JP2023528778A - 抗ｐｄ－１抗体 - Google Patents

抗ｐｄ－１抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2023528778A
JP2023528778A JP2022572362A JP2022572362A JP2023528778A JP 2023528778 A JP2023528778 A JP 2023528778A JP 2022572362 A JP2022572362 A JP 2022572362A JP 2022572362 A JP2022572362 A JP 2022572362A JP 2023528778 A JP2023528778 A JP 2023528778A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022572362A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021242663A5 (ja
Inventor
ブレア，デイビッド・エー
ガラファ，ニコル・ケー
グプタ，パンカジ
グプタ，プリヤンカー
ハン，フェイ
カルラック，アーロン・ティモシー
リウ，ドンメイ
ロレンツ，アイヴォ
ンボウ，ムアマドゥ・ラミン
モレノ－ガルシア，ミゲル・イー
モッツィエルツ，ヨーゼフ・エー
ラルフ，ケリー・エル・エム
シャアバン，アブドゥルサラム
ホワイト，デラ・エム
ウー，ヘレン・ハイシャ
ヤン，グアンウェイ
Original Assignee
ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング filed Critical ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
Publication of JP2023528778A publication Critical patent/JP2023528778A/ja
Publication of JPWO2021242663A5 publication Critical patent/JPWO2021242663A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、治療的及び診断的方法のための新たな抗ＰＤ－１（プログラム細胞死１）抗体及びその抗原結合フラグメントならびにそれらを使用する組成物に関する。

Description

配列リスト
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。こ前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年４月２９日に作成されており、０９－０７０１－ＷＯ－１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは１３６，５２７バイトである。
発明の分野
本発明は、一般的に、治療的及び診断的な使用のための抗ＰＤ－１（プログラム細胞死１）抗体に関する。より具体的には、ＰＤ－１を発現する細胞により特徴付けられる種々の疾患又は障害の処置のための抗ＰＤ－１抗体及び使用の方法を開示する。抗ＰＤ－１抗体を含む医薬組成物及びキットがまた、開示される。
発明の背景
プログラム細胞死１は、また、ＰＤ－１及びＣＤ２７９（分化クラスター２７９）としても公知であり、主にＴ細胞上で発現される細胞表面受容体タンパク質であるが、しかし、また、他の免疫細胞上で発現される。ＰＤ－１経路は、免疫寛容の誘導及び維持における重要なレギュレーターである。このタンパク質は「免疫チェックポイント」阻害剤として機能する、即ち、自己免疫疾患を調節及び制限するように、免疫系における細胞の活性を調節するように作用する。ＰＤ－１は２つのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を有し、それらは細胞表面受容体と相互作用する。結合時に、ＰＤ－１は細胞内シグナルを誘導し、それはＴ細胞応答を負に調節する。活性化Ｔ細胞の表面上では、ＰＤ－１発現が、Ｔ細胞による末梢抗原の認識後に上方調節される；その後、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２へのＰＤ－１の上昇した結合は、下流の阻害性シグナル伝達のための重要な工程になる。ＰＤ－１はまた、増加したＴｒｅｇ細胞増殖及び増強された免疫抑制機能に関連付けられる。
最近、多くの癌が「免疫チェックポイント」阻害剤を修飾することにより免疫系からそれ自体を保護し、このように、検出を回避することができることが理解されてきた。ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１を遮断する新たなクラスの薬物であり、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃し、特定の型の癌を処置するために使用される。
対照的に、欠損したＰＤ－１阻害機能はまた、免疫媒介性疾患の病態生理学に関連付けられており、ＰＤ－１又はそのリガンドの発現は調節不全になる、又は特定の自己免疫適応症において完全に関与していないことがある。ＰＤ－１活性化の誘導ならびにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２系の使用は、免疫応答を抑制し、種々の免疫障害及び炎症性障害のための処置を提供するための代替アプローチを表す。
従って、治療についての必要性があり、それによって、ＰＤ－１経路を誘導し、抑制機能を増強し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２系により制御される免疫障害及び炎症性障害のための処置を提供する。特に、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の間での相互作用を、そのような相互作用を遮断することなく調節する生物学的治療薬、例えば抗体などについての必要性がある。
発明の概要
本発明は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の一態様では、本発明の抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を遮断しない。本発明の一態様では、本発明の抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を増強する。本発明の一態様では、本発明の抗体は、ＰＤ－１シグナル伝達経路を活性化する。本発明の一態様では、本発明の抗体は抗ＰＤ－１アゴニスト抗体である。本発明の抗体は、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節することにより、特にＰＤ－１経路を活性化することにより軽減することができる疾患又は障害の処置及び／又は予防のために有用である。
一態様では、本発明は、本明細書中で以下に記載する特性の１つ又は複数を有する、抗ＰＤ－１抗体、特にモノクローナル抗ＰＤ－１抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗ＰＤ－１抗体を提供する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、２０nM又はそれ以下、例えば、１０nM又はそれ以下、例えば、５nM又はそれ以下の高親和性で精製組換えヒトＰＤ－１に結合する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、５０nM又はそれ以下の親和性で精製組換えカニクイザルＰＤ－１に結合する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１に選択的に結合する。一態様では、本発明の抗体は、マウス、ラット、又はウサギのＰＤ－１に結合しない。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断しない。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を増強する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ＩＦＮγ産生の阻害、ＩＬ－１７Ａ産生の阻害、又はＩＬ－２１産生の阻害により、機能細胞アッセイにおいてＴ細胞活性を減弱させる。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、マウスモデルにおけるヒト細胞蓄積を阻害し、マウスモデルにおけるヒト炎症性サイトカインのレベルを低下させる。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、好ましい薬物動態特性を有する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、好ましい生物物理学的特性、例えば収量、質、安定性、又は溶解度を有する。一態様では、本発明は、本発明の抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、本発明は、以下を含む抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
配列番号４３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号４３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号４７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号５０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号５３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号５６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号５９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号６２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号６５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号６８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号８０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号８３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号８６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号８９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号９０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号９１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号４１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域。
一実施形態では、本発明は、以下を含む抗ＰＤ－１抗体又は抗原結合フラグメントを提供する：
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域。
一実施形態では、本発明は、以下を含む抗ＰＤ－１抗体又は抗原結合フラグメントを提供する：
以下のいずれか１つを含む重鎖可変領域：
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）、
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）、
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）、又は
配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）；
ならびに
以下のいずれかを含む軽鎖可変領域：
配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）、
配列番号１６４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）、
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）、
配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）。
一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲは、ケミカルコンピューティング群（ＣＣＧ）のナンバリングによって定義される。
一実施形態では、本発明は、上に示す抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントはヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、本発明は、上に示す抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１０８及び配列番号９２；それぞれ配列番号１０９及び配列番号９３；それぞれ配列番号１１０及び配列番号９４；それぞれ配列番号１１１及び配列番号９５；それぞれ配列番号１１２及び配列番号９６；それぞれ配列番号１１３及び配列番号９７；それぞれ配列番号１１４及び配列番号９８；それぞれ配列番号１１５及び配列番号９９；それぞれ配列番号１１６及び配列番号１００；それぞれ配列番号１１７及び配列番号１０１；それぞれ配列番号１１８及び配列番号１０２；それぞれ配列番号１１９及び配列番号１０３；それぞれ配列番号１２０及び配列番号１０４；それぞれ配列番号１２１及び配列番号１０５；それぞれ配列番号１２２及び配列番号１０６；それぞれ配列番号１２３及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、又は配列番号１３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２５、配列番号１２７、又は配列番号１２９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３１及び配列番号１２５のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３３及び配列番号１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３５及び配列番号１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３７及び配列番号１２９のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３９及び配列番号１２９のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１３１及び配列番号１２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１３３及び配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１３５及び配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＥからなる群より選択される重鎖定常領域を含む。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ１抗体を提供し、その重鎖定常領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を伴うＩｇＧ４の重鎖定常領域である。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ１抗体を提供し、その重鎖定常領域はＩｇＧ１の重鎖定常領域である。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ１抗体を提供し、その重鎖定常領域は、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を伴うＩｇＧ１の重鎖定常領域である。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、カッパ及びラムダからなる群より選択される軽鎖定常領域を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は、それぞれ配列番号１４３及び配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は、それぞれ配列番号１５３及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は、それぞれ配列番号１５５及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１４３のアミノ酸からなり、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１４１のアミノ酸からなる。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１４７のアミノ酸からなり、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１４５のアミノ酸からなる。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１４９のアミノ酸からなり、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１４５のアミノ酸からなる。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１５３のアミノ酸からなり、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１５１のアミノ酸からなる。
一実施形態では、本発明は抗ＰＤ１抗体を提供し、この抗体は重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１５５のアミノ酸からなり、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１５１のアミノ酸からなる。
一実施形態では、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、アゴニスト抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、上に記載する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、２０nM又はそれ以下、例えば、１０nM又はそれ以下、例えば、５nM又はそれ以下の高親和性でヒトＰＤ－１に結合する。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントと、ＰＤ－１への結合について競合する抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、又は抗体Ｅと、ＰＤ－１への結合について競合する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、医薬品としての使用のための、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、本発明は、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＰＤ－１経路障害を処置する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１経路障害を処置する際での使用のための、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１経路障害を処置するための医薬品の製造における、上に記載する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントを、ヒト患者においてＰＤ－１経路を活性化するのに十分な量で含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節する際での使用のための抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節するための医薬品の製造における、抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントを、ヒト患者において免疫応答を下方調節するのに十分な量で含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱させる方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱させる際での使用のための抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱させるための医薬品の製造における、抗ＰＤ－１抗体又は上に記載する抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、上記の方法において、上記の使用のための抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、あるいは上記の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用において、この疾患は、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び炎症性腸疾患からなる群より選択される。
一実施形態では、上記の方法において、上記の使用のための抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、あるいは上記の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用において、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、非経口経路、静脈内経路、又は皮下経路の投与により投与される。
一実施形態では、本発明は、上に記載する重鎖可変領域アミノ及び／又は軽鎖可変領域をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、上に記載する重鎖及び／又は軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、上に記載するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
一実施形態では、本発明は、上に記載する発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
一実施形態では、本発明は、以下の工程を含む、抗体を製造する方法を提供する：
－ 上に記載する重鎖可変領域をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上に記載する軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体の形成を可能にする条件下で培養すること、ならびに
－ 当該抗体を回収すること。
一実施形態では、本発明は、以下の工程を含む、抗体を製造する方法を提供する：
－ 上に記載する重鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上に記載する軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体の形成を可能にする条件下で培養すること、ならびに
－ 当該抗体を回収すること。
一実施形態では、上記の方法は、抗体を精製する工程をさらに含む。一実施形態では、上記の方法は、抗体を医薬組成物中に製剤化する工程をさらに含む。
一実施形態では、本発明は、第１の抗ＰＤ－１アゴニスト抗原結合部位及び第２の抗原結合部位を含む多重特異性抗体を提供する。
一実施形態では、第２の抗原結合部位は、抗ＣＤ４８結合部位、抗ＣＤ－２結合部位、抗ＣＤ１１ａ結合部位、又は抗ＣＤ３結合部位である。
一実施形態では、第１の抗ＰＤ－１アゴニスト抗原結合部位は、上に記載する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、多重特異性抗体は二重特異性抗体である。
図１：フローサイトメトリーにより評価された細胞ベースのアッセイにおけるヒトＰＤ－１タンパク質に対する抗ＰＤ－１抗体の選択性。ＭＦＩは「平均蛍光強度」を表す。 図２：ヒトＰＤ－Ｌ１－ＦｃへのヒトＰＤ－１－Ｆｃ結合の競合結合アッセイ。ＧＬＭ チップ表面上に結合されたＰＤ－Ｌ１－Ｆｃアミンに対する２５nM ＰＤ－１－Ｆｃの結合曲線を描写するセンサーグラム（図２Ａ）。ＧＬＭチップ表面に結合されたＰＤ－Ｌ１－Ｆｃアミンに結合する２５nM ＰＤ－１－Ｆｃと事前に混合された抗体Ｃ、ＭＫ－３４７５、及びＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐ（５００nM）のセンサーグラム（図２Ｂ）。 図３：抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の存在におけるＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の増強した結合。ＰＤ－１ビオチン：ＰＤ－Ｌ１相互作用アッセイ（図３Ａ）。ＣＨＯ ＰＤ－１- ＰＤ－Ｌ１Ｄｅｌｐｈｉａ－Ｅｕ ＴＲＦアッセイ（図３Ｂ及び３Ｄ）。ＣＨＯ ＰＤ－１：ビオチンＰＤ－Ｌ１結合アッセイ（図３Ｃ）。図３Ｄでは、個々のデータポイントは、抗体Ｃについてだけ描写されている；他の抗体についての個々のデータポイントは、それらの互いの近接のため、図３Ｄ中には描写されていない。ＰＯＣは「制御のパーセンテージ」を表す。 図４：親７２３Ｃ２アゴニスト抗体（図４Ａ）又は親アゴニスト抗体８２０Ｃ３（図４Ｂ）から由来する抗ＰＤ－１アゴニスト抗体又はＦ（ａｂ’）２フラグメントの存在におけるＴ細胞機能活性。ＰＯＣは「制御のパーセンテージ」を表す。 図５：架橋時のＣＤ４８に対するＭＡｂによるＰＤ－１活性化の誘導。 図６：CellTrace－Violetでのヒト汎Ｔ細胞の標識、ＣＤ３ ＭＡｂでの活性化、及びCellTraceの希釈による細胞増殖の分析。 図７：二重特異性コンストラクト（図７Ａ）。ＰＤ－１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーにより実証されるＰＤ－１又はＣＤ４８への各々のアームの結合（図７Ｂ）。プレートに結合したＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂ又はコントロール抗体の存在における、プレートに結合した抗ＣＤ３ｅでのヒト記憶ＣＤ４＋ Ｔ（ＰＤ１＋）細胞の刺激（図７Ｃ）。ＭＦＩは「平均蛍光強度」を表す。
発明の詳細な説明。
本発明は、免疫障害及び炎症性障害、特にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２系により制御される免疫障害及び炎症性障害のための処置についての必要性に対処する。この必要性に対処するために、本発明は抗ＰＤ－１抗体を提供し、これはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を遮断しない。一態様において、本発明は抗体を提供し、それはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を増強する。本発明の一態様では、本発明の抗体は、ＰＤ－１シグナル伝達経路を活性化する。一態様では、本発明の抗体は抗ＰＤ－１アゴニスト抗体である。ＰＤ－１アゴニズムによって、ＰＤ－１が発現されているが、しかし、そのリガンドにより関与しないであろう、又は、場合により、関与しうるヒト疾患において自己反応性Ｔ細胞の増殖及びエフェクター機能を阻害することにより、免疫バランスが回復される。一態様では、本発明の抗体は、免疫障害及び炎症性障害ならびに移植片拒絶を処置する際に有用である。例えば、本発明の抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を調節することにより、特にＰＤ－１経路を活性化することにより軽減することができる疾患又は障害の処置及び／又は予防のために有用である。一態様では、本発明の抗体は、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は炎症性腸疾患を処置及び／又は予防する際に有用である。
一態様では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体、特にモノクローナル抗ＰＤ－１抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗ＰＤ－１抗体を提供し、本明細書中で下に記載する特性の１つ又は複数を有する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、２０nM又はそれ以下、例えば、１０nM又はそれ以下、例えば、５nM又はそれ以下の高親和性で精製組換えヒトＰＤ－１に結合する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、５０nM又はそれ以下の親和性で精製組換えカニクイザルＰＤ－１に結合する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１に選択的に結合する。一態様では、本発明の抗体は、マウス、ラット、又はウサギのＰＤ－１に結合しない。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断しない。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を増強する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ＩＦＮγ産生の阻害、ＩＬ－１７Ａ産生の阻害、又はＩＬ－２１産生の阻害により、本明細書中で下に示すように、いくつかの機能的細胞アッセイにおいてＴ細胞活性を減弱させる。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、マウスモデルにおけるヒト細胞蓄積を阻害し、マウスモデルにおけるヒト炎症性サイトカインのレベルを低下させる。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、好ましい薬物動態特性を有する。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、好ましい生物物理学的特性、例えば、収量、質、安定性、又は溶解度を有する。これらの特性は、例えば、本明細書中の下の実施例において示されている。
抗体又は免疫グロブリンの一般化された構造は、当業者に周知であり、これらの分子は、典型的には約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される。各々の軽鎖は、１つのジスルフィド結合により重鎖に共有結合的に連結されてヘテロ二量体を形成し、ヘテロ三量体分子は、ヘテロ二量体の２つの同一の重鎖間での共有結合的なジスルフィド連結を通じて形成される。軽鎖及び重鎖は、１つのジスルフィド結合により一緒に連結されているが、２つの重鎖間でのジスルフィド連結の数は、免疫グロブリンのアイソタイプにより変動する。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＨ＝可変重鎖）を有し、その後に３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）、ならびにＣＨ１とＣＨ２の間でのヒンジ領域が続く。各々の軽鎖は、２つのドメイン、アミノ末端可変ドメイン（ＶＬ＝可変軽鎖）及びカルボキシ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬドメインは、ＶＨドメインと非共有結合的に会合するのに対して、ＣＬドメインは一般に、ジスルフィド結合を介して ＣＨ１ドメインに共有結合的に連結される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663、Vargas-Madrazo E, Paz-Garcia E. J Mol. Recognit.2003;16(3):113-120）。可変ドメインは可変領域として、及び定常ドメインは定常領域として本明細書中で言及されることもある。
可変ドメイン内の特定のドメインは、異なる抗体間で広範に異なり、即ち、「超可変」である。これらの超可変ドメインは、その特定の抗原決定基についての各々の特定の抗体の結合及び特異性において直接含まれる残基を含む。軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として公知である３つのセグメント中に集中している。ＣＤＲは、Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.における配列比較により定義されるのに対し、HVLは、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917により記載されるように、可変ドメインの三次元構造に従って構造的に定義される。これらの２つの方法によって、ＣＤＲのわずかに異なる同定がもたらされる場合、構造的な定義が好まれる。Ｋａｂａｔにより定義されるように、ＣＤＲ－Ｌ１は軽鎖可変ドメイン中の約２４～３４残基に、ＣＤＲ－Ｌ２は約５０～５６残基に、及びＣＤＲ－Ｌ３は約８９～９７残基に位置付けられる；ＣＤＲ－Ｈ１は重鎖可変ドメイン中の約３１～３５残基に、ＣＤＲ－Ｈ２は約５０～６５残基に、及びＣＤＲ－Ｈ３は約９５～１０２残基に位置付けられる。ＣＤＲの代わりの定義は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＣＣＧ）ナンバリングによる（Almagro et al., Proteins 2011;79:3050-3066及びMaier et al, Proteins 2014;82:1599-1610）。重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３によって、従って、所与の抗体について特異的な固有の機能的特性が定義される。
重鎖及び軽鎖の各々の内の３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）により分離されており、それらは、あまり可変性のない傾向にある配列を含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ及びＣＤＲは、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。ＦＲの大部分のβシート構成によって、鎖の各々の内のＣＤＲが互いに、ならびに他の鎖のＣＤＲに近接する。結果として得られた立体構造は、抗原結合部位に寄与する（Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, page 647-669を参照のこと）が、全てのＣＤＲ残基が、必ずしも、抗原結合において直接的に含まれるわけではない。
ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは、一般的に、抗原結合において直接的に含まれないが、しかし、抗原結合に寄与し、及び／又は抗体エフェクター機能を媒介する。一部のＦＲ残基は、少なくとも３つの方法において抗原結合に対して有意な効果を有すると考えられる：エピトープに直接的に非共有結合することによる、１つ又は複数のＣＤＲ残基と相互作用することによる、及び重鎖と軽鎖の間の界面に影響を及ぼすことによる。定常ドメインは、抗原結合において直接的に含まれないが、しかし、種々のＩｇエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）における抗体の関与などを媒介する。
脊椎動物免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なるクラス、カッパ（λ）及びラムダ（λ）の１つに割り当てられる。比較により、哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って、５つの主要なクラスの１つに割り当てられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。ＩｇＧ及びＩｇＡは、それぞれ、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、及びμと呼ばれる。天然免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。
用語「抗体」、「抗ＰＤ－１抗体」、「ヒト化抗ＰＤ－１抗体」、及び「変異体ヒト化抗ＰＤ－１抗体」は、本明細書中で最も広い意味において使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、軽微な改変、例えばＮ末端又はＣ末端切断などを伴う抗体、ならびに抗体フラグメント、例えば可変ドメイン及び所望の生物学的活性、例えば、ＰＤ－１結合を示す抗体の他の部分などを包含する。
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団の抗体を指す；すなわち、その集団中の個々の抗体は、自然に生じる変異、又は可能な周知の変化、例えば抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去あるいは翻訳後修飾、例えばアミノ酸異性化もしくは脱アミド化、メチオニン酸化、又は少量で存在しうるアスパラギンもしくはグルタミンの脱アミド化などを除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原決定基「エピトープ」に対して向けられる。従って、修飾語「モノクローナル」は、同一のエピトープに向けられた抗体の実質的に均一な集団を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要求するとして解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の技術又は方法論により作製することができることを理解すべきであり；例えば、ハイブリドーマ方法（Kohler et al., 1975, Nature256:495）、又は当技術分野において公知の組換えＤＮＡ方法（例、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、又はファージ抗体ライブラリーを使用して組換え産生されたモノクローナルの単離の方法、又はClackson et al., 1991, Nature 352: 624-628、及びMarks et al., 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597において記載されている技術を使用することを含む。
キメラ抗体は、１つの種（例、非ヒト哺乳動物、例えばマウスなど）からの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ならびに別の種（例、ヒト）の抗体の重鎖及び軽鎖定常領域からなり、第１の種（例、マウス）からの抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、第２の（例、ヒト）種からの抗体の定常領域についてのＤＮＡ配列に連結し、宿主を、キメラ抗体を産生することを可能にする連結配列を含む発現ベクターで形質転換することにより得ることができる。あるいは、キメラ抗体はまた、重鎖及び／又は軽鎖の１つ又は複数の領域又はドメインが、別の免疫グロブリンクラスもしくはアイソタイプからの、又はコンセンサス配列もしくは生殖系列配列からの、モノクローナル抗体における対応する配列と同一である、相同である、又はそのバリアントであるキメラ抗体でありうる。キメラ抗体は、抗体フラグメントがその親抗体の所望の生物学的活性、例えば、同じエピトープへの結合を示すという条件で、そのような抗体のフラグメントを含むことができる（例、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855を参照のこと）。
用語「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」、「抗ＰＤ－１抗体フラグメント」、「ヒト化抗ＰＤ－１抗体フラグメント」、「バリアントヒト化抗ＰＤ－１抗体フラグメント」は、可変領域又は機能的能力、例えば、特異的なＰＤ－１エピトープ結合が保持されている全長抗ＰＤ－１抗体の一部を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体、ミニボディ、抗体フラグメントから形成されたダイアボディ、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定しない。
抗体フラグメントは、例えば、酵素、例えばパパイン又はペプシンなどで処理された全長抗体を処理して、有用な抗体フラグメントを生成することにより得ることができる。パパイン消化を使用し、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合抗体フラグメントを産生し、各々が単一の抗原結合部位、及び残存「Ｆｃ」フラグメントを伴う。Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
本発明による抗体フラグメントの別の例は、Ｆａｂ’フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのＣ末端での抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む、追加の残基の存在によりＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、ヒンジ領域中のシステイン残基により連結されたＦａｂ’ フラグメントの対である。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
「Ｆｖ」フラグメントは、密接な非共有結合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる完全な抗原認識及び結合部位を含む。この構成において、各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を定める。集合的に、６つのＣＤＲによって、抗体への抗原結合特異性が付与される。
抗体フラグメントはまた、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」フラグメントを含みうる。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む単鎖Ｆｖバリアントであり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在している。単鎖Ｆｖは、抗原を認識して結合することが可能である。ｓｃＦｖポリペプチドはまた、場合により、ｓｃＦｖによる抗原結合のための所望の三次元構造の形成を促進するために、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に配置されるポリペプチドリンカーを含みうる（例、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315を参照のこと）。
抗体フラグメントはまた、タンデムＦｄセグメントを形成しうるが、それは、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む。これらの「線状抗体」は、例えば、Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062において記載されるように、二重特異性又は単一特異性でありうる。
一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗体又は抗体フラグメントである。ヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントは、特定の型のキメラ抗体であり、それは、免疫グロブリンアミノ酸配列バリアント、又はそのフラグメントを含み、所定の抗原に結合することが可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ又は複数のＦＲ、及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ又は複数のＣＤＲを含む。しばしば「移入」配列として言及されるこの非ヒトアミノ酸配列は、典型的には、「移入」抗体ドメイン、特に可変ドメインから取られる。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト重鎖又は軽鎖可変ドメインのＦＲ間に挿入された、非ヒト抗体の少なくともＣＤＲ又はＨＶＬを含む。抗体のヒト化の方法は、例えば、Almagro et al.,(2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633により、又はＷＯ１２０９２３７４ Ａ２において記載されている。
本発明は、ヒト生殖系列配列の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＦＲ間に挿入されたマウスリード７２３Ｃ２から由来するＣＤＲを含む特異的なヒト化抗ＰＤ－１抗体を記載する。加えて、マウスリード７２３Ｃ２の重鎖 ＣＤＲ３中のシステインは、マウスリード７２３Ｃ２から由来するヒト化抗ＰＤ－１抗体中のチロシンで置換された（「ＤＣ」から「ＤＹ」へ）。
一態様では、ヒト化抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、及びＦｖフラグメント中に含まれる）の実質的に全てを含み、それらにおいて、全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、具体的には本明細書中では、ＣＤＲはマウスリード７２３Ｃ２のマウス配列であり、ＦＲはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列又は生殖系列配列のＦＲである。別の態様では、ヒト化抗ＰＤ－１抗体はまた、免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む。通常、抗体は軽鎖ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含む。抗体はまた、適する場合、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及び／又はＣＨ４領域の１つ又は複数を含んでもよい。
本発明によるヒト化抗ＰＤ－１抗体は、免疫グロブリンの任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む）ならびに任意のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を含む）より選択することができる。例えば、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが望まれる場合、補体固定定常ドメインであることができ、アイソタイプは典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインは別のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２であってもよい。代替のヒト化抗ＰＤ－１抗体は、１を上回る免疫グロブリンクラス又はアイソタイプからの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野の技能の範囲内である。
一態様では、本発明の抗体の定常ドメインはＩｇＧ４Ｐｒｏであり、それはＦａｂアーム交換を防止する１つの置換変異（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を有する。このＳｅｒからＰｒｏへの変異は、ＩｇＧ４骨格のヒンジ領域中にあり、一般にＳｅｒ２２８Ｐｒｏとして公知であるが、重鎖中でのその位置は、例えば、可変領域の長さ及び／又はＩｇＧ１とＩｇＧ４の間のヒンジの長さの違いに依存して、数個のアミノ酸だけ変動しうる。ヒンジ領域中でのＳｅｒからＰｒｏへの変異（Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）は、重鎖中でのその位置に非依存的に、本明細書中で「Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ」として言及される。別の態様では、本発明の抗体の定常ドメインはＩｇＧ１ＫＯであり、それは、エフェクター機能（ＡＤＣＣ）を低下させるために、ヒンジ領域中に２つの変異Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａを有する。
ヒト化抗ＰＤ－１抗体のＦＲ及びＣＤＲ、又はＨＶＬは、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、移入ＣＤＲ、又はＨＶＬ、又はコンセンサス配列もしくは生殖系列ＦＲ配列中の１つ又は複数の残基は、置換、挿入、又は欠失により改変（例、変異誘発）されうるが、結果として得られるアミノ酸残基は、いずれかの親配列における対応する位置における元のアミノ酸残基ともはや同一ではないが、しかし、抗体は、それにもかかわらず、ＰＤ－１に結合する機能を保持するようにする。そのような改変は、典型的には、広範囲ではなく、保守的な改変である。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５%は、親コンセンサス配列又は生殖細胞系ＦＲ配列及び移入ＣＤＲ配列の残基に対応しており、よりしばしば少なくとも９０%、最も頻繁には９５%を上回り、又は９８%を上回り、又は９９%を上回る。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間での界面（「ＶＬ－ＶＨ界面」）に影響を及ぼす免疫グロブリン残基は、互いに対する２本の鎖の近接性又は配向に影響を及ぼすものである。鎖間相互作用において含まれうる特定の残基は、ＶＬ残基３４、３６、３８、４４、４６、８７、８９、９１、９６、及び９８ならびにＶＨ残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００、及び１０３を含む（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)）に示されているナンバリングシステムを利用）。米国特許第６，４０７，２１３号でも、残基、例えばＶＬ残基４３及び８５、ならびにＶＨ残基４３及び６０などがまた、この相互作用において含まれうることが考察されている。これらの残基は、ヒトＩｇＧだけについて示されている一方で、それらは種にわたり適用可能である。鎖間相互作用において含まれると合理的に予想される重要な抗体残基が、コンセンサス配列への置換のために選択される。
用語「コンセンサス配列」及び「コンセンサス抗体」は、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造、例えば、ヒト免疫グロブリン可変ドメインの全ての免疫グロブリン中の各々の位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、特定の種の又は多くの種の免疫グロブリンに基づきうる。「コンセンサス」配列、構造、又は抗体は、特定の実施形態において記載するコンセンサスヒト配列を包含し、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造の全てのヒト免疫グロブリン中の各々の位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指すと理解される。このように、コンセンサス配列は、１つ又は複数の公知の免疫グロブリン中に存在するアミノ酸を各々の位置に有するアミノ酸配列を含むが、しかし、それは、任意の単一の免疫グロブリンの全アミノ酸配列を正確に複製しないことがある。可変領域コンセンサス配列は、任意の天然に産生された抗体又は免疫グロブリンからは得らない。Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.（国立衛生研究所公衆衛生局、メリーランド州ベセスダ）、及びそのバリアント。重鎖及び軽鎖コンセンサス配列のＦＲ、ならびにそれらのバリアントは、ヒト化抗ＰＤ－１抗体の調製のために有用な配列を提供する。例えば、米国特許第６，０３７，４５４号及び第６，０５４，２９７号を参照のこと。
ヒト生殖系列配列は、ヒト集団において自然に見出される。それらの生殖細胞系遺伝子の組み合わせによって、抗体多様性が生成される。抗体の軽鎖についての生殖系列抗体配列は、保存されたヒト生殖系列カッパ又はラムダｖ遺伝子及びｊ遺伝子から由来する。同様に、重鎖配列は、生殖系列のｖ、ｄ、及びｊ遺伝子から由来する（LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press,2001）。
「単離」抗体は、同定され、その自然環境の成分から同定及び／又は分離されたものである。抗体の自然環境の混入成分は、抗体の診断的又は治療的な使用に干渉しうる物質であり、酵素、ホルモン、又は他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質でありうる。一態様では、抗体は、抗体の少なくとも９５重量%を上回るまで単離まで精製され、例えば、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%を上回るまで精製される。
単離抗体は、それが産生される組換え細胞内にin situで抗体を含む。なぜなら、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。通常、しかし、単離抗体は、組換え細胞材料が除去される少なくとも１つの精製工程により調製される。
本発明に従って使用される用語「抗体性能」は、抗原の抗体認識又はインビボでの抗体の有効性に寄与する要因／特性を指す。抗体のアミノ酸配列における変化は、抗体特性、例えば折り畳みなどに影響を及ぼしうる、ならびに、物理的要因、例えば抗原への抗体結合の初速度（ｋａ）、抗原からの抗体の解離定数（ｋｄ）、抗原についての抗体の親和性定数（Ｋｄ）、抗体の立体構造、タンパク質の安定性、及び抗体の半減期などに影響しうる。
本発明に従って使用される用語「アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）抗体」又は「アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）抗体」は、ＰＤ－１への結合時に、ＰＤ－１リガンドＰＤ－Ｌ１により誘導される少なくとも１つの生物学的活性を誘導する抗体を指す。一態様では、誘導は、アゴニスト抗体の非存在における誘導と比較した場合、統計的に有意である。一態様では、抗体は、少なくとも１つの生物学的活性が、例えば、本明細書中で下に記載する実施例の１つにおけるように測定された場合、アゴニスト抗体の非存在におけるよりも少なくとも約２０%、３０%、４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、又は１００%大きく誘導される場合、アゴニスト抗体である。一部の実施形態では、「アゴニスト抗体」は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を増強する。ＰＤ－１アゴニスト特性を検出するための例示的なアッセイが、本明細書中に記載されている、又は当技術分野において公知である。
「多重特異性」は、２つ又はそれ以上の別個の抗原あるいは同じ抗原内の２つ又はそれ以上の別個のエピトープに特異的に結合するタンパク質、例えば抗体などを指す。
「二重特異性」は、２つの別個の抗原又は同じ抗原内の２つの別個のエピトープに特異的に結合するタンパク質、例えば抗体などを指す。
一部の実施形態では、本発明のＰＤ－１又はその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、多重特異性抗体である。本明細書中で提供するＰＤ－１に特異的に結合する単一特異性抗体は、二重特異性抗体に操作してもよく、それはまた、本発明の範囲内に包含される。
全長二重特異性抗体は、例えば、無細胞環境中でのインビトロで又は同時発現を使用して、のいずれかで別個の特異性を有する２つの抗体の半分子のヘテロ二量体形成を支持する、各々の半分の分子中の重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより、２つの単一特異性二価抗体間のＦａｂアーム交換（例、半分子交換、１つの重鎖－軽鎖対の交換）を使用して生成してもよい。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合の結果である。
二重特異性抗体はまた、デザイン、例えばTriomab/Quadroma（Trion Pharma/Fresenius Biotech）、Knob-in-Hole（Genentech）、CrossMAbs（Roche）及び静電誘導ＣＨ３相互作用（Chugai、Amgen、NovoNordisk、Oncomed）、LUZ-Y（Genentech）、Strand Exchange Engineered Domain body（SEEDbody）（EMD Serono）、Biclonic（Merus）、及びDuoBody（登録商標）Products（Genmab A/S）などを使用して生成してもよい。
例えば、二重特異性ＰＤ－１／ＣＤ２、二重特異性ＰＤ－１／ＣＤ４８、二重特異性ＰＤ－１／ＣＤ１１ａ又はＰＤ－１／ＣＤ３抗体は、本明細書中に記載するＰＤ－１抗体のＶＨ／ＶＬドメイン、又は公開された抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の任意のＶＨ／ＶＬ領域及び公開された抗ＣＤ２、抗ＣＤ４８、抗ＣＤ１１ａ、又は抗ＣＤ３抗体の任意のＶＨ／ＶＬ領域をそれぞれ使用して生成することができる。
本発明の別の実施形態は、ＰＤ－１に結合する第１のドメイン及びＣＤ２、ＣＤ４８、ＣＤ１１ａ、又はＣＤ３に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体である。
本明細書中で使用するように、用語「同一の」又は「パーセント同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列の状況において、最大の一致のために比較及び整列された場合に、同じである、あるいは、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較のために整列させる（例、ギャップを、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列中に導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを次に比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、次に分子はその位置で同一である。２つの配列間での同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（即ち、同一性%＝同一位置の数／位置の総数（例、重複位置）×１００）。一部の実施形態では、比較される２つの配列は、適した場合、配列内にギャップが導入された後に同じ長さである（例、比較される配列を超えて延びる追加の配列を除く）。例えば、可変領域配列を比較する場合、リーダー及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間での配列比較については、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列中の同じ位置におけるＣＤＲを指す（例、各々の配列のＣＤＲ－Ｈ１）。
２つの配列間のパーセント同一性又はパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において改変されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み入れられる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施し、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402において記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)である。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメント ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。配列分析のための追加のアルゴリズムが当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5において記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8において記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている２つの配列中の類似領域は、整列された残基の対を見ることにより見出される；ｋｔｕｐ＝１の場合、整列されたアミノ酸が検証される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２又は１、ＤＮＡ配列については１から６に設定することができる。ｋｔｕｐが特定されていない場合のデフォルトは、タンパク質については２及びＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol.266:383-402により記載されるように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行われ得る。
核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、核酸プレ配列又は分泌リーダーは、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結される；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み枠中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、場合により、近接している。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成することができる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド アダプター又はリンカーを使用することができる。
本明細書中で使用するように、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は互換的に使用され、全てのそのような呼称はその後代を含む。このように、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、移入の数に関係なく、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含み、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１つ又は複数のアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の発現ベクターでトランスフェクトされていてもよい。
本発明による処置の目的のための用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指しヒト、家畜及び農場動物、及び動物園、スポーツ、又はペットの動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「障害」は、本明細書中で使用するように、本明細書中に記載する抗ＰＤ－１抗体、特に本明細書中に記載するヒト化抗ＰＤ－１抗体での処置から利益を得うる任意の状態である。これは、慢性及び急性の障害又は疾患（哺乳動物を問題の障害に罹りやすくする病理学的状態を含む）を含む。
本明細書中で使用するように、用語「ＰＤ－１経路障害」又は「ＰＤ－１経路疾患」は状態を指し、それは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節することにより、特にＰＤ－１経路を活性化することにより軽減することができる。「ＰＤ－１経路障害」又は「ＰＤ－１経路疾患」は、ＰＤ－１が発現されるＴ細胞関連疾患を含む。「ＰＤ－１経路障害」又は「ＰＤ－１経路疾患」はまた、ＰＤ－１を発現し、慢性炎症及び自己免疫疾患のドライバーであり、ＰＤ－１を発現するＴ細胞活性の減弱及び／又は免疫応答の下方調節が望まれる、活性化された自己反応性Ｔ細胞により特徴付けられる状態を含む。ＰＤ－１経路障害の例は、疾患又は障害、例えば全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び炎症性腸疾患などを含む。
用語「特異的に結合する」などは、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定するための方法は、本明細書中に記載されている、又は当技術分野において公知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。一実施形態では、特異的結合は、本明細書中の実施例のセクションにおいて記載される親和性結合方法に従った、約１×１０－７M（１００nM）又はそれ以下のＫＤにより特徴付けられる。別の実施形態では、特異的結合は、本明細書中の実施例セクションにおいて記載される親和性結合方法に従って、約５×１０－８M（５０nM）又はそれ以下のＫＤにより特徴付けられる。別の実施形態では、特異的結合は、本明細書中の実施例セクションにおいて記載される親和性結合方法に従って、約１×１０－８M（１０nM）又はそれ以下のＫＤにより特徴付けられる。別の実施形態では、特異的結合は、本明細書中の実施例セクションにおいて記載される親和性結合方法に従って、約５×１０－９M（５nM）又はそれ以下のＫＤにより特徴付けられる。ヒトＰＤ－１に特異的に結合する、単離抗体は、他の抗原、例えば他の種からのＰＤ－１分子などに対して交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
用語「皮下投与」は、薬物容器からの比較的遅い持続的な送達による、動物又はヒト患者の皮膚下、好ましくは、皮膚とその下の組織の間のポケット内への薬物、例えば、本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの導入を指す。皮膚をつまむ又は引っ張って下の組織から離すことで、ポケットが作られうる。
用語「皮下注入」は、３０分又はそれ以下、あるいは９０分又はそれ以下を含むが、それらに限定しない期間にわたる薬物容器からの比較的遅い持続的送達による、動物又はヒト患者の皮膚の下、好ましくは、皮膚とその下の組織の間のポケット内への薬物、例えば、本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの導入を指す。場合により、注入は、動物又はヒト患者の皮膚下に移植された薬物送達ポンプの皮下移植により行ってもよく、このポンプによって、所定の時間、例えば３０分、９０分、又は処置レジメンの長さに及ぶ期間など、にわたって所定の量の薬物が送達される。
用語「皮下ボーラス」は、動物又はヒト患者の皮膚の下への薬物投与を指し、ここで、ボーラス薬物送達は約１５分未満；別の態様では５分未満、さらに別の態様では６０秒未満である。さらに別の態様では、投与は、皮膚と下層組織の間のポケット内であり、ここで、このポケットは、皮膚をつまむ又は引っ張って下の組織から離すことにより作ってもよい。例えば、「皮下ボーラス」は、約１５分未満；別の態様では５分未満、さらに別の態様では６０秒未満での、ヒト患者への本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を指す。
用語「治療有効量」は、処置される障害の症状の１つ又は複数を緩和又は寛解する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの量を指すために使用される。そうする際に、それは、有益な患者転帰を有する量である。有効性は、処置される状態に依存して、従来の方法において測定することができる。
用語「処置」及び「治療」などは、本明細書中で使用するように、臨床的に望ましい又は有益な効果（１つ又は複数の症状の軽減又は緩和、疾患又は障害の進行の退行、遅延、又は停止を含むが、それらに限定しない）に導く、疾患又は障害についての治療的な、ならびに予防的な、又は抑制的な手段を含むことを意味する。このように、例えば、用語「処置」は、疾患又は障害の症状の発症前又は後での抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含み、それにより疾患又は障害の１つ又は複数の徴候を予防又は除去することを含む。別の例として、この用語は、疾患の症状と闘うための、疾患の臨床発現の後での抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含む。さらに、発症後及び臨床症状が発生した後での抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与、ここで、投与は、疾患又は障害の臨床パラメータ、例えば組織損傷の程度又は転移の量もしくは範囲などに影響を及ぼし、処置が疾患の寛解に導くか否かに関わらず、本明細書中で使用する「処置」又は「治療」を含む。さらに、本発明の組成物が、単独で、又は別の治療用薬剤との組み合わせにおいて、抗ＰＤ－１抗体組成物又はその抗原結合フラグメントの使用の非存在における症状と比較して、処置される障害の少なくとも１つの症状を軽減又は寛解する限り、結果は、障害の全ての症状が軽減されるか否かに関係なく、基礎障害の有効な処置と考えるべきである。
用語「添付文書」は、治療用産物の商業的なパッケージ中に慣習的に含まれる説明書を指すために使用され、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与、禁忌、及び／又は警告に関する情報を含む。
抗体
本明細書中に記載及び開示するのは、抗ＰＤ－１抗体、特にヒト化抗ＰＤ－１抗体、ならびに本発明の抗ＰＤ－１抗体を含む組成物及び製造品である。また、記載するのは、抗ＰＤ－１抗体の抗原結合フラグメントである。抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合フラグメントは、多様な疾患又は障害、特に、ＰＤ－１を発現し、慢性炎症及び自己免疫疾患のドライバーである、活性化された自己反応性Ｔ細胞により特徴付けられる疾患又は障害の処置において使用することができる。抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合フラグメントは、各々が、少なくとも、ＰＤ－１エピトープを特異的に認識する部分を含む。一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合フラグメントは、アゴニスト抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合フラグメントである。
本発明による抗ＰＤ－１抗体の生成及びそれらの特徴付けが、実施例において記載されている。初期の特徴付けでは、抗ＰＤ－１キメラリード７２３Ｃ２が、例えば、下の実施例において記載されるように、その優れた抗体性能に基づいて選択された。バリアントのライブラリーが、キメラリードのＣＤＲをヒトコンセンサス重鎖及び軽鎖可変ドメインのＦＲ中に配置し、さらに、異なる改変を伴ってＦＲを操作することにより生成された。加えて、マウスリード７２３Ｃ２の重鎖ＣＤＲ３中のシステインを、マウスリード７２３Ｃ２から由来するヒト化抗ＰＤ－１抗体中のチロシンで置換した（「ＤＣ」から「ＤＹ」へ）。「ＤＣ」から「ＤＹ」への変化は、抗体の薬理学的特性に対する影響を有さなかった。ヒト化抗体の産生のための過程が、実施例において記載されている。
代表的なマウスリードの可変領域のアミノ酸配列を表１及び２中に示す。これらのマウスリードのＣＤＲ領域及びリード７２３Ｃ２の操作バリアントのＣＤＲ領域を表３及び４中に示す。
Figure 2023528778000001
Figure 2023528778000002

Figure 2023528778000003
Figure 2023528778000004
種々のマウス抗体のマウス軽鎖及び重鎖ＣＤＲを、それぞれ表３及び表４中に示す。表３及び４はまた、ヒト化過程を通じてマウス抗体７２３Ｃ２から由来する３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを示す。
Figure 2023528778000005
Figure 2023528778000006

Figure 2023528778000007
Figure 2023528778000008

上の表３及び４中に列挙されているＣＤＲは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＣＣＧ）ナンバリングを使用して定義される。
マウス抗体７２３Ｃ２から由来する代表的な数のヒト化軽鎖及び重鎖可変領域を表５及び６中に提供して示す。
Figure 2023528778000009
Figure 2023528778000010
Figure 2023528778000011
マウス抗体７２３Ｃ２から由来するヒト化軽鎖及び重鎖可変領域の選択された組み合わせによって、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びびＥがもたらされた：
抗体Ａ：ＩｇＫ－４６３－６０を伴う７２３Ｃ２－ＩｇＧ４Ｐｒｏ－４６３－６０（重鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＨ－４６３－６０及び軽鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＫ－４６３－６０）；
抗体Ｂ：ＩｇＫ－４６２－０７を伴う７２３Ｃ２－ＩｇＧ４Ｐｒｏ－４６１－４１（重鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＨ－４６１－４１及び軽鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＫ－４６２－０７）；
抗体Ｃ：ＩｇＫ－４６２－０７を伴う７２３Ｃ２－ＩｇＧ４Ｐｒｏ－４６１－４７（重鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＨ－４６１－４７及び軽鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＫ－４６２－０７）；
抗体Ｄ：ＩｇＫ－４６２－０８を伴う７２３Ｃ２－ＩｇＧ４Ｐｒｏ－４６１－４４（重鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＨ－４６１－４４及び軽鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＫ－４６２－０８）；
抗体Ｅ：ＩｇＫ－４６２－０８を伴う７２３Ｃ２－ＩｇＧ４Ｐｒｏ－４６１－４０（重鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＨ－４６１－４０及び軽鎖可変領域７２３Ｃ２ＶＫ－４６２－０８）。
抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、表７中に示される重鎖及び軽鎖配列を有する。
Figure 2023528778000012
Figure 2023528778000013

Figure 2023528778000014

Figure 2023528778000015

Figure 2023528778000016

Figure 2023528778000017

Figure 2023528778000018

Figure 2023528778000019

Figure 2023528778000020
抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの軽鎖及び重鎖可変領域に、表７中で下線を引いている。重鎖定常領域中のヒンジ領域を太字で示しており、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を四角で囲んでいる。
マウスリード７２３Ｃ２がまた、ヒトＩｇＧ１ＷＴ、ＩｇＧ１ＫＯ、及びＩｇＧ４Ｐｒｏフォーマットに変換されている。ＩｇＧ４Ｐｒｏは、ヒンジ領域中に１つの変異Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏを有し、それによってＦａｂアームの交換が防止される。ＩｇＧ１ＫＯは、エフェクター機能（ＡＤＣＣ）を低下させるために、ヒンジ領域中に２つの変異Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａを有する。
ヒトＩｇＧ１ＷＴ、ＩｇＧ１ＫＯ、及びＩｇＧ４Ｐｒｏフォーマット中のキメラ７２３Ｃ２を表８中に示す。
Figure 2023528778000021
Figure 2023528778000022

Figure 2023528778000023

Figure 2023528778000024

Figure 2023528778000025

Ｈ－ＣＤＲ３のＤＣからＤＹへの変化に対応するアミノ酸に、表８中でアミノ酸配列において下線を引いている。
ヒト化及びアミノ酸配列バリアント
さらなるバリアント抗ＰＤ－１抗体及び抗体フラグメントを、表３及び４中に描写されるＣＤＲのセットに基づいて操作することができる。バリアント抗ＰＤ－１抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲのアミノ酸配列は不変のままであるが、しかし、周囲の領域、例えば、ＦＲ領域を操作することができることを理解すべきである。抗ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列バリアントは、適したヌクレオチド変化を抗ＰＤ－１抗体ＤＮＡ中に導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのようなバリアントは、例えば、本明細書中の実施例の抗ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基中への挿入及び／又は残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトが所望の特徴を持つという条件で、最終コンストラクトに到達するために作製される。アミノ酸変化はまた、ヒト化又はバリアント抗ＰＤ－１抗体の翻訳後過程を改変しうる（例えばグリコシル化部位の数又は位置を変化させる、など）。
一部の実施形態では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖を有する抗ＰＤ－１抗体又はその抗体フラグメントを含み、そこで、可変重鎖アミノ酸配列及び可変軽鎖アミノ酸配列は、表１、２、５、及び６中に開示されるアミノ酸配列と少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９２．５%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%同一である。
一部の実施形態では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖を有する抗ＰＤ－１抗体又はその抗体フラグメントを含み、ここで、可変重鎖アミノ酸配列及び可変軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３１、１３３、１３５、１３７、又は１３９、及び配列番号１２５、１２７、又は１２９のアミノ酸配列と少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９２．５%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%同一である。
一部の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖を有する抗ＰＤ－１抗体を含み、ここで、重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列が、表７及び８中に開示されるアミノ酸配列と少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%同一である。
抗体のアミノ酸バリアントの別の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変することを含む。この文脈における用語「改変する」は、抗体において見出される１つ又は複数の糖部分を欠失させること、ならびに／あるいは抗体において以前は存在しなかった１つ又は複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。例えば、抗体は、アスパラギン２９７を置換することにより（例、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素複合体媒介性グリコシル化を抑止するために、ヒトＩｇＧ１重鎖の位置２９７でのアミノ酸置換を含みうる。
一部の態様では、本発明は、本明細書中に記載する抗ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子を含む。抗ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野において公知の多様な方法により調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列バリアントの場合において）又は抗ＰＤ－１抗体の初期に調製されたバリアントもしくは非バリアントバージョンのオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製を含むが、これらに限定しない。例えば、本発明による核酸分子はまた、ストリンジェントな条件下で、本明細書中に開示される核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も包含し、それにより、本発明の範囲内の用語「ストリンジェントな条件」は、例えば、４２℃で５０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１%ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション、又は６５℃で５×ＳＳＣ及び１%ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション（両方とも０．２×ＳＳＣ及び０．１%ＳＤＳで洗浄）を含むことができる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、３７℃で４０%ホルムアミド、１M ＮａＣｌ、及び１% ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、ならびに４５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は抗体フラグメントである。抗体フラグメントの産生のために開発された技術がある。フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して由来しうる（例、Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及びBrennan et al., 1985, Science 229:81を参照のこと）。あるいは、フラグメントは組換え宿主細胞中で直接的に産生することができる。例えば、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接的に回収され、化学的に共役されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（例、Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167を参照のこと）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。
一態様では、抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合フラグメントは、修飾、例えばグリコシル化又は脱アミド化などを含むことができる。
特定の実施形態では、インタクトな抗体ではなく、抗ＰＤ－１抗体フラグメントを使用することが望ましいであろう。その血清半減期を増加させるために、抗体フラグメントを修飾することが望ましいであろう。これは、例えば、抗体フラグメント中へのサルベージ受容体結合エピトープの組み入れにより達成することができる。１つの方法では、抗体フラグメントの適した領域を改変（例、変異）させることができる、又はエピトープをペプチドタグ中に組み入れることができ、それを次に、例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成により、抗体フラグメントに、いずれかの末端で又は中央において融合させる。例えば、ＷＯ９６／３２４７８を参照のこと。例えば、本発明の抗体フラグメントを、全長ＩｇＧ１スキャフォールドの使用が望ましくない場合には、ヒト血清アルブミンに融合させて血清半減期を増加させてもよい。抗体フラグメントとヒト血清アルブミンとのそのような融合タンパク質は、２つの異なる抗体フラグメントを融合させて結合力を増加させる、又は延長された血清半減期を伴う二重特異性結合タンパク質を生成する必要がある状況において有利でありうる（例、ＷＯ０５０７７０４２ Ａ２を参照のこと）。
他の実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体の共有結合的な修飾を含む。共有結合的な修飾は、システイニル残基、ヒスチジル残基、リシニル残基及びアミノ末端残基、アルギニル残基、チロシル残基、カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基、あるいはセリル残基、又はスレオニル残基の修飾を含む。別の型の共有結合的な修飾は、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的に共役することを含む。そのような修飾は、適用可能な場合、化学合成により、又は抗体の酵素的もしくは化学的な切断により作製することができる。抗体の共有結合的な修飾の他の型を、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又はアミノもしくはカルボキシ末端残基と反応させることが可能である有機誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入することができる。
抗体上に存在する任意の糖部分の除去は、化学的又は酵素的に達成することができる。化学的な脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52により、及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131により記載されている。抗体上の糖部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350により記載されているように、多様なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
有用な共有結合的な修飾の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、及び米国特許第４，１７９，３３７号の１つ又は複数において示されている様式において、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つに連結することを含む。
エピトープ結合
別の態様では、本発明は、特異的な「ＰＤ－１抗原エピトープ」及び「ＰＤ－１エピトープ」を認識する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
本明細書中で使用するように、用語「ＰＤ－１抗原エピトープ」及び「ＰＤ－１エピトープ」は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントに結合することが可能な分子（例、ペプチド）又は分子のフラグメントを指す。これらの用語は、例えば、本発明の抗体又は抗体フラグメントのいずれかにより認識されるＰＤ－１抗原決定基をさらに含む。
ＰＤ－１抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドなどにおいて含まれることができる。エピトープは、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣体（即ち、ＰＤ－１抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、又はそれらの組み合わせである。
一態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体媒介性アゴニズムをもたらす生理学的リガンドの結合を模倣する様式においてＰＤ－１エピトープに特異的に結合する。
本発明はまた、ＰＤ－１への結合について、本発明による抗ＰＤ－１抗体と競合する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１への結合について、本明細書中に記載する抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、又は抗体Ｅのいずれか１つと競合する抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。競合アッセイは、例えば、バイオセンサーを使用したPLoS One.2014;9(3): e92451、もしくはPLoS One2020 Mar 5;15(3):e0229206において記載されるように、又は本明細書中で開示する方法により行ってもよい。
治療的な使用
一実施形態では、本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＰＤ－１経路障害を処置又は予防するために有用である。
別の実施形態では、本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、医薬品として有用である。
したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１経路を活性化するのに十分な量の本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節する際での使用のための、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用を調節するための医薬品の製造における、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒト患者において免疫応答を下方調節するのに十分な量の本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱させる方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱する際での使用のための、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者においてＰＤ－１発現Ｔ細胞活性を減弱するための医薬品の製造における、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、ＰＤ－１経路の疾患又は障害は、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は炎症性腸疾患である。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者において全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は炎症性腸疾患を処置又は予防する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者において全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は炎症性腸疾患を処置又は予防する際での使用のための、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者において全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は炎症性腸疾患を処置又は予防するための医薬品の製造における、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一実施形態では、ＰＤ－１経路の疾患又は障害は慢性又は急性であり、例えば慢性炎症性疾患又は急性炎症性疾患などである。一実施形態では、ＰＤ－１経路の疾患又は障害は、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデスなど）、ギラン・バー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、バセドウ病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心臓疾患（虚血性疾患、例えば心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化などを含む）、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎及び低酸症、胎児母体耐性の欠如に関連する不妊症、シェーグレン症候群、白斑、重症筋無力症、又は全身性硬化症である。
したがって、一実施形態では、本発明は、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者において上の疾患又は障害の１つを処置又は予防する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者において上の疾患又は障害の１つを処置又は予防する際での使用のための、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト患者において上の疾患又は障害の１つを処置又は予防するための医薬品の製造における、本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
一態様では、上に記載する使用のための、又は使用における、あるいは上に記載する方法におけるＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、アゴニスト抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントである。
非治療的な使用
本明細書中に記載する抗体は、親和性精製剤として有用である。この過程では、抗体を、当技術分野において周知の方法を使用して、固相、例えばプロテインＡ樹脂などに固定化する。固定化された抗体は、精製されるＰＤ－１タンパク質（又はそのフラグメント）を含むサンプルと接触させられ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合しているＰＤ－１タンパク質を除く、サンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を、抗体からＰＤ－１タンパク質を放出する別の適切な溶媒で洗浄する。
本明細書中に開示する本発明の抗ＰＤ－１抗体及びそのフラグメントはまた、ＰＤ－１タンパク質を検出及び／又は定量化するための診断アッセイにおいて、例えば、特定の細胞、組織、組織、又は血清中のＰＤ－１発現を検出する際に有用である。
一部の実施形態では、例えば、診断目的のために、抗体を検出可能な検出可能な部分で標識することが有利である。多数の検出可能な標識が利用可能であり、放射性同位体、蛍光標識、酵素基質標識、量子ドットなどを含む。標識は、種々の公知の技術を使用して抗体と間接的にコンジュゲートしてもよい。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートすることができ、上で言及する標識の３つの広いカテゴリーのいずれかをアビジンとコンジュゲートすることができ、又はその逆もできる。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、このように、標識を、この間接的な様式において抗体とコンジュゲートすることができる。あるいは、標識と抗体との間接的なコンジュゲーションを達成するために、抗体を小さなハプテン（例えばジゴキシンなど）とコンジュゲートすることができ、上で言及する異なるタイプの標識の１つを、抗ハプテン抗体（例、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートする‘。このように、標識と抗体との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
例示的な放射性同位体標識は、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉを含む。抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1and2, 1991, Coligen etal., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubsにおいて記載される技術を使用して放射性同位体で標識することができる。放射活性は、例えば、シンチレーション計数により測定することができる。
例示的な蛍光標識は、希土類キレート（ユーロピウムキレート）から由来する標識を含み、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドが利用可能であり、例えば、以下の蛍光標識のいずれかである：ジアルキルアミノクマリン、ローダミンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５）、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン３４３、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、ダンシル、ダポキシル、ジアルキルアミノクマリン、．ＤＭ－ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡ、ヒドロキシクマリン、ＩＲＤｙｅｓ（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、マリーナブルー、メトキシ クマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰｙＭＰＯ、５－カルボキシ－４’，５，－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、５－カルボキシ－２’，４’，５，，７’－テトラクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミン、６－カルボキシローダミン、６－カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６－ＦＡＭ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、ＮＢＤ（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ジシアニン、ラジョラブルー色素、アウオピコシアニン、アロコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリスロシアニン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、又はテキサスレッド。蛍光標識は、公知の技術、例えば、Current Protocols in Immunology（上記）において開示されている技術などを介して抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光を、蛍光光度計を使用して定量化することができる。
当技術分野において公知である、十分に特徴付けられた種々の酵素基質標識がある（総説については、例えば、米国特許第４，２７５，１４９号を参照のこと）。酵素は、一般的に、種々の技術を使用して測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、変化は、分光光度的に測定することができる基質における色の変化でありうる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させうる。蛍光における変化を定量化するための技術が、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、次に、例えば、ケミルミノメーターを使用して測定することができる光を発しうる、又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。
酵素標識の例は、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなど）、ヘテロサイディックオキシダーゼ（ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなど。酵素を抗体にコンジュゲートするための技術は、例えば、O’Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym.(J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y.,73: 147-166において記載されている。
酵素－基質の組み合わせの例としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての水素ペルオキシダーゼ（水素ペルオキシダーゼは、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）などの色素前駆体を酸化する）； アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてパラニトロフェニルリン酸；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ（β－Ｄ－Ｇａｌ）とｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼなどの発色基質又は蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼが含まれる。
多数の他の酵素－基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４，２７５，１４９号及び米国特許第４，３１８，９８０号を参照のこと。
別の実施形態では、本発明の抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントを非標識で使用し、抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントに結合する標識抗体で検出する。例えば、標識抗ヒトＦｃ抗体、又は抗ヒトＦａｂ抗体を使用し、非標識抗ＰＤ－１抗体又はフラグメントを検出してもよい。本発明による非標識抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントの使用は、より良好な組織浸透を達成するために有利でありうる。なぜなら、蛍光標識は、それが融合される抗体又は抗体フラグメントの分子量を増加させ、及び／又は疎水性を増加させて、それにより、組織浸透を低下させるためである。
本明細書中に記載する抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどにおいて用いてもよい。例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc. 1987). Diagnostic Kitsを参照のこと。
本発明のヒト化抗ＰＤ－１抗体は、診断キット、即ち、診断アッセイを実施するための説明書を伴う、所定量の試薬のパッケージ化された組み合わせにおいて使用することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素により要求される基質及び補因子、例えば検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体などを含みうる。また、他の添加剤を含めてもよく、例えば安定剤、緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤又は溶解緩衝剤）などである。種々の試薬の相対量は広く変動し、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供しうる。試薬は、溶解時に適した濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供されてもよい。
診断キット
抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントは、診断キット、即ち、診断アッセイを実施するための説明書を伴う、所定量の試薬のパッケージ化された組み合わせにおいて使用することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素により要求される基質及び補因子、例えば検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体などを含みうる。また、他の添加剤を含めてもよく、例えば安定剤、緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤又は溶解緩衝剤）などである。種々の試薬の相対量は広く変動し、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供しうる。試薬は、溶解時に適した濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供されてもよい。
組成物及びその投与
本発明による抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物は、本明細書中に記載するＰＤ－１経路の疾患又は障害を有する、あるいはそのリスクがある対象に投与することができる。本発明はさらに、ＰＤ－１経路疾患又は障害の予防又は処置のための医薬品の製造における抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本明細書中で使用する用語「対象」は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することができる任意の哺乳動物患者を意味し、例えば、ヒト及び特定の非ヒト哺乳動物、例えば霊長類など、及びイヌなどを含む。本明細書中に記載する方法を用いた処置について特に意図される対象は、ヒトを含む。本発明の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、単独で、又は他の組成物との組み合わせにおいて投与することができる。
一態様では、本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
種々の送達系が公知であり、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを投与するために使用することができる。導入の方法は、硝子体内、点眼、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路を含むが、これらに限定しない。抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば注入、ボーラス、又は注射により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身的又は局所的であることができる。そのような注射用の製剤は、例えば、プレフィルドシリンジ中で調製してもよい。
抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント及び１つ又は複数の医薬的に適合する成分を含む医薬組成物として投与することができる。
典型的な実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの静脈内又は皮下投与のために適合された医薬組成物として、ルーチン的な手順に従って製剤化される。典型的には、注射による投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、医薬品はまた、可溶化剤及び、注射の部位での疼痛を和らげるための局所麻酔薬、例えばリグノカインなどを含むことができる。一般的に、成分は、例えば、活性薬剤の量を示す密閉容器、例えばアンプル又は小袋などの中の乾燥凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として別々に供給される、又は、単位投与形態で一緒に混合される。医薬品が注入により投与される場合、それは、滅菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む注入ボトルを用いて調合することができる。医薬品が注射により投与される場合、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを、成分を投与前に混合できるように提供することができる。
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む容器、及び（ｂ）注射用の医薬的に許容可能な希釈剤（例、滅菌水）を含む医薬的キットとして提供することができる。医薬的に許容可能な希釈剤は、凍結乾燥抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの再構成又は希釈のために使用することができる。場合により、そのような容器に関連するのは、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定された形式の通知でありうるが、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、又は販売の機関による承認を反映する。
ＰＤ－１経路の疾患又は障害の処置又は予防において有効な抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの量は、標準的な臨床技術により決定することができる。また、インビトロアッセイを、場合により、最適な投与量範囲の特定を助けるために用いてもよい。製剤化において用いられる正確な用量はまた、投与の経路、及び障害の段階に依存し、医師の判断及び各々の患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデルテスト系から由来する用量反応曲線から外挿してもよい。
例えば、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物において、ＥＤ５０（集団の５０%において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な医薬的手順により決定することができる。大きな治療指数を示す抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントが好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を製剤化する際に使用することができる。抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与量は、典型的には、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変動しうる。本方法において使用される任意の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントについて、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡなどにより測定することができる。
一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は定期的な間隔で投与される。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、例えば、１mg/mlから２５０mg/ml、例えば、２０mg/mlから２００mg/mlを含む用量に製剤化することができる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、結合剤にコンジュゲートされた又はコンジュゲートされていない治療用薬剤をさらに含むことができる。
そのような併用治療の投与は、疾患パラメータ（例、症状の重症度、症状の数、又は再発の頻度）に対して相加的又は相乗的な効果を有することができる。
コンビナトリアル投与のための治療レジメンに関して、特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療用薬剤と同時に投与される。別の特定の実施形態では、治療用薬剤は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの投与の前に又はそれに続いて投与される。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本発明は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド、ベクター、及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびに抗体の産生のための組換え技術に関する。単離ポリヌクレオチドは、抗ＰＤ－１抗体の任意の所望の形態（例えば、全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む）をコードすることができる。
抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントもしくは鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であるように、１つ又は複数の調節配列又は制御配列に融合することができ、当技術分野において公知である適切な発現ベクター又は宿主細胞中に含めることができる。重鎖又は軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド分子の各々を、定常ドメイン、例えばヒト定常ドメインなどをコードするポリヌクレオチド配列に非依存的に融合することができ、インタクトな抗体の産生を可能にする。あるいは、ポリヌクレオチド、又はその一部を一緒に融合し、単鎖抗体の産生のための鋳型を提供することができる。
組換え産生のために、抗体をコードするポリヌクレオチドを、クローニング（ＤＮＡの増幅）のために又は発現のために複製可能なベクター中に挿入する。組換え抗体を発現するための多くの適切なベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般的に、以下の１つ又は複数を含むが、これらに限定しない：シグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
抗ＰＤ－１抗体はまた、抗体が、成熟タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端に特異的な切断部位を有する異種ポリペプチド、例えばシグナル配列又は他のポリペプチドなどと融合している融合ポリペプチドとして産生することもできる。選択される異種シグナル配列は、典型的には、宿主細胞により認識され、処理される（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。抗ＰＤ－１抗体シグナル配列を認識及び処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列を原核シグナル配列により置換することができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーなどでありうる。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼアルファ因子（サッカロミセス及びクルイベロミセスα因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼ、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼ、又はＷＯ９０／１３６４６において記載されているシグナルで置換することができる。哺乳動物細胞においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。そのような前駆体領域のためのＤＮＡは、ヒト化抗ＰＤ－１抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームで連結される。
発現及びクローニングベクターは、ベクターが１つ又は複数の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクター中では、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡに非依存的に複製することを可能にするものであり、複製起点又は自律的に複製する配列を含む。そのような配列は、多様な細菌、酵母、及びウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大半のグラム陰性細菌について適切であり、２－νプラスミド起点は酵母について適切であり、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、及びＢＰＶ）が、哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするために有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターについて必要とされない（ＳＶ４０起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含むだけのために使用されうる）。
発現及びクローニングベクターは、発現の同定を促進する選択マーカーをコードする遺伝子を含みうる。典型的な選択マーカー遺伝子は、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする、あるいは、補体栄養要求性欠損である、又は他の代替物では、複合培地中には存在しない特定の栄養素を供給し、例えば、桿菌でのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の増殖を停止させるために薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されたそれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、このように、選択レジメンで生存する。そのような優性選択の例では、薬物、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。哺乳動物細胞のための一般的な選択マーカーは、ヒト化抗ＰＤ－１抗体をコードする核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものであり、例えばＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ（例えば霊長類のメタロチオネイン遺伝子など）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培地ですべての形質転換体を培養することにより最初に識別される。野生型 ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＤＧ４４）である。
あるいは、抗ＰＤ－１抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えばアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などをコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択マーカーのための選択薬剤、例えばアミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８ などを含む培地中での細胞増殖により選択することができる。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
組換え産生を、宿主細胞として酵母細胞中で実施する場合、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するＴＲＰ１遺伝子（Stinchcomb et al., 1979, Nature 282:39）を選択マーカーとして使用することができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４－１（Jones, 1977, Genetics 85:12）についての選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１損傷の存在は次に、トリプトファンの非存在における増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２ｐ欠損酵母株、例えばＡＴＣＣ２０，６２２及び３８，６２６などは、ＬＥＵ２遺伝子を持つ公知のプラスミドにより補完される。
また、１．６μm環状プラスミドｐＫＤ１から由来するベクターを、クルイベロミセス酵母の形質転換のために使用することができる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が、Ｋラクチスについて報告された（Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135）。クルイベロミセスの工業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている（Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975）。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、抗ＰＤ－１抗体又はそのポリペプチド鎖をコードする核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核宿主との使用のために適切なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターなどを含む。他の公知の細菌プロモーターも適切である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、ヒト化抗ＰＤ－１抗体をコードする ＤＮＡに作動可能に連結されたＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｍｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
多くの真核プロモーター配列が公知である。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全てが、真核発現ベクター中に適切に挿入される。
酵母宿主との使用のための適切な促進配列の例は、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
誘導性プロモーターは、増殖条件により制御される転写の追加の利点を有する。これらは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロム Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連付けられる誘導体酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のための酵母プロモーター領域を含む。酵母発現における使用のための適切なベクター及びプロモーターが、ＥＰ７３，６５７又はBaghban et al. Molecular Biotechnology(2019) 61:365-384においてさらに記載されている。酵母エンハンサーがまた、酵母プロモーターと有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗ＰＤ－１抗体の転写は、例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、あるいは熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターが、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させるためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。このシステムの改変が、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、Reyes et al., 1982, Nature297:598-601を参照のこと（単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトｐ－インターフェロンｃＤＮＡの発現が開示されている）。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復をプロモーターとして使用することができる。
組換え発現ベクターにおいて使用することができる別の有用なエレメントは、エンハンサー配列であり、それは、高等真核生物による抗ＰＤ－１抗体をコードするＤＮＡの転写を増加させるために使用される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物の遺伝子から公知である（例、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）。典型的には、しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例は、複製開始点の後期側（ｂｐ １００－２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントの説明については、Yaniv, 1982, Nature297:17-18を参照のこと。エンハンサーは、抗ＰＤ－１抗体をコードする配列に対して５’又は３’の位置でベクター中にスプライシングされうるが、しかし、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のために及びｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含むことができる。そのような配列は一般に、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び、時折、３’の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗ＰＤ－１抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれにおいて開示されている発現ベクターを参照のこと。一部の実施形態では、抗ＡＮＧＰＴ２抗体は、ＣＨＥＦ系を使用して発現させることができる。（例えば、米国特許第５，８８８，８０９号を参照のこと；その開示は、参照により本明細書中に組み入れられる。）
本明細書中のベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現するために適切な宿主細胞は、上に記載する原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞である。この目的のための適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌など、例えば、腸内細菌、例えばエシェリヒアなど、例、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例、サルモネラ・チフィリウム、セラチア、例、セラチア・マルセスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、ならびにバチルス、例えばＢ．ズブチリス及びＢ．リケニフォルミス（１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０において開示されているＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌など、及びストレプトマイセスなどを含む。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などが適切である。これらの例は、限定的よりむしろ、例証的である。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母などは、抗ＰＤ－１抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ、又は一般的なパン酵母が、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多くの他の属、種、及び株が一般に入手可能であり、本明細書中で有用である（例えばシゾサッカロミセス・ポンベなど；クルイベロミセス宿主、例えば、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ウォルティ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ． マルシアヌス；ヤロウイア（ＥＰ ４０２，２２６）；ピキア・パストス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオマイセス、例えばシュワンニオマイセス・オクシデンタリスなど；及び糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウムなど、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニドゥランス及び Ａ．ニガ－など）。
グリコシル化抗ＰＤ－１抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物から由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含み、例えば、多数のバキュロウイルス株及びバリアント、ならびに宿主、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びボンビクス・モリ（蚕）などからの対応する許容昆虫宿主細胞を含む。トランスフェクション用の多様なウイルス株が公的に入手可能であり、例えば、オートグラファ・カリフォルニアＮＰＶのＬ－１バリアント及びボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ－５ 株があり、そのようなウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、ウイルスベクター中に組み入れることができ、即ち、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドをウイルスベクター中に導入し、次に、ウイルスでの感染後に患者の身体において発現させる。
別の態様では、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの発現は、脊椎動物細胞において行われる。培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、ルーチン的な手順になっており、技術は広く利用可能である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により形質転換されたサル腎臓 ＣＶ１株、ヒト胎児腎臓株（浮遊培養中での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、（Graham et al., 1977, J Gen Virol.36: 59）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ１（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA77: 4216；例、ＤＧ４４）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod.23:243-251）、サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci.383: 44-68）、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞を、抗体産生のための上に記載する発現ベクターもしくはクローニングベクター又はその抗原結合フラグメントで形質転換し、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。
本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地中で培養してもよい。商業的に利用可能な培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Sigma-Aldrich Co.、ミズーリ州セントルイス）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、（Sigma-Aldrich Co.）、ＲＰＭＩ－１６４０（Sigma-Aldrich Co.）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma-Aldrich Co.)などが、宿主細胞を培養するために適切である。また、Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980、Anal. Biochem. 102:255、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、米国特許第５，１２２，４６９号、ＷＯ ９０／１０３４３０、及びＷＯ ８７／００１９５の１つ又は複数において記載されている任意の培地を、宿主細胞のための培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩類（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（例えばゲンタマイシンなど）、微量元素（無機化合物として定義され、通常、マイクロモル範囲中の最終濃度で存在する）、及びグルコース又は等価のエネルギー源を添加してもよい。他の添加剤がまた、当業者に公知でありうる適した濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を使用する場合、抗体は、ペリプラズム間隙において細胞内で産生されうる、又は培地中に直接的に分泌されうる。抗体が細胞内で産生される場合、細胞を、最初の工程として破壊してタンパク質を放出させてもよい。粒子状細片（宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれか）は、例えば、遠心分離又は限外ろ過により除去することができる。Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡単には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在において約３０分にわたり解凍する。細胞細片は遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦなどが、タンパク質分解を阻害するために前述の工程のいずれかに含まれてもよく、抗生物質が、外来性の混入物の増殖を防止するために含まれてもよい。多様な方法を、宿主細胞から抗体を単離するために使用することができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは典型的な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトガンマ１、ガンマ２、又はガンマ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（例、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照のこと）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプについて及びヒトガンマ３について推奨される（例、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575を参照のこと）。親和性リガンドが付着されるマトリックスは、最もしばしば、アガロースであるが、しかし、他のマトリックスが利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどは、アガロースで達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿がまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
任意の予備精製工程後、目的の抗体及び混入物を含む混合物を、典型的には低塩濃度（例、約 ０～０．２５Mの塩）で実施される、溶出緩衝液を約２．５～４．５のｐＨで使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
また、含まれるのは、本明細書中で定義するように、低、中程度、高ストリンジェンシー条件下で、特に高ストリンジェンシー条件下で、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド配列により表されるヌクレオチド配列の全部又は一部（例、可変領域をコードする部分）にハイブリダイズする核酸である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、典型的には、少なくとも１５（例、２０、２５、３０、又は５０）ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、抗ＰＤ－１ポリペプチド（例、重鎖又は軽鎖可変領域）、又はその補体をコードする核酸の一部又は全部の配列と少なくとも８０%、例えば、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９８%同一である。本明細書中に記載する型のハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例、ＰＣＲプライマー、又は診断プローブとして使用することができる。一態様では、「高ストリンジェンシー条件」は、少なくとも１００ヌクレオチド長さのプローブについての、１２～２４時間にわたり標準的なサザンブロッティング手順に従った、５×ＳＳＰＥ、０．３% ＳＤＳ、２００マイクログラム/mlの剪断及び変性サケ精子ＤＮＡ、ならびに５０%ホルムアミド中での４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料を、最後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．２% ＳＤＳを使用して１５分間にわたり３回ずつ洗浄する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１０８～１２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号９２～１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、又は配列番号１３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、又は配列番号１３８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１２５、配列番号１２７、又は配列番号１２９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１２４、配列番号１２６、又は配列番号１２８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５３、又は配列番号１５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５２、又は配列番号１５４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１４１、配列番号１４５、又は配列番号１５１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１４０、配列番号１４４、又は配列番号１５０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１５９、配列番号１６１、又は配列番号１６３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１５８、配列番号１６０、又は配列番号１６２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１５６のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
製造品
別の態様では、上に記載する障害の処置のために有用な材料を含む製造品が含まれる。製造品は容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器、及び試験管を含む。容器は、多様な材料、例えばガラス又はプラスチックなどから形成されうる。容器は、状態を処置するために有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる。例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる。組成物中の活性薬剤は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントである。容器上の又はそれに関連するラベルは、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。製造品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などを含む第２の容器をさらに含んでもよい。それは、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を伴う添付文書を含む）をさらに含みうる。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されているが、それらは本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例
実施例１：抗体生成（免疫化）
ＭＨＣ型Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｇ系統のマウスを、組換え単量体ヒトＰＤ－１又はヒトＰＤ－１－ヒトＦｃ－Ｈｉｓタンパク質で免疫化した。この組換えタンパク質についての遺伝子記号はＰＤＣＤ１であり、ＧｅｎｅＩＤは５１３３である。血清学を次に、結合のためにヒトＰＤ－１抗原を発現するＣＨＯヒトＰＤ－１細胞を使用したフローサイトメトリーにより評価した。選択された血清学的に陽性のマウスに、Ｂ細胞単離前に最終追加免疫を与えた。全ての選択されたマウスが、血清中で陽性の抗体価を示した。陽性の血清学で、脾細胞を、抗原特異的Ｂ細胞の回収のために回収した。全ての手順を、ＩＡＣＵＣ（Institutional Animal Careand Use Committee）により承認されたプロトコルに従って行った。
実施例２：ヒト化抗ＰＤ－１抗体の産生
マウスリード抗体７２３Ｃ２を、７２３Ｃ２のマウス可変ドメイン及びヒト定常ＩｇＧ１ＷＴ、ＩｇＧ１ＫＯ、又はＩｇＧ４Ｐｒｏドメインからなるキメラ抗体に変換した。マウス抗体７２３Ｃ２軽鎖可変領域（Ｖκ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列を、本明細書中の上の表１及び２において示す。ＩｇＧ４Ｐｒｏは、Ｆａｂ アーム交換を防止する１つの置換変異（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を有する。ＩｇＧ１ＫＯは、エフェクター機能（ＡＤＣＣ）を低下させるために、ヒンジ領域中に２つの変異、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａを有する。キメラ抗体を生成し、抗体の機能を確認し、正しい配列が得られていることを保証する。ヒトＩｇＧ１ＷＴ、ＩｇＧ１ＫＯ、及びＩｇＧ４Ｐｒｏフォーマット中のキメラ７２３Ｃ２の配列を表８中に示す。ヒトＩｇＧ１ＷＴ及びＩｇＧ４Ｐｒｏ中のキメラ７２３Ｃ２は、Ｈ－ＣＤＲ３における変異、ＤＣからＤＹを含む。しかし、ヒトＩｇＧ１ＫＯ中のキメラ７２３Ｃ２は変異を有さない。この部位における変異を表８中で強調している。抗体の可変領域を次に、設計及びスクリーニング過程を通じてヒト化させる。ライブラリーを作成し、ここでヒト残基及びマウス残基を、任意の所与の位置においてヒト残基又はマウス残基のいずれかがありうるように変動させた。そのようなライブラリーを、ヒト生殖系列とマウス抗体の間で異なるアミノ酸について作成した。親マウス抗体の機能を保持しているクローンだけを選択した。抗体７２３Ｃ２についての代表的なヒト化可変領域を表５及び６中に示す。
この様式において、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、及び抗体Ｅは、マウス抗体７２３Ｃ２（ヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ／カッパ骨格中にクローニングされた）から由来するヒト化抗体であった。抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥを表７中に示す。
実施例３：組換えＰＤ－１タンパク質への抗体の結合
Ａ）組換えヒトＰＤ－１に結合するヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格におけるキメラ抗ＰＤ－１抗体の動態及び親和性を下に示す（表９）。動態及び結合親和性を、ProteOn XPR36（Biorad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用し、単一カラム精製後の一過性トランスフェクションから生成された材料を使用して測定した。
Figure 2023528778000026
Ｂ）親和性を、マウス抗体７２３Ｃ２から由来するヒト化抗ＰＤ－１抗体について測定した。動態結合データが、ProteOn XPR36（Biorad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して測定され、１：１結合モデルに包括的に適合され、組換えヒトＰＤ－１との相互作用が １nM～１０nMの範囲中であることを実証した（表１０）。抗体ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐ（Celgeneに対するＷＯ２０１７／０５８８５９において開示されているＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格中の抗体）もテストした。
Figure 2023528778000027
Ｃ）カニクイザルＰＤ－１に結合する抗ＰＤ－１抗体の親和性及び動態データをProteOn XPR36で測定し、１：１結合モデルに包括的に適合させた（表１１）。抗体、ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐもテストした。
Figure 2023528778000028
Ｄ）ヒトＰＤ－１への分子選択性
細胞ベースのアッセイにおけるヒトＰＤ－１タンパク質に対する抗ＰＤ－１抗体の選択性を、フローサイトメトリーにより評価した。ヒトＰＤ－１タンパク質を発現しない親 Ｊｕｒｋａｔ細胞又はヒトＰＤ－１タンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、下に示す濃度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７で標識した抗ＰＤ－１抗体とインキュベートした。コントロールとして、親細胞及びＰＤ－１発現 Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗ＴＮＰアイソタイプコントロール抗体とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、ＰＦＡ中で固定し、次に染色緩衝液中で洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞への抗体の結合を、フローサイトメトリーにより評価された。非染色細胞をまた、ネガティブコントロールとしてフローサイトメトリーにより評価した。抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも１マイクロモルまでヒトＰＤ－１に選択的に結合し、ヒトＰＤ－１タンパク質を発現する Ｊｕｒｋａｔ細胞への用量依存的な抗体結合及びＰＤ－１発現を欠く親 Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識抗ＰＤ－１抗体の結合の欠如により示される通りである。抗体Ｃ（Ａｂ Ｃ）を使用した代表的な実験の結果を図１中に示す。
実施例４：ヒトＰＤ－Ｌ１－ＦｃへのヒトＰＤ－１－Ｆｃ結合の競合結合アッセイ
ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃは、BioRad ProteOn XPR36機器でのＧＬＭチップのチャンネル１～３に ６０μg/mLの濃度で結合したアミンであった；３つのテスト抗体、抗体Ｃ、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、及びＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐは、３０μg/mLでそれぞれチャネル ４、５、及び６上に結合したアミンであった。ヒトＰＤ１－Ｆｃをチップ表面上のチャネル１～ ６にわたり２５nMの濃度で注入した。センサーグラムは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１受容体の間での特異的結合を示す（図２Ａ）。５００nM 抗体Ｃ、ＭＫ－３４７５、及びＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐを２５nM ＰＤ１－Ｆｃと事前に混合し、チップ上の全てのチャネルにわたり分析物として注入し、個々の抗体がＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害するか否かを評価した。抗体Ｃ及びＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐの両方が、センサーグラムにより実証されるように、ＰＤ－１抗原への結合についてＰＤ－Ｌ１と非競合的である。ＭＫ－３４７５及びＰＤ－Ｌ１は、競合アッセイにおいて観察された非結合センサーグラムに基づくＰＤ－１との互いの潜在的な結合ブロッカーである（図２Ｂ）。
実施例５．抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の存在におけるＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の増強した結合
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を、Ｈ－ＣＤＲ３中でのＤＣからＤＹへの変異を伴わないヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格中でのＰＤ－１アゴニスト抗体７２３Ｃ２の存在において調べた。複数のアッセイを利用して、抗体７２３Ｃ２によってＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合が増強されることを実証した。生化学的ＥＬＩＳＡベースのアッセイを利用して、プレート結合ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を評価した（BPS Bioscience）。白色９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳ溶液中の２μg/mlでの５０μlのＰＤ－Ｌ１で、一晩４℃でコーティングした。上清を除去し、プレートを、製造元であるBPS Bioscienceにより提供された１×イムノ緩衝液（カタログ番号７２００５）で３回洗浄し、その後にブロッキング緩衝液を用いた室温（ＲＴ）で１時間にわたるブロッキングが続いた。抗体を、関連コントロールと共に加え、その後に室温で２時間にわたる０．５ｎg/ml（１０ng）のＰＤ－１ビオチンの添加が続いた。プレートをブロッキング緩衝液で１０分間にわたり遮断した。ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体を、洗浄したプレートに１時間にわたり加えて、その後にＰＤ－１アッセイ緩衝液での洗浄が続いた。プレートを１０分間にわたり遮断した。化学発光基質混合物を読み取り直前にプレートに加えた。化学発光シグナルは、ルミノメーター（Envision）で、又は化学発光を読み取ることが可能なマイクロタイタープレートで読み取った。
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との増強した相互作用が、抗体７２３Ｃ２の存在において観察されたが、アイソタイプコントロールで処理されたサンプルと比較し、増加した化学発光シグナルにより示される（図３Ａ）。抗体７２３Ｃ２は、図３Ａ中で７２３Ｃ２－４Ｐとして命名されている。これは、ＭＫ３４７５（公知の抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体）とは対照的であり、それは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を遮断した。抗体ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐは、このアッセイにおいて ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１の限定的な増強を実証した（図３Ａ）。
細胞ベースのアッセイを利用して、抗体７２３Ｃ２の存在においてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の増強を実証するＥＬＩＳＡベースの結果を確認した。ここで、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を、ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ）受容体－リガンド結合アッセイ（Perkin Elmer）を用いて、ＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ細胞への可溶性ＰＤ－１の結合を測定することにより評価した。
１０，０００個の細胞を播種し、３７℃＋５% ＣＯ２インキュベーター（加湿インキュベーター）で一晩インキュベートした。ビオチン標識ＰＤ－Ｌ１ＥＣ １０（１３０nM）及び１０μlのＰＤ－１抗体を各々のウェルに加えて、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。プレートを５０μlの１×ＴＲＦ 洗浄緩衝液で２回洗浄した。２０μＬのＥｕ－ストレプトアビジン試薬をアッセイプレートに加えて、室温で１時間にわたりインキュベートした。Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートした。プレートを蛍光プレートリーダーで読み取った（励起：３２０又は３４０nm、発光：６１５nm）。このアッセイでは、ＥＬＩＳＡアッセイの確認では、この細胞ベースのアッセイにおける抗体７２３Ｃ２の存在によって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用が強化された（図３Ｂ）。抗体７２３Ｃ２は、図３Ｂ中で７２３Ｃ２－４Ｐとして命名されている。
ＰＤ－１がＣＨＯ細胞で発現された第２の細胞ベースのアッセイをまた、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を評価するために利用した。このアッセイでは、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞へのＰＤ－Ｌ１多量体結合をフローサイトメトリーにより測定した。５０μlの２×１０６細胞／ｍｌを各々のウェルに加えた（１００，０００個細胞／ウェル）。細胞を遠心分離し、５０μlの示した濃度の抗体中に再懸濁し、氷上で６０分間にわたりインキュベートした。ＰＤＬ１－ビオチン及びストレプトアビジン－ＡＰＣを染色緩衝液中で組み合わせた（１μg/ml ＰＤＬ１－ビオチン＋０．２５μg/mlストレプトアビジン－ＡＰＣ）。５０μlの２×ＰＤＬ１－ビオチン／ストレプトアビジン－ＡＰＣ 混合液を細胞に加え、氷上で６０分間にわたりインキュベートする。細胞を洗浄し、１８０μlの染色緩衝液＋２０μＰＦＡ中に再懸濁し、データをＢＤ ＬＳＲ ＩＩで取得した。図３Ｃ中に示すように、この細胞ベースのアッセイはまた、抗体７２３Ｃ２の存在における ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の増強した結合を実証した。抗体ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐは、ＰＤ－Ｌ１結合に対する効果を有さなかった一方で、ＭＫ３４７５アンタゴニスト抗体は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害した（図３Ｃ）。抗体７２３Ｃ２は、図３Ｃ中で７２３Ｃ２－４Ｐとして命名されている。
上に記載するＣＨＯ ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１Ｄｅｌｐｈｉａ－Ｅｕ ＴＲＦアッセイをまた、抗体Ｃ、抗体ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐ、抗体１－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９０－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９４－４Ｐｒｏ、及び抗体ＡＮＢ－０３０－４Ｐｒｏを使用して実施した。抗体１－４Ｐｒｏは、Eli LillyへのＷＯ２０１９／１６８７４５において記載されている抗体１の重鎖及び軽鎖可変領域をＩｇＧ４－Ｐｒｏ骨格に含む。抗体ＰＤ１Ｂ１０９０－４Ｐｒｏ及び抗体ＰＤ１Ｂ１０９４－４Ｐｒｏは、Janssen BiotechへのＷＯ２０１８／２２６５８０において記載されている、それぞれＰＤ１Ｂ１０９０及びＰＤ１Ｂ１０９４の重鎖及び軽鎖の可変領域をＩｇＧ４－Ｐｒｏ骨格中に含む。抗体ＡＮＢ－０３０－４Ｐｒｏは、ＣＡＳ番号 ＣＡＳ２４１２７６４－４０－８の下に記載されている抗体ＡＮＢ－０３０の重鎖及び軽鎖可変領域をＩｇＧ４－Ｐｒｏ骨格中に含む（また、AnaptysbioへのＷＯ２０２０／２４７６４８において記載されているＡＰＥ１２５３７の重鎖及び軽鎖可変領域に対応する）。ＩｇＧ４－Ｐｒｏ骨格中の抗ＴＮＰ抗体も含まれた。
抗体Ｃは、濃度依存的にＰＤ－１＼ＰＤＬ－１結合の一貫した（Ｎ＝３） 増強を示した（図３Ｄ）。全ての他の抗ＰＤ－１アゴニストは、ＰＤ－１＼ＰＤＬ－１結合の増強を一貫して示さなかった（図３Ｄ）。
実施例６：機能的細胞アッセイ、ＴＨＰ－１／Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１アゴニストレポーターアッセイにおけるＮＦＡＴ活性化の阻害
ＴＨＰ－１／Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ１ＮＦＡＴ 共培養アッセイを、複数のキャンペーンから生成された抗ＰＤ１抗体のアゴニスト活性を評価するために開発した。ＴＨＰ－１細胞株をＡＴＣＣから得た。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を内部で生成した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞は、細胞表面上でヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）を過剰発現し、ＮＦＡＴ駆動型ルシフェラーゼレポーターも発現し、刺激への応答における細胞の活性化状態が測定される。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ１ＮＦＡＴ細胞は、ＴＨＰ－１細胞の存在においてＣＤ３ｘＣＤ３３ ＢｉＴＥで活性化される。ＢｉＴＥの抗ＣＤ３３アームは、ＴＨＰ－１細胞上に発現されるＣＤ３３に結合する一方で、抗ＣＤ３アームはＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３分子に結合する。ＢｉＴＥは、ＴＨＰ－１とＪｕｒｋａｔ細胞を会合させる役割を果たし、Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化しながら、２つの細胞間に免疫シナプスの形成をもたらす。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＮＦＡＴ 駆動型ルシフェラーゼレポーターにより測定する。このアッセイを、アゴニスト抗体を同定するために、抗ＰＤ１抗体の存在において実行した。活性化における２０%又はそれ以上の低下を示した分子を、ルシフェラーゼシグナルの喪失により示されるように、アゴニスト抗体として分類した（表１２）。表１２中の抗ＰＤ－１抗体３０６Ｅ６から８２０Ｃ３は、マウスＩｇＧ１骨格上にあった。これらの抗体のいくつかを、ヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格（表１２中でキメラ抗体として示されている）での追加のプロファイリングのために選択した。
Figure 2023528778000029
実施例７：機能的細胞アッセイ－ヒトＰＤ－１ノックイン脾細胞からのＩＦＮγ産生の阻害
上位の抗ＰＤ１抗体を選択するために使用された初代細胞アッセイは、ｈＰＤ１ノックインマウス脾細胞アッセイであった。脾臓を、マウスＰＤ１の代わりにヒトＰＤ１を発現するＣ５７ＢＬ／６マウスから収集した。脾細胞を脾臓から単離し、０．１μg/mlの濃度の抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）で活性化した。Ｔ細胞の活性化を、ＭＳＤ分析（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によりｍＩＦＮγレベルを定量化することにより、４８時間後に測定した。このアッセイは、ＴＨＰ－１／Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ１ＮＦＡＴ スクリーニングアッセイより選択された抗ＰＤ１抗体の存在において実行された。このアッセイから同定された上位の分子を、ｍＩＦＮγの阻害%（５０%又はそれ以上）及び配列クレードに基づいて選択した。阻害値及びＩＣ５０値を表１３中に示す。
Figure 2023528778000030
実施例８：機能的細胞アッセイ、ヒトＰＢＭＣアッセイからのＩＦＮγ産生の阻害
抗ＰＤ－１アゴニスト抗体を、ヒト初代細胞アッセイにおいて、ＩＦＮγ産生により測定されるように、Ｔ細胞の機能活性を調節するそれらの能力についてさらに特徴付けた。ＰＢＭＣをヒト全血から単離して、１．５pMの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、BioLegend）で活性化させた。Ｔ細胞の活性化及び機能を、ＭＳＤ分析によりｈＩＦＮγレベルを定量化することにより、７２時間後に評価した。同定された抗ＰＤ－１アゴニスト抗体は、アイソタイプコントロール処理細胞と比較して、ＩＦＮγ分泌を低下させることができた（表１４Ａ）。
Figure 2023528778000031
抗体Ｃ、抗体１－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９０－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９４－４Ｐｒｏ、抗体ＡＮＢ－０３０－４Ｐｒｏ、及びアバタセプトをまた、このアッセイにおいてテストした。結果を表１４Ｂ中に示す。抗体Ｃ、ＩｇＧ１野生型骨格中の及びＩｇＧ１ＫＯ骨格中の抗体１－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９０－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９４－４Ｐｒｏ、及び抗体ＡＮＢ－０３０－４Ｐｒｏの可変領域、ならびにアバタセプトをまた、このアッセイにおいてテストした。結果を、下に要約する表１４Ｃ中に示す。各々の実験では、５人のドナーをテストした。
Figure 2023528778000032
Figure 2023528778000033
ＩｇＧ１ＫＯ骨格中の抗体１－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９０－４Ｐｒｏ、抗体ＰＤ１Ｂ１０９４－４Ｐｒｏ、及び抗体ＡＮＢ－０３０－４Ｐｒｏの可変領域についてのＩＦＮγの阻害は、３０nMを上回るＩＣ５０値で４０%未満であった。
実施例９：機能的細胞アッセイ、Ｔｈ１７－単球共培養アッセイからのＩＬ－１７Ａ産生の阻害
抗ＰＤ－１アゴニスト抗体を、Ｔｈ１７分化Ｔ細胞によるＩＬ－１７分泌の機能的阻害についてテストした。初代細胞共培養アッセイを、ＰＤ－１によるＩＬ－１７の調節を評価するために開発した。ＰＢＭＣ から単離されたヒト初代Ｔ細胞は、以下の傾斜条件下でＴｈ１７分化した：ＣＤ４ Ｔ細胞は、Ｔｈ１７傾斜培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地＋ＩＬ－１β（１０ng/mL）、ＩＬ－２３（１０ng/mL）、ＩＬ－６（１０ng/mL）、ＩＬ－２（２ng/mL）、ＴＧＦβ（０．５ng/mL）、５μg/mL 抗ＩＬ４、５μg/mL 抗ＩＦＮγ）中で４日間にわたり０．５μg/mlプレート結合抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）で刺激した。４日後、細胞を抗ＣＤ３コーティングプレートから取り出し、Ｔｈ１７傾斜培地を含むフラスコに移した。分化後、Ｔｈ１７細胞を少なくとも３日間にわたり休止させ、次に自己単球と共培養し、ＰＤ－１抗体の存在において４０ｆＭ 抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）で再刺激した。共培養系は、抗ＰＤ－１抗体がアゴニスト活性を示すために必要なＦｃ要件に起因して要求された。ＩＬ－１７の阻害が、このアッセイにおいて、抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の存在において観察された。抗体のＩＣ５０及びＩＬ－１７応答の最大阻害を下の表中に示す（表１５）。最大阻害をアイソタイプコントロール抗体に対して比較した。
Figure 2023528778000034
実施例１０：機能的細胞アッセイ、Ｔｆｈ－単球共培養アッセイからのＩＬ－２１産生の阻害
濾胞性ヘルパー Ｔ（Ｔｆｈ）細胞活性をインビトロで阻害する抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の能力を評価するためのアッセイを開発した。ＣＤ４Ｔ細胞及び自己単球をＡＬＬＣＥＬＬＳから得た。Ｔ細胞を、ＩＬ－２３（２５ng/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）の存在においてDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Gibco）で細胞を５日間にわたり活性化することによりＴｆｈ系統に傾斜させ、次に、細胞を洗浄し、活性化ビーズを除去した後、４．５pM 抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、BioLegend）及び抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の存在において自己単球と組み合わせた。２４時間後、上清を収集し、ＩＬ－２１の存在についてアッセイした（Meso Scale Discovery、MSD V-Plex Human IL-21Kit）。再刺激されたＴｆｈ分化細胞のＩＬ－２１産生は、抗ＰＤ－１アゴニスト抗体により阻害した。代表的なＩＣ５０及びＥｍａｘ阻害値を表１６中に示す。
Figure 2023528778000035
実施例１１：ＰＤ－１アゴニスト活性に対するＦｃｇＲ相互作用の役割
アゴニスト抗体の機能活性に対するＦｃ－Ｆｃｇ受容体相互作用の役割を、異なる骨格フォーマット（ＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ１ＫＯ、又はＩｇＧ４ Ｐｒｏ）又は二価抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）での候補ＰＤ－１アゴニスト抗体を利用することにより特徴付けた。抗体バリアントの機能活性を、上に記載するヒトＰＢＭＣアッセイにおいて活性化 Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生を調節する能力により評価した。機能的アゴニスト活性は、ＩＦＮｇ産生における低下により測定され、親の７２３Ｃ２及び８２０Ｃ３抗体の二価Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでは失われる（図４Ａ及び４Ｂ）。対照的に、ヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格における全長抗体は、用量依存的な様式においてＩＦＮγ産生を阻害した（図４Ａ及び４Ｂ、それぞれ７２３Ｃ２－４Ｐ及び８２０Ｃ３－４Ｐとして命名する）。これらのアッセイでは、ヒトＰＢＭＣを全血から単離し、抗ＰＤ－１抗体又は示された抗ＰＤ－１抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの存在において１．５pMの抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で活性化した。７２時間後、上清中のヒトＩＦＮガンマサイトカインレベルをＭＳＤ分析により測定した。
これは、Ｆｃ相互作用が抗ＰＤ－１抗体の機能的アゴニスト活性のために要求されることを示唆しているため、７２３Ｃ２抗体をＩｇＧ１ＷＴ、ＩｇＧ１ＫＯ、及びＩｇＧ４Ｐｒｏ骨格で生成して、これらの相互作用をさらに特徴付けた（それぞれ７２３－ＩｇＧ１ＷＴ、７２３－ＩｇＧ１ＫＯ、及び７２３－ＩｇＧ４Ｐｒｏ、下の表１７中）。ＩｇＧ１ＷＴ及びＩｇＧ４ Ｐｒｏの両方が、異なる程度でヒトＦｃ受容体に結合する一方で、ＩｇＧ１ＫＯ骨格はＦｃ受容体への大きく低下した結合を有する。ＩｇＧ４ Ｐｒｏ上の抗ＰＤ－１アゴニスト抗体が、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける最も高い程度のＩＦＮγ阻害を示した一方で、ＩｇＧ１ＫＯ上の抗体は、大きく低下した結合を示した（表１７）。まとめると、これらのデータは、抗ＰＤ－１抗体の機能的アゴニズムがＦｃ相互作用に依存的であることを示す。
Figure 2023528778000036
実施例１２：インビボモデル－異種ＣＤ４＋Ｔ細胞ＧｖＨＤモデル
インビボ異種ＣＤ４＋Ｔ細胞ＧｖＨＤマウスモデルを使用して、ＰＤ－１アゴニスト抗体の有効性をテストした。群当たり８匹のＮＳＧ マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Jackson Laboratory）に、健常ドナーｌｅｕｋｏｐａｋｓからの５×１０６個ＣＤ４＋Ｔ細胞（ネガティブセレクションにより精製）を静脈注射した。マウスに、以下に従って０．６２５mg/kg ＩＰを週２回投与した：群１：７２３（ＩｇＧ４－Ｐｒｏ）、群２：ＰＤ１ＡＢ－６－４Ｐ（ＩｇＧ４－Ｐｒｏ）、群３：抗ＴＮＰアイソタイプ（ＩｇＧ４－Ｐｒｏ）、群４：アベルマブ（ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡＰＧ）、群５：抗ＴＮＰアイソタイプ（ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡＰＧ）、群６：ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ）。ＴＮＰはトリニトロフェノールである。ＬＡＬＡは、抗体のエフェクター機能を破壊するために一般に使用されるＬｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ変異を表する。ＰＧはＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異を表し、それは、Ｆｃガンマ受容体への結合を防止することによりエフェクター機能を排除する。
３回の実験的繰り返しを実行し、各々が固有のドナーを伴った。第４週までに、ヒト細胞蓄積の有意な阻害が、テストされた全てのドナーについてのそれらのアイソタイプが一致されたコントロールと比較して、群１、２、及び６において認められた（表１８）。４週目での炎症性サイトカインの定量化は、全てのドナーにおいてヒトＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ－１０のレベルにおける有意な低下を示した（表１９）。ヒトＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、及びＩＬ－１３をまたテストしたが、しかし、全てが、アッセイについての検出の限度を下回った。
Figure 2023528778000037
Figure 2023528778000038
実施例１３：カニクイザルにおける薬物動態試験
抗体Ｃの薬物動態（ＰＫ）を、０．１、０．３、及び１．５mg/kgの単回静脈内（ＩＶ）ボーラス投与又は１．５mg/kgの皮下（ＳＣ）投与後に、中国起源の雄カニクイザルにおいて評価した（ｎ＝３／群）。抗体Ｃの血清中濃度を、２つの異なる ＭＳＤイムノアッセイフォーマットを使用して決定された：（１）「総」薬物の一般的な抗ヒト捕捉及び検出アッセイならびに（２）抗原（ＰＤ１－ＥＣＤ）捕捉及び抗ヒト検出を伴う「遊離」薬物アッセイ。両方のアッセイのＰＫ プロファイルを重ね合わせることができ、内因性ｓＰＤ－１が抗体Ｃの測定に干渉せず、ＴＭＤＤに対するほとんど又はまったく効果を有さなかったことを示唆している。抗体Ｃは、全体的なクリアランスへの標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）の寄与を示唆する、０．１～０．３mg/kgの間の用量依存的なＣＬを示した（遊離アッセイと「総」アッセイの両方を使用）。それぞれの用量の各々についてのＮＣＡ薬物動態パラメータの要約を、下の表２０中に示す。
Figure 2023528778000039
実施例１４：ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション及び産生ならびに生物物理学的データ
ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション及び産生：
ＣＨＯ－Ｅ細胞を～２ｘ１０Ｅ６個細胞/mLで、Irvine BalanCD Transfectory CHO ＋ ４mM Ｌ－グルタミン（又はGlutamax）中にトランスフェクトする。１Lのトランスフェクションのために要求される量は、０．１５mgのＨＣ ＤＮＡプラス０．３mgのＬＣ ＤＮＡ及び１．０５mgのフィラーＤＮＡ（ニシンの精子）及び０．１５mgのＸＢＰ１ＤＮＡである。ＤＮＡを１００mLのOptiPro SFM中に希釈し、０．２μmフィルターを通じて滅菌ろ過する。０．７５mLのMirus TransIT Proトランスフェクション試薬を、希釈したＤＮＡ 混合物に加え、ＤＮＡ複合体を、調製したＣＨＯ－Ｅ細胞に直ぐに加え、振盪フラスコを、３７℃、５% ＣＯ２、１４０rpmのシェーカーに戻す。トランスフェクション後の２４時間に、温度を３２℃に変えて、２mLのGibco Anti-Clumping Agent及び１００mLのIrvine Transfectory Supplementを、トランスフェクトされた細胞に加える。トランスフェクション後の５日に、シェーカーの温度を３０℃に変える。２００mLのIrvine Transfectory Supplementを、グルコースレベルがいつ２g/L～１g/Lの間に下落するかに依存して、５日目又は７日目の間に加える。トランスフェクトされた培養物を１０日間にわたり維持する。回収は、細胞をスピンダウンし、その後の０．２μm ＰＥＳフィルター（Thermo Scientific）を通じた滅菌ろ過により行う。
回収後、清澄化された細胞培養上清を、以下のように、プロテインＡバイオセンサーを伴うForteBio/Pall Octet Red 96機器により、力価についてサンプリングした。
抗体Ａ、抗体Ｃ、及び抗体Ｅについての力価は１８～３８mg/Lの間であり、タンパク質精製からの約８０%回収、及びＳＥＣ精製後の９８%を上回る単量体を伴った。タンパク質を、１０mMヒスチジン－ＨＣｌ、ｐＨ６．０を含む最終緩衝液中で緩衝液交換して、４℃で少なくとも４ヶ月間にわたり安定であり、この緩衝液中での１８０mg/mlまでの溶解度を伴う。
Figure 2023528778000040
Figure 2023528778000041
ＡＵＣ：０．５～１mg/mlの濃度での沈降速度方法により測定される分析用超遠心分離；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー。%Ｍ：単量体のパーセント。
実施例１５：二重特異性抗体
材料及び方法
マウス抗体及び試薬。抗ｈＰＤ１（ＥＨ１２．２Ｈ７）（Biolegend、３２９９１２）；抗ｈＣＤ４８（Bio-gems、１０５１１－２５－５００）；ＩｇＧ１（カタログ番号１６－４７１４－８５）、抗ｈＣＤ３（ＯＫＴ３）（１６－００３７－８５）、抗ｈＣＤ３（ＵＣＨＴ１）（１６－００３８－８５）、及び抗ＣＤ１１ａ（１４００１１９８２）（eBiosciencesから）；抗ｈＣＤ７１（Southern Biotech、９６７０－１４）。ａＣＤ３／ａＣＤ２８ヒトＴ細胞アクチベーターDynabeads（Gibco、１１１３１Ｄ）。
Imagestream。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１細胞を、ＡＦ－４８８コレラ毒素（Life Technologies、Ｖ－３４４０３）及び架橋抗体（Jackson ImmunoResearch）及びＡＰＣａＣＤ３（Biolegend、３１７３１８）、ＰＶ７８６ａＰＤ－１（Biolegend、３２９９３０）、又はＡＰＣａＣＤ４８（Sigma、ＳＡＢ４７００１９３）のいずれかを用いて、XVIVO 15培地（Lonza）中で、氷上で１０分間にわたりインキュベートした。細胞を、予熱したX-VIVO 15への移入により活性化し、追加の１２分間にわたりインキュベートした。細胞の活性化を、冷ＰＢＳ－２%ＰＦＡ（約１：１０の比率、細胞：ＰＦＡ）の添加により停止させ、細胞を、氷上で２０分間にわたり固定溶液中でインキュベートした。細胞を洗浄し、XVIVO中に再懸濁し、Imagestreamソフトウェアを使用してキャップ形成及び周囲長閾値について分析した。
フローサイトメトリー。１×１０５個のＪｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１、又はａＣＤ３／ａＣＤ２８で刺激された初代ヒトＴ細胞を、１mg/mlの初代 ＭＡｂと４℃で１時間にわたりインキュベートした、又は二重特異性分子がテストされた場合、８点結合曲線を６．２５mg/mlの開始濃度から生成し、１：４で段階希釈した。６．２５mg/mlの開始濃度から１：４に段階希釈する。細胞を洗浄し、それぞれ１：１００希釈のＰＥ－抗マウスＩｇ（Life Technologies、Ｐ８５２）、又は１：８００希釈のＰＥ－ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Invitrogen AHI1707）を用いて４℃で１時間にわたり染色した。サンプルを洗浄し、１×固定／溶解緩衝液（eBioscience、００－５３３３－５７）中で固定し、ＬＳＲ２（ＢＤ）で分析した。
ＰＤ－１相補性アッセイ。全長 ＰＤ－１－ＰＫ及び細胞内全長 ＳＨＰ１－ＥＡ 融合タンパク質を過剰発現する２×１０４個のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をDiscoverX（ＤＲＸ－ＢＩ－０８０５１５Ａ）から購入し、製造元の説明に従って培養した。細胞を細胞播種培地（DiscoverX、９３－０５６３Ｒ４Ｂ）中に再懸濁し、一次マウス又はヒト抗体と４℃で３０分間にわたりプレインキュベートした。実験に依存して、細胞を、１０ｍＭのｐａｎ－Ｓｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２（Abcam、ａｂ１２０３０８）又は不活性類似体ＰＰ３（Abcam、ａｂ１２０６１７）と追加でプレインキュベートした。細胞を洗浄し、架橋二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Thermo Scientific、３１１７０）を伴って、又は伴わずに処理した。細胞を、384-white Opti-Plates（PerkinElmer）に移し、Flash Detection試薬（DiscoverX、９３－０２４７）を受けて、EnVision Plate Reader（PerkinElmer）において読み取った。
初代ｈｕＴ細胞活性化。初代ヒトＰａｎ－Ｔ細胞（AllCells、ＰＢ００９－１Ｆ）を５００nMのCell Trace Violet（Life technologies、カタログ番号ｃ３４５５７）で標識した。Epoxy-dynabeads M450（Invitrogen、１４０１１）を、製造元の指示に従って、２．５mgのマウスＡｂｓ／１０７ビーズで共有結合的にコーティングした。細胞を未刺激で放置するか、又はＡｂコーティングされたエポキシ ビーズの存在において、プレートに結合した抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）（２５０及び５００ng/mL）で刺激した。細胞を９６時間後に回収し、ＢＶ５１０抗ＣＤ４（ＢＤ、５６２９７０）Ａｂｓ及びＰｅＣｙ７ 抗ＣＤ８（ＢＤ、３３５７８７）Ａｂｓで染色し、細胞増殖を、ＬＳＲ２（ＢＤ）中でのCell Trace Violet希釈により分析した。初代記憶ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞（AllCells、ＰＢ００９－７Ｆ）を、それぞれ１mg/ウェルのプレート結合アイソタイプコントロール（ＩＳＯ）又はＢｓＡｂの存在において１mg/ウェルのプレート結合抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）で刺激した。培養上清を７２時間で回収し、ＩＬ－２及びＩＬ－１０分泌（ＭＳＤ）について分析した。
ＢｓＡｂｓの生成及びコンストラクトの設計。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を、公開された抗ＣＤ４８（ＵＳ２０１２／００７６７９０）及び抗ＰＤ１（ＷＯ２０１１／１１０６２１Ａｌ）配列から生成し、それらをビルディングブロックとして使用した。二重特異性コンストラクトを、２つの異なる標的可変領域（ＩｇＧ１－ＫＯ）のヘテロ二量体化を促進するノブインツーホール技術を用いて設計し、抗ＰＤ－１及び抗ＣＤ４８（ＰＤ－１／ＣＤ４８）、又はコントロールとして抗ＰＤ－１及び抗ＴＮＰ（ＰＤ－１／ＩＳＯ）を含むＢｓＡｂｓを生成した（図７Ａ）。それぞれの標的について得られた可変領域配列を、ヒト定常領域を含むｐＴＴ－５（カナダ国立研究評議会からライセンス供与）発現ベクター中にクローニングした。簡単には、可変領域のアミノ酸配列を、哺乳動物での発現のためにコドン最適化した。標的Ｖ遺伝子の軽鎖及び重鎖を、結合リンカーセグメントを含む同じ発現ベクター中にクローニングした。ベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ認識部位を使用した制限酵素消化により直線化した。可変領域についてのＤＮＡ配列を、Integrated DNA Technologies（IDTDNA）からＧブロック（ｄｓＤＮＡ）として注文し、ベクター及び隣接するリンカーセグメントへの重複した相同末端を伴う。Ｇブロックを次に、製造元のプロトコルに従って、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ方法（NEBuilder HiFiキット、New England Biolabs、カタログ番号Ｅ５５１０Ｓ）を介して連結させた。従来のクローニングを次に、アセンブリ混合物をコンピテント細胞（NEB 5-alpha C2987、New England Biolabs）中に形質転換することにより完了し、１００μg/mlカルベニシリン（Teknova）を伴うＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。個々のコロニーを採取し、カルベニシリンを伴うＬＢ 培地中で、３７℃で一晩増殖させた。インサートについての陽性クローンを、Lasergeneソフトウェア パッケージ（DNAstar）を使用した配列分析により確認した。配列が確認されたプラスミド ＤＮＡを０．５L培養中でスケールアップし、次に、製造元のプロトコルに従って、Plasmid Plus megaprepキット（Qiagen、カタログ番号１２９８１）を介して精製した。
ＣＨＯ－Ｅ一過性トランスフェクション。ＣＨＯ－Ｅ細胞を、２mMグルタミンを添加したＦＳ－ＣＨＯ中で２ｅ６個細胞/mLでトランスフェクトする。１L ｍＡｂトランスフェクション容量について、１mgの軽鎖（ＬＣ）プラスミドＤＮＡ及び０．５mgの重鎖（ＨＣ）プラスミド ＤＮＡを１００mLのOptiPro SFM（Gibco）中で希釈し、０．２μmフィルター（Millipore）を通じて滅菌ろ過する。１．５mLのTransIT Pro（Mirus Bio LLC）トランスフェクション試薬を加えて、室温で１５～３０分間にわたりインキュベートする。複合体を次に、調製したＣＨＯ－Ｅ細胞に加えて、振盪フラスコをシェーカーに戻す。トランスフェクション後の２４時間に、１０mLのAnti-Clumping Agent及び１５０mLのCHO CD Efficient Feed B（両方ともGibcoから）をトランスフェクトした細胞に加えて、温度を３２℃に変える。トランスフェクトされた培養物を６～１２日間にわたり維持し、細胞増殖、生存率、及び栄養消費について培養を通して定期的にモニターする。培養物の回収を、４℃で４７００rpmでの遠心分離により完了し、その後に滅菌ろ過が続く。
ＢｓＡｂｓ精製。収集した培養上清を、１．０ml/分で、緩衝液Ａ（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）で事前に平衡化したＧＥ（カタログ番号１１００３４９３）からの１ml HiTrap MabSelect SuReカラムにロードする。カラムを緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ（ＤＰＢＳプラス１．０M ＮａＣｌ）の各々の１０mlで、１ml/分の緩衝液 Ａで再び洗浄する。次に、結合したタンパク質を３０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出する。５ml画分を１%体積対体積の３M酢酸ナトリウム、ｐＨ～９で中和する。最終緩衝液は、プロテインＡ 溶出後に６０mM ＮａＯＡｃ、ｐＨ～５である。単量体のパーセンテージは、ａＳＥＣにより、ＰＤ１／ＩＳＯについて７１%＆ＰＤ１／ＣＤ４８について６３%であった。
MabSelect Sureで精製された材料をさらに研磨して、陽イオン交換により凝集物を除去した。Thermo FisherからのPoros GoPure HS Pre-packedカラム（カタログ番号 ４４８１３１６）をイオン交換のために使用した。緩衝液Ａ（６０mM ＮａＯＡｃ． ｐＨ ５．０）で事前に平衡化した１mlのPoros HSカラム上にプロテインＡ サンプルをロードし、１０カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。次に、結合したタンパク質を、２０カラム体積中の緩衝液Ｂ（６０mM ＮａＯＡ、１M ＮａＣｌ、ｐＨ ５．０）中の０%から４０%の勾配で、０．５ml/分で溶出する。ピーク付近の画分をプールし、塩濃度を１００mM ＮａＣｌに調整する。ろ過ユニットでサンプルを無菌的にろ過する。タンパク質濃度を測定し、エンドトキシンレベルを測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥならびにａＳＥＣを実行する。
ＮＦＡＴルシフェラーゼアッセイ。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１ＮＦＡＴレポーター細胞株を社内で生成した。GeneCopoeiaからのヒトＰＤ－１（ＥＸ－Ｂ０１６９－Ｍ０２）をベクター中にクローニングし、それを、エレクトロポレーションを介してＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）中にトランスフェクトした。ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター（Promega E8481）を次に、エレクトロポレーションを介してＰＤ－１発現クローン中にトランスフェクトした。ＴＨＰ－１細胞株をから購入しＡＴＣＣ（ＴＩＢ－２０２）、製造元の指示に従って培養した。
Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１及びＮＦＡＴレポーター細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ、２% ＨＩ－ＦＢＳ）中に再懸濁し、３×１０４個細胞／条件を、ＢｓＡｂｓの用量（１００nMの開始濃度及び１：３希釈）を用いて、３８４の平底Opti-Plates中で１５分間にわたりプレインキュベートした。ＴＨＰ－１細胞（３×１０４個細胞／条件）を加えて、細胞を、ＣＤ３×ＣＤ３３アクチベーターの１０nM溶液を用いて、３７℃で６時間にわたり刺激した。ＮＦＡＴレポーターを、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay reagent form 15 min（Promega、Ｅ２５２０）の添加により分析し、EnVisionプレートリーダーにおいて読み取った。
結果
ＣＤ４８及びＰＤ－１の架橋によって、ＰＤ－１リン酸化が促進される。ＣＤ４８は、マウス及びヒトのリンパ球における確立された脂質ラフト及びＩＳ常在タンパク質である（Elishmereni and Levi-Schaffer,2011）。ＰＤ－１及びＣＤ３のものと比べて、脂質ラフトにおけるＣＤ４８の存在及び存在量をより良く評価するために、本発明者らはＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ実験を行って、ＰＤ－１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞におけるコレラ毒素（ＣＴ）誘導性脂質ラフト合体（キャッピング）とこれらの受容体の共局在を単一細胞レベルで定量化した。ＣＴにより誘導された脂質ラフトキャップ内のＣＤ４８、ＣＤ３、及びＰＤ－１の共局在の分析を、フルオロフォア標識ＭＡｂを使用して行った。この分析によって、ＰＤ－１とは異なり、ＣＤ３及びＣＤ４８がＣＴにより誘導されたキャッピング内で容易に観察されることが示された。周囲長の定量化では、より小さな周囲長の値がキャッピングと相関し、活性化後にＣＤ４８のキャッピングが明らかであるが、しかし、ＣＤ３よりもわずかに少ないことが明らかになった。対照的に、ＰＤ－１は通常、ＣＴと共局在しなかったが、ＰＤ－１が、脂質ラフトに富むＩＳに動員されるために、活性な過程（例、ＰＤＬ－１との相互作用）を要求するという仮説と一致している（Yokosuka et al.,2012）。
脂質ラフト中へのＣＤ４８の存在及びＳｒｃキナーゼ（Ｔ細胞のＬｃｋ）との構成的会合によって、ＣＤ３と同様に、ＣＤ４８とＰＤ－１の近似が ＰＤ－１活性化／リン酸化を誘導するという仮説を本発明者らは立てることが可能であった。なぜなら、ＰＤ－１活性化のための基準機構が、ＰＤ－１の細胞内ＩＴＳＭ及びＩＴＩＭドメインのＬｃｋ媒介性リン酸化を要求するからである（Chemnitz et al.,2004；Parry et al.,2005；Sheppard et al.,2004）。この仮説をテストするために、カスタマイズされたＪｕｒｋａｔ細胞株を、ｂガラクトシダーゼ（ＰＫ）の１つの半分を伴うヒトＰＤ－１融合タンパク質（ＰＫ）、及びｂガラクトシダーゼの相補的な半分を伴うサイトゾル全長ＳＨＰ１融合タンパク質（ＥＡ）を発現するように生成した。ＰＤ－１活性化を、このように、リン酸化ＰＤ１へのＳＨＰ１の動員に起因する ＰＫ／ＥＡ相補性の機能として測定し、それによって機能的なｂガラクトシダーゼが産生される。これらの細胞におけるＰＤ－１、ＣＤ４８、及びＣＤ３の発現を確認した後、実験を設定し、架橋時にＰＤ－１活性化を誘導する、ＣＤ４８に対する ＭＡｂの潜在能を評価した（図５）。ＰＤ－１活性化は、ＰＤ－１ＭＡｂ又はＦｃ特異的二次Ｆ（ａｂ’）２抗体の非存在において誘導されなかった。二次抗体との架橋によって、ＰＤ－１活性化が約３倍だけ誘導された；しかし、ＣＤ４８又はＣＤ３ Ｍａｂの存在において、ＰＤ－１活性化が約９倍だけ増強され、ＣＤ４８又はＣＤ３とＰＤ－１との密接な会合が、ＰＤ－１活性化を増強させることができることを示している。自己架橋により誘導される低レベルのＰＤ－１活性化は驚くべきことではなかった。なぜなら、試験によって、Ｌｃｋの小さな分画が、Ｔ細胞におけるＰＤ－１と構成的に会合していることが実証されているためである（Sheppard et al.,2004）。
ＰＤ－１のＣＤ４８依存性活性化は、Ｓｒｃキナーゼ活性を要求する。ＣＤ４８によるＰＤ－１活性化／リン酸化の増強が、Ｓｒｃキナーゼ活性に依存的であるか否かを決定するために、架橋実験を、ｐａｎ－Ｓｒｃ キナーゼ阻害剤 ＰＰ２又は不活性類似体 ＰＰ３の存在において行った。Ｓｒｃ－キナーゼ阻害によって、ＣＤ４８との自己架橋又は共架橋時のＰＤ－１活性化が抑止されたが、Ｌｃｋ活性がＰＤ－１活性化のために要求されることを示している。この概念をさらに検証するために、ＰＤ－１活性化を、ＣＤ７１（脂質ラフト中に移行せず、Ｓｒｃ－キナーゼと結合しない受容体（Schatzlmaier et al.,2015））に対する抗体の存在において最適量以下の抗ＰＤ－１でＰＤ－１を架橋することにより評価した。ＰＤ－１とＣＤ７１の架橋はＰＤ－１活性化をもたらさず、活性化されたＳｒｃ キナーゼに富む環境へのＰＤ－１の転座によって、ＰＤ－１リン酸化及び活性化が可能になるという知見を裏付けている。
ＣＤ４８依存性ＰＤ－１活性化は、初代ヒトＴ細胞のＡＲ誘導性増殖を鈍らせる。Ｔ細胞機能を調節するＣＤ４８依存性ＰＤ－１活性化の能力を機能的に評価するために、磁気ビーズをＣＤ４８、ＰＤ－１ＭＡｂ、及びアイソタイプコントロールで共有結合的に共コーティングし、プレート結合抗ＣＤ３で刺激された初代ヒトＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）でテストした。最初に、本発明者らは、活性化前のヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ リンパ球における ＣＤ４８及びＰＤ－１の発現を確認した。細胞活性化に対するコーティングビーズの効果を評価するために、ヒト汎－Ｔ細胞をCellTrace-Violetで標識し、次にＣＤ３ ＭＡｂで活性化し、細胞増殖をCellTraceの希釈により分析した（図６）。図６中に示すように、ＣＤ４８及びＰＤ－１ＭＡｂの両方でコーティングされたビーズは、ＣＤ４８又はＰＤ－１ＭＡｂ単独でコーティングされたビーズで処理された細胞と比べて、Ｔ細胞増殖を有意に低下させることができ、阻害効果は、ＣＤ８＋細胞よりもＣＤ４＋でより有意であった。追加のコントロールとして、本発明者らは、ＰＤ－１及びＣＤ１１ａ Ｍａｂで共コーティングされたビーズもテストした；後者は、ＣＤ１１ａが構成的に脂質ラフト常在タンパク質ではないという前提で選択された。予想通り、ＰＤ－１は、ＣＤ１１ａとの動員時に阻害機能を有さなかった。これらの結果は、脂質ラフト常在分子（即ち、ＣＤ４８）による ＰＤ－１活性化が、ＰＤ－１を効果的に活性化し、Ｔ細胞増殖を阻害することができるという仮説をさらに裏付ける。
ＰＤ－１及びＣＤ４８に対する二重特異性抗体は、ＰＤ－１活性化を誘導し、ＡＲ 刺激されたヒトＴ細胞におけるサイトカイン分泌及びＮＦＡＴ活性化を調節する。別々のモノクローナル抗体でコーティングされたビーズを使用して得られた結果によって、ＣＤ４８を用いたＰＤ－１の分子局在化が、活性化ヒトＴ細胞に対して阻害シグナルを提供するという仮説をテストするために、本発明者らが二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を生成するように促された（図７）。公開された抗体が生成され（特許出願 ＷＯ２０１１／１１０６２１Ａｌからのアゴニスト抗ＰＤ－１抗体）、及びＵＳ２０１２／００７６７９０ からの抗ＣＤ４８ Ａｂ）、ＢｓＡｂをノブ又はホールの単一の重鎖／軽鎖コンストラクトとして操作し、ＢｓＡｂを含む抗ＰＤ－１及び抗ＣＤ４８（ＰＤ－１／ＣＤ４８）、又はコントロールとしての抗ＰＤ－１及び抗ＴＮＰ（ＰＤ－１／ＩＳＯ）を生成した（図７Ａ）。ＰＤ－１又はＣＤ４８への各々のアームの結合が、ＰＤ－１及びＣＤ４８の両方の結合を検出するために ＰＤ－１を過剰発現する、又はＣＤ４８ 結合だけを検出するために ＰＤ－１発現を欠くＪｕｒｋａｔ細胞でのフローサイトメトリーにより実証された（図７Ｂ）。上に記載するＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１相補性アッセイ系を使用し、本発明者らは、ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂが、ＰＤ－１／ＩＳＯコントロールよりも約３ 倍強力にＰＤ－１活性化を誘導することを実証し、このＢｓＡｂフォーマットを使用したＰＤ－１／ＣＤ４８共局在化が、増強されたＰＤ－１リン酸化ももたらすことを確認した（図６）。ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂの機能的効果を評価するために、ヒト記憶ＣＤ４＋ Ｔ（ＰＤ１＋）細胞を、プレート結合ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂ又はコントロール抗体の存在において、プレート結合抗ＣＤ３ｅで刺激し、サイトカイン分泌について分析した（図７Ｃ）。この分析によって、ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂの免疫調節効果が明らかになった。なぜなら、それによって、炎症性サイトカインＩＬ２の分泌を有意に低下させたが、しかし、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の産生を増強したためである。ＩＬ－２分泌はＮＦＡＴ転写活性化を要求するため（Chow et al., 1999）、ＮＦＡＴ活性化に対する ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂの効果を、ＰＤ－１及びＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターの両方を発現し、共刺激のためにＴＨＰ－１細胞の存在において抗ＣＤ３ｅで活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において評価した。この分析によって、ＰＤ－１／ＣＤ４８ ＢｓＡｂが、コントロール抗体よりもＮＦＡＴレポーターを＞１０－３０%低下させることができたことが示され、ＰＤ－１のＣＤ４８依存性活性化がまた、ＩＬ－２産生に導く、重要なＴ細胞エフェクター転写事象を阻害することを示す。

Claims (35)

  1. 配列番号４３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号４３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号４７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号４８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号５０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号５３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号５６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号５７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号５９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号１８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号６２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号６５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号６７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号２２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号６８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号６９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号２５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号２６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号５８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号２８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号２９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号８０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３３のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号８３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号８６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号８７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号８８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号８９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号９０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号９１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号４０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号４１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号４２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７４のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号３０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６４のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号３１のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６６のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号７３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）；配列番号７９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）；及び配列番号７７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号１６５のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）；配列番号１６７のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）；及び配列番号３２のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－１抗体又は抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１又は２に記載の抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号１０８及び配列番号９２；それぞれ配列番号１０９及び配列番号９３；それぞれ配列番号１１０及び配列番号９４；それぞれ配列番号１１１及び配列番号９５；それぞれ配列番号１１２及び配列番号９６；それぞれ配列番号１１３及び配列番号９７；それぞれ配列番号１１４及び配列番号９８；それぞれ配列番号１１５及び配列番号９９；それぞれ配列番号１１６及び配列番号１００；それぞれ配列番号１１７及び配列番号１０１；それぞれ配列番号１１８及び配列番号１０２；それぞれ配列番号１１９及び配列番号１０３；それぞれ配列番号１２０及び配列番号１０４；それぞれ配列番号１２１及び配列番号１０５；それぞれ配列番号１２２及び配列番号１０６；それぞれ配列番号１２３及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、又は配列番号１３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２５、配列番号１２７、又は配列番号１２９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号１３１及び配列番号１２５；それぞれ配列番号１３３及び配列番号１２７；それぞれ配列番号１３５及び配列番号１２７；それぞれ配列番号１３７及び配列番号１２９；又はそれぞれ配列番号１３９及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号１３１及び配列番号１２５；それぞれ配列番号１３３及び配列番号１２７；それぞれ配列番号１３５及び配列番号１２７；それぞれ配列番号１３７及び配列番号１２９；それぞれ配列番号１３９及び配列番号１２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、又は少なくとも９９%の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗ＰＤ１抗体。
  10. 前記重鎖定常領域が、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を伴うＩｇＧ４の重鎖定常領域である、請求項９に記載の抗ＰＤ１抗体。
  11. 前記重鎖定常領域がＩｇＧ１の重鎖定常領域である、請求項９に記載の抗ＰＤ１抗体。
  12. 前記重鎖定常領域が、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を伴うＩｇＧ１の重鎖定常領域である、請求項９に記載の抗ＰＤ１抗体。
  13. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、カッパ及びラムダからなる群より選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  14. 前記抗体が、それぞれ配列番号１４３及び配列番号１４１；それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４５；それぞれ配列番号１４９及び配列番号１４５；それぞれ配列番号１５３及び配列番号１５１；又は配列番号１５５及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－１抗体。
  15. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項５から１４のいずれか一項に記載のＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
  17. 医薬品としての使用のための、請求項１～１６のいずれかに記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  18. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＰＤ－１経路障害を処置する方法。
  19. ＰＤ－１経路障害の処置する際での使用のための、請求項１～１６のいずれかに記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  20. ＰＤ－１経路障害を処置するための医薬品の製造における、請求項１～１６のいずれかに記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
  21. 前記疾患が、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び炎症性腸疾患からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法、請求項１９に記載の使用のための抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント、あるいは請求項２０に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
  22. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、投与の非経口経路、静脈内経路、又は皮下経路により投与される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法、使用のための抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメント、あるいは使用。
  23. 請求項５～７のいずれか一項に記載の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする単離ポリヌクレオチド。
  24. 請求項１４に記載の重鎖及び／又は軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチド。
  25. 請求項２３又は２４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  26. 請求項２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  27. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. － 請求項５～７のいずれか一項に記載の重鎖可変領域をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項５～７のいずれか一項に記載の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体の形成を可能にする条件下で培養すること、ならびに
    － 前記抗体を回収することの工程を含む、抗体を製造する方法。
  29. － 請求項１４に記載の重鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項１４に記載の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体の形成を可能にする条件下で培養すること、ならびに
    － 前記抗体を回収することの工程を含む、抗体を製造する方法。
  30. 前記抗体を精製する工程をさらに含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. 前記抗体を医薬組成物中に製剤化する工程をさらに含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
  32. 第１の抗ＰＤ－１アゴニスト抗原結合部位及び第２の抗原結合部位を含む多重特異性抗体。
  33. 前記第２の抗原結合部位が、抗ＣＤ４８結合部位、抗ＣＤ－２結合部位、抗ＣＤ１１ａ結合部位、又は抗ＣＤ３結合部位である、請求項３２に記載の多重特異性抗体。
  34. 前記第１の抗ＰＤ－１アゴニスト抗原結合部位が、請求項１～８のいずれか一項に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の多重特異性抗体。
  35. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
JP2022572362A 2020-05-26 2021-05-24 抗ｐｄ－１抗体 Pending JP2023528778A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063029962P 2020-05-26 2020-05-26
US63/029,962 2020-05-26
US202063039686P 2020-06-16 2020-06-16
US63/039,686 2020-06-16
PCT/US2021/033823 WO2021242663A1 (en) 2020-05-26 2021-05-24 Anti-pd-1 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023528778A true JP2023528778A (ja) 2023-07-06
JPWO2021242663A5 JPWO2021242663A5 (ja) 2024-02-02

Family

ID=76808128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022572362A Pending JP2023528778A (ja) 2020-05-26 2021-05-24 抗ｐｄ－１抗体

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20210380696A1 (ja)
EP (1) EP4157876A1 (ja)
JP (1) JP2023528778A (ja)
KR (1) KR20230015997A (ja)
CN (1) CN115956087A (ja)
AU (1) AU2021280232A1 (ja)
BR (1) BR112022023989A2 (ja)
CA (1) CA3181776A1 (ja)
CL (1) CL2022003304A1 (ja)
CO (1) CO2022018416A2 (ja)
CR (1) CR20220596A (ja)
DO (1) DOP2022000264A (ja)
EC (1) ECSP22092185A (ja)
IL (1) IL298431A (ja)
MX (1) MX2022014974A (ja)
PE (1) PE20231076A1 (ja)
TW (1) TW202216765A (ja)
WO (1) WO2021242663A1 (ja)

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
DK2658970T3 (en) 2010-12-31 2017-01-16 Bioatla Llc Express humanization of antibodies
AR106184A1 (es) 2015-09-29 2017-12-20 Celgene Corp Proteínas de unión a pd-1 y sus métodos de uso
WO2017189964A2 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US10995149B2 (en) 2017-06-05 2021-05-04 Janssen Biotech, Inc. Antibodies that specifically bind PD-1 and methods of use
TWI708787B (zh) 2018-03-02 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 Pd-1促效劑抗體及其用途
CN114364697A (zh) 2019-06-05 2022-04-15 安奈普泰斯生物有限公司 Pd-1激动剂和其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CR20220596A (es) 2023-01-23
MX2022014974A (es) 2023-01-11
BR112022023989A2 (pt) 2023-02-07
IL298431A (en) 2023-01-01
CL2022003304A1 (es) 2023-04-14
WO2021242663A1 (en) 2021-12-02
PE20231076A1 (es) 2023-07-17
KR20230015997A (ko) 2023-01-31
EP4157876A1 (en) 2023-04-05
DOP2022000264A (es) 2023-01-31
CA3181776A1 (en) 2021-12-02
ECSP22092185A (es) 2023-01-31
AU2021280232A1 (en) 2022-12-15
US20210380696A1 (en) 2021-12-09
CN115956087A (zh) 2023-04-11
CO2022018416A2 (es) 2022-12-30
TW202216765A (zh) 2022-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210171648A1 (en) Antibodies and methods of use thereof
US20210284739A1 (en) Anti-cd74 antibodies, compositions comprising anti-cd74 antibodies and methods of using anti-cd74 antibodies
JP7000476B2 (ja) 炎症性疾患の処置法
KR20220007128A (ko) 항-ｓｅｍａ３ａ 항체 및 눈 또는 안구 질환 치료를 위한 이의 용도
JP2018519832A (ja) 多重特異的結合タンパク質
US11542329B2 (en) Antibodies targeting Glycoprotein VI
US20220363743A1 (en) Anti-angpt2 antibodies
AU2022229993A1 (en) Pharmaceutical composition containing anti-tslp antibody
US20210380696A1 (en) Anti-pd-1 antibodies
US11739142B2 (en) Bispecific anti-CCL2 antibodies
WO2023237928A2 (en) Igf1r antibodies
EA046375B1 (ru) Способ лечения воспалительных заболеваний

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240125

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240125

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20240125

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240213

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240513