CN115956087A - 抗-pd-1抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗及诊断方法的新颖抗‑PD‑1(计划性细胞死亡1)抗体及其抗原结合片段，及使用其的组合物。
Description
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其以引用方式在此整体并入。该ASCII副本创建于2021年4月29日，文件名09-0701-WO-1_SL.txt，大小为136527bytes。
技术领域
本发明大体上涉及用于治疗及诊断用途的抗-PD-1(计划性细胞死亡1)抗体。更具体地，公开用于治疗通过表达PD-1的细胞表征的各种疾病或病症的抗-PD-1抗体及使用方法。亦公开包含抗-PD-1抗体的药物组合物及试剂盒。
背景技术
计划性细胞死亡1，又称为PD-1及CD279(分化簇279)为主要表达于T细胞以及其他免疫细胞上的细胞表面受体蛋白质。PD-1通路为诱导及维持免疫耐受性的关键调节因子。该蛋白质充当“免疫检查点”抑制剂，亦即其用以调节免疫系统中细胞的活性以便调节且限制自体免疫疾病。PD-1具有两种配位体PD-L1及PD-L2，其与细胞表面受体相互作用。在结合时，PD-1诱导胞内信号，其负面地调节T细胞反应。在活化T细胞的表面上，在T细胞识别外周抗原后使PD-1表达上调；随后，PD-1与PD-L1及PD-L2的较高结合成为下游抑制性信号传导的关键步骤。PD-1亦与提高的Treg细胞增殖及增强的免疫抑制功能相关。
近年来已了解，许多癌症可通过修饰“免疫检查点”抑制剂来保护自身免受免疫系统影响且因此避免检测。PD-1抑制剂(一种阻断PD-1的新类别药物)活化免疫系统以攻击肿瘤且用以治疗某些类型的癌症。
相比之下，有缺陷的PD-1抑制功能亦与免疫介导性疾病的病理生理学相关，且PD-1或其配位体的表达可失调或并不完全参与某些自体免疫性适应症。因此，诱导PD-1活化及使用PD-1/PD-L1和/或PD-L2系统代表一种抑制免疫反应的替代性途径且为各种免疫及发炎性病症提供治疗。
因此，需要诱导PD-1通路、增强抑制功能且为受PD-1/PD-L1和/或PD-L2系统控制的免疫及发炎性病症提供治疗的疗法。特别是，需要调节PD-1与PD-L1或PD-L2之间的相互作用而不阻断此相互作用的生物治疗剂，诸如抗体。
发明内容
本发明提供特异性结合至人类PD-1的抗体。在本发明的一个方面中，本发明的抗体不阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。在本发明的一个方面中，本发明的抗体增强PD-1与PD-L1之间的相互作用。在本发明的一个方面中，本发明的抗体活化PD-1信号传导通路。在一个实施方案中，本发明抗体为抗-PD-1激动剂抗体。举例而言，本发明的抗体适用于治疗和/或预防可通过调节PD-1与PD-L1之间的相互作用，特别是通过活化PD-1通路而缓解的疾病或病症。
在一个方面中，本发明提供一种具有下文所描述的特性中的一或多者的抗-PD-1抗体，特别是单克隆抗-PD-1抗体，例如人源化单克隆抗-PD-1抗体。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体以高亲和力，例如20nM或更低、例如10nM或更低、例如5nM或更低结合至纯化重组人类PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体以50nM或更低亲和力结合至纯化重组食蟹猕猴PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体选择性地结合至PD-1，特别是人类PD-1。在一个方面中，本发明的抗体不结合于小鼠、大鼠或兔PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体不阻断PD-L1与PD-1的结合。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体增强PD-L1与PD-1的结合。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体例如通过抑制IFNγ产生、抑制IL-17A产生或抑制IL-21产生来减弱功能性细胞分析中的T细胞活性。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体抑制小鼠模型中的人类细胞累积且减少小鼠模型中人类发炎性细胞因子的含量。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体具有有利的药物动力学特性。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体具有有利的生物物理学特性，例如产率、质量、稳定性或溶解性。在一个方面中，本发明提供本发明的抗体的抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
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在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其包含：
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在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:74的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:75的氨基酸序列(H-CDR3)，
SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:76的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)，
SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:78的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)，或
SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)；
及
轻链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO:164的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:166的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:167的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)。
在一个实施方案中，抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的CDR根据ChemicalComputing Group(CCG)编号定义。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所阐述抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所阐述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、Fab、F(ab′)2、Fv及scFv。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含以下的氨基酸序列：分别包含SEQ ID NO:108及SEQ ID NO:92；分别包含SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:93；分别包含SEQID NO:110及SEQ ID NO:94；分别包含SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:95；分别包含SEQ IDNO:112及SEQ ID NO:96；分别包含SEQ ID NO:113及SEQ ID NO:97；分别包含SEQ ID NO:114及SEQ ID NO:98；分别包含SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:99；分别包含SEQ ID NO:116及SEQ ID NO:100；分别包含SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:101；分别包含SEQ ID NO:118及SEQID NO:102；分别包含SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:103；分别包含SEQ ID NO:120及SEQ IDNO:104；分别包含SEQ ID NO:121及SEQ ID NO:105；分别包含SEQ ID NO:122及SEQ ID NO:106；分别包含SEQ ID NO:123及SEQ ID NO:107。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139中任一者的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含SEQID NO:125、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:129中任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:131及SEQ IDNO:125的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:133及SEQ IDNO:127的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:135及SEQ IDNO:127的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:137及SEQ IDNO:129的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:139及SEQ IDNO:129的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:133及SEQ ID NO:127的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:135及SEQ ID NO:127的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:137及SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:139及SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含选自由以下组成的组的重链恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定区，例如人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgE。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD1抗体，其中重链恒定区为具有Ser228Pro突变的IgG4的重链恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD1抗体，其中重链恒定区为IgG1的重链恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD1抗体，其中重链恒定区为具有Leu234Ala及Leu235Ala突变的IgG1的重链恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由κ及λ组成的组的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其分别包含SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:141的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其分别包含SEQ ID NO:147及SEQ ID NO:145的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其分别包含SEQ ID NO:149及SEQ ID NO:145的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其分别包含SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:151的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其分别包含SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:151的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其中该重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:143的氨基酸组成且该轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:141的氨基酸组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其中该重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:147的氨基酸组成且该轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:145的氨基酸组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其中该重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:149的氨基酸组成且该轻链氨基酸序列由SEQ ID NO:145的氨基酸组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其中该重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:153的氨基酸组成且该轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:151的氨基酸组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体，其中该抗体包含重链及轻链，其中该重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:155的氨基酸组成且该轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:151的氨基酸组成。
在一个实施方案中，如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段为激动剂抗-PD1抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，如上文所描述的抗-PD1抗体或其抗原结合片段以高亲和力，例如20nM或更低、例如10nM或更低、例如5nM或更低结合至人类PD-1。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其与如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段竞争结合于PD-1。在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其与抗体A、抗体B、抗体C、抗体D或抗体E竞争结合于PD-1。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，及药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用作药剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗PD-1通路病症的方法，其包含向需要其的患者施用药学上有效量的如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于治疗PD-1通路病症。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于治疗PD-1通路病症的药剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种调节人类患者中PD-1与PD-L1之间的相互作用的方法，其包含向人类患者施用足以活化人类患者的PD-1通路的量的包含如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其用于调节人类患者中PD-1与PD-L1之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段的用途，其用于制造用于调节人类患者中PD-1与PD-L1之间的相互作用的药剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性的方法，其包含向人类患者施用足以下调人类患者的免疫反应的量的包含如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段，其用于减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性。在一个实施方案中，本发明提供如上文所描述的抗-PD-1抗体或抗原结合片段的用途，其用于制造用于减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性的药剂。
在一个实施方案中，在以上方法中，在用于以上用途的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段中或在以上抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途中，疾病选自由以下组成的组：全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎及发炎性肠病。
在一个实施方案中，在以上方法中，在用于以上用途的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段中或在以上抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途中，该抗体或其抗原结合片段通过非经肠途径、静脉内途径或皮下给药途径施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种经分离聚核苷酸，其编码如上文所描述的重链可变区和/或轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供一种经分离聚核苷酸，其编码如上文所描述的重链和/或轻链。
在一个实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含如上文所描述的聚核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含如上文所描述的表达载体。在一实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种制造抗体的方法，其包含以下步骤：
-在允许形成抗体的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞包含：包含编码如上文所描述的重链可变区的经分离聚核苷酸的表达载体及包含编码如上文所描述的轻链可变区的聚核苷酸的表达载体，及
-回收该抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种制造抗体的方法，其包含以下步骤：
-在允许形成抗体的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞包含：包含编码如上文所描述的重链的经分离聚核苷酸的表达载体及包含编码如上文所描述的轻链的聚核苷酸的表达载体；及
-回收该抗体。
在一个实施方案中，上述方法进一步包含纯化抗体的步骤。在一个实施方案中，上述方法进一步包含将抗体调配至药物组合物中的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供一种多特异性抗体，其包含第一抗-PD-1激动剂抗原结合位点及第二抗原结合位点。
在一个实施方案中，第二抗原结合位点为抗-CD48结合位点、抗-CD-2结合位点、抗-CD11a结合位点或抗-CD3结合位点。
在一个实施方案中，第一抗-PD-1激动剂抗原结合位点包含如上文所描述的重链可变区及轻链可变区。
在一个实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体。
附图说明
图1：在基于细胞的分析中通过流式细胞术评估的抗-PD-1抗体对人类PD-1蛋白质的选择性。MFI表示“平均荧光强度”。
图2：人类PD-1-Fc结合至人类PD-L1-Fc的竞争结合分析。描绘25nM PD-1-Fc与偶合于GLM芯片表面上的PD-L1-Fc胺的结合曲线的传感图谱(图2A)。抗体C、MK-3475及PD1AB-6-4P(500nM)与结合至偶合于GLM芯片表面上的PD-L1-Fc胺的25nM PD-1-Fc预混合的传感图谱(图2B)。
图3：在存在抗-PD-1激动剂抗体的情况下PD-L1与PD-1的增强结合。PD-1生物素：PD-L1相互作用分析(图3A)。CHO PD-1-PD-L1 Delphia-Eu TRF分析(图3B及3D)。CHO PD-1:生物素PD-L1结合分析(图3C)。在图3D中，仅描绘针对抗体C的个别数据点；图3D中未描绘针对其他抗体的个别数据点，因为其彼此极为接近。POC表示“对照的百分比”。
图4：在存在衍生自亲本723C2激动剂抗体(图4A)或亲本激动剂抗体820C3(图4B)的抗-PD-1激动剂抗体或F(ab')2片段的情况下的T细胞功能活性。POC表示“对照的百分比”。
图5：交联后通过抗CD48的MAb诱导PD-1活化。
图6：用CellTrace-Violet标记人类泛T细胞、用CD3 MAb的活化及通过CellTrace的稀释对细胞增殖的分析。
图7：双特异性构建物(图7A)。通过在过度表达PD-1的Jurkat细胞上进行流式细胞术来展现各臂与PD-1或CD48的结合(图7B)。在存在培养盘结合的PD-1/CD48 BsAb或对照抗体的情况下用培养盘结合的抗-CD3e刺激人类记忆CD4+T(PD1+)细胞(图7C)。MFI表示“平均荧光强度”。
具体实施方式
本发明解决对免疫及发炎性病症，特别是受PD-1/PD-L1和/或PD-L2系统控制的免疫及发炎性病症的治疗的需求。为解决此需要，本发明提供不阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用的抗-PD-1抗体。在一个方面中，本发明提供增强PD-1与PD-L1之间的相互作用的抗体。在本发明的一个方面中，本发明的抗体活化PD-1信号传导通路。在一个方面中，本发明的抗体为抗-PD-1激动剂抗体。PD-1激动作用通过抑制人类疾病中自体反应性T细胞的扩增及效应功能来恢复免疫平衡，在所述人类疾病中，PD-1经表达但可能不与其配位体接合或最佳接合。在一个方面中，本发明的抗体适用于治疗免疫及发炎性病症及移植排斥反应。举例而言，本发明的抗体适用于治疗和/或预防可通过调节PD-1与PD-L1之间的相互作用，特别是通过活化PD-1通路而缓解的疾病或病症。在一个方面中，本发明的抗体适用于治疗和/或预防全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎或发炎性肠病。
在一个方面中，本发明提供一种具有下文所描述的特性中的一或多者的抗-PD-1抗体，特别是单克隆抗-PD-1抗体，例如人源化单克隆抗-PD-1抗体。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体以高亲和力，例如20nM或更低、例如10nM或更低、例如5nM或更低结合至纯化重组人类PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体以50nM或更低的亲和力结合至纯化重组食蟹猕猴PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体选择性地结合至PD-1，特别是人类PD-1。在一个方面中，本发明的抗体不结合至小鼠、大鼠或兔PD-1。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体不阻断PD-L1与PD-1的结合。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体增强PD-L1与PD-1的结合。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体例如通过抑制IFNγ产生、抑制IL-17A产生或抑制IL-21产生来减弱如下文中所展示的若干功能性细胞分析中的T细胞活性。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体抑制小鼠模型中的人类细胞累积且减少小鼠模型中人类发炎性细胞因子的含量。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体具有有利的药物动力学特性。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体具有有利的生物物理学特性，例如产率、质量、稳定性或溶解性。这些特性例如展示于下文实施例中。
抗体或免疫球蛋白的通用结构为本领域技术人员所熟知，这些分子是通常约150,000道尔顿的由两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。各轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成杂二聚体，且杂三聚分子经由杂二聚体的两个相同重链之间的共价二硫键形成。尽管所述轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两个重链之间的二硫键数目因免疫球蛋白同型而不同。各重链及轻链亦具有有规律地间隔的链内二硫桥键。各重链在氨基端具有可变域(VH＝可变重链)，之后为三个或四个恒定域(CH1、CH2、CH3及CH4)以及CH1与CH2之间的铰链区。各轻链具有两个域，氨基端可变域(VL＝可变轻链)及羧基端恒定域(CL)。VL域非共价缔合VH域，然而CL域通常经由二硫键共价连接至CH1域。据信特定氨基酸残基在轻链及重链可变域之间形成界面(Chothia等人,1985,J.Mol.Biol.186:651-663,Vargas-Madrazo E,Paz-García E.J Mol Recognit.2003；16(3):113-120)。可变域在本文中也称为可变区，且恒定域也称为恒定区。
亦即，不同抗体之间极不同的可变域内的某些域为“高变的”。这些高变域含有直接参与各特定抗体与其特异性抗原决定子的结合及特异性的残基。轻链可变域与重链可变域中的高变性集中于三个称为互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的区段中。CDR通过序列比较定义，Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.，然而HVL在结构上根据可变域的三维结构定义，如Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所描述。在这些两种方法产生CDR的略不同标识的情况下，结构性定义是优选的。如Kabat所定义，在轻链可变域中，CDR-L1位于约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，且CDR-L3位于约残基89-97处；在重链可变域中，CDR-H1位于约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，且CDR-H3位于约残基95-102处。CDR的替代性定义根据Chemical Computing Group(CCG)编号(Almagro等人,Proteins 2011；79:3050-3066及Maier等人,Proteins 2014；82:1599-1610)。因此，重链及轻链的CDR1、CDR2、CDR3定义对既定抗体具有特异性的特有及功能特性。
重链及轻链中的每一者内的三个CDR通过构架区(FR)分隔开，其含有趋向于较不可变的序列。自重链可变域及轻链可变域的氨基端至羧基端，FR及CDR按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的主要β片构象使各链内的CDR彼此紧密靠近以及紧密靠近来自另一链的CDR。所得构象有助于抗原结合位点(参见Kabat等人,1991,NIH公开案第91-3242号,第I卷,第647-669页)，但并非所有CDR残基必需直接参与抗原结合。
FR残基及Ig恒定域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合和/或介导抗体效应功能。认为一些FR残基以至少三种方式对抗原结合产生显著作用：非共价直接结合于表位、与一个或多个CDR残基相互作用及影响重链与轻链之间的界面。恒定域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。
脊椎动物免疫球蛋白的轻链基于恒定域的氨基酸序列而归属于两个明确不同的类别κ及λ中的一者。通过比较，根据恒定域的序列将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配至五个主要类别中的一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步划分成子类(同型)，例如分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。所述类别的原生免疫球蛋白的子单元结构及三维构象已为所熟知的。
术语“抗体”、“抗-PD-1抗体”、“人源化抗-PD-1抗体”及“变异型人源化抗-PD-1抗体”在本文中以最广泛意义使用，且特定涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、微小修饰(诸如N或C端截短)的抗体及抗体片段(诸如抗体的展现所需生物活性，例如PD-1结合的可变域及其他部分)。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指大体上同质的抗体组中的抗体；亦即，除可能少量存在的天然存在的突变或可能熟知的改变(诸如自抗体重链移除C端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或去酰胺化、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺去酰胺化)以外，群体中的个别抗体是一致的。单克隆抗体针对单一抗原决定子“表位”具有高度特异性。因此，修饰语“单克隆”指示针对相同表位的大体上同质的抗体组，且不应视为需要通过任何特定方法来产生该抗体。应了解单克隆抗体可通过本领域已知的任何技术或方法制得；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人,1975,Nature 256:495)，或本领域已知的重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)，或使用Clackson等人,1991,Nature 352:624-628及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术使用噬菌体抗体库分离以重组方式产生的单克隆的方法。
嵌合抗体由来自一个物种(例如非人类哺乳动物，诸如小鼠)的抗体的重链及轻链可变区及另一物种(例如人类)抗体的重链及轻链恒定区组成，且可如下获得：使编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体的可变区的DNA序列连接于来自第二(例如人类)物种的抗体的恒定区的DNA序列，及用含有连接序列的表达载体转型宿主使其产生嵌合抗体。替代地，嵌合抗体亦可为重链和/或轻链的一个或多个区或域与单克隆抗体中来自另一免疫球蛋白类别或同型或来自共同或生殖系序列的对应序列相同、同源或为其变体的抗体。嵌合抗体可包括此类抗体的片段，其限制条件为抗体片段展现其亲本抗体的所需生物活性，例如结合于同一表位(参见例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。
术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗-PD-1抗体片段”、“人源化抗-PD-1抗体片段”、“变异型人源化抗-PD-1抗体片段”是指全长抗-PD-1抗体的一部分，其中保持可变区或功能性能力，例如特异性PD-1表位结合。抗体片段的例子包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双功能抗体、线抗体、单链抗体、微型抗体、由抗体片段形成的双功能抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体片段可例如通过用酶(诸如木瓜酶或胃蛋白酶)处理全长抗体以产生适用抗体片段来获得。使用木瓜酶消化以产生各自具有单一抗原结合位点的两种相同的抗原结合抗体片段(称为“Fab”片段)，及残余“Fc”片段。Fab片段亦含有轻链的恒定域及重链的CH1域。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
根据本发明的抗体片段的另一实施例为Fab'片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1域的C端存在额外残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')2抗体片段为由铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。亦已知抗体片段的其他化学偶联。
“Fv”片段含有由一个重链可变域及一个轻链可变域的紧密非共价缔合的二聚体的组成的完整抗原识别及结合位点。在此构象中，各可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体以抗原结合特异性。
抗体片段亦可包括“单链Fv”或“scFv”片段。“单链Fv”或“scFv”抗体片段为包含抗体的VH域及VL域的单链Fv变体，其中所述域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别且结合抗原。scFv多肽亦可任选含有位于VH与VL域之间的多肽接头以有助于通过scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见例如Pluckthun,1994,The Pharmacology of monoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。
抗体片段亦可形成包含一对串叠型Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)以形成一对抗原结合区的串叠型Fd区段。这些“线抗体”可为双特异性或单特异性抗体，如例如Zapata等人,1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所述。
在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体为人源化抗体或抗体片段。人源化抗体或人源化抗体片段为特定类型的嵌合抗体，其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，能够结合至预定抗原且包含实质上具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个FR及实质上具有非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个CDR。通常称为“导入”序列的此非人类氨基酸序列通常获自“导入”抗体域，特别是可变域。一般而言，人源化抗体至少包括插入人类重链可变域或轻链可变域的FR之间的非人类抗体的CDR或HVL。由例如Almagro等人,(2008)Frontiers in Bioscience 13,1619-1633或WO12092374A2中描述抗体的人源化方法。
本发明描述特异性人源化抗-PD-1抗体，其含有衍生自小鼠前导723C2的插入于人类生殖系序列重链及轻链可变域的FR之间的CDR。另外，小鼠前导723C2的重链CDR3中的半胱氨酸经人源化抗-PD-1抗体中衍生自小鼠前导723C2的酪氨酸置换(“DC”至“DY”)。
在一个方面中，人源化抗-PD-1抗体包含至少一个及通常两个可变域的实质上所有(诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中所含者)，其中所有或实质上所有CDR与非人类免疫球蛋白的那些CDR对应，且特别是，在本文中，CDR为小鼠前导723C2的鼠类序列，且FR为人类免疫球蛋白共同或生殖系序列的那些FR。在另一方面中，人源化抗-PD-1抗体亦包括免疫球蛋白Fc区、通常人类免疫球蛋白Fc区的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变域两者。适当时，抗体亦可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4区中的一或多者。
根据本发明的人源化抗-PD-1抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。举例而言，恒定域可为补体固定恒定域，其中人源化抗体需要展现细胞毒活性且同型通常为IgG1。在不需要此类细胞毒活性的情况下，恒定域可具有另一同型，例如IgG2。替代性人源化抗-PD-1抗体可包含来自超过一个免疫球蛋白类别或同型的序列，且选择特定恒定域以使所需效应功能达最佳在一般本领域技术人员的能力内。
在一个方面中，本发明的抗体的恒定域为IgG4Pro，其具有一个防止Fab臂交换的置换突变(Ser228Pro)。此Ser至Pro突变为在IgG4主链铰链区中且通常称为Ser228Pro，但其在重链中的位置可因几个氨基酸而不同，例如视可变区的长度和/或IgG1与IgG4之间的铰链长度差异而定。铰链区中的Ser至Pro突变(Cys-Pro-Ser-Cys-Pro)在本文中称为“Ser228Pro”，与其在重链中的位置无关。在另一方面中，本发明的抗体的恒定域为IgG1KO，其在铰链区中具有两个突变Leu234Ala及Leu235Ala以减少效应功能(ADCC)。
人源化抗-PD-1抗体的FR及CDR或HVL无需与亲本序列精确对应。举例而言，导入CDR、或HVL、或共同或生殖系FR序列的一个或多个残基可通过取代、插入或缺失而改变(例如，诱变)，使得所得氨基酸残基不再与亲本序列的对应位置中的原始残基相同，但尽管如此抗体仍保持结合于PD-1的功能。此类改变通常并非大范围的且将为保守性改变。通常，至少75％的人源化抗体残基将与亲本共同或生殖系FR及导入CDR序列的那些残基对应，更通常至少90％，且最通常大于95％、或大于98％或大于99％。
影响重链可变区与轻链可变区之间的界面(“VL-VH界面”)的免疫球蛋白残基为影响两个链相对于彼此的接近度或定向的残基。可参与链间相互作用的某些残基包括VL残基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及VH残基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(利用Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,Md.,1987)中所阐述的编号系统)。美国专利第6,407,213号亦论述诸如VL残基43及85及VH残基43及60的残基亦可参与此相互作用。尽管这些残基仅针对于人类IgG指示，但其在物种间均适用。选择用于取代至共同序列中的合理预期参与链间相互作用的重要抗体残基。
术语“共同序列”及“共同抗体”是指在任何特定类别、同型或子单元结构的所有免疫球蛋白中的每一位置(例如人类免疫球蛋白可变域)处包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共同序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。应了解，“共同”序列、结构或抗体涵盖如某些实施方案中所述的共同人类序列，且是指在任何特定类别、同型或子单元结构的所有人类免疫球蛋白中的每一位置处包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共同序列含有在每一位置具有存在于一个或多个已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其不可精确重复任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共同序列不获自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白。Kabat等人,1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md，及其变体。重链及轻链共同序列的FR及其变体提供适用于制备人源化抗-PD-1抗体的序列。参见例如美国专利第6,037,454号及第6,054,297号。
人类生殖系序列天然见于人类群体中。那些生殖系基因的组合产生抗体多样性。抗体的轻链的生殖系抗体序列来自保守人类生殖系κ或λv基因及j基因。类似地，重链序列来自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“The Immunoglobulin FactsBook”Academic Press,2001)。
“经分离”抗体为已自其天然环境的组分识别出且分离和/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染物组分为可干扰抗体的诊断或治疗用途的那些物质，且可为酶、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶质。在一个方面中，抗体将纯化至至少大于95％分离重量的抗体，例如纯化至至少大于95％、96％、97％、98％或99％。
经分离抗体包括原位产生于重组细胞内的抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤制备，在该步骤中移除重组细胞物质。
如根据本发明所使用，术语“抗体效能”是指有助于抗体识别抗原的因素/特性或抗体的体内效应。抗体的氨基酸序列的变化可影响诸如折叠的抗体特性，且可影响物理因素，诸如抗体结合于抗原的初始速率(ka)、抗体自抗原的解离常数(kd)、抗体对于抗原的亲和力常数(Kd)、抗体的构象、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。
如根据本发明所使用，术语“激动剂抗体”或“激动性抗体”是指在结合至PD-1后诱导至少一种由PD-1配位体PD-L1诱导的生物活性的抗体。在一个方面中，该诱导当与不存在激动剂抗体的情况下的诱导相比较时系统计显著的。在一个方面中，例如，如下文所描述的一个实施例中所测量，当至少一种生物活性经诱导比不存在激动剂抗体的情况大至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、、80％、85％、90％、95％或100％时，抗体为激动剂抗体。在一些实施方案中，“激动剂抗体”增强PD-1与PD-L1之间的相互作用。用于检测PD-1激动剂特性的例示性分析描述于本文中或为本领域所已知。
“多特异性”是指特异性结合两种或更多种不同抗原或相同抗原内的两种或更多种不同表位的蛋白质，诸如抗体。
“双特异性”是指特异性结合两中不同抗原或相同抗原内的两种不同表位的蛋白质，诸如抗体。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段为双特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段为多特异性抗体。本文中所提供的特异性结合PD-1的单特异性抗体可经工程改造成亦涵盖于本发明的范畴内的双特异性抗体。
全长双特异性抗体可例如在两个单特异性二价抗体之间使用Fab臂交换(例如，半分子交换、交换一个重链-轻链对)通过在各半分子中的重链CH3界面处引入取代以有利于在无细胞环境中或使用共表达具有不同特异性的两个抗体半分子的杂二聚体形成来产生。Fab臂交换反应为二硫键-键合的结果。
双特异性抗体亦可使用以下设计来产生：诸如Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵-臼(Genentech)、CrossMAb(Roche)与静电诱导的CH3相互作用(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程域体(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)及
产品(Genmab A/S)。
举例而言，可使用本文所描述的PD-1抗体的VH/VL域或所公布抗-PD-1激动剂抗体的任何VH/VL区及所公布抗-CD2、抗-CD48、抗-CD11a或抗CD3抗体的任何VH/VL区各别地产生双特异性PD-1/CD2、双特异性PD-1/CD48、双特异性PD-1/CD11a或PD-1/CD3抗体。
本发明的另一实施方案为包含结合PD-1的第一域及结合CD2、CD48、CD11a或CD3的第二域的双特异性抗体。
如本文所使用，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性百分比”是指在针对最大对应性比较及比对时，两个或更多个序列或子序列相同或有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。为确定一致性百分比，出于最佳比较目的而比对序列(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入间隙以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。随后比较相对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间的一致性百分比为所述序列共有的一致位置数的函数(亦即，一致性％＝一致位置数/位置(亦即重叠位置)总数×100)。在一些实施方案中，适当时，在序列内引入间隙之后，进行比较的两个序列长度相同(例如不包括延长超过比较序列的额外序列)。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导序列和/或恒定域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如每一序列的CDR-H1)。
可使用数学算法实现判定两个序列之间的一致性百分比或相似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实施例为Karlin及Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中经修改的算法。将此类算法并入至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)执行以获得与编码所关注蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)执行，以获得与所关注蛋白质同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的间隙比对，可如Altschul等人，1997，NucleicAcids Res.25:3389-3402中所描述来利用间隙式BLAST。替代地，PSI-Blast可用于进行检测分子之间的远缘关系的叠代检索(同上)。当利用BLAST、间隙式BLAST及PSI-Blast程序时，可使用个别程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实施例为Myers及Miller，CABIOS(1989)的算法。此类算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，所述程序为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12及空位罚分4。用于序列分析的额外算法在本领域为已知的且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所描述的ADVANCE及ADAM；以及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所描述的FASTA。在FASTA内，ktup为设定检索的敏感性及速度的对照选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对得到比较的两个序列中的类似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若ktup未得以指定，则对于蛋白质默认值为2，且对于DNA为6。替代地，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人，1996，Methods Enzymol.266:383-402中所描述。
核酸序列在其置放至与另一核酸序列具有功能关系时“可操作地连接”。举例而言，若核酸前序列或分泌性前导子表达为参与多肽分泌之前蛋白，则其与编码该多肽的核酸可操作地连接；若启动子或强化子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点经定位以便有助于翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意谓经连接的DNA序列是连续的，且在分泌性前导子的情况下，其为连续的且在读框内。然而，强化子任选为连续的。连接可通过在适宜限制性位点处接合来实现。若此类位点不存在，则可使用合成寡核苷酸接附子或接头。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞株”及“细胞培养物”可互换使用且所有此类名称均包括其子代。因此，“转化体”及“转化细胞”包括与传递次数无关的主要靶细胞及自其衍生的培养物，其可例如经编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的一个或多个表达载体转染。
出于根据本发明的治疗的目的，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜与农畜及动物园、竞技或宠物动物，诸如狗、马、猫、奶牛及其类似动物。哺乳动物优选为人类。
如本文中所使用的“病症”为将得益于用本文所描述的抗-PD-1抗体，特别是本文所描述的人源化抗-PD-1抗体治疗的任何病状。此病症包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理病状。
如本文中所使用，术语“PD-1通路病症”或“PD-1通路疾病”是指可通过调节PD-1与PD-L1之间的相互作用，特别是通过活化PD-1通路而缓解的病状。“PD-1通路病症”或“PD-1通路疾病”包括表达PD-1的T细胞相关疾病，“PD-1通路病症”或“PD-1通路疾病”亦包括通过活化的自体反应性T细胞表征且其中需要减弱表达PD-1的T细胞活性和/或下调免疫反应的病状，所述T细胞表达PD-1且为慢性炎症及自体免疫疾病的驱动子。PD-1通路病症的例子包括诸如以下的疾病或病症：全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮症、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎及发炎性肠病。
术语“特异性结合”或其类似术语意谓抗-PD-1抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。用于判定两个分子是否特异性结合的方法描述于本文中或为本领域熟知的，且包括例如平衡透析、表面等离子共振及类似者。在一个实施方案中，根据本文实施例部分中所描述的亲和力结合方法，特异性结合的特征在于KD为约1×10-7M(100nM)或更低。在另一实施方案中，根据本文实施例部分中所描述的亲和力结合方法，特异性结合的特征在于KD为约5×10-8M(50nM)或更低。在另一实施方案中，根据本文实施例部分中所描述的亲和力结合方法，特异性结合的特征在于KD为约1×10-8M(10nM)或更低。在另一实施方案中，根据本文实施例部分中所描述的亲和力结合方法，特异性结合的特征在于KD为约5×10-9M(5nM)或更低。然而，特异性结合人类PD-1的经分离抗体可能与其他抗原(诸如来自其他物种的PD-1分子)具有交叉反应。另外，分离抗体可实质上不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语“皮下施用”是指通过相对地缓慢的持续递送将药物，例如本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的袋内。捏起或拉起皮肤且远离下层组织可产生袋。
术语“皮下输注”是指通过相对缓慢的持续性递送将药物，例如本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选地皮肤与皮下组织之间的袋内，持续一段时间，包括(但不限于)30分钟或更短，或90分钟或更短。任选地输注可通过植入于动物或人类患者的皮肤下的药物递送泵的皮下植入来进行，其中泵递送预定量的药物，保持预定时段，诸如30分钟、90分钟或横跨治疗方案长度的时段。
术语“皮下推注”是指动物或人类患者的皮肤下方的药物施用，其中推注药物递送小于约15分钟；在另一方面中，小于5分钟，且在又一方面中，小于60秒。在甚至又一方面中，施用为在皮肤与下层组织之间的袋内，其中袋可通过捏起或拉起皮肤且远离下层组织而产生。举例而言，“皮下推注”是指在小于大约15分钟；在另一方面中，小于5分钟且在又一方面中，小于60秒内向人类患者施用本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
术语“治疗有效量”用以指抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的减轻或改善所治疗病症的症状中的一或多者的量。由此，其为具有有益患者结果的量。功效可视待治疗的病状而定以常规方式测量。
如本文中所用，术语“治疗”及“疗法”及其类似术语意谓包括疾病或病症的治疗性以及预防性或抑制措施，产生任何临床上需要或有益的作用，包括(但不限于)缓解或减轻一种或多种症状，消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，举例而言，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，由此预防或去除疾病或病症的一种或多种病征。作为另一实施例，该术语包括在临床表达疾病之后施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，在发作之后及在已发生临床症状之后施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段包含如本文所使用的“治疗”或“疗法”，其中施用影响疾病或病症的临床参数，诸如组织损伤程度或癌转移的量或程度，治疗是否导致改善疾病。此外，只要本发明的组合物单独或与另一治疗剂组合对于所治疗病症的至少一种症状相比于不使用抗-PD-1抗体组合物或其抗原结合片段下的该症状有缓解或改善，该结果应视是有效治疗潜在病症，不论病症的所有症状是否缓解。
术语“药品说明书”用以指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于使用这些治疗产品的适应症、用法、给药、禁忌和/或警告的信息。
抗体
本文描述且公开抗-PD-1抗体，特别是人源化抗-PD-1抗体，以及包含本发明的抗-PD-1抗体的组合物及制品。亦描述抗-PD-1抗体的抗原结合片段。抗-PD-1抗体及其抗原结合片段可用于治疗多种疾病或病症，特别是由活化的自体反应性T细胞表征的疾病或病症，所述T细胞表达PD-1且为慢性发炎及自体免疫疾病的驱动子。抗-PD-1抗体及其抗原结合片段各包括特定识别PD-1表位的至少一部分。在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体及其抗原结合片段为激动剂抗-PD-1抗体及其抗原结合片段。
根据本发明的抗-PD-1抗体的产生及其表征描述于实施例中。在初始表征中，基于其优良的抗体效能选择抗-PD-1嵌合之前导723C2，如例如以下实施例中所描述。变体库通过将嵌合前导的CDR置放至人类共同重链及轻链可变域的FR中且此外通过不同变化对FR进行工程改造来产生。另外，小鼠前导723C2的重链CDR3中的半胱氨酸经人源化抗-PD-1抗体中衍生自小鼠前导723C2的酪氨酸置换(“DC”至“DY”)。自“DC”变化至“DY”对抗体的药理学特性不具有影响。用于产生人源化抗体的流程经描述于实施例中。
代表性小鼠前导的可变区的氨基酸序列展示于表1及2中。这些小鼠前导的CDR区及前导723C2的经工程改造的变体的CDR区展示于表3及4中。
表1：抗-PD-1小鼠前导-VK序列
表2：抗-PD-1小鼠前导-VH序列
各种小鼠抗体的小鼠轻链及重链CDR分别展示于表3及表4中。表3及4亦展示经由人源化流程衍生自小鼠抗体723C2的三个轻链CDR及三个重链CDR。
表3：轻链CDR序列
表4：重链CDR序列
将上表3及4中列出的使用Chemical Computing Group(CCG)编号界定的CDR加下划线(Almagro等人,Proteins 2011；79:3050-3066及Maier等人,Proteins 2014；82:1599-1610)。
衍生自小鼠抗体723C2的人源化轻链及重链可变区的代表性数目提供且展示于表5及6中。
表5：人源化723C2-VK序列
表6：人源化723C2-VH序列
衍生自小鼠抗体723C2的人源化轻链及重链可变区的选择组合产生抗体A、B、C、D及E：
抗体A：723C2-IgG4Pro-463-60与IgK-463-60(重链可变区723C2VH-463-60及轻链可变区723C2VK-463-60)；
抗体B：723C2-IgG4Pro-461-41与IgK-462-07(重链可变区723C2VH-461-41及轻链可变区723C2VK-462-07)；
抗体C：723C2-IgG4Pro-461-47与IgK-462-07(重链可变区723C2VH-461-47及轻链可变区723C2VK-462-07)；
抗体D：723C2-IgG4Pro-461-44与IgK-462-08(重链可变区723C2VH-461-44及轻链可变区723C2VK-462-08)；
抗体E：723C2-IgG4Pro-461-40与IgK-462-08(重链可变区723C2VH-461-40及轻链可变区723C2VK-462-08)。
抗体A、B、C、D及E具有表7中所示的重链及轻链序列。
表7：抗体A、B、C、D及E的重链及轻链DNA及氨基酸序列
抗体A、B、C、D及E的轻链及重链可变区在表7中带下划线。重链恒定区中的铰链区以粗体展示，其中Ser228Pro突变加框。
小鼠前导723C2亦转化成人类IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式。IgG4Pro在铰链区中具有一个突变Ser228Pro，其防止Fab臂交换。IgG1KO在铰链区中具有两个突变Leu234Ala及Leu235Ala以降低效应功能(ADCC)。
人类IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式中的嵌合723C2展示于表8中。
表8：人类IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro中的嵌合723C2的重链及轻链DNA及氨基酸序列
H-CDR3中对应于DC至DY的变化的氨基酸在表8中的氨基酸序列中带下划线。
人源化及氨基酸序列变体
其他变异型抗-PD-1抗体及抗体片段可基于表3及4中所描绘的CDR集合进行工程改造。应了解，在所述变异型抗-PD-1抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但例如FR区的周围区域可经工程改造。抗-PD-1抗体的氨基酸序列变体可通过将适当核苷酸变化引入至抗-PD-1抗体DNA中或通过肽合成来制备。此类变体包括例如自本文中实施例的抗-PD-1抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建物，其限制条件为该最终构建物拥有所需特征。氨基酸变化亦可改变人源化或变异型抗-PD-1抗体的翻译后流程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
在一些实施方案中，本发明包括具有可变重链及可变轻链的抗-PD-1抗体或其抗体片段，其中可变重链氨基酸序列及可变轻链氨基酸序列与表1、2、5及6中所公开的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一些实施方案中，本发明包括具有可变重链及可变轻链的抗-PD-1抗体或其抗体片段，其中可变重链氨基酸序列及可变轻链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:131、133、135、137或139及SEQ ID NO:125、127或129的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
在一些实施方案中，本发明包括具有重链及轻链的抗-PD-1抗体，其中重链氨基酸序列及轻链氨基酸序列与表7及8中所公开的氨基酸序列至少95％、至少98％或至少99％一致性。
抗体的另一类型氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。在此上下文中，术语“改变”意谓缺失一个或多个见于抗体中的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个先前不存在于抗体中的糖基化位点。举例而言，抗体可包含人类IgG1重链的位置297处的氨基酸取代以通过置换天冬酰胺297(例如，N297A、N297G)消除寡糖基转移酶复合物介导的糖基化。
在一些方面中，本发明包括编码本文所述的抗-PD-1抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗-PD-1抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过对抗-PD-1抗体的早期制备变体或非变异型进行寡核苷酸介导(或定点)突变诱发、PCR突变诱发及卡匣突变诱发来制备。举例而言，根据本发明的核酸分子亦涵盖在严格条件下与如本文所公开的核酸分子杂交的核酸分子，其中术语“严格条件”在本发明的范畴内可包括例如在42℃下在包含50％甲酰胺、5×SSC及1％SDS的缓冲液中杂交，或在65℃下在包含5×SSC及1％SDS的缓冲液中杂交，均在65℃下用0.2×SSC及0.1％SDS洗涤。例示性严格杂交条件亦可包括在37℃下在40％甲酰胺、1M NaCl及1％SDS的缓冲液中杂交且在45℃下于1×SSC中洗涤。
在某些实施方案中，抗-PD-1抗体为抗体片段。存在已开发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如Morimoto等人,1992,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人,1985,Science229:81)。替代地，片段可在重组宿主细胞中直接产生。举例而言，Fab'-SH片段可自大肠杆菌(E.coli)直接回收且经化学偶合以形成F(ab')2片段(参见例如，Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-167)。通过另一途径，F(ab')2片段可自重组宿主细胞培养物直接分离。产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员而言为显而易见的。
在一个方面中，抗-PD-1抗体及其抗原结合片段可包括修饰，诸如糖基化或去酰胺。
在某些实施方案中，可能需要使用抗-PD-1抗体片段，而非完整抗体。可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此情况可例如通过将救助受体结合表位并入至抗体片段中来达成。在一种方法中，抗体片段的适当区域可经改变(例如，经突变)，或可将表位并入至肽标签中，接着例如通过DNA或肽合成在任一末端或在中间融合至抗体片段。参见例如WO96/32478。举例而言，若不适宜使用全长IgG1支架，则本发明的抗体片段亦可与人类血清白蛋白融合以增加血清半衰期。抗体片段与人类血清白蛋白的此融合蛋白质在需要融合两种不同抗体片段以增加亲合力或以产生具有延长血清半衰期的双特异性结合蛋白的情况下可是有利的(发现例如，WO05077042A2)。
在其他实施方案中，本发明包括抗-PD-1抗体的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、赖氨酰基及氨基端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或麸氨酰基)、谷氨酰胺酰基及天冬酰胺酰基残基、或丝氨酰基、或苏氨酰基残基的修饰。另一类型的共价修饰涉及以化学方式或酶促方式将糖苷偶合至抗体。若适用，则此类修饰可通过抗体的化学合成或通过酶促或化学裂解进行。可通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或氨基或羧基端残基反应的有机衍生药剂反应来将抗体的其他类型的共价修饰引入至分子中。
存在于抗体上的任何碳水化合物部分的移除可以化学方式或酶促方式实现。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131描述。抗体上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol138:350所述的各种内糖苷酶及外糖苷酶实现。
另一类型的适用共价修饰包含以美国专利第4,640,835号、美国专利第4,496,689号、美国专利第4,301,144号、美国专利第4,670,417号、美国专利第4,791,192号及美国专利第4,179,337号中的一或多者中所阐述的方式使抗体连接至各种非蛋白质聚合物中的一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
表位结合
在另一方面中，本发明涉及识别特定“PD-1表位(PD-1 antigen epitope/PD-1epitope)”及“PD-1表位”的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“PD-1表位(PD-1 antigen epitope/PD-1 epitope)”是指能够结合至抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的分子(例如肽)或分子片段。这些术语进一步包括例如由本发明的抗体或抗体片段中的任一者识别的PD-1抗原决定子。
PD-1表位可包括于蛋白质、蛋白质片段、肽或其类似物中。表位最常为蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(亦即，模拟PD-1抗原的抗体结合特性的有机化合物)或其组合。
在一个方面中，本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段以模拟生理学配位体的结合的方式特异性结合于PD-1表位，从而得到抗体介导的激动作用。
本发明亦提供一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其与根据本发明的抗-PD-1抗体竞争结合至PD-1。在一个实施方案中，本发明提供一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其与本文所描述的抗体A、抗体B、抗体C、抗体D或抗体E竞争结合至PD-1。竞争分析可例如如PLoS One.2014；9(3):e92451中所描述使用生物传感器，或PLoS One 2020年3月5日；15(3):e0229206，或通过本文所公开的方法来进行。
治疗用途
在一个实施方案中，本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段适用于治疗或预防PD-1通路病症。
在另一实施方案中，本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段适用作药剂。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种调节人类患者的PD-1与PD-L1之间的相互作用的方法，其包含向该人类患者施用组合物，该组合物包含足以活化该人类患者的PD-1通路的量的根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于调节人类患者的PD-1与PD-L1之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于调节人类患者的PD-1与PD-L1之间的相互作用的药剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性的方法，其包含向该人类患者施用组合物，该组合物包含足以下调该人类患者的免疫反应的量的根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供一种根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于减弱人类患者的表达PD-1的T细胞活性的药剂。
在一个实施方案中，PD-1通路疾病或病症为全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎及发炎性肠病。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防人类患者的全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎或发炎性肠病的方法，其包含向该人类患者施用包含根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防人类患者的全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎或发炎性肠病。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于治疗或预防人类患者的全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎或发炎性肠病的药剂。
在一个实施方案中，PD-1通路疾病或病症为慢性或急性的，诸如慢性发炎疾病或急性发炎性疾病。在一个实施方案中，PD-1通路疾病或病症为关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、骨盆发炎性疾病、阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease)、发炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、佩洛尼氏病(Peyronie's Disease)、腹腔病、胆囊病、潜毛病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、脉管炎、手术黏附、中风、I型糖尿病、莱姆病(Lyme disease)、脑膜脑炎、自体免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、狼疮(诸如全身性红斑性狼疮)、格林巴利氏综合征(Guillain-Barr syndrome)、异位性皮肤炎、自体免疫肝炎、纤维化肺泡炎、格雷氏病(Grave's disease)、IgA肾病变、特发性血小板减少性紫癜、梅尼尔氏病(Meniere's disease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、类肉瘤病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、其他自体免疫性病症、胰脏炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心脏病(包括缺血性疾病，诸如心肌梗塞)以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松、骨关节炎、齿根骨膜炎及胃酸过少、与缺乏胎儿母体耐受性相关的不孕症、休格连氏综合征(Sjogren's Syndrome)、白癜风、重症肌无力或全身性硬化症。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防人类患者的以上疾病或病症中的一者的方法，其包含向该人类患者施用包含根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防人类患者的以上疾病或病症中的一者。在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于治疗或预防人类患者的以上疾病或病症中的一者的药剂。
在一个方面中，所使用或如上文所描述的用途或如上文所描述的方法中的PD-1抗体或其抗原结合片段为激动剂抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
非治疗用途
本文所述的抗体适用作亲和纯化剂。在此过程中，使用本领域熟知的方法将抗体固定于诸如蛋白质A树脂的固相上。使固定抗体与含有待纯化的PD-1蛋白质(或其片段)的样品接触，且此后用将移除样品中除PD-1蛋白质外的实质上所有物质的适合溶剂洗涤载体，该PD-1蛋白质经结合至固定抗体。最后，用自抗体释放PD-1蛋白质的另一适合溶剂洗涤载体。
如本文中所公开的本发明的抗-PD-1抗体及其片段亦适用于诊断分析以检测和/或定量PD-1蛋白质，例如检测特定细胞、组织或血清中的PD-1表达。
在一些实施方案中，有利的是例如出于诊断性目的用可检测部分标记抗体。许多可检测标识均可获得，包括放射性同位素、荧光标记、酶底物标记、量子点及类似者。标记可使用各种已知技术与抗体间接结合。举例而言，抗体可与生物素结合，且上文所提及的三大类别标记中的任一者可与抗生素蛋白结合，反之亦然。生物素选择性结合至抗生素蛋白，且因此标记可以此间接方式与抗体结合。或者，为实现标记与抗体之间接结合，可使抗体与小半抗原(诸如地高辛)结合，且不同类型的上文所提及标记中的一者与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)结合。因此，可实现标记与抗体之间接结合。
例示性放射性同位素标记包括35S、14C、125I、3H及131I。抗体可用放射性同位素使用例如Current Protocols in Immunology,第1及2卷,1991,Coligen等人编.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs中所描述的技术来标记。放射性可例如通过闪烁计数来测量。
例示性荧光标记包括衍生自以下的标记：可获得的稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰基、丽丝胺(Lissamine)、藻红素及得克萨斯红(Texas Red)，或例如以下荧光标记中的任一者：二烷基氨基香豆素、若丹明异硫氰酸酯、Alexa 350、Alexa 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素343、花青染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹磺酰基、达珀西(Dapoxyl)、二烷基氨基香豆素、DM-NERF、曙红、赤藻红、荧光素、FA、羟基香豆素、IRDyes(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、丽丝胺若丹明B、Marina Blue、甲氧基香豆素、Naphtho荧光素、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、PyMPO、5-羧基-4',5-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、5-羧基-2',4',5,7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝苯-2-氧杂-I,3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫(cresyl fast violet)、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶二胺铕、铕穴状合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻青蛋白C、藻青蛋白R、硫胺、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸酯、若丹明红、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明或得克萨斯红。荧光标记可经由例如已知技术(诸如Current Protocols inImmunology,同上中所公开的技术)与抗体结合。荧光可使用荧光计定量。
存在本领域已知的各种充分表征的酶底物标记(关于综述，参见例如美国专利第4,275,149号)。酶一般催化显色底物的化学改变，该化学改变可使用各种技术测量。举例而言，改变可为可以分光亮度法测量的底物的颜色变化。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应以电子方式激发且接着可发射可使用例如化学发光仪测量的光，或为荧光受体供给能量。
酶标记的例子包括荧光素酶(诸如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶)(美国专利第4,737,456号)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸盐脱氢酶、尿素酶、过氧化酶(诸如辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖、淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(诸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化酶、微过氧化酶及其类似物。使酶与抗体结合的技术描述于例如O'Sullivan等人,1981,Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods in Enzym.(J.Langone及H.VanVunakis编),Academic press,N.Y.,73:147-166中。
酶-底物组合的例子包括例如：辣根过氧化酶(HRPO)与作为底物的氢过氧化酶，其中氢过氧化酶氧化染料前体，诸如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)；碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯磷酸酯；及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与诸如对硝苯基-β-D-半乳糖苷酶的显色底物或荧光底物4-甲基香豆素基-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可获得许多其他酶-底物组合。关于这些组合的一般综述，参见美国专利第4,275,149号及美国专利第4,318,980号。
在另一实施方案中，本发明的抗-PD-1抗体或抗体片段未经标记使用且结合抗-PD-1抗体或其片段的标记抗体检测。举例而言，经标记的抗人类Fc或抗人类Fab抗体可用于检测未经标记的抗-PD-1抗体或片段。根据本发明的未标记抗-PD-1抗体或其片段的用途可有利于实现更优选的组织穿透，作为荧光标记将增加其融合的抗体或抗体片段的分子量和/或增加其疏水性，从而减少组织穿透。
本文所述的抗体可用于任何已知分析方法，诸如竞争性结合分析、直接及间接夹心分析，及免疫沉淀分析。参见例如Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,第147至158页(CRC Press,Inc.1987)。诊断试剂盒。
本发明的人源化抗-PD-1抗体可用于诊断试剂盒中，亦即预定量的试剂与用于进行诊断分析的说明书的封装组合。若抗体用酶标记，则试剂盒可包括酶所需的底物及辅因子，诸如提供可检测发色团或荧光团的底物前体。另外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)及其类似物。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上使分析敏感性最佳的试剂溶液中的浓度。试剂可以干燥粉末(通常冻干)形式提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
诊断试剂盒
本发明的抗-PD-1抗体或其片段可用于诊断试剂盒中，亦即预定量的试剂与用于进行诊断分析的说明书的封装组合。若抗体用酶标记，则试剂盒可包括酶所需的底物及辅因子，诸如提供可检测发色团或荧光团的底物前体。另外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)及其类似物。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上使分析敏感性最佳的试剂溶液中的浓度。试剂可以干燥粉末(通常冻干)形式提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
组合物及其施用
可向具有本文所描述的PD-1通路疾病或病症或处于其风险下的个体施用包含根据本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物。本发明进一步提供抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于预防或治疗PD-1通路疾病或病症的药剂。如本文中所使用的术语“个体”意谓可施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的任何哺乳动物患者，包括例如人类及某些非人类哺乳动物，诸如灵长类动物及狗。特别意欲使用本文所描述的方法治疗的个体包括人类。本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段可单独或与其他组合物组合施用。
在一个方面中，本发明亦提供包含本发明的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
已知各种递送系统且可用以施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。引入方法包括(但不限于)玻璃体内、滴眼剂、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗-PD-1抗体或其抗原结合片段可例如通过输注、推注或注射施用，且可与其他生物活性剂一起施用。给药可为全身性或局部的。用于此类注射的调配物可以例如预填充注射器制备。
抗-PD-1抗体或其抗原结合片段可以包含治疗有效量的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段及一种或多种药学上可兼容的成分的药物组合物形式施用。
在典型实施方案中，根据常规程序将药物组合物调配成适用于向人类静脉内或皮下施用的药物组合物。通常，通过注射施用的组合物为于无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，药物亦可包括增溶剂及诸如利多卡因(lignocaine)的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。一般而言，所述成分为在指示活性剂的量的密闭性密封容器(诸如安瓿或药囊)中单独供应或以单位剂型混合在一起，例如呈冻干粉末或无水浓缩物形式。当通过输注施用药物时，其可用含有无菌药物级水或生理盐水的输注瓶来配药。当通过注射施用药物时，可提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿，使得所述成分可于施用前混合。
此外，药物组合物可以药物试剂盒形式提供，该药物试剂盒包含(a)含有呈冻干形式的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的容器及(b)含有注射用药学上可接受的稀释剂(例如无菌水)的第二容器。可使用药学上可接受的稀释剂复水或稀释冻干的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。视需要与该(等)容器相关联的可为由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，该注意事项反映由人类给药的制造、使用或销售机构的批准。
可通过标准临床技术测定有效治疗或预防PD-1通路疾病或病症的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的量。另外，体外分析可任选用于帮助鉴别最佳剂量范围。欲用于调配物中的精确剂量亦将视给药途径及病症阶段而定，且应根据医师的判断及各患者的情况来决定。可自来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。
举例而言，抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗功效可通过测定ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)的标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定。展现大治疗指数的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段为优选。
自细胞培养物分析及动物研究获得的资料可用于调配用于人类的剂量范围。抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的剂量通常于包括具有极小或不具毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，视所采用剂型及所用给药途径而定。对于方法中所用的任何抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，治疗有效剂量最初可由细胞培养物分析估计。可在动物模型中调配剂量以达成循环血浆浓度范围，包括如在细胞培养物中所测定的IC50(亦即，达成症状之一半最大抑制的测试化合物的浓度)。此信息可用于更精确地测定适用于人类的剂量。可例如通过高效液相色谱、ELISA及其类似方法测量血浆中的含量。
在一个实施方案中，抗-PD-1抗体以规律的时间间隔施用。
在一些实施方案中，本发明的抗体可调配成包括例如1mg/ml至250mg/ml、例如20mg/ml至200mg/ml的剂量。
在一些实施方案中，包含抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物可进一步包含结合或未结合至结合剂的治疗剂。
此类组合疗法施用对疾病参数(例如症状的严重度、症状数目或复发频率)可具有累加或协同作用。
关于用于组合施用的治疗方案，在一特定实施方案中，将抗-PD-1抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时施用。在另一特定实施方案中，在施用抗-PD-1抗体或其抗原结合片段之前或之后施用治疗剂。
聚核苷酸、载体、宿主细胞及重组方法
本发明涉及经分离的聚核苷酸，其包含编码抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的序列；载体；及宿主细胞，其包含聚核苷酸；及用于产生抗体的重组技术。经分离的聚核苷酸可编码任何所需形式的抗-PD-1抗体，包括例如全长单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、双功能抗体、线抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。
包含编码抗-PD-1抗体或其片段或链的序列的聚核苷酸可与如本领域已知的一个或多个调节或对照序列融合，且可包含于如本领域已知的适合的表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变域的聚核苷酸分子中的每一者可独立地融合至编码恒定域(诸如人类恒定域)的聚核苷酸序列，从而使得能够产生完整抗体。替代地，聚核苷酸或其部分可融合在一起，从而提供用于产生单链抗体的模板。
对于重组产生，将编码抗体的聚核苷酸插入至用于克隆(DNA扩增)或表达的可复制载体中。可获得许多适用于表达重组抗体的载体。载体组分一般包括(但不限于)以下一或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、强化子组件、启动子及转录终止序列。
抗-PD-1抗体亦可以融合多肽形式产生，其中抗体与异源多肽(诸如信号序列)在成熟蛋白或多肽的氨基端具有特异性裂解位点的其他多肽融合。选定的异源信号序列通常为经宿主细胞识别且处理(亦即，通过信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别且处理抗-PD-1抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可经原核信号序列取代。信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导子及其类似物。对于酵母分泌，原生信号序列可经例如获自酵母转化酶α因子(包括酵母(Saccharomyces)及克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导子)、酸磷酸酶、白色念珠菌(C.albicans)淀粉酶的前导序列或WO90/13646中所描述的信号取代。在哺乳动物细胞中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导子，例如单纯疱疹gD信号。此类前驱区的DNA在阅读框架中接合至编码人源化抗-PD-1抗体的DNA。
表达载体及克隆载体含有使得载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体中，此序列为使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母及病毒而言此类序列是熟知的。来自质体pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacteria)，2-υ.质体起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。
表达载体及克隆载体可含有编码可选标记的基因，以便于识别表达。典型可选标记基因编码如下蛋白质，所述蛋白质赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄西林(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性，或者补充营养缺陷型缺乏，或在其他替代方案中，提供不存在于复合培养基中的特定营养素，例如编码用于杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实施例利用药物来阻滞宿主细胞生长。这些经异源基因成功转型的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且因此在选择疗法中存活。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸及潮霉素。哺乳动物细胞的常见可选标记为使得能够鉴别可摄取编码人源化抗-PD-1抗体的核酸的细胞的标记，诸如DHFR(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及金属硫蛋白-II(诸如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鸟氨酸去羧酶及其类似物。首先通过在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转型体来识别经DHFR选择基因转型的细胞。当采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(例如DG44)。
替代地，经编码抗-PD-1抗体、野生型DHFR蛋白质及另一种可选标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转型或共转型的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过在含有针对可选标记(诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中进行细胞生长来选择。参见例如美国专利第4,965,199号。
在酵母细胞作为宿主细胞执行重组生产的情况下，存在于酵母质体YRp7中的TRP1基因(Stinchcomb等人,1979,Nature 282:39)可用作可选标记。TRP1基因为在色氨酸中不具有生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC编号44076或PEP4-1)提供选择标记(Jones,1977,Genetics 85:12)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤接着提供通过在不存在色氨酸下生长检测转型的有效环境。类似地，诸如ATCC 20,622及38,626的Leu2p缺乏酵母菌株由带有LEU2基因的已知质体来补充。
另外，衍生自1.6μm环形质体pKD1的载体可用于克鲁维酵母的转型。或者，针对克鲁维乳球菌(K.lactis)报导用于大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。亦已公开用于通过工业克鲁维酵母菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定多复本表达载体(Fleer等人,1991,Bio/Technology 9:968-975)。
表达载体及克隆载体通常含有通过宿主生物体识别且可操作地连接于编码抗-PD-1抗体或其多肽链的核酸分子的启动子。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统及杂合启动子，诸如tac启动子。其他已知细菌启动子亦为适合的。用于细菌系统中的启动子亦将含有可操作地连接于编码人源化抗-PD-1抗体的DNA的夏因-达尔加莫(Shine-Dalgamo，S.D.)序列。
已知许多真核启动子序列。几乎所有的真核基因均具有富AT区，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列为CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。在大部分真核基因的3'端处为AATAAA序列，其可为将聚A尾添加至编码序列的3'端的信号。所有这些序列适合插入至真核表达载体中。
适合与酵母宿主一起使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的启动子，所述糖分解酶诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡糖激酶。
诱导性启动子具有通过生长条件控制的额外转录优势。这些启动子包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶的酵母启动子区。适用于酵母表达的载体及启动子进一步描述于EP 73,657或Baghban等人，Molecular Biotechnology(2019)61:365-384中。酵母强化子亦宜与酵母启动子一起使用。
可控制哺乳动物宿主细胞中自载体的抗-PD-1抗体转录，例如通过获自诸如以下的病毒的基因组的启动子实现：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或热休克启动子，限制条件为此类启动子与宿主细胞系统兼容。
SV40病毒的早期及晚期启动子宜以亦含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子适宜以HindIII E限制性片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛科动物乳头瘤病毒作为载体来表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号中。此系统的修饰描述于美国专利第4,601,978号中。亦参见Reyes等人,1982,Nature 297:598-601，其公开在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下，人类p-干扰素cDNA于小鼠细胞中的表达。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列作为启动子。
可用于重组表达载体中的另一适用要素为强化子序列，其用以增加高级真核生物的编码抗-PD-1抗体的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(例如血球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)的许多强化子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的强化子。实施例包括复制起点后侧(bp 100-270)上的SV40强化子、细胞巨大病毒早期启动子强化子、复制起点后侧上的多瘤病毒强化子以及腺病毒强化子。关于增强真核启动子活化的组件的描述亦参见Yaniv,1982,Nature 297:17-18。强化子可剪接至载体中在抗-PD-1抗体编码序列5'或3'端的位置处，但优选位于启动子5'端的位点处。
真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体亦可含有终止转录及稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔3'非翻译区。这些区域在编码抗-PD-1抗体的mRNA的未翻译部分中含有以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。在一些实施方案中，可使用CHEF系统表达抗-ANGPT2抗体。(参见例如美国专利第5,888,809号，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
本文中适用于在载体中克隆或表达DNA的宿主细胞为上文所描述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))及志贺杆菌属(Shigella)；以及杆菌属(Bacilli)(诸如枯草杆菌(B.subtilis)及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中所公开的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如绿脓杆菌(P.aeruginosa))及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选大肠杆菌克隆宿主为大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的其他菌株为适合的。这些实施例为说明性而非限制性的。
除原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为编码抗-PD-1抗体的载体的适合克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物中最常使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母。然而，多种其他属、种及菌株通常可用且适用于本文，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔第克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗厚神经胞子菌(Neurosporacrassa)；施氏酵母属(Schwanniomyce)，诸如西方施氏酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；及丝状真菌，例如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)及黑曲霉(A.niger)。
适用于表达经糖基化抗-PD-1抗体的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的例子包括植物及昆虫细胞，包括例如许多杆状病毒菌株及变体以及来自诸如以下宿主的对应容许昆虫宿主细胞：草地黏虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊虫)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊虫)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)(桑蚕(silk worm))。用于转染的各种病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体及家蚕NPV的Bm-5菌株，且此类病毒可特别是用于转染草地黏虫细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿及烟草的植物细胞培养物亦可用作宿主。
本发明的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段亦可并入至病毒载体中，亦即将编码抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸引入至病毒载体中且接着在用病毒感染之后表达于患者体内。
在另一方面中，抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的表达为在脊椎动物细胞中进行。脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已变成常规程序且可广泛获得技术。适用哺乳动物宿主细胞株的例子为经SV40转型的猴肾脏CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)、人类胚胎肾株(经次克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,1977,J.GenVirol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如DG44)、小鼠塞特利氏细胞(mousesertoli cell)(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人类子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCCCRL 1442)、人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞、及人类肝肿瘤株(Hep G2)。
宿主细胞经用于产生抗体或其抗原结合片段的上述表达或克隆载体转型且在适当时经调节的常规营养物培养基中培养以便诱导启动子、选择转型体或扩增编码所要序列的基因。
用以本文所描述的产生抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。诸如Ham's F10(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,Mo.)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)，Sigma-Aldrich Co.)的可商购培养基适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人,1979,Meth.Enz.58:44；Barnes等人,1980,Anal.Biochem.102:255；美国专利第4,767,704号、美国专利第4,657,866号、美国专利第4,927,762号、美国专利第4,560,655号、美国专利第5,122,469号、WO 90/103430及WO 87/00195中的一或多者中所描述的培养基中的任一者可用作用于宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可视需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙盐、镁盐及磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷及胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素)、痕量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量来源。亦可以本领域技术人员已知的适当浓度包括其他补充剂。培养条件(诸如温度、pH值及其类似条件)为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，且对于一般本领域技术人员而言将显而易见。
当使用重组技术时，抗体可于细胞内、周质间隙中产生或直接分泌于培养基中。若抗体于细胞内产生，则第一步可将细胞破坏以释放蛋白质。可例如通过离心或超过滤移除微粒碎片，亦即宿主细胞或裂解片段。Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-167描述用于分离将分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下历时约30min解冻细胞浆料。可通过离心来移除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩此类表达系统的上清液。在任何先前步骤中可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。可使用多种方法自宿主细胞分离抗体。
由细胞制备的抗体组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析及亲和力色谱加以纯化，其中亲和力色谱是典型纯化技术。蛋白质A作为亲和配位体的适合性视抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类及同型而定。可使用蛋白质A纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如Lindmark等人,1983J.Immunol.Meth.62:1-13)。针对所有小鼠同型及人类γ3，推荐蛋白质G(参见例如Guss等人,1986EMBO J.5:1567-1575)。连接亲和配位体的基质最常为琼脂糖，但其他基质为可用的。与琼脂糖可达成者相比，机械稳定性基质(诸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许较快流动速率及较短处理时间。在抗体包含CH3域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。亦可利用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀，此视欲回收的抗体而定。
在任何初步纯化步骤之后，包含所关注的抗体及污染物的混合物可经历通常在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下执行的使用洗脱缓冲液的约2.5与4.5之间的pH值下的低pH疏水性相互作用色谱。
亦包括在低严格、中等严格及高严格条件下，特别是在如本文所定义的高严格条件下与由编码抗-PD-1抗体或抗体片段的经分离聚核苷酸序列表示的所有核苷酸序列或一部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗-PD-1多肽(例如重链或轻链可变区)的一部分或所有核酸的序列或其互补序列至少80％，例如至少90％、至少95％或至少98％一致性。可使用本文所描述的类型的杂交核酸例如作为克隆探针、引物，例如PCR引物或诊断探针。在一个方面中，“高严格条件”意谓针对长至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切及改性的鲑鱼精子DNA及50％甲酰胺中预杂交及杂交，接着进行标准南方墨点法程序12至24小时。最后在65℃下使用0.2×SSC、0.2％SDS洗涤载剂材料三次，每次15分钟。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码重链可变区的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该重链可变区包含SEQ ID NO:108至123中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码轻链可变区的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该轻链可变区包含SEQ ID NO:92至107中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码重链可变区的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该重链可变区包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:130、SEQID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:138中的任一者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码轻链可变区的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该轻链可变区包含SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:129中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:124、SEQID NO:126或SEQ ID NO:128中的任一者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码重链的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该重链包含SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:153或SEQ IDNO:155中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:142、SEQID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:152或SEQ ID NO:154中的任一者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码轻链的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该轻链包含SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:151中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:140、SEQID NO:144或SEQ ID NO:150中的任一者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码重链的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该重链包含SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161或SEQ ID NO:163中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:158、SEQID NO:160或SEQ ID NO:162中的任一者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码轻链的核苷酸序列的经分离聚核苷酸，该轻链包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种经分离聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:156的核苷酸序列。
制品
在另一方面中，包括含有适用于治疗上文所述病症的材料的制品。制品包含容器及标签。适合的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及试管。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑料。容器固持有效治疗病状的组合物且可具有无菌接取口。举例而言，容器可为具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。组合物中的活性剂为抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关联的卷标指示该组合物用于治疗所选病状。制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可进一步包括自商业及使用者的观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的药品说明书。
本发明在以下实施例中进一步加以描述，其不意欲限制本发明的范畴。
实施例
实施例1：抗体产生(免疫接种)
使MHC A型、C型、D型、E型、H型、G型菌株小鼠免疫接种有重组单体人类PD-1或人类PD-1-人类Fc-His蛋白质。此重组蛋白的基因符号为PDCD1且GeneID为5133。随后通过流式细胞术使用表达用于结合的人类PD-1抗原的CHO-人类PD-1细胞来评估血清学。在B细胞分离之前，向所选血清阳性小鼠给予最终增强免疫。所有选择的小鼠展现出血清的阳性抗体效价。在阳性血清学下，收集脾脏细胞以用于回收抗原特异性B细胞。根据IACUC(实验动物照护及使用委员会)批准的方案进行所有程序。
实施例2：人源化抗-PD-1抗体的产生
将小鼠前导抗体723C2转化成由723C2的小鼠可变域及人类恒定IgG1WT、IgG1KO或IgG4Pro域组成的嵌合抗体。小鼠抗体723C2轻链可变区(Vκ)及重链可变区(VH)的序列展示于上文表1及2中。IgG4Pro具有一个防止Fab-臂交换的置换突变(Ser228Pro)。IgG1KO在铰链区中具有两个突变Leu234Ala及Leu235Ala以降低效应功能(ADCC)。产生嵌合抗体以确认抗体的功能且确保获得校正序列。人类IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式中的嵌合723C2的序列展示于表8中。人类IgG1WT及IgG4Pro中的嵌合723C2在H-CDR3中含有DC至DY的突变。然而，人类IgG1KO中的嵌合723C2不具有突变。此位点中的突变在表8中经突出显示。随后经由设计及筛选流程使抗体的可变区人源化。制备其中人类及小鼠残基以使得任何给定位置中可存在人类或小鼠残基的方式变化的库。针对在人类生殖系抗体与小鼠抗体之间不同的那些氨基酸，制得此库。仅选择保留亲本小鼠抗体的功能的克隆。抗体723C2的代表性人源化可变区展示于表5及6中。
以此方式，抗体A、抗体B、抗体C、抗体D及抗体E为衍生自小鼠抗体723C2的人源化抗体(克隆入人类IgG4Pro/κ主链中)。抗体A、B、C、D及E展示于表7中。
实施例3：抗体与重组PD-1蛋白质的结合
A)人类IgG4Pro主链中的嵌合抗-PD-1抗体结合至重组人类PD-1的动力学及亲和力展示于下文中(表9)。使用ProteOn XPR36(Biorad，Hercules，CA)使用由瞬时转染接着单一柱纯化产生的材料来测量动力学及结合亲和力。
表9
B)测量衍生自小鼠抗体723C2的人源化抗-PD-1抗体的亲和力。使用ProteOnXPR36(Biorad，Hercules，CA)及全局拟合1:1结合模型所测量的动力学结合数据显示与重组人类PD-1的相互作用介于1nM至10nM范围内(表10)。亦测试抗体PD1AB-6-4P(公开于Celgene的WO2017/058859中的IgG4Pro主链中的抗体)。
表10
C)在ProteOn XPR36上测量抗-PD-1抗体结合至食蟹猕猴PD-1的亲和力及动力学资料，且全局拟合1:1结合模型(表11)。亦测试抗体PD1AB-6-4P。
表11
D)对人类PD-1的分子选择性
在基于细胞的分析中，通过流式细胞术评估抗-PD-1抗体对人类PD-1蛋白质的选择性。将不表达人类PD-1蛋白质的亲本Jurkat细胞或表达人类PD-1蛋白质的Jurkat细胞与如下所示的浓度的经AlexaFluor 647标记的抗-PD-1抗体一起培育。作为对照，将亲本的且表达PD-1的Jurkat细胞与抗-TNP同型对照抗体一起培育。培育之后，洗涤细胞以移除未结合抗体，固定于PFA中，且接着于染色缓冲液中洗涤。通过流式细胞术评估抗体与Jurkat细胞的结合。亦通过流式细胞术评估未染色细胞，作为阴性对照。抗-PD-1抗体选择性地结合至人类PD-1，高达至少1微摩尔，如由结合至表达人类PD-1蛋白质的Jurkat细胞的剂量依赖性抗体，且缺乏经AlexaFluor 647标记的抗-PD-1抗体与不具有PD-1表达的亲本Jurkat细胞的结合指示。使用抗体C(Ab C)的代表性实验的结果展示于图1中。
实施例4：人类PD-1-Fc结合至人类PD-L1-Fc的竞争结合分析
人类PD-L1-Fc以60μg/mL的浓度胺偶合于BioRad ProteOn XPR36仪器上的GLM芯片的信道1至3上；三种测试抗体(抗体C、MK-3475(派立珠单抗)及PD1AB-6-4P)分别以30μg/mL胺偶合于通道4、5及6上。人类PD1-Fc以25nM的浓度注射于芯片表面上的信道1至6中。传感图谱指示PD-L1与PD-1受体之间的特异性结合(图2A)。将500nM抗体C、MK-3475及PD1AB-6-4P与25nM PD1-Fc预混合且以分析物形式注射在芯片上的所有信道中以评估个别抗体是否抑制PD-L1与PD-1的结合。如传感图谱所表明，抗体C及PD1AB-6-4P两者与PD-L1非竞争性结合至PD-1抗原。基于竞争分析中所观测的非结合传感图谱，MK-3475及PD-L1为彼此与PD-1的潜在结合阻断剂(图2B)。
实施例5.在存在抗-PD-1激动剂抗体的情况下PD-L1与PD-1的增强结合
在人类IgG4Pro主链中存在PD-1激动剂抗体723C2而H-CDR3中不存在DC至DY突变的情况下，询问PD-1/PD-L1相互作用。利用多种分析证实抗体723C2增强PD-L1与PD-1的结合。利用基于ELISA的生物化学分析评估PD-1与培养盘结合的PD-L1的结合(BPSBioscience)。在4℃下使白色96孔微量盘涂布有50μl含2μg/ml PD-L1的PBS隔夜。移除上清液且用由制造商BPS Bioscience(目录号72005)提供的1×免疫缓冲液洗涤培养盘三次，接着在室温(RT)下用封闭缓冲液阻断一小时。添加抗体以及相关对照物，接着在室温下添加0.5ng/ml(10ng)的PD-1生物素持续两小时。用封闭缓冲液阻断培养盘10分钟。将链霉亲和素辣根过氧化物酶二级抗体添加至洗涤培养盘中一小时，接着用PD-1分析缓冲液洗涤。将培养盘阻断10分钟。刚好在读取之前将化学发光底物混合物添加至培养盘中。在亮度计(Envision)上或在能够读取化学发光的微量滴定盘上读取化学发光信号。
如与同型对照物处理的样品相比，化学发光信号增加所指示，在存在抗体723C2的情况下观测到PD-1与PD-L1的相互作用增强(图3A)。抗体723C2在图3A中指定为723C2-4P。此与MK3475(阻断PD-L1-PD-1相互作用的已知抗-PD-1拮抗剂抗体)形成对比。在此分析中，抗体PD1AB-6-4P显示PD-1-PD-L1的增强有限(图3A)。
利用基于细胞的分析证实基于ELISA的结果，从而表明PD-1/PD-L1相互作用在存在抗体723C2的情况下增强。在此处，通过用DELFIA(解离增强的镧为元素荧光免疫分析)受体-配位体结合分析(Perkin Elmer)测量可溶性PD-1与过度表达PD-1的CHO细胞的结合来评估PD-1/PD-L1的相互作用。
接种10,000个细胞且在37℃+5％CO2培育箱(含湿气培育箱)中培育隔夜。将生物素标记的PD-L1 EC 10(130nM)及10μl PD-1抗体添加至各孔中且在室温下培育1小时。用50μl的1×TRF洗涤缓冲液洗涤培养盘两次。将20μL的Eu-链霉亲和素试剂添加至分析盘中，且在室温下培育一小时。添加增强溶液且在室温下培育30分钟。在荧光盘读取器(激发：320或340nm，发射：615nm)上读取培养盘。在此分析中且在ELISA分析的证实中，此基于细胞的分析中存在抗体723C2使PD-1/PD-L1相互作用增强(图3B)。抗体723C2在图3B中指定为723C2-4P。
亦利用其中PD-1表达于CHO细胞上的第二种基于细胞的分析来评估PD-1/PD-L1相互作用。在此分析中，通过流式细胞术测量结合至表达PD-1的CHO细胞的PD-L1-多聚体。将50μl的2×106个细胞/毫升添加至各孔中(100,000个细胞/孔)。将细胞离心且再悬浮于50μl的指定抗体浓度中且在冰上培育60分钟。将PDL1-生物素及链霉亲和素-APC合并于染色缓冲液中(1μg/ml PDL1-生物素+0.25μg/ml链霉亲和素-APC)。添加50μl的2×PDL1-生物素/链霉亲和素-APC混合物至细胞中且在冰上培育60分钟。将细胞洗涤且再悬浮于180μl染色缓冲液+20μPFA中且在BD LSR II上获取资料。如图3C中所指示，此基于细胞的分析亦显示在存在抗体723C2的情况下PD-L1与PD-1的结合增强。抗体-6-4P对PD-L1结合不具有作用，而MK3475拮抗剂抗体抑制PD-L1与PD-1的结合(图3C)。抗体723C2在图3C中指定为723C2-4P。
亦用抗体C、抗体PD1AB-6-4P、抗体1-4Pro、抗体PD1B1090-4Pro、抗体PD1B1094-4Pro及抗体ANB-030-4Pro进行如上文所描述的CHO PD-1-PD-L1Delphia-Eu TRF分析。抗体1-4Pro在IgG4-Pro主链中包含Eli Lilly的WO2019/168745中所描述的抗体1的重链及轻链可变区。抗体PD1B1090-4Pro及抗体PD1B1094-4Pro在IgG4-Pro主链中包含JanssenBiotech的WO2018/226580中所描述的PD1B1090及PD1B1094各别的重链及轻链可变区。抗体ANB-030-4Pro在IgG4-Pro主链中包含在CAS编号CAS 2412764-40-8下描述的抗体ANB-030的重链及轻链可变区(亦对应于Anaptysbio的WO2020/247648中所描述的APE12537的重链及轻链可变区)。亦包括IgG4-Pro主链中的抗-TNP抗体。
抗体C展示PD-1\PDL-1结合以浓度依赖性方式恒定(N＝3)增强(图3D)。所有其他抗-PD-1激动剂始终展示PD-1\PDL-1结合未增强(图3D)。
实施例6：功能性细胞分析，抑制THP-1/Jurkat-PD-1激动剂报导子分析中的NFAT活化
研发THP-1/Jurkat PD1 NFAT共培养分析以评估由多次活动产生的抗-PD1抗体的激动剂活性。THP-1细胞株为获自ATCC。内部产生Jurkat报导子细胞株。Jurkat报导子细胞在细胞表面上过度表达人类PD-1(hPD-1)且亦表达NFAT-驱动荧光素酶报导子以测量细胞回应于刺激的活化状态。在存在THP-1细胞的情况下用CD3×CD33 BiTE活化Jurkat PD1NFAT细胞。BiTE的抗-CD33臂结合THP-1细胞上表达的CD33，而抗-CD3臂结合Jurkat细胞上的CD3分子。BiTE用以接合THP-1及Jurkat细胞，从而在两种细胞之间形成免疫突触同时使Jurkat细胞活化。经由NFAT驱动荧光素酶报导子测量Jurkat PD-1NFAT细胞的活化。此分析为在存在抗-PD1抗体的情况下运行以鉴别激动剂抗体。如由荧光素酶信号损失所指示，展现20％或更大的活化减少的分子归类为激动剂抗体(表12)。表12中的抗-PD-1抗体306E6至820C3为在小鼠IgG1主链上。选择若干这些抗体以对人类IgG4Pro主链进行额外型态分析(表示为表12中的嵌合抗体)。
表12
实施例7：功能性细胞分析-抑制人类PD-1基因敲入脾细胞的IFNγ产生
用以选择靠前的抗-PD1抗体的初级细胞分析为hPD1基因敲入小鼠脾细胞分析。自表达人类PD1而非小鼠PD1的C57BL/6小鼠收集脾脏。自脾脏分离脾细胞且用浓度为0.1μg/ml的抗-CD3(克隆2C11)活化。48小时之后通过MSD分析(Meso Scale Discovery)定量mIFNγ含量来测量T细胞活化。在存在选自THP-1/Jurkat PD1 NFAT筛选分析的抗-PD1抗体的情况下运行分析。基于mIFNγ的抑制％(50％或更大)及序列分枝为选择自此分析鉴别出的靠前的分子。抑制及IC50值展示于表13中。
表13
实施例8：功能性细胞分析，抑制人类PBMC分析的IFNγ产生
如通过在人类初级细胞分析中的IFNγ产生所测量，进一步表征抗-PD-1激动剂抗体调节T细胞功能活性的能力。自人类全血分离PBMC且用1.5pM的抗-CD3(克隆OKT3，BioLegend)活化。72小时之后通过MSD分析定量hIFNγ含量来评估T细胞活化及功能。与同型对照处理的细胞相比，所鉴别的抗-PD-1激动剂抗体能够减少IFNγ分泌(表14A)。
表14A
亦在此分析中测试抗体C、抗体1-4Pro、抗体PD1B1090-4Pro、抗体PD1B1094-4Pro、抗体ANB-030-4Pro及阿巴西普(abatacept)。结果展示于表14B中。亦在此分析中测试抗体C，抗体1-4Pro、抗体PD1B1090-4Pro、抗体PD1B1094-4Pro及抗体ANB-030-4Pro于IgG1野生型主链及IgG1 KO主链中的可变区，以及阿巴西普。结果展示于以下概述的表14C中。在各实验中，测试五个供体。
表14B
表14C
抗体1-4Pro、抗体PD1B1090-4Pro、抗体PD1B1094-4Pro及抗体ANB-030-4Pro于IgG1 KO主链中的可变区的IFNγ抑制小于40％，其中IC50值高于30nM。
实施例9：功能性细胞分析，抑制Th17-单核细胞共培养分析的IL-17A产生
测试抗-PD-1激动剂抗体对Th17分化T细胞的IL-17分泌的功能性抑制。研发初级细胞共培养分析以评估通过PD-1调节IL-17。自PBMC分离的人类初级T细胞在以下偏斜条件下经Th17分化：在Th17偏斜培养基(X-VIVO15培养基+IL-1β(10ng/mL)、IL-23(10ng/mL)、IL-6(10ng/mL)、IL-2(2ng/mL)、TGFβ(0.5ng/mL)、5μg/mL抗-IL4、5μg/mL抗-IFNγ)中用0.5μg/ml培养盘结合的抗-CD3(克隆UCHT1)刺激CD4 T细胞4天。4天之后，自抗-CD3涂布的培养盘移除细胞且转移至含有Th17偏斜培养基的烧瓶中。接着分化，将Th17细胞静置至少3天，随后与自体单核细胞共培养且用40fM抗-CD3(克隆OKT3)在存在PD-1抗体的情况下再刺激。由于抗-PD-1抗体展现激动剂活性所必需的Fc要求，需要共培养系统。在此分析中在存在抗-PD-1激动剂抗体的情况下观测到IL-17的抑制。抗体IC50及IL-17反应的最大抑制展示于下表中(表15)。相对于同型对照抗体比较最大抑制。
表15
实施例10：功能性细胞分析，抑制Tfh-单核细胞共培养分析的IL-21产生
开发了一种评估抗-PD-1激动剂抗体抑制T滤泡辅助(Tfh)细胞体外活性的能力的分析。CD4 T细胞及自体单核细胞获自ALLCELLS。T通过用Dynabeads人类T-活化剂CD3/CD28(Gibco)在存在IL-23(25ng/ml)及TGFβ(5ng/ml)的情况下活化细胞5天而使所述细胞偏向Tfh谱系，且接着在洗涤细胞且移除活化珠粒之后，在存在4.5pM抗-CD3(克隆OKT3，BioLegend)及抗-PD-1激动剂抗体的情况下与自体单核细胞合并。24小时后，收集上清液且分析IL-21的存在(Meso Scale Discovery，MSD V-Plex人类IL-21试剂盒)。通过抗-PD-1激动剂抗体抑制经再刺激Tfh分化细胞的IL-21产生。代表性IC50及Emax抑制值展示于表16中。
表16
实施例11：FcgR相互作用对PD-1激动剂活性的作用
通过利用不同主链形式(IgG1野生型、IgG1 KO或IgG4 Pro)的候选抗PD-1激动剂抗体或二价抗体片段(F(ab')2片段)表征Fc-Fcg受体相互作用对激动剂抗体的功能活性的作用。通过上文所描述的人类PBMC分析中调节活化T细胞的IFNγ产生的能力评估抗体变体的功能活性。如通过IFNg产生减少所测量，亲本723C2及820C3抗体的二价F(ab')2片段的功能激动剂活性损失(图4A及4B)。相比之下，人类IgG4Pro主链中的全长抗体以剂量依赖性方式抑制IFNγ产生(图4A及4B，各别地指定为723C2-4P及820C3-4P)。在这些分析中，自全血分离人类PBMC且用1.5pM的抗-CD3克隆OKT3在存在抗-PD-1抗体或所指定抗-PD-1抗体的F(ab')2片段的情况下活化。72小时之后，通过MSD分析测量上清液中的人类IFNγ细胞因子含量。
由于此表明抗-PD-1抗体的功能激动剂活性需要Fc相互作用，723C2抗体产生于IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro主链上以进一步表征这些相互作用(各别地723-IgG1WT 723-IgG1KO及723-IgG4Pro，于下表17中)。IgG1 WT及IgG4Pro均结合至人类Fc受体达至不同程度，而IgG1 KO主链极大地减少与Fc受体的结合。IgG4 Pro上的抗-PD-1激动剂抗体展现人类PBMC分析中IFNγ的最高程度抑制，而IgG1 KO上的抗体展现极大地减少活性(表17)。总体而言，这些数据指示抗-PD-1抗体的功能性激动作用取决于Fc相互作用。
表17
实施例12：体内模型-异种CD4+T细胞GvHD模型
体内异种CD4+T细胞GvHD小鼠模型用以测试PD-1激动剂抗体的功效。每组八只NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，The Jackson Laboratory)经IV注射来自健康供体leukopak的5×106个CD4+T细胞(通过阴性选择纯化)。根据以下每周以0.625mg/kg IP向小鼠给药两次；第1组：723(IgG4-Pro)，第2组：PD1AB-6-4P(IgG4-Pro)，第3组：抗-TNP同种型(IgG4-Pro)，第4组：阿维鲁单抗(hIgG1-LALAPG)，第5组：抗-TNP同种型(hIgG1-LALAPG)，第6组：CTLA4-Ig(hIgG1-LALA)。TNP为三硝基苯酚。LALA表示常用于破坏抗体效应功能的Leu234Ala/Leu235Ala突变。PG表示Pro329Gly突变，其通过预防与Fcγ受体结合而消除效应功能。
运行三个实验重复，各自具有单独的供体。在第四周，相比于所有测试供体的同种型匹配对照，在第1组、第2组及第6组中注意到人类细胞累积的显著抑制(表18)。在第四周，细胞因子的定量展示所有供体中人类IFNγ、TNFα及IL-10的含量的显著减少(表19)。亦测试人类IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12p70及IL-13，但全部低于分析的检测极限。
表18：人类CD45+细胞累积
表19：人类血浆细胞因子产生
实施例13：食蟹猕猴的药物动力学研究
在中国来源的雄性食蟹猕猴中单次静脉内(IV)推注剂量0.1、0.3及1.5mg/kg或皮下(SC)剂量1.5mg/kg(n＝3/组)之后，评估抗体C的药物动力学(PK)。使用两种不同的MSD免疫分析形式确定抗体C的血清浓度：(1)“总”药物通用抗人类捕获及检测分析及(2)具有抗原(PD1-ECD)捕获及抗人类检测的“游离”药物分析。两种分析的PK概况可重叠，表明内源性sPD-1不干扰抗体C的测量且对TMDD几乎无影响。抗体C展现出剂量依赖性CL(使用游离及“总”分析)，在0.1与0.3mg/kg之间表明目标介导的药物处置(TMDD)对总体清除率的贡献。各别剂量中的每一者的NCA药物动力学参数的概述展示于下表20中。
表20
实施例14：CHO细胞中的转染及产生以及生物物理学数据
CHO细胞中的转染及产生：
CHO-E细胞以约2×10E6个细胞/毫升在Irvine BalanCD Transfectory CHO+4mML-谷氨酰胺(或Glutamax)中转染。1L转染所需的量为0.15mg HC DNA加0.3mg LC DNA及1.05mg填充剂DNA(鲱鱼精子)及0.15mg XBP1 DNA。将DNA稀释于100mL OptiPro SFM中且经由0.2μm过滤器进行无菌过滤。将0.75mL Mirus TransIT Pro转染剂添加至经稀释的DNA混合物中且立即将DNA复合物添加至制备的CHO-E细胞中，且将摇瓶返回至140rpm的37℃、5％CO2振荡器。转染后24小时，将温度转变为32℃，将2mL的Gibco抗凝集剂及100ml IrvineTransfectory补充剂添加至经转染的细胞中。转染后五天，将振荡器温度转变为30℃。视葡萄糖含量下降在2g/L至1g/L之间的时候而定，在第5天或第7天添加200mL的IrvineTransfectory补充剂。将经传染的培养物保持10天。通过使细胞短暂离心进行采集，接着经由0.2μm PES过滤器(Thermo Scientific)进行无菌过滤。
采集之后，通过具有蛋白质A生物传感器的ForteBio/Pall Octet Red 96仪器如下取样澄清的细胞培养上清液以用于效价。
抗体A、抗体C及抗体E的效价为在18至38mg/L之间，其中自蛋白质纯化中回收约80％，且在SEC纯化之后回收大于98％单体。蛋白质经缓冲液更换于含有10mM组氨酸-HCl，pH 6.0的最终缓冲液中且在4℃下稳定至少4个月且在此缓冲液中的溶解性高达180mg/ml。
表21
表22
AUC：如通过在0.5至1mg/ml的浓度下的沉降速度法所测量的分析型超速离心；SEC：尺寸排阻色谱；％M：单体百分比。
实施例15：双特异性抗体
材料及方法
小鼠抗体及试剂。抗-hPD1(EH12.2H7)(Biolegend，329912)；抗-hCD48(Bio-gems，10511 -25-500)；来自eBiosciences的IgG1(目录号16-4714-85)、抗-hCD3(OKT3)(16-0037-85)、抗-hCD3(UCHT1)(16-0038-85)及抗-CD11a(140011982)；抗-hCD71(SouthernBiotech，9670-14)。aCD3/aCD28人类T细胞活化剂Dynabeads(Gibco，11131D)
Imagestream。将Jurkat PD-1细胞与AF-488霍乱毒素(Life Technologies，V-34403)及交联抗体(Jackson ImmunoResearch)及APC aCD3(Biolegend，317318)、PV786aPD-1(Biolegend，329930)或APC aCD48(Sigma，SAB4700193)在冰上的XVIVO 15培养基(Lonza)中培育10分钟。细胞通过转移至预温热X-VIVO 15中而活化且使其培育额外12分钟。通过添加冷PBS-2％PFA(大致1:10比率，细胞:PFA)停止细胞活化，且将细胞在冰上的固定溶液中培育20分钟。将细胞洗涤且再悬浮于XVIVO中别使用Imagestream软件分析端帽形成及周长临限值。
流式细胞术。将1×105个Jurkat、Jurkat-PD-1或aCD3/aCD28刺激的初级人类T细胞与1mg/ml的初级mAb在4℃下培育1小时，或在测试双特异性分子的情况下，自6.25mg/ml的起始浓度及连续稀释1:4产生8-点结合曲线。将细胞洗涤且在4℃下用各别地1:100稀释的PE-抗-小鼠Ig(Life Technologies，P852)或1:800稀释的PE-山羊抗人类F(ab')2(Invitrogen AHI1707)染色1小时。将样品洗涤，固定于1×固定/裂解缓冲液(eBioscience，00-5333-57)中且在LSR2(BD)上进行分析
PD-1补充分析。过度表达全长PD-1-PK及胞内全长SHP1-EA融合蛋白质的2×104个Jurkat T细胞为购自DiscoverX(DRX-BI-080515A)且根据制造商说明进行培养。将细胞再悬浮于细胞接种培养基(DiscoverX，93-0563R4B)中，且与初级小鼠或人类抗体在4℃下一起预培育30min。根据实验，另外将细胞与10mM的泛Src激酶抑制剂PP2(Abcam，ab120308)或失活类似物PP3(Abcam，ab120617)一起预培育。将细胞洗涤且用或不用交联二级山羊抗-小鼠IgG(Thermo Scientific，31170)处理。将细胞转移至384-白色Opti-培养盘(PerkinElmer)，接受快速检测试剂(DiscoverX，93-0247)，且在EnVision盘读取器(PerkinElmer)上读取。
初级huT细胞活化。用500nM Cell Trace Violet(Life Technologies，目录号c34557)标记初级人类Pan-T细胞(AllCells，PB009-1F)。根据制造商说明书，使Epoxy-dynabeads M450(Invitrogen，14011)共价涂布有2.5mg的小鼠Ab/107个珠粒。使细胞不受刺激或用培养盘结合的抗-CD3(UCHT1)(250及500ng/mL)在存在Ab涂布的环氧基珠粒的情况下刺激。在96h后采集细胞，用BV510抗CD4(BD，562970)及PeCy7抗-CD8(BD，335787)Ab染色，且通过含Cell Trace Violet稀释液的LSR2(BD)分析细胞增殖。初级记忆CD4+/CD45RO+T细胞(AllCells，PB009-7F)分别用1毫克/孔的培养盘结合的抗-CD3(UCHT1)在存在1毫克/孔的培养盘结合的同型对照(ISO)或BsAb的情况下刺激。在72h时采集培养物上清液且分析IL-2及IL-10分泌(MSD)。
BsAb产生及构建物设计。由公开的用作建构嵌段的的抗-CD48(US2012/0076790)及抗-PD1(WO 2011/110621Al)序列产生双特异性抗体(BsAb)。用杵-臼技术设计双特异性构建物以便于两个不同目标可变区(IgG1-KO)的异二聚化以产生含有抗-PD-1及抗-CD48(PD-1/CD48)，或抗-PD-1及抗-TNP作为对照(PD-1/ISO)的BsAb(图7A)。针对各别目标获得的可变区序列经克隆入含有人类恒定区的pTT-5(已由加拿大国家研究委员会授权)表达载体中。简言之，可变区氨基酸序列经密码子优化用于哺乳动物表达。目标V-基因的轻链及重链经克隆入含有接合接头区段的相同表达载体中。通过限制酶消化使用EcoRI及NheI识别位点来使载体线性化。可变区的DNA序列经整合DNA技术(IDTDNA)定序为G-嵌段(dsDNA)，与载体及邻接接头区段具有重叠的同源末端。随后根据制造商的方案经由Gibson组装方法(NEBuilder HiFi试剂盒，New England Biolabs，目录号E5510S)接合G-嵌段。随后通过将组装混合物转换至胜任细胞(NEB 5-αC2987，New England Biolabs)中，且接着在37℃下于具有100μg/ml卡本西林(carbenicillin)(Teknova)的LB琼脂盘上生长隔夜来完成传统的克隆。拣取个别集落且在37℃下于具有卡本西林的LB培养基中生长隔夜。通过使用Lasergene软件包(DNAstar)进行序列分析证实插入物的阳性克隆。序列证实的质体DNA在0.5L培养物中按比例增加且接着根据制造商的方案经由Plasmid Plus megaprep试剂盒(Qiagen，目录号12981)纯化。
CHO-E瞬时转染。将CHO-E细胞以2e6个细胞/毫升于补充有2mM谷氨酰胺的FS-CHO中进行转染。对于1L mAb转染量，将1mg轻链(LC)质体DNA及0.5mg重链(HC)质体DNA稀释于100mL的OptiPro SFM(Gibco)中且经由0.2μm过滤器(Millipore)进行无菌过滤。添加1.5mL的TransIT Pro(Mirus Bio LLC)转染剂且使其在室温下培育15-30分钟。随后将复合物添加至制备的CHO-E细胞中，且将摇瓶返回至振荡器中。转染后24小时，将10mL的抗凝集剂及150mL的CHO CD有效馈料B(均来自Gibco)添加至经转染的细胞中且将温度转变为32℃。将经传染的培养物保持6至12天且在整个培养期间常规地监测细胞生长、存活率及营养物消耗。通过在4℃下以4700rpm离心，接着进行无菌过滤来完成培养物采集。
BsAb纯化。将采集的培养物上清液以1.0ml/min负载于来自GE(目录号11003493)的用缓冲液A(DPBS，pH7.2)预平衡的1ml HiTrap MabSelect SuRe柱上。用10ml缓冲液A、缓冲液B(DPBS加1.0M NaCl)中的每一者且再用缓冲液A以1ml/min洗涤柱。随后，用30mM乙酸钠，pH3.5洗脱结合的蛋白质。用1％体积比体积的3M乙酸钠，pH约9中和5ml洗脱份。在蛋白质A洗脱之后，最终缓冲液为60mM NaOAc，pH约5。通过aSEC，对于PD1/ISO的单体百分比为71％，且对于PD1/CD48的单体百分比为63％。
进一步精制经MabSelect Sure纯化的材料以通过阳离子交换移除聚集物。使用来自Thermo Fisher(目录号4481316)的Poros GoPure HS预装填的柱进行离子交换。将蛋白质A样品负载于用缓冲液A(60mM NaOAc，pH 5.0)预平衡的1ml Poros HS柱上且用10柱体积的缓冲液A洗涤柱。随后用20柱体积的0％至40％梯度的缓冲液B(60mM NaOA，1M NaCl，pH5.0)以0.5ml/min洗脱结合的蛋白质。合并峰周围的洗脱份且将盐浓度调节至100mM NaCl。用过滤单元对样品进行无菌过滤，测量蛋白质浓度，测定内毒素含量且运行SDS-PAGE以及aSEC。
NFAT荧光素酶分析。内部产生Jurkat PD-1NFAT报导子细胞株。将来自GeneCopoeia(EX-B0169-M02)的人类PD-1克隆入载体中，该载体经由电穿孔转染至Jurkat细胞(ATCC)中。随后经由电穿孔将NFAT荧光素酶报导子(Promega E8481)转染至表达PD-1的克隆中。THP-1细胞株购自ATCC(TIB-202)且根据制造商说明书进行培养。
将Jurkat PD-1及NFAT报导子细胞再悬浮于分析培养基(RPMI，2％HI-FBS)中，且将3×104个细胞/条件与一定剂量的BsAb(起始浓度为100nM且1:3稀释)在384平底Opti-培养盘中一起预培育15min。添加THP-1细胞(3×104个细胞/条件)，且在37℃下用10nM aCD3×aCD33活化剂溶液刺激细胞6h。通过添加
荧光素酶分析试剂形式15min(Promega，E2520)分析NFAT报导子且在EnVision盘读取器中进行读取。
结果
CD48及PD-1交联增强PD-1磷酸化。CD48为小鼠及人类淋巴球中公认的脂质筏及IS常驻蛋白(Elishmereni及Levi-Schaffer，2011)。为更优选的限定脂质筏中的CD48的存在及丰度相对于PD-1及CD3的存在及丰度，我们实施ImageStream实验以在单细胞层级上定量这些受体与霍乱毒素(CT)诱导的脂质筏聚结(端帽)在过度表达PD-1的Jurkat细胞中的共定位。使用荧光团标记的MAb进行对CD48、CD3及PD-1于由CT诱导的脂质筏帽内的共定位的分析。此分析显示，不同于PD-1，容易在CT诱导的端帽内观测到CD3及CD48。其中较小周长值与加帽相关的周长定量公开，在活化之后CD48的端帽显而易见，但比CD3略微不丰富。相比之下，PD-1通常不与CT共定位，与PD-1需要主动过程(例如，与PDL-1相互作用)以便募集至脂质筏富集的IS的假设一致(Yokosuka等人，2012)。
CD48存在于脂质筏中且与Src激酶(T细胞中的Lck)组成性缔合，使得我们假设，类似于CD3，CD48近似于PD-1将诱导PD-1活化/磷酸化，因为PD-1活化的正准机制需要Lck介导的PD-1的胞内ITSM及ITIM域磷酸化(Chemnitz等人,2004；Parry等人,2005；Sheppard等人,2004)。为了测试此假设，产生定制Jurkat细胞株以表达具有一半b-半乳糖(PK)的人类PD-1融合蛋白，及具有一半互补b-半乳糖(EA)的胞溶质全长SHP1融合蛋白。由于SHP1募集至产生功能性b-半乳糖的磷酸化PD1，由此依据PK/EA募集测量PD-1活化。在这些细胞中确认PD-1、CD48及CD3的表达之后，设定实验以评估MAb抗CD48以在交联后诱导PD-1活化的潜能(图5)。在不存在PD-1MAb或Fc特异性二级F(ab')2抗体的情况下，不诱导PD-1活化。与二级抗体交联诱导PD-1活化约3倍；然而，在存在CD48或CD3 Mab的情况下，PD-1活化增强约9倍，从而表明CD48或CD3与PD-1的紧密缔合可增强PD-1活化。由自交联诱导的低水平PD-1活化是出人意料的，因为研究已证实，小部分Lck与T细胞中的PD-1组成性缔合(Sheppard等人,2004)。
PD-1的CD48-依赖性活化需要Src-激酶活性。为判定通过CD48增强PD-1活化/磷酸化是否取决于Src激酶活性，在存在泛Src激酶抑制剂PP2或失活类似物PP3的情况下实施交联实验。Src-激酶抑制在自交联或与CD48共交联后消除PD-1活化，从而表明PD-1活化需要Lck活性。为进一步验证此概念，通过在存在抗CD71(一种不迁移至脂质筏或不与Src-激酶缔合的受体)的抗体的情况下使PD-1与次佳量的抗-PD-1交联来评估PD-1活化(Schatzlmaier等人,2015)。PD-1与CD71的交联并不引起PD-1活化，从而支持PD-1易位至富含活化Src激酶的环境中能够使得PD-1磷酸化及活化的发现。
CD48依赖性PD-1活化使AR诱导的初级人类T细胞增殖钝化。为在功能上评估CD48依赖性PD-1活化调节T细胞功能的能力，使磁性珠粒共价地共涂布有CD48、PD-1MAb及同型对照，且在用培养盘结合的抗-CD3刺激的初级人类T细胞(CD4+及CD8+)上测试。首先，我们证实CD48及PD-1在预活化的人类CD4+及CD8+T淋巴球中的表达。为评估经涂布珠粒对细胞活化的作用，人类泛T细胞用CellTrace-Violet标记，随后用CD3 MAb活化，且通过CellTrace的稀释分析细胞增殖(图6)。如图6中所示，相对于用单独涂布有CD48或PD-1MAb的珠粒处理的细胞，共涂布有CD48及PD-1MAb两者的珠粒能够显著地减少T细胞增殖，且对CD4+的抑制作用比CD8+细胞更显著。作为额外对照，我们亦测试共涂布有PD-1及CD11a Mab的珠粒；在假定CD11a不为组成性脂质筏常驻蛋白质时选择后者。如所预期，PD-1在与CD11a共募集时不具有抑制功能。这些结果进一步支持通过脂质筏常驻分子(亦即，CD48)的PD-1活化可有效地活化PD-1以抑制T细胞扩增的假设。
针对PD-1及CD48的双特异性抗体诱导PD-1活化以调节AR刺激的人类T细胞中的细胞因子分泌及NFAT活化。使用各别单克隆抗体涂布的珠粒获得的结果提示我们产生双特异性抗体(BsAb)以便测试PD-1与CD48的分子定位将提供活化人类T细胞上的抑制信号的假设(图7)。产生公开的抗体(来自专利申请案WO 2011/110621Al的激动性抗-PD-1抗体)，且来自US2012/0076790的抗-CD48 Ab及BsAb经工程改造为杵或臼单重/轻链构建物以产生含有抗-PD-1及抗-CD48(PD-1/CD48)，或抗-PD-1及抗-TNP作为对照(PD-1/ISO)的BsAb(图7A)。通过在过度表达PD-1的Jurkat细胞上进行流式细胞术以便检测PD-1及CD48结合，或在缺乏PD-1表达的Jurkat细胞上进行流式细胞术以检测仅CD48结合来展现各臂与PD-1或CD48的结合(图7B)。使用上文所描述的Jurkat PD-1补充分析系统，我们证实PD-1/CD48 BsAb相比于PD-1/ISO对照组约3倍更强效的诱导PD-1活化，从而证实使用此BsAb形式的PD-1/CD48共定位亦使得PD-1磷酸化增强(图6)。为评估PD-1/CD48 BsAb的功能性效应，人类记忆CD4+T(PD1+)细胞用培养盘结合的抗-CD3e在存在培养盘结合的PD-1/CD48BsAb或对照抗体的情况下刺激，且分析细胞因子分泌(图7C)。此分析公开PD-1/CD48 BsAb的免疫调节效应，因为其显著减少促发炎细胞因子IL2的分泌，但增强抗炎细胞因子IL-10的产生。由于IL-2分泌需要NFAT转录活化(Chow等人,1999)，在表达PD-1及NFAT-荧光素酶报导子的Jurkat T细胞中评估PD-1/CD48 BsAb对NFAT活化的作用，且用抗-CD3e在存在用于共刺激的THP-1细胞的情况下进行活化。此分析展示相比于对照抗体，PD-1/CD48 BsAb能够减少NFAT报导子>10％至30％，且指示PD-1的CD48依赖性活化亦抑制导致IL-2产生的关键T细胞效应子转录事件。
序列表
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<213> 人工序列
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<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
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Trp Ile Phe Pro Gly Ser Thr Asn Asp Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gly
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<213> 人工序列
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<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
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Tyr Arg Thr Asp Phe Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
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<213> 人工序列
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肽"
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Asp Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Ala Tyr His Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
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肽"
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Ala Asp Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
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肽"
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn
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肽"
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Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Asp Thr Lys His Asn Glu Asn Phe Lys
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Gly
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肽"
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Tyr Ser Asn Phe Phe Phe Asp Tyr
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肽"
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Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser
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肽"
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His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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肽"
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Ser Ser Gln Gly Leu Tyr Ser Ser Tyr Asp Tyr
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肽"
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
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肽"
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Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
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肽"
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
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肽"
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Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
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Gly
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肽"
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Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Cys
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Pro Asp Leu Val Lys
1 5 10 15
Gly
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肽"
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Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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肽"
<400> 78
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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肽"
<400> 79
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Leu Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5 10
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Phe Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
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<220>
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肽"
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Gly Gly Tyr Trp Ser Leu Tyr Phe Asp Tyr
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肽"
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn
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肽"
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Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly His Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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肽"
<400> 85
Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Phe
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肽"
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Gln
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Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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肽"
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Tyr Gly Leu Val Pro Phe Asp Tyr
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Gly Asn Thr Phe Asn Ser Asn Tyr Ile Gln
1 5 10
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肽"
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Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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肽"
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Tyr Gly Pro Val Pro Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 112
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多肽"
<400> 92
Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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<213> 人工序列
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多肽"
<400> 93
Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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多肽"
<400> 94
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Val Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 107
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多肽"
<400> 95
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Lys Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 112
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<213> 人工序列
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多肽"
<400> 96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Tyr Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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多肽"
<400> 97
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
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Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
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多肽"
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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多肽"
<400> 99
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Phe Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 107
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多肽"
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Arg Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Phe
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Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<213> 人工序列
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多肽"
<400> 101
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys His Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
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多肽"
<400> 102
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Asn Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 103
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
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多肽"
<400> 103
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Ser Leu Pro
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 104
<211> 113
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<400> 104
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
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Lys
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多肽"
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 107
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<213> 人工序列
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多肽"
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Ser Leu Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 107
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<213> 人工序列
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多肽"
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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多肽"
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20 25 30
Tyr Val Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Phe
35 40 45
Gly Asp Ile His Pro Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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多肽"
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20 25 30
Tyr Val Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Phe
35 40 45
Gly Asp Ile His Pro Asn Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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多肽"
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35 40 45
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50 55 60
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多肽"
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多肽"
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多肽"
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Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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cctgaagaca tcgcgacgta ttattgtcag cagggtacta gcctgcctcg cgccttcggc 300
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聚核苷酸"
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多肽"
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聚核苷酸"
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多肽"
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聚核苷酸"
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agctgcgccg caagcggttt cacctttagc gactactata tgtcctgggt gcgtcaggcg 120
ccaggtaaag gtctggaatg ggtgtcatac atcagctccg ggggcggtag caagtactat 180
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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多肽"
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聚核苷酸"
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多肽"
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Gln Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gln Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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聚核苷酸"
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多肽"
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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聚核苷酸"
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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聚核苷酸"
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tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgccc tcctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 600
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ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
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多肽"
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130 135 140
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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<400> 160
gaagtgcagc tggtggaatc tggcggagga cttgttcaac ctggcggcag cctgaaactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctgggt ccgacagacc 120
cctgagaaga gactggaatg ggtcgcctac atcagctctg gcggcggaag cagctactac 180
cctgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acaccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatgt ccagcctgaa gtctgaggac accgccgtgt actactgtgc cagactgcct 300
cactacttcg ccatggattg ttggggccag ggcacatctg tgaccgttag ttctgcctcc 360
accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agcgcgttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgctgg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccgcga ggagatgacc 1080
aagaaccagg taagtttgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg t 1341
<210> 161
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
多肽"
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 162
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
聚核苷酸"
<400> 162
gaagtgcagc tggtggaatc tggcggagga cttgttcaac ctggcggcag cctgaaactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctgggt ccgacagacc 120
cctgagaaga gactggaatg ggtcgcctac atcagctctg gcggcggaag cagctactac 180
cctgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acaccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatgt ccagcctgaa gtctgaggac accgccgtgt actactgtgc cagactgcct 300
cactacttcg ccatggatta ttggggccag ggcaccagcg tgaccgtttc ttctgcctcc 360
acaaagggcc cttccgtgtt ccccctggcc ccttgctccc ggtccacctc cgagtctacc 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc ctccggcctg 540
tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgccc tcctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 600
tgtaacgtgg accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660
ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggaccctc cgtgttcctg 720
ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 840
gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac ctaccgggtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960
gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020
ccccgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccaagccagg aagagatgac caagaaccag 1080
gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tgtactctcg gctgaccgtg gacaagtccc ggtggcagga aggcaacgtc 1260
ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 1320
ctgagcctgg gc 1332
<210> 163
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
多肽"
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
<400> 164
Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
<400> 165
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
<400> 166
Arg Thr Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列描述：合成
肽"
<400> 167
Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
Claims (35)
1.一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:44的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:45的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQID NO:3的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:46的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:45的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQID NO:3的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:48的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:49的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:51的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:52的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:8的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQID NO:9的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:54的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:55的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:11的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:12的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:57的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:58的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:14的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:15的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:60的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:61的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:17的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:18的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:63的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:64的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:20的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:21的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:66的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:67的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:23的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:24的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:69的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:70的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:26的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:27的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:72的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:58的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:14的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:29的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:74的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:75的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:76的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:78的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:76的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:166的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:78的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:166的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:167的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:81的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:82的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:14的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:34的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:84的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:85的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:35的氨基酸序列L-CDR2)；及SEQ ID NO:36的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:87的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:88的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:38的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:39的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:90的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:91的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:41的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:42的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。
2.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:74的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:75的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:76的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:78的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:76的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:166的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:78的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:166的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区，
或
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:79的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:77的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及
包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:167的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求1至3中任一项的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、Fab、F(ab′)2、Fv及scFv。
5.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区及轻链可变区分别包含以下的氨基酸序列：分别包含SEQ ID NO:108及SEQ ID NO:92；分别包含SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:93；分别包含SEQ ID NO:110及SEQ ID NO:94；分别包含SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:95；分别包含SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:96；分别包含SEQ ID NO:113及SEQ ID NO:97；分别包含SEQID NO:114及SEQ ID NO:98；分别包含SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:99；分别包含SEQ IDNO:116及SEQ ID NO:100；分别包含SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:101；分别包含SEQ ID NO:118及SEQ ID NO:102；分别包含SEQ ID NO:119及SEQ ID NO:103；分别包含SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:104；分别包含SEQ ID NO:121及SEQ ID NO:105；分别包含SEQ ID NO:122及SEQ ID NO:106；分别包含SEQ ID NO:123及SEQ ID NO:107。
6.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139中任一者的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:129中任一者的氨基酸序列。
7.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区及轻链可变区分别包含以下的氨基酸序列：分别包含SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:125；分别包含SEQ ID NO:133及SEQ ID NO:127；分别包含SEQ ID NO:135及SEQ ID NO:127；分别包含SEQ ID NO:137及SEQ ID NO:129；或分别包含SEQ ID NO:139及SEQ ID NO:129。
8.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区及轻链可变区，其分别与SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:125；分别与SEQ IDNO:133及SEQ ID NO:127；分别与SEQ ID NO:135及SEQ ID NO:127；分别与SEQ ID NO:137及SEQ ID NO:129；分别与SEQ ID NO:139及SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性。
9.根据权利要求1至8中任一项的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含选自由以下组成的组的重链恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定区。
10.根据权利要求9的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该重链恒定区为具有Ser228Pro突变的IgG4的重链恒定区。
11.根据权利要求9的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该重链恒定区为IgG1的重链恒定区。
12.根据权利要求9的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该重链恒定区为具有Leu234Ala及Leu235Ala突变的IgG1的重链恒定区。
13.根据权利要求1至12中任一项的抗-PD1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由κ及λ组成的组的轻链恒定区。
14.根据权利要求1的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含重链及轻链，所述重链和轻链分别包含以下的氨基酸序列：分别包含SEQ IDNO:143及SEQ ID NO:141；分别包含SEQ ID NO:147及SEQ ID NO:145；分别包含SEQ ID NO:149及SEQ ID NO:145；分别包含SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:151；或分别包含SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:151。
15.根据权利要求5至14中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至15中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，及药学上可接受的赋形剂。
17.根据权利要求1至16中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用作药物。
18.一种治疗PD-1通路病症的方法，该方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据权利要求1至16中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
19.根据权利要求1至16中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于治疗PD-1通路病症。
20.根据权利要求1至16中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗PD-1通路病症的药物中的用途。
21.根据权利要求18的方法，根据权利要求19的用于所述用途的所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求20的所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的用途，其中该疾病选自由以下组成的组：全身性硬化症(SSc)、全身性红斑性狼疮、多发性肌炎、巨大细胞动脉炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、僵直性脊椎炎及发炎性肠病。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，用于所述用途的所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，或用途，其中该抗体或其抗原结合片段通过非经肠途径、静脉内途径或皮下途径施用。
23.一种经分离的聚核苷酸，其编码根据权利要求5至7中任一项的重链可变区和/或轻链可变区。
24.一种经分离的聚核苷酸，其编码根据权利要求14的重链和/或轻链。
25.一种表达载体，其包含根据权利要求23或24的聚核苷酸。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25的表达载体。
27.根据权利要求26的宿主细胞，其中该细胞为哺乳动物细胞。
28.一种制造抗体的方法，其包含以下步骤：
使宿主细胞在允许抗体形成的条件下培养，该宿主细胞包含：包含编码根据权利要求5至7中任一项的重链可变区的经分离的聚核苷酸的表达载体及包含编码根据权利要求5至7中任一项的轻链可变区的聚核苷酸的表达载体；及
回收该抗体。
29.一种制造抗体的方法，其包含以下步骤：
使宿主细胞在允许抗体形成的条件下培养，该宿主细胞包含：包含编码根据权利要求14的重链的经分离的聚核苷酸的表达载体及包含编码根据权利要求14的轻链的聚核苷酸的表达载体；及
回收该抗体。
30.根据权利要求28或29的方法，其进一步包含纯化该抗体的步骤。
31.根据权利要求28或29的方法，其进一步包含将该抗体调配成药物组合物的步骤。
32.一种多特异性抗体，其包含第一抗-PD-1激动剂抗原结合位点及第二抗原结合位点。
33.根据权利要求32的多特异性抗体，其中该第二抗原结合位点为抗-CD48结合位点、抗-CD-2结合位点、抗-CD11a结合位点或抗-CD3结合位点。
34.根据权利要求32的多特异性抗体，其中该第一抗-PD-1激动剂抗原结合位点包含根据权利要求1至8中任一项的重链可变区及轻链可变区。
35.根据权利要求32至34中任一项的多特异性抗体，其中该抗体为双特异性抗体。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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