
在一些实施方案中，免疫障碍是莱姆病。
在一些实施方案中，免疫障碍是脑膜脑炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是自身免疫性葡萄膜炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是多发性硬化症。
在一些实施方案中，免疫障碍是狼疮。
在一些实施方案中，免疫障碍是系统性红斑狼疮。
在一些实施方案中，免疫障碍是格-巴二氏综合征。
在一些实施方案中，免疫障碍是特应性皮炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是自身免疫性肝炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是纤维性肺泡炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是格雷夫斯病。
在一些实施方案中，免疫障碍为IgA肾病。
在一些实施方案中，免疫障碍是特发性血小板减少性紫癜。
在一些实施方案中，免疫障碍是美尼尔氏病。
在一些实施方案中，免疫障碍是天疱疮。
在一些实施方案中，免疫障碍是原发性胆汁性肝硬化。
在一些实施方案中，免疫障碍是结节病。
在一些实施方案中，免疫障碍为硬皮病。
在一些实施方案中，免疫障碍是韦格纳氏肉芽肿病。
在一些实施方案中，免疫障碍是胰腺炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是移植排斥。
在一些实施方案中，免疫障碍是心脏病，包括缺血性心脏疾病诸如心肌梗死。
在一些实施方案中，免疫障碍是动脉粥样硬化。
在一些实施方案中，免疫障碍是血管内凝血。
在一些实施方案中，免疫障碍是骨吸收。
在一些实施方案中，免疫障碍是骨质疏松。
在一些实施方案中，免疫障碍是骨关节炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是牙周炎。
在一些实施方案中，免疫障碍是胃酸过少。
在一些实施方案中，免疫障碍是干燥综合症。
在一些实施方案中，免疫障碍是白癜风。
在一些实施方案中，免疫障碍是重症肌无力。
在一些实施方案中，免疫障碍是系统性硬化病。
还提供了一种治疗与炎症相关联的疼痛的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段以治疗与炎症相关联的疼痛。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在治疗中的使用。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在治疗免疫障碍中的使用。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在治疗类风湿性关节炎中的使用。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在治疗狼疮(诸如系统性红斑狼疮)中的使用。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在治疗移植物抗宿主病中的使用。
本发明还提供了本发明的特异性结合PD-1的抗体在制备用于治疗或预防免疫障碍的药物中的使用。
联合治疗
本文提供的抗体可与第二治疗剂组合施用。
第二治疗剂可以是任何已知的用于免疫障碍(诸如自身免疫性或炎性疾病)的疗法，包括已被使用或目前正在使用的用于治疗这些疾病的任何药剂或已知可用的药剂组合。此类疗法和治疗剂包括外科手术或手术治疗(例如脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆置换术、白细胞去除术、细胞、组织或器官移植、肠手术、器官灌注等)、放射疗法、诸如类固醇疗法和非类固醇疗法、激素疗法、细胞因子疗法之类的疗法，采用皮肤病药物的疗法(例如，用于治疗皮肤状况如过敏、接触性皮炎和牛皮癣的局部试剂)、免疫抑制疗法和其它抗炎单克隆抗体疗法。
第二治疗剂可为皮质类固醇、抗疟药、免疫抑制剂、细胞毒性药物或B细胞调节剂。
在一些实施方案中，第二治疗剂是泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地夫可特、羟化氯喹、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环磷酰胺、麦考酚酸莫酯(MMF)、霉酚酸钠、环孢霉素、来氟米特、他克莫司、利妥昔单抗或贝利单抗/>
在一些实施方案中，将本发明的抗体与第二治疗剂组合施用。示例性第二治疗剂是皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、羟化氯喹、柳氮磺吡啶、细胞毒性药物、免疫抑制药物、免疫调节抗体、甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506；ProGrafrM)、麦考酚酸莫酯和硫唑嘌呤(6-巯嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特及其丙二腈酰胺类似物；抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激因子抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和CTLA4-Ig融合物(BLyS-lg)、抗-CD80抗体、抗-T细胞抗体(诸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4)、皮质类固醇(诸如例如氯倍他索、乌倍他索、氢化可的松、曲安西龙、倍他米松、氟新诺龙、氟轻松醋酸酯、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼松)；非甾体抗炎药(NSAID)诸如例如柳氮磺吡啶、含有氨水杨酸的药物(称为5-ASA药剂)、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、吡罗昔康、罗非考昔、水杨酸盐、舒林酸和托美丁；磷酸二酯酶-4抑制剂、抗-TNFα抗体英夫利昔戈利木单抗/>和阿达木单抗/>沙利度胺或其类似物，诸如来那度胺。
本发明的抗体可与第二治疗剂组合同时、按顺序施用或单独施用。
RA的治疗效果可使用效果进行评定，如由美国风湿病学学院(American Collegeof Rheumatology)标准/欧洲风湿病联合会(European League ofRheumatism)标准或任何其他标准定义的临床反应所测。参见例如Felson等人(1995)Arthritis Rheum.38：727-35和van Gestel等人1996年，Arthritis Rheum.39：34-40。
虽然已经概括地描述了本发明，但是本发明的实施方案还将在以下实施例中进一步公开，以下实施例不应理解为限制权利要求的范围。
实施例1.方法
使用表面等离振子共振(SPR)进行的亲和力测量
使用ProteOn XPR36系统(BioRad)进行亲和力测量。通过使用制造商针对胺偶联化学的说明，将抗人IgG Fc(Jackson目录号109-005-098)与GLC芯片(BioRad，目录号176-5011)的修饰藻酸盐聚合物层表面偶联来制备生物传感器表面。将大约5000RU(应答单位)的mAb固定。在25℃下在运行缓冲液(DPBS+0.01％P20+100μg/mL BSA)中进行动力学实验。为了进行动力学实验，捕获200RU的mAb，然后以1.563nM至400nM范围内的浓度(以4倍系列稀释度)注射分析物(人和食蟹猕猴PD-1)。以50μL/min监测缔合阶段3分钟，接着使缓冲液流动10或15分钟(解离阶段)。在100μL/min下，用100mM H3PO4(Sigma，目录号7961)的两个18秒的脉冲，使芯片表面再生。
使用ProteOn Manager软件处理采集的数据。首先，利用区间(inter-spots)对数据进行背景校正。然后，对于分析物注射，使用缓冲液注射来实施数据的双基准减法。使用朗缪尔1∶1结合模型进行数据的动力学分析。每个mAb的结果以ka(缔合率)、kd(解离率)和KD(平衡解离常数)的格式记录。
抗原特异性T细胞的抑制：细胞巨化病毒(CMV)诱导的外周血单核细胞(PBMC)活化 测定(“CMV-PBMC”)
利用CMV特异性回忆应答的测定用于评定所产生的抗体抑制通过在用CMV肽混合物(JPT Technologies)处理CMV反应性供体的PBMC时抑制细胞增殖所测量的T细胞活化的能力。
经测定，PBMC(Astarte Biologics、Hemacare、Precision for Medicine)对相应供应商的CMV抗原有反应性。PBMC的冷冻小瓶购自供应商并置于液氮中。在实验当天，将冷冻PBMC的等分试样解冻并将细胞重悬于10mL测定培养基(包含1％青霉素/链霉素、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸(NEAA)溶液、10％加热灭活的胎牛血清的RPMI-1640/Glutamax/HEPES(全部购自Thermo Fisher Scientific))中。将细胞在室温下以200g离心15分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于10mL测定培养基中，并以250g旋转搅拌10分钟。离心后，将细胞重悬于10mL测定培养基中，通过70μm滤网并计数。将细胞浓度调节至1.5×106个细胞/mL或2×106个细胞/mL，并且使用经组织培养物处理的圆底96孔板(Coming)以100μl/孔接种细胞。接种细胞密度是特定于供体的，并且在初步实验中预先确定以最大化测定窗口。根据制造商的说明书来制备CMV肽混合物。简而言之，将40μL二甲基亚砜(Sigma)添加到盛有25μg CMV肽混合物冻干粉末的小瓶中，并且轻轻地移取以溶解试剂。将CMV肽混合物的DMSO原液在PBS中稀释以制备50μg/mL溶液，并且在室温下静置10min。在测定培养基中以4倍最终浓度进一步稀释，并且将50μL的CMV肽溶液添加到每个受刺激孔中；而未受刺激的对照孔接收到未补充的培养基。在初步实验中针对特定供体PBMC优化最终浓度(0.1-0.2μg/mL)。以在测定培养基中以4倍最终浓度连续稀释的10μg/mL的单一剂量添加抗-PD-1抗体，并且将50μL抗体稀释液添加至每个孔，而“无抗体”对照孔接收到50μl培养基。将板在37℃/5％CO2下温育6天。温育后，从每个孔收集100μL上清液，并将100μL含有1μCi/孔的甲基-3H-胸苷(PerkinElmer)的测定培养基加入每个孔中，并且将板在37℃/5％CO2下温育6小时。将细胞收获到Unifilter-96，GF/C板(PerkinElmer)上，使其在室温下干燥过夜。将50μLMicroscint-20(PerkinElmer)添加到每个孔中。将板密封并使用TopCount NXT(PerkinElmer)计数。
抑制细胞聚集以确定抗体的受体-配体阻断能力
利用过表达PD-1(PD-1-HEK细胞)或PD-1配体PD-L1(PD-L1-HEK细胞)或PD-L2(PD-L2-HEK细胞)的人胚肾(HEK)细胞的1∶1混合物的测定用于评定所产生的抗体在基于细胞的背景中抑制受体：配体相互作用的能力，这通过抑制如由流式细胞术定量的细胞聚集测量。
用Violet Cell Trace染色剂(Life Technologies)标记过表达人PD1(CrownBio)的HEK细胞。用Far Red Cell Trace染色剂(Life technologies)标记过表达食蟹猕猴PD-L1或PD-L2的HEK细胞。简而言之，将染料溶解于20μL DMSO中以制备5mM原液，然后将5μL稀释到10mL PBS中以制备2.5μM溶液。对细胞计数，并在室温下以1000rpm将50×106个细胞离心5分钟。将细胞在PBS中洗涤一次，并且留出1×106个细胞作为未染色对照。重复离心后，弃去上清液，并且将细胞重悬于上述适当的染料溶液中并在室温下温育15分钟。接着加入4mL冰冷胎牛血清(FBS)，并且再温育5分钟。然后如上所述将细胞离心，在测定缓冲液(PBS，10％FBS，1mM EDTA)中洗涤一次，再次离心并且抽吸上清液，然后将每种细胞类型以3×106个细胞/mL重悬于测定缓冲液中。将测试抗体在测定缓冲液中稀释三倍至最终期望浓度(60μg/mL)。为了制备最终的细胞/抗体样本(一式三份)，将100μL PD-1-HEK细胞与100μ抗体混合。温育10分钟后，加入100μL PD-L1-HEK或PD-L2-HEK细胞，并且将最终混合样本在冰上温育最少一小时。最后，加入5μL碘化丙啶并轻轻混合样本，将其转移至聚苯乙烯圆底管中，并且在LSRII流式细胞仪(BD Bioscience)上进行分析。在对活细胞进行门控事件之后，使用Flowjo软件测定(对于Pacific Blue和APC通道)双阳性事件百分比，并在GraphPadPrism 6中作图。将如由双阳性事件的百分比测量的抗-PD-1mAb的聚集水平与阳性和阴性同种型对照抗体进行比较。
Octet表位分箱
在基于生物层干涉测量法的Octet Red384平台(Forte bio)上用竞争结合测定进行抗体的表位分箱。该技术测量初始抗体与经PD-1涂覆的生物传感器的结合，作为由于结合的抗体随时间推移增加生物传感器尖端的光密度而导致的波长偏移。简而言之，将组氨酸标记的PD-1抗原装载到HIS传感器上。然后将传感器暴露于20μg/mL的第一抗-PD-1抗体，之后暴露于相等浓度的第二抗-PD-1抗体。使用ForteBio数据分析软件处理数据。在用第一抗体饱和后被第二抗体附加结合指示两种抗体的同时结合，这两种抗体必须具有独特的不重叠表位。另选地，不被附加结合指示这两种抗体竞争结合PD-1抗原。
抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)
人记忆T细胞(靶细胞)的活化：
将人记忆T细胞(AllCells LLC)的冷冻等分试样在37℃水浴中解冻并重新悬浮于40mL培养基(RPMI+10％FBS或5％HuSAB+50μM βME(1∶1000)+1％GlutaMax+10mM Hepes)中。将细胞在室温下以250g离心15分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于10mL培养基中，并以250g旋转搅拌10分钟。离心后，将细胞重悬于10mL测定培养基中，并计数。将细胞浓度调节至1.0×106个细胞/mL，并且将10mL细胞悬浮液转移至预先涂覆有抗CD3抗体的组织培养板(eBioscience，5μg/mL的PBS溶液，37℃下1小时)。培养基补充有2μg/mL抗-CD28 Ab(eBioscience)和IL-2、IL-15和IL-7细胞因子(R&D Systems和Peprotech)在100ng/mL浓度下的混合物。初步实验表明，PD-1表达在活化后5天时达到峰值，因此选择该时间点进行测定。刚分离的静息记忆T细胞(未被CD3/CD28刺激活化)也包括在分析中作为对照，因为它们表达低水平的PD-1。
效应细胞(NK92.CD16和PBMC)的制备：
让NK-92细胞在直立保存的组织培养瓶中生长，并以0.5-1.0×106个细胞/mL的密度保持在40mL培养基(Myelocult H5100(StemCell Technologies)、1倍丙酮酸钠/非必需氨基酸/青霉素-链霉素(Invitrogen)、4μM氢化可的松(StemCell Technologies)、100ng/mL rhIL-2(R&D Systems))中。在实验前一天将冷冻PBMC细胞(Hemacare)解冻，并重悬于XVIVO-10培养基(Lonza)、10％HI FBS(Invitrogen)和100ng/mL IL2(R&D Systems)中。将细胞在室温下以250g离心15分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于10mL培养基中，并以250g旋转搅拌10分钟。离心后，将细胞重悬于10mL培养基中并计数。将细胞浓度调节至1.0×106个细胞/mL，并且将所需数量的细胞接种在TC培养皿中。
在测定当天，收获PBMC细胞和NK细胞并分别以1×107个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于测定培养基(RPMI，10％FBS，1mM丙酮酸钠，0.1mM NEAA)中。将记忆T细胞洗涤一次，以1×106个细胞/mL重悬，并且在37℃下每毫升细胞用6μL BATDA(Perkin Elmer)标记30分钟。用过量的冷测定培养基将BATDA标记的细胞洗涤三次，并且将其密度调节至0.2×106个细胞/mL。在测定培养基中制备始于20μg/mL的测试Ab的系列稀释液(100μL，2倍最终浓度)，并将其递送至U形底部96孔测定板。以0.2×106个细胞/mL添加BATDA标记的靶细胞(50μL)，并将其与测试mAb一起温育。对于50∶1效应细胞∶靶细胞比率，以1×107个细胞/mL添加PBMC(50μL)，而对于20∶1效应细胞∶靶细胞比率以4×106个细胞/mL添加NK细胞(50μL)。一式三份建立盛有标记靶细胞和20μL 2％Triton X-100的最大裂解对照孔。另外一式三份建立盛有测定培养基中的标记靶细胞的最小(背景BATDA释放)对照孔。所有测定板孔中的最终体积为200μL。用移液管轻轻混合孔内容物。将板短暂旋转搅拌，并且在37℃下于5％CO2培养箱中温育2.5小时。在温育之后，将细胞以1200rpm旋转5分钟。将上清液(30μL)转移到盛有200μL铕溶液(PerkinElmer，C135-100)的96孔白色不透明Nunc板(ThermoFisher，136101)中。将板盖上以避光，并且在摇动器上混合15分钟。在Envision多标记读取器(PerkinElmer)上读取样本。如下计算裂解百分比：100*(实验释放一背景释放)/(最大释放一背景释放)。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
将人Pan T细胞(Biological Specialty，LSII 49301C)的冷冻等分试样在37℃水浴中解冻，并且重悬于40mL预热的RPMI 1640+Glutamax+25mM HEPES(Life Technologies，目录号72400-047)+10％FBS(Gibco，160000-36)中。将细胞在RT下以250g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于10mL-20mL培养基中并计数。在CDC测定之前，使用人T活化剂CD3/CD28 DynabeadsTM(Life Technologies，目录号11132D)将人Pan T细胞(BiologicalSpecialty，LSII 49301C)活化5-6天。简而言之，将75μL预清洗的Dynabeads与6.0×106个细胞/烧瓶的T细胞混合，加入在10-20mL培养基中的T175中，并且在37℃/5％CO2培养箱中温育6天。6天后，使用EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies，18000)从混合物中取出微珠。
在准备进行CDC测定时，将细胞在室温下以250g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于10mL无血清培养基中并计数。在无血清培养基中将细胞浓度调节至1.6×106个细胞/mL，并且以50μL/孔接种在96孔U形底部板(Falcon，353077)中。从25μg/mL(3倍)开始，将测试抗体在无血清培养基中以1∶3连续稀释十一个点。将50μL/孔的测试抗体加入适当的靶细胞孔中。将50μL/孔的无血清培养基加入背景孔和裂解对照孔中。将板盖上并且在室温(RT)下温育1小时。将50μL/孔的在无血清培养基中稀释的10％(3倍)兔补体(Invitrogen，31038-100)加入测试孔中。将50μL/孔的无血清培养基加入背景对照孔中。将50μL/孔的在无血清培养基中的2％Triton-X加入裂解对照孔中。将板在37℃/5％CO2下温育60分钟。将细胞以250g旋转搅拌5分钟。取出50μL/孔的上清液并将其转移到96孔平底UV-Vis板(Coming，3635)中。将50μL/孔的LDH检测试剂(Roche，11-644-793-001)加入每个样本中；将板盖上并且在RT下温育15分钟。在SpectraMax Plus M5(Molecular Devices)上记录490nm和650nm处的吸光度。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 6进行统计分析。将490nm处的吸光度减去650nm处的吸光度，以归一化浊度。使用以下公式确定每个样本的细胞毒性百分比(％)：
(实验值-低对照)/(高对照-低对照)×100
其中高对照是Triton-X裂解对照孔的平均值，并且低对照是“仅培养基”背景对照孔的平均值。在GraphPad Prism中，将四参数逻辑曲线拟合模型[log(激动剂)对应答-变量斜率(四个参数)]施加至Ab浓度的log10对所计算的细胞毒性％。将样本一式两份地进行实验，并进行两次测定。
为了确认靶表达，在活化后第5天或第6天，通过流式细胞术测量活化的人Pan T细胞上的PD-1水平。简而言之，将T细胞以250g离心5分钟，并以1×106个细胞/mL重悬于BSA染色缓冲液(BD Biosciences，554657)中。在100μL总体积中用饱和浓度的PE-PD-1 Ab(Biolegend，329906)温育100-200K个细胞。用BSA染色缓冲液将细胞洗涤2次，并重悬于等体积的包含DRAQ7活/死染色剂(Cell Signaling Technology，7406S)的缓冲液中。在MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪上记录5K个活细胞事件的中值荧光强度。使用标准曲线确定受体水平并将其表示为每个细胞结合的抗体，该标准曲线使用QuantibriteTM PE微珠(BD，340495)产生。
实施例2.特异性结合PD-1的激动性抗体的产生及其结构表征
用缀合至Fc的人PD-1(SEQ ID NO：1)(huPD-1-Fc)的胞外域(ECD)和使用标准方案产生的杂交瘤来免疫三只Balb/c小鼠和三只C3H小鼠。通过ELISA筛选结合重组PD-1(ECD)的杂交瘤。命中被定义为ELISA信号为阴性对照平均值的五倍的样本。交叉筛选针对不相关Fc融合蛋白和结合小鼠PD-1的阳性克隆。测试来自单细胞克隆的杂交瘤的上清液对人PD-1和食蟹猕猴PD-1蛋白质的结合。命中被定义为信号大于阴性对照的平均值+3S.D.。
将选择的小鼠抗体克隆为到人IgG1中的嵌合mAb，并根据实施例1中所述的方案在CMV回忆测定(CMV-PBMC测定)中测试它们抑制抗原特异性T细胞活化的能力。图1A和图1B示出，大多数测试抗体以超过50％或更高的水平抑制T细胞增殖。PD1B199是拮抗性抗-PD1mAb。CNTO3930：同种型对照。
SEQ ID NO：1PD-1ECD
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
SEQ ID NO：131FL成熟PD-1
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
实施例3.抗-PD-1抗体的人源化
将包括PD1B505、PD1B506和PD1B512在内的几个亲本抗体人源化。为了寻找人源化VH和VL的最佳组合，为每个抗体选择一种或多种人种系重链和轻链V区序列。通过将亲本J片段序列与人J片段序列进行比较来选择用于每个亲本抗体的VL和VH的人J片段以最大化序列同一性。找出每个抗体的所有VH/VL人源化对并在基质中作为粗制上清液测试其抗原结合和蛋白质表达。基于这些数据，将展示与亲本小鼠抗体相当或比亲本小鼠抗体改善的PD-1结合的抗体纯化，并测试其在CMV-PBMC测定中的功效。
分析所产生的抗体可能的不期望翻译后修饰风险。通过诱变移除位于CDR中的高风险脱酰胺基基序和抗体中任何位置的游离半胱氨酸，并且在CMV-PBMC测定中测试所得抗体与PD-1的结合和功效。
将人源化抗体及其变体克隆为IgG1。
表3示出了所产生的抗体。表4示出了抗体的VH、VL、HC和LC氨基酸序列的SEQ IDNO：。表5示出了抗体的编码VH、VL、HC和LC的多核苷酸序列的SEQ ID NO：。表6示出了抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的SEQ ID NO：。表7示出了抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。表8示出了抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。表9示出了抗体的VH和VL氨基酸序列。表10示出了抗体的编码VH的多核苷酸序列。表11示出了抗体的编码VL的多核苷酸序列。表12示出了HC氨基酸序列。表13示出了LC氨基酸序列。表14示出了抗体的编码HC的多核苷酸序列。表15示出了抗体的编码LC的多核苷酸序列。
表3.
mAb 抗体来源 VH名称 VL名称
PD1B505 亲本 PD1H93 PD1L30
PD1B742 人源化PD1B505 PD1H384 PD1L468
PD1B743 人源化PD1B505 PD1H384 PD1L469
PD1B878 PD1B743的C84S变体 PD1H405 PD1L469
PD1B506 亲本 PD1H90 PD1L28
PD1B750 人源化PD1B506 PD1H388 PD1L470
PD1B751 人源化PD1B506 PD1H388 PD1L471
PD1B845 PD1B750的G56A变体 PD1H399 PD1L470
PD1B846 PD1B750的N55D、G56A变体 PD1H400 PD1L470
PD1B847 PD1B750的N55Q变体 PD1H401 PD1L470
PD1B848 PD1B750的N55K变体 PD1H402 PD1L470
PD1B849 PD1B750的N55E变体 PD1H403 PD1L470
PD1B850 PD1B750的G56I变体 PD1H404 PD1L470
PD1B512 亲本 PD1H81 PD1L43
PD1B756 人源化PD1B512 PD1H389 PD1L472
PD1B757 人源化PD1B512 PD1H389 PD1L473
表4.
表5.
表6.
抗体 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
PD1B505 2 3 4 5 6 7
PD1B742 2 3 4 5 6 7
PD1B743 2 3 4 5 6 7
PD1B878 2 3 4 5 6 7
PD1B506 32 33 40 41 42 43
PD1B750 32 33 40 41 42 43
PD1B751 32 33 40 41 42 43
PD1B845 32 34 40 41 42 43
PD1B846 32 35 40 41 42 43
PD1B847 32 36 40 41 42 43
PD1B848 32 37 40 41 42 43
PD1B849 32 38 40 41 42 43
PD1B850 32 39 40 41 42 43
PD1B512 88 89 90 91 92 93
PD1B756 88 89 90 91 92 93
PD1B757 88 89 90 91 92 93
表7.
表8.
表9.
/>
/>
表10.
/>
/>
/>
表11.
/>
/>
表12.
/>
/>
/>
表13.
/>
表14.
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表15.
/>
/>
编码本文提供的抗体VH、VL、HC和LC的cDNA序列可经密码子优化以在各种细胞中表达，例如在HEK或CHO细胞中表达。可用于编码和表达PD1B878和PD1B849 VH、VL、HC和LC的另外的cDNA序列如下所示。
SEQ ID NO：132 PD1B878 VH cDNA
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACAGGCGAGCCCACATACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCGTGTTCAGCCTGGACACCTCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTTCTTCT
SEQ ID NO：133 PD1B878 VL cDNA
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTACCGCCAGCAGCTCTGTGTCCAGCAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCATCCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTACACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACAGAAGCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO：134 PD1B878 HC cDNA
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACAGGCGAGCCCACATACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCGTGTTCAGCCTGGACACCTCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：135 PD1B878 LC cDNA
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTACCGCCAGCAGCTCTGTGTCCAGCAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCATCCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTACACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACAGAAGCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO：136 PD1B849 VH cDNA
CAAGTGCAGCTGGTGCAATCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCACCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAGTGGATGGGCGAGATCAACCCCAATGAAGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGTGGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGATCCGATGACACCGCCGTGTACTACTGCACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTTACAGTGTCCTCT
SEQ ID NO：137 PD1B849 VL cDNA
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAATGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGAAGGCCCCTAAGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO：138 PD1B849 HC cDNA
CAAGTGCAGCTGGTGCAATCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCACCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAGTGGATGGGCGAGATCAACCCCAATGAAGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGTGGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGATCCGATGACACCGCCGTGTACTACTGCACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTTACAGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：139PD1B849 LC cDNA
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAATGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGAAGGCCCCTAAGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
图2A和图2B分别示出了PD1B505谱系mAb的VH和VL氨基酸序列的比对。
图3A和图3B分别示出了PD1B506谱系mAb的VL和VL氨基酸序列的比对。
图4A和图4B分别示出了PD1B512谱系mAb的VH和VL氨基酸序列的比对。
实施例4.人源化抗-PD-1抗体抑制抗原特异性T细胞
选择的人源化抗体的特征在于它们在CMV特异性回忆测定(实施例1中所述的CMV-PBMC测定)中抑制活化T细胞的能力。亲本抗体PD1B505和PDlB506显示出在几个单独实验中在三个不同供体上评定的对活化T细胞的稳健抑制，如表16所示，其中结果以在10μg/mLmAb下抑制T细胞增殖的百分比(％)示出。图5A示出了在与同种型对照(人IgG1)(-9.5％±28.8％)进行比较时，PD1B505(57.8％±9.5％)和PD1B506(77.0％+/-7.8％)的平均抑制％和标准偏差。人源化抗体PD1B743、PD1B750和PD1B756也抑制T细胞活化，如表17中所示的10μg/mL下的抑制％。图5B示出了在与同种型对照(人IgG1)(3.5％±25.6％)进行比较时，平均抑制％和标准偏差分别为PD1B743(58.0％±11.3％)、PD1B750(65.9％±13.2％)、PD1B756(36.7％±15.5％)。显示超过25％标准偏差的测定被排除在分析之外。工程化抗体PD1B878和PD1B849类似地抑制活化T细胞，如表18所示。图5C示出了在与同种型对照(人IgG1)(4.1％±28.7％)进行比较时，平均抑制％和标准偏差分别为PD1B878(78.3％±18.1％)和PD1B849(69.0％±4.0％)。
表16.
表17.
表18.
实施例5.PD-1抗体以高亲和力结合人PD-1S
使用如实施例1所述的SPR测量亲本抗体和人源化抗体对PD-1的亲和力。
表19示出了亲和力测量的结果。抗体以介于约5.2×10-8M和2.1×10-8M之间的范围内的KD结合PD-1。
表19.
实施例6.PD-1抗体有差别地阻断PD-1/配体相互作用
通过使用实施例1中所述的方案评估抗体对过表达PD-1或PD-1配体(PD-L1或PD-L2)的细胞的聚集的影响来评定配体阻断。所记录的双阳性事件的百分比(％)较低表明所测试的mAb阻断PD-1结合至所测试的配体。
图6A示出了在用PD1B743、PD1B750或PD1B756处理细胞之后保留的PD-1-HEK和PD-L1-HEK细胞群％。PD1B743和PD1B756不阻断PD-L1结合至PD-1，而PD1B750阻断PD-L1结合至PD-1。类似地，PD1B743和PD1B756不阻断PD-L2结合至PD-1，而PD1B750阻断PD-L2结合至PD-1(图6B)。阻断mAb的已知抗-PD-1配体用作实验中的阳性对照。
实施例7.抗体的表位分箱
遵循实施例1中所述的方案，使用嵌合抗体在初始基质测定中鉴定五个不同的表位分箱。分箱4和5不与任何其他分箱交叉竞争。分箱1、2和3部分重叠；分箱1与分箱2和3竞争，并且分箱2和3与分箱1竞争。分箱1、2、3和4不阻断PD-L1结合至PD-1，而分箱5阻断PD-L1/PD-1相互作用。图7示出了不同的表位分箱和每个分箱内的抗体。
进行以同种型对照作为添加的第一抗体的对照实验，以表明第二抗体将如何单独结合至人PD-1。然后在竞争实验中，在该步骤开始后180秒时采集第二抗体的缔合信号(nm)。将每种潜在竞争抗体的信号与在同种型对照之后添加的相同抗体的3次运行的信号的平均值进行比较。确定这些信号的比率。如果该比率低于0.7，则确定第二抗体不能结合至人PD-1并且两种抗体共享相同表位。如果该比率大于0.7，则确定第二抗体可在存在第一抗体的情况下结合，并因此两种抗体结合至非竞争表位。
预计人源化和PTM工程化不会导致表位偏移，因此预计PD1B743、PD1B742和PD1B878与亲本嵌合分箱1 PD1B505结合相同的表位。类似地，预计PD1B750、PD1B751和PD1B849与亲本嵌合分箱5PD1B506结合相同的表位，并且预计PD1B756与亲本嵌合分箱2PD1B512结合相同的表位。
PD1B503包含分别为SEQ ID NO：114和115的VH和VL。
PD1B517包含分别为SEQ ID NO：116和117的VH和VL。
SEQ ID NO：114PD1B503 VH(PD1H96)
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGSTKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQFSRLTSEDSAVYFCARGGMRQLGRFVYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：115PD1B503 VL(PD1L32)
DIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASNPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：116PD1B517 VH(PD1H73)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNVKDTYFHWVKQRPDQGLEWIGRIVSANGDTKYAPKLQDKATITTDTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCVLIYYGFEEGDFWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：117PD1B517 VL(PD1L34)
DIVMTQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNVPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLNISSLQPEDIATYYCQQGQSFPLTFGAGTKLELK
实施例8.PD1B878的亲和力成熟
为改善PD1B878的结合亲和力，对重链和轻链都进行CDR扫描。设计非组合库以使所有六个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的每个位置多样化。
简而言之，在pIX噬菌体Fab展示系统中构建Fab文库，如WO2009/085462；Shi等人，J Mol Biol，第397卷，第385-396页，2010年；以及Tornetta等人，J Immunol Methods，第360卷，第39-46页，2010年中所述，并且对限制性酶位点进行微小修饰。根据本领域已知的淘选方案，诸如WO2009/085462和Shi等人，J Mol Biol，第397卷，第385-396页，2010年中所述，针对生物素酰化人PD-1/PDCD1(Acro Biosystems，目录号PD1-H82E4)对这些文库进行淘选。噬菌体通过辅助噬菌体感染产生。通过添加珠形成珠/抗原/噬菌体复合物来回收结合子。在最终洗涤后，通过感染指数生长的TG-1大肠杆菌细胞拯救噬菌体。
对于后续淘选，由TG-1大肠杆菌细胞的过夜培养物制备质粒DNA，并且通过NheI/SpeI消化切除pIX基因。在连接后，将所述DNA转化到TG-1细胞内，并且在LB/琼脂平板上生长过夜。第二天，挑取集落，使其生长过夜，并且该培养物用于(i)集落V区测序；以及(ii)诱导Fab产生。对于Fab生产，将过夜培养物在新培养基中稀释100倍，并在37℃下生长5-6小时。通过加入包含IPTG的新鲜培养基诱导Fab产生，并且培养物在30℃下生长过夜。第三天，将培养物旋转搅拌，并且将包含可溶性Fab蛋白质的上清液用于Fab ELISA。对于ELISA，通过多克隆抗Fd(CH1)抗体，将所述可溶性Fab蛋白捕获到板上。在洗涤和阻断后，以5nM浓度加入生物素酰化的人PD-1/PDCD1。这个浓度能分级Fab变体，其定义为相对于亲本的倍数变化，其中所有平板中作为对照存在的亲本Fab被定义为100％结合。利用在读板机中测量的化学发光，通过HRP缀合的链霉抗生物素蛋白来检测生物素酰化的人PD-1。按照该标准，选择相对于亲本Fab以10倍或更高结合人PD-1的3条重链和2条轻链。
表20示出了在VH的HCDR2中的位置57处和在VL的LCDR1中的位置29或30处具有置换的变体。表21示出了抗体的CDR的SEQ ID NO：。表22示出了VH、VL、HC和LC氨基酸序列的SEQ ID NO：。表23示出了抗体的编码VH、VL、HC和LC的多核苷酸的SEQ ID NO：。表24示出了HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。表25示出了LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。表26示出了VH氨基酸序列。表27示出了VL氨基酸序列。预计亲和力成熟的变体结合PD-1上的与亲本抗体PD1B878相同的表位。
表20.
mAb ID VH肽ID 相比于亲本的VH突变 VL肽ID 相比于亲本的VL突变
PD1B1085 PD1H585 E57Y PD1L469
PD1B1086 PD1H586 E57H PD1L469
PD1B1087 PD1H587 E57W PD1L469
PD1B1088 PD1H405 PD1L651 V29F
PD1B1089 PD1H405 PD1L652 S30P
PD1B1090 PD1H585 E57Y PD1L651 V29F
PD1B1091 PD1H586 E57H PD1L651 V29F
PD1B1092 PD1H587 E57W PD1L651 V29F
PD1B1093 PD1H585 E57Y PD1L652 S30P
PD1B1094 PD1H586 E57H PD1L652 S30P
PD1B1095 PD1H587 E57W PD1L652 S30P
表21.
抗体 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
PD1B1085 2 145 4 5 6 7
PD1B1086 2 146 4 5 6 7
PD1B1087 2 147 4 5 6 7
PD1B1088 2 3 4 148 6 7
PD1B1089 2 3 4 149 6 7
PD1B1090 2 145 4 148 6 7
PD1B1091 2 146 4 148 6 7
PD1B1092 2 147 4 148 6 7
PD1B1093 2 145 4 149 6 7
PD1B1094 2 146 4 149 6 7
PD1B1095 2 147 4 149 6 7
表22.
表23.
表24.
表25.
/>
表26.
表27.
SEQ ID NO：150PD1B1085、PD1B1090、PD1B1093 HC
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLEWMGWINIETGYPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：151PD1B1086、PD1B1091、PD1B1094 HC
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLEWMGWINIETGHPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：152PD1B1087、PD1B1092、PD1B1095 HC
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLEWMGWINIETGWPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：153PD1B1088、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSFSSSYLHWYQQKPGLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：154PD1B1089、PD1B1093、PD1B1094、PD1B1095 LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVPSSYLHWYQQKPGLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：155PD1H585 cDNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTATCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT
SEQ ID NO：156 PD1H586 cDNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCCATCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT
SEQ ID NO：157 PD1H587 cDNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTGGCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT
SEQ ID NO：158 PD1L651 cDNA
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCTTCAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO：159 PD1L652 cDNA
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGCCAAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO：160 PD1B1085、PD1B1090、PD1B1093 HC cDNA
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTATCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
SEQ ID NO：161 PD1B1086、PD1B1091、PD1B1094 HC cDNA
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCCATCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
SEQ ID NO：162PD1B1087、PD1B1092、PD1B1095 HC cDNA
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTGGCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
SEQ ID NO：163 PD1B1088、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092 LCcDNA
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCCGAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCTTCAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTGATTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
SEQ ID NO：164 PD1B1089、PD1B1093、PD1B1094、PD1B1095 LCcDNA
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCCGAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGCCAAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTGATTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
使用如实施例1所述的SPR测量抗体对人PD-1和食蟹猕猴PD-1的亲和力。抗体以介于1×10-8M至10×10-10M之间范围内的KD结合人PD-1(表28)并且以介于7×10-8M至1×10-9M之间范围内的KD(表26)结合食蟹猕猴PD-1。当与亲本抗体进行比较时，大多数亲和力成熟的PD1B878变体的亲和力提高约100倍。
表28.
mAb ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PD1B1085 1.56E+05 1.42E-04 9.11E-10
PD1B1086 1.24E+05 3.94E-04 3.19E-09
PD1B1087 1.66E+05 2.39E-04 1.44E-09
PD1B1088 3.13E+04 3.41E-04 1.09E-08
PD1B1089 5.86E+04 4.74E-04 8.09E-09
PD1B1090 1.06E+05 2.37E-05 2.23E-10
PD1B1091 7.77E+04 6.44E-05 8.30E-10
PD1B1092 1.40E+05 3.00E-05 2.14E-10
PD1B1093 1.25E+05 4.36E-05 3.49E-10
PD1B1094 1.05E+05 9.16E-05 8.71E-10
PD1B1095 1.51E+05 7.12E-05 4.71E-10
表29.
mAb ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PD1B1085 2.00E+05 1.29E-03 6.45E-09
PD1B1086 1.71E+05 5.44E-03 3.18E-08
PD1B1087 2.12E+05 2.47E-03 1.16E-08
PD1B1088 6.61E+04 4.79E-03 7.24E-08
PD1B1089 9.32E+04 8.39E-03 9.00E-08
PD1B1090 1.30E+05 1.85E-04 1.43E-09
PD1B1091 9.91E+04 9.24E-04 9.32E-09
PD1B1092 1.29E+05 4.11E-04 3.18E-09
PD1B1093 1.69E+05 3.68E-04 2.18E-09
PD1B1094 1.35E+05 1.62E-03 1.20E-08
PD1B1095 1.85E+05 7.81E-04 4.23E-09
PD1B1086、PD1B1090和PD1B1094的特征在于它们在CMV特异性回忆测定(实施例1中所述的CMV-PBMC测定)中抑制活化T细胞的能力。表30示出了一个实验中在两个供体上的平均抑制百分比。所有测试的抗体均以70％或更大的程度抑制CMV特异性回忆测定。
表30.
PD1B1086 PD1B1090 PD1B1094 IgG1
平均％ 72.7 74.8 77.9 6.0
实施例9.PD-1激动性抗体选择性地靶向长期活化的记忆T细胞
发现PD-1主要在记忆T细胞(CD45RO+细胞)上表达，而不在初始T细胞上表达，并且发现在T细胞活化时上调该表达。在用CMV肽刺激的记忆T细胞上，PD-1表达有所增加(图8A)。
利用CMV活化的PBMC，测试抗体PD1B849和PD1B878抑制活化记忆CD4+或CD8+ T细胞增殖的能力。在CMV-PBMC回忆测定中，PD1B849和PD1B878均抑制CMV特异性活化的PBMC的增殖(图8B)。
实施例10.PD-1激动性抗体通过ADCC耗尽活化的但不是静息的记忆T细胞
使用NK细胞或PBMC作为效应细胞，测试PD1B849和PD1B878介导活化的记忆T细胞或静息记忆T细胞的ADCC的能力。经鉴定，当与静息记忆T细胞进行比较时活化的记忆T细胞具有更高的PD-1表达。根据实施例1所述的方案进行实验。PD1B849和PD1B878在两个单独的CHO细胞系中表达，其中一个细胞系产生具有正常CHO抗体糖基化特征的抗体，另一个细胞系(例如，低岩藻糖(LF)细胞系)产生具有降低的碳水化合物岩藻糖基含量的抗体。在低岩藻糖细胞系中表达的抗体具有约1-15％的岩藻糖基含量。
PD1B849和PD1B878在存在NK(图9A，左图)细胞和存在PBMC(图9A，右图)效应细胞两种情况下均引起活化记忆T细胞的ADCC。具有低岩藻糖含量(PD1B849-LF和PD1B878-LF)的抗体表现出对记忆T细胞更强的ADCC活性。PD1B849和PD1B878在存在NK细胞(图10A，左图)或在存在PBMC(图10B，右图)效应细胞的情况下都不能在表达低水平PD-1的静息记忆T细胞中引起可检测到的ADCC。PD1B849-LF和PD1B878-LF在存在NK细胞或PBMC的情况下触发低水平ADCC。
实施例11.PD-1激动性抗体不引起CDC
使用添加的兔补体，测试PD1B849和PD1B878介导活化的pan T细胞的CDC的能力。当与静息T细胞进行比较时活化的T细胞具有更高的PD-1表达。根据实施例1所述的方案进行实验。PD1B849和PD1B878在所测试的浓度下不引起活化T细胞的CDC(图11)。阳性对照OKT3显示出在存在而不是不存在补体的情况下对活化T细胞的CDC活性。
实施例12.亲和力成熟的抗体不阻断PD-L1结合PD-1
测试选择的抗体阻断dextramer化的PD-L1-Fc与表达PD-1的Jurkat细胞结合的能力。根据下面描述的方案进行实验。PD1B878、PD1B1090和PD1B1094在所测试的浓度下不阻断PD-L1的结合(图12)。作为阳性对照，已知拮抗性抗体显示以剂量依赖性方式与PD-L1竞争结合PD-1。
方法：以4倍浓度制备生物素酰化的PD-L1-Fc(Acro Biosystems)和SA&APC缀合的Dextramer(Immudex)，并在染色缓冲液中以100nM：10nM的比例混合。以与阴性或非特异性结合对照相同的方式制备生物素酰化IgG1-Fc与Dextramer以及Dextramer与单独培养基的混合物。用箔覆盖该混合物并在冰上温育一小时，同时制备实验的其余部分。在染色缓冲液中以20nM、2nM和0.2nM的2倍浓度制备测试抗体的系列稀释液。在测定当天收获过表达PD-1的Jurkat细胞，并且通过在4℃下以300g将细胞旋转5分钟，用染色缓冲液(BD Pharmingen)将细胞洗涤一次。对细胞计数，检查存活力，并以2×106个细胞/mL重悬于染色缓冲液中。将细胞以25μL/孔(50000个细胞/孔)添加至U形底部96孔测定板，然后以50μL/孔添加所制备的测试抗体。将细胞与抗体在冰上温育15分钟。以25μL/孔添加生物素酰化PD-L1-Fc：Dextramer、生物素酰化IgG1-Fc：Dextramer和Dextramers：缓冲液的预混复合物。将细胞、抗体和结合至Dextramer的PD-L1的这种混合物在冰上温育1小时，并且用箔盖上。
通过下列方式将细胞洗涤两次：添加150μL染色缓冲液，以300g离心5分钟以将细胞制粒并轻弹板以去除上清液。将最终洗涤后的细胞粒重悬于40μL的IntelliCyt运行缓冲液(补充有1mM EDTA和0.1％古洛糖醛酸的BD染色缓冲液)，该缓冲液包含Sytox绿色活/死细胞存活力染色剂(ThermoFisher)的1∶1000稀释液。测定中的最终抗体浓度为10nM、1nM和0.1nM。最终的生物素酰化PD-L1-Fc配体蛋白质浓度为25nM。最终的Dextramer浓度为2.5nM。
板在iQue筛选器(IntelliCyt)上运行。简而言之，在FCS对比SCS上对细胞进行门控以消除碎片。在SCS-A对比SCS-H上对单峰进行门控，并且从单峰群体中，在低BL1通道上对活细胞进行门控，以获得对Sytox绿色存活力染色剂呈阴性的活细胞。由Geomeans在RL1/APC通道中评定结合PD-L1-Fc-Dextramer的阳性活细胞百分比，并将其与阴性对照(Fc-Dex单独结合)进行比较。使用ForeCyt(来自IntelliCyt的软件程序)中的高级度量，将PD-L1阳性群体计算为活群体％。如下计算特异性PD-L1结合百分比：其＝(对mAb呈阳性％-对IgG1-Fc生物素dextramer呈阳性％)/(对同种型对照呈阳性％-对IgG1-Fc生物素dextramer呈阳性％)*100。最终结果以Excel制表并在Prism中作图，示出在存在抗PD-1 mAb的情况下PD-L1配体结合％。
实施例13.PD-1激动性抗体在移植物抗宿主病(GvHD)的小鼠模型中是有效的
为了研究PD-1激动剂mAb在体内对病原性T细胞的影响，通过将人外周血单核细胞(PBMC)过继转移到免疫失能的NOD-scid IL-2Rγnull(NSG)小鼠中，开发了异种移植物抗宿主病(Xeno-GVHD)模型。雌性NSG小鼠(7-9周龄)得自Jackson Labs。在使用之前，将小鼠在饲养箱设施中隔离一周。从血沉棕黄层分离的冷冻人PBMC得自AllCells，Alameda，CA。注射前，将冷冻细胞在37℃下水浴中快速解冻，并且通过在室温下以500g离心5分钟，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。将细胞悬浮于冷PBS中以获得50×106个/mL的最终细胞浓度。
动物按体重随机化并分成多个处理组(N＝10只/组)。在随机化之后，使用3000Elan辐照器(9.72Gy/分钟)让有意识且自由移动的小鼠接受100Rad(1Gy)的全身辐照。将小鼠放回他们的笼中。
每只小鼠经腹膜内注射接收500μL体积的25×106个人PBMC。根据表31每天记录每只动物的临床分数和体重。处死体重减轻≥20％的小鼠，并且根据机构IACUC指南记录它们在终点时的临床分数。在21天将所有动物安乐死。收集脾用于FACS分析。收集皮肤和结肠组织用于组织学分析。
表31.
说明 临床分数
正常警觉和反应 0
毛糙毛发、活力降低、眼黏分泌物 1
驼背姿势、中度体温过低或体温过高、戳刺时呼吸困难 2
休息时呼吸困难、运动失调、震颤、体温过低或体温过高 3
轻轻戳刺时不能走动、无意识 4
死亡 5
小鼠按照Q4d/Q3d方案(在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天和第18天给药)经腹膜内注射10mg/kg PD1B505、PD1B506、PD1B849和PD1B878 mAb，这些mAb被克隆为嵌合mIgG2a抗体以及PD-1拮抗剂mAb(小鼠效应子沉默Fc上的PD1B786)。按照Q3d给药方案(在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天给药)经腹膜内注射10mg/kg CTLA-4-Ig，用作对照。
在研究终止时，将脾移至冷RPMI1640培养基中。在将脾压碎通过70μm过滤器并通过在4℃下以1200rpm离心5分钟将细胞粒化后，将红细胞在冰上在ACK裂解缓冲液(Lonza)中裂解5分钟，并且在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/2mM EDTA)中洗涤多次。通过根据制造商的说明用ef506存活力染料(eBioscience)将细胞染色来评定脾细胞的存活力。将脾细胞与人和小鼠Fc段(BD Bioscience)一起在冰上温育15分钟，然后在4℃下用最佳浓度的荧光物缀合的mAb(在100μL Brilliant染色缓冲液中1×106个细胞)染色30分钟，并且用固定缓冲液(BD Bioscience)固定。将Count Brite微珠(Thermofisher)添加到每个样本中。制备FMO(荧光减一)对照，作为每种荧光物的阴性对照。在LSRll仪器(BD Biosciences)上分析样本。使用下列mAb进行调节性T细胞分析：抗-hCD45多甲藻黄素叶绿素α蛋白(PCP，克隆2D1)、抗-FoxP3别藻蓝蛋白(APC，克隆pCH101)、抗-hCD3别藻蓝蛋白-青色素7(APC-Cy7，克隆HIT3a)、抗-hCD4 Brilliant Violet 605(BV605，克隆OKT4)和抗-hCD25 Brilliantviolet 650(BV650，克隆M-A251)。调节性T细胞被定义为hCD45+hCD3+hCD4+、Foxp3+CD25+。
图13A示出了用PD1B505-mIgG2a和PD1B506-mIgG2a治疗阻止GvHD小鼠模型中的疾病发展。图13B示出了用PD1B505-mIgG2a和PD1B506-mIgG2a治疗阻止GvHD小鼠模型中的体重减轻。图14A示出了用PD1B849-mIgG2a和PD1B878-mIgG2a治疗阻止GvHD小鼠模型中的疾病发展。图14B示出了用PD1B849-mIgG2a和PD1B878-mIgG2a治疗阻止GvHD小鼠模型中的体重减轻。体重减轻和临床分数的抑制与脾中调节性T细胞的增加相关。图15示出了用PD1B849-mIgG2a或PD1B878-mIgG2a治疗的动物的脾中的Treg频率。
实施例14.PD-1激动性抗体耗尽滤泡辅助性T细胞(TFH)和外周辅助性T细胞(TPH)
从液氮冷冻保存中提取人PBMC并置于37℃水浴中快速解冻直至刚刚解冻。将小瓶的内容物转移到无菌的50mL锥形管中(用于每种所用供体的单独管)，并且将完整的RPMI培养基(10％FBS、1倍青霉素/链霉素、1倍丙酮酸钠)逐滴添加至每个管，至总体积15mL。将细胞在室温下以250xg离心10分钟，然后弃去上清液，并将细胞重悬于5-10mL完整培养基中并使用台盼蓝排除法计数。将细胞以2.5×106个细胞/mL重悬，并以2.5×105个细胞/孔(＝100μL/孔)一式三份接种在96孔无菌U形底部聚苯乙烯板中。将PD-1mAb或人IgG1同种型对照稀释至4倍最终浓度，并以50μL/孔添加到适当的孔中。添加抗体后，将正常人血清添加至5％的最终浓度。每个孔中的总体积为200μL，并且将细胞在37℃、5％CO2下温育96小时。除了样本之外，将额外细胞的几个孔接种，接收5％的人血清，并且与处理过的样本一起温育，以用作流式细胞术染色对照。
温育后，将板以350xg离心5分钟，并将上清液抽真空去除。将细胞重悬于200μLPBS中，合并平行测定孔，然后将其转移到新的96孔U形底板上，以进行流式细胞术染色。将混合的细胞以350xg离心5分钟，将上清液抽真空去除，并将荧光抗体混合物添加至每个样本孔(所使用的抗体参见下表)。使用用于重要标记物诸如PD-1、CXCR5、ICOS等的FMO混合物将保存用于对照的附加细胞染色，以用于限定门控分析。将细胞在室温下在黑暗中染色25分钟，然后以350xg离心5分钟。将细胞在200μLPBS中洗涤两次，然后将100μL 4％多聚甲醛添加到每个孔中以固定细胞。将细胞在4℃下在黑暗中固定10分钟，然后用PBS+1％BSA洗涤一次，然后重悬于200μL PBS+1％BSA中。在BD LSRII流式细胞仪上采集样本之前，以5μL/孔(5000个微珠)为每个样本添加计数微珠(Invitrogen)。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。将样本计数归一化为微珠计数，如下所示：样本中的细胞数＝(计数的细胞数*5000添加的微珠)/(计数的微珠数)。样本被归一化为huIgG1同种型对照，如下所示：(微珠归一化细胞计数“样本”/微珠归一化细胞计数“同种型”)*100并以百分比(％)表示。使用GraphPadPrism V7对数据作图。
在分析期间，描述了以下细胞群：
滤泡辅助性T细胞(Tfh)：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+；
外周辅助性T细胞(Tph)：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+；
Tfh/Tph群体组合：活的，CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1+。
图16示出了抗体介导的组合THF/TPH群体被PD1B878、PD1B878-FL(低岩藻糖)、PD1B1090和PD1B1094耗尽的剂量响应曲线。数据以使用n＝8个健康人供体(对于PD1B1090，n＝7)，来自同种型对照的TFH/TPH细胞数的平均倍数变化％表示。PD1B878-FL在耗尽TFH/TPH群体时最有效。

Claims (22)

1.一种特异性结合PD-1的分离抗体或其抗原结合片段，包含分别为SEQ ID NO:2、3、4、5、6和7的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含
a)来源于IGHV7-4-1*1的具有SEQ ID NO:125的序列的重链可变区(VH)框架；
b)来源于IGKV3D-20*1的具有SEQ ID NO:126的序列的轻链可变区(VL)框架；或
c)来源于IGHV7-4-1*1的具有SEQ ID NO:125的序列的VH框架和来源于IGKV3D-20*1的具有SEQ ID NO:126的序列的VL框架。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，包含
a)SEQ ID NO:10的重链可变区(VH)；
b)SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)；或
c)分别为SEQ ID NO:10和16的所述VH和所述VL。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是PD-1的激动剂或介导表达PD-1的细胞的抗体依赖性细胞毒性或这两者。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表达PD-1的细胞是活化的记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞或外周辅助性T细胞，或它们的任何组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在所述抗体Fc中包含至少一种突变，所述至少一种突变调节所述抗体或其抗原结合片段与Fc受体的结合。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述至少一种突变为
a)S267E突变；
b)S267D突变；
c)S267E/I332E突变；
d)S267E/L328F突变；
e)G236D/S267E突变；
f)P238D突变；或
g)P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R突变，并且其中所述氨基酸编号参照EU索引。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含
a)SEQ ID NO:22的重链(HC)；
b)SEQ ID NO:28的轻链(LC)；或
c)SEQ ID NO:22的HC以及SEQ ID NO:28的LC。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有岩藻糖含量介于1％至15％之间的双分枝聚糖结构。
11.一种多核苷酸，包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
12.一种载体，包含根据权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，包含根据权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞、原核细胞、CHO细胞、HEK293细胞或杂交瘤。
15.一种药物组合物，包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.一种试剂盒，包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种免疫缀合物，包含缀合至异源分子的根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或所述抗原结合片段。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制受试者中的表达PD-1的T细胞活化的药物中的用途，其中向受试者施用所述药物达足以抑制所述表达PD-1的T细胞活化的时间。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述表达PD-1的T细胞是抗原特异性CD4+T细胞和/或抗原特异性CD8+T细胞。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗表达PD-1的免疫障碍的药物中的用途，其中向对其有需要的受试者施用治疗有效量的所述药物以治疗所述免疫障碍。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述免疫障碍为狼疮、系统性红斑狼疮、干燥综合症、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、盆腔炎、阿尔茨海默病、炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泄、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、格-巴二氏综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维性肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、其他自身免疫性障碍、胰腺炎、创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、包括缺血性心脏病诸如心肌梗死以及动脉粥样硬化在内的心脏病、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎和胃酸过少、与缺乏母胎界面耐受性相关的不孕症、白癜风、重症肌无力或系统性硬化病。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的用途，其中将所述抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂联合施用。
CN201880050979.XA 2017-06-05 2018-06-04 特异性结合pd-1的抗体及其使用方法 Active CN110997712B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762515188P 2017-06-05 2017-06-05
US62/515188 2017-06-05
US201862648114P 2018-03-26 2018-03-26
US62/648114 2018-03-26
US201862673185P 2018-05-18 2018-05-18
US62/673185 2018-05-18
PCT/US2018/035843 WO2018226580A2 (en) 2017-06-05 2018-06-04 Antibodies that specifically bind pd-1 and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110997712A CN110997712A (zh) 2020-04-10
CN110997712B true CN110997712B (zh) 2024-03-19

Family

ID=64562613

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880050979.XA Active CN110997712B (zh) 2017-06-05 2018-06-04 特异性结合pd-1的抗体及其使用方法

Country Status (23)

Country Link
US (3) US10995149B2 (zh)
EP (1) EP3634995A4 (zh)
JP (1) JP7235733B2 (zh)
KR (1) KR20200014414A (zh)
CN (1) CN110997712B (zh)
AU (1) AU2018282094A1 (zh)
BR (1) BR112019025574A2 (zh)
CA (1) CA3065516A1 (zh)
CL (1) CL2019003520A1 (zh)
CO (1) CO2019013935A2 (zh)
CR (1) CR20190550A (zh)
EC (1) ECSP19086810A (zh)
IL (1) IL271009A (zh)
MA (1) MA52459A (zh)
MX (1) MX2019014577A (zh)
NI (1) NI201900123A (zh)
PE (1) PE20200294A1 (zh)
PH (1) PH12019502755A1 (zh)
TW (1) TWI806873B (zh)
UA (1) UA128035C2 (zh)
UY (1) UY37761A (zh)
WO (1) WO2018226580A2 (zh)
ZA (1) ZA202000051B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3065125A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Bayer Aktiengesellschaft Combination of regorafenib and pd-1/pd-l1(2) inhibitors for treating cancer
AR114127A1 (es) 2018-03-02 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpos agonistas contra pd-1 y usos de estos
US20220298211A1 (en) * 2019-06-04 2022-09-22 Qiang Chen PLANT-PRODUCED mABs AGAINST CHIKUNGUNYA VIRUS WITH ENHANCED EFFECTOR FUNCTION AND EFFICACY
KR20220030956A (ko) 2019-07-05 2022-03-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 Pd-1/cd3 이중 특이성 단백질에 의한 혈액암 치료
JP6856183B1 (ja) * 2019-07-30 2021-04-07 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体
WO2021025140A1 (ja) 2019-08-08 2021-02-11 小野薬品工業株式会社 二重特異性タンパク質
CN115956087A (zh) 2020-05-26 2023-04-11 勃林格殷格翰国际有限公司 抗-pd-1抗体
WO2022156773A1 (en) * 2021-01-21 2022-07-28 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd Protein complexes targeting il12 pathway
AU2022272835A1 (en) 2021-05-13 2023-11-02 Foundation For Biomedical Research And Innovation At Kobe Anti-human pd-1 agonist antibody and pharmaceutical composition comprising the antibody for treating or preventing inflammatory diseases
AU2022294106A1 (en) * 2021-06-18 2024-01-25 Therini Bio, Inc. ANTIBODIES WHICH BIND HUMAN FIBRIN OR FIBRINOGEN γC DOMAIN AND METHODS OF USE
WO2023089377A2 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Mirobio Limited Engineered pd-1 antibodies and uses thereof
WO2024010861A2 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Santa Ana Bio, Inc. Methods and compositions for treating autoimmune, allergic and inflammatory diseases
CN116854820B (zh) * 2023-06-26 2024-02-06 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Pd-1非阻断性清除抗体及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102892785A (zh) * 2010-03-11 2013-01-23 Ucb医药有限公司 生物学制品：人源化激动性抗-pd-1抗体

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
AR036993A1 (es) 2001-04-02 2004-10-20 Wyeth Corp Uso de agentes que modulan la interaccion entre pd-1 y sus ligandos en la submodulacion de respuestas inmunologicas
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP2010535032A (ja) 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
CN101970730A (zh) 2007-12-19 2011-02-09 森托科尔奥索生物科技公司 通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
WO2010029434A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Isis Innovation Limited Pd-1 specific antibodies and uses thereof
AU2009290544B2 (en) 2008-09-12 2015-07-16 Oxford University Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
EP2347038A4 (en) 2008-10-14 2013-06-12 Janssen Biotech Inc METHOD FOR HUMANIZATION AND AFFINITY TREATMENT OF ANTIBODIES
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
JP5920929B2 (ja) 2010-03-11 2016-05-18 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム Ｐｄ−１抗体
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
EP2643351A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Glaxo Group Limited Multispecific antigen binding proteins targeting hgf
WO2013063702A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
LT2970980T (lt) 2013-03-15 2018-10-25 Janssen Biotech, Inc. Gamybos būdas kontroliuoti c galinio lizino, galaktozės ir sialo rūgšties kiekį rekombinantiniuose baltymuose
CN104558177B (zh) 2013-10-25 2020-02-18 苏州思坦维生物技术股份有限公司 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
RS59480B1 (sr) 2013-12-12 2019-12-31 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antitelo, njegov fragment koji se vezuje na antigen, i njegova medicinska primena
CA2932476A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Stemcentrx, Inc. Novel anti-dpep3 antibodies and methods of use
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN106232626B (zh) * 2014-03-27 2022-05-03 鸟石生物公司 结合人大麻素1(cb1)受体的抗体
PT3177644T (pt) * 2014-08-05 2021-01-13 MabQuest SA Reagentes imunológicos que se ligam a pd-1
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
US10239942B2 (en) 2014-12-22 2019-03-26 Pd-1 Acquisition Group, Llc Anti-PD-1 antibodies
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
KR20180034588A (ko) 2015-07-30 2018-04-04 마크로제닉스, 인크. Pd-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법
CA2993276A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Yong Zheng Novel anti-pd-1 antibodies
EA201890630A1 (ru) 2015-09-01 2018-10-31 Эйдженус Инк. Антитела против pd-1 и способы их применения
EA201890790A1 (ru) * 2015-09-29 2018-10-31 Селджин Корпорейшн Связывающие pd-1 белки и способы их применения
BR112018008904A2 (pt) 2015-11-03 2018-11-27 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a tim-3 e seus usos
RU2656181C1 (ru) 2016-07-13 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения
HUE051700T2 (hu) 2016-09-14 2021-03-29 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-PD-1 antitestek
WO2018053405A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 Celgene Corporation Methods of treating immune disorders using pd-1 binding proteins
US11225523B2 (en) 2017-06-01 2022-01-18 Compugen Ltd. Triple combination antibody therapies
EP3679070A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 Augusta University Research Institute, Inc. Antibodies to programmed cell death protein 1
AR114127A1 (es) 2018-03-02 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpos agonistas contra pd-1 y usos de estos

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102892785A (zh) * 2010-03-11 2013-01-23 Ucb医药有限公司 生物学制品：人源化激动性抗-pd-1抗体

Also Published As

Publication number Publication date
US10995149B2 (en) 2021-05-04
CO2019013935A2 (es) 2020-01-17
JP7235733B2 (ja) 2023-03-08
EP3634995A4 (en) 2021-06-09
EP3634995A2 (en) 2020-04-15
KR20200014414A (ko) 2020-02-10
ECSP19086810A (es) 2020-02-28
MA52459A (fr) 2021-03-10
CR20190550A (es) 2020-04-05
US20230340155A1 (en) 2023-10-26
TWI806873B (zh) 2023-07-01
WO2018226580A3 (en) 2019-01-31
PH12019502755A1 (en) 2020-06-08
CL2019003520A1 (es) 2020-05-08
WO2018226580A2 (en) 2018-12-13
PE20200294A1 (es) 2020-02-05
MX2019014577A (es) 2020-07-29
UY37761A (es) 2019-01-02
JP2020522278A (ja) 2020-07-30
ZA202000051B (en) 2021-07-28
TW201906863A (zh) 2019-02-16
US20180355061A1 (en) 2018-12-13
UA128035C2 (uk) 2024-03-20
BR112019025574A2 (pt) 2020-06-23
IL271009A (en) 2020-01-30
US11746161B2 (en) 2023-09-05
US20210102000A1 (en) 2021-04-08
NI201900123A (es) 2020-12-01
AU2018282094A1 (en) 2019-12-12
CA3065516A1 (en) 2018-12-13
CN110997712A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110997712B (zh) 特异性结合pd-1的抗体及其使用方法
KR20170049554A (ko) Cd123 결합제 및 그의 용도
EA037882B1 (ru) Агонистические антитела, специфически связывающие человеческий cd40, и способы их применения
CA3008819A1 (en) Antibodies specifically binding hla-dr and their uses
TW202118788A (zh) 包含血管舒緩素相關肽酶2抗原結合域之蛋白質及其用途
US11827708B2 (en) Proteins comprising HLA-G antigen binding domains and their uses
CN117377694A (zh) 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
US20220306738A1 (en) Antibody targeting cd22 and cd79b
EA043064B1 (ru) Антитела, специфически связывающиеся с pd-1, и способы их применения
TW202233672A (zh) 包括類δ配體３（ＤＬＬ３）抗原結合區之蛋白質及其用途
CN116249714A (zh) 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
WO2020089769A1 (en) Antibodies specifically binding hla-dr/colii_259 complex and their uses
TW202302648A (zh) Cd79b抗體於自體免疫治療應用之用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant