KR20220007128A - 항-ｓｅｍａ３ａ 항체 및 눈 또는 안구 질환 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

항-ｓｅｍａ３ａ 항체 및 눈 또는 안구 질환 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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사티아데비 벤카타라마니
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Abstract

본 발명은 세마포린 3A(Sema3A)를 표적으로 하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항-Sema3A 항체 및 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위한 사용 방법이 개시된다.

Description

항-ＳＥＭＡ３Ａ 항체 및 눈 또는 안구 질환 치료를 위한 이의 용도
본 발명은 일반적으로 세마포린 3A(Sema3A)를 표적으로 하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항-Sema3A 항체 및 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위한 사용 방법이 개시되어 있다. 항-Sema3A 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 개시되어 있다.
허혈성 망막병증은 혈류의 감소 및 저산소증을 초래하는 망막 혈관계의 손실 또는 기능 장애를 특징으로 한다. 망막의 허혈은 실명으로 이어질 수 있는 망막 신혈관화(neovascularization)를 촉진하는 혈관신생 촉진 성장 인자의 상향-조절을 초래한다. 그러나, 허혈성 망막의 혈관재생(revascularization)은 통상적으로 혈관이 없는 눈의 영역인 유리체로의 강력한 병리학적 신혈관화가 있을 때에는 발생하지 않는다.
이러한 비정상적인 새로운 혈관의 성장은 누출, 출혈로 이어지거나 망막 박리로 끝날 수 있는 흉터로 이어질 수 있기 때문에 시력에 대한 위협의 대부분을 생성한다. 허혈성 망막병증에 대한 현재의 치료법은 병리학적 혈관의 성장을 중단시키는 것을 추구하지만 이들의 성장을 유도하는 근본적인 허혈은 해결하지 못한다. 또한, 당뇨병성 망막병증에 대한 표준 치료는 새로운 혈관 성장을 막고 중심 시력을 보존하기 위해 레이저로 망막의 일부를 파괴하는 것을 포함한다. 그러나 이러한 치료법은 어느 정도 비효율적이다. 일부 환자는 다년간 안정적인 시력을 유지할 수 있지만 망막병증을 앓고 있는 환자의 높은 비율은 결국 완전한 시력 상실로 고통받는다.
결과적으로, 눈 또는 망막 질환을 효율적으로 치료하기 위한 신규한 치료 접근법에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다.
Sema3A는 클래스 3 세마포린 계열(Sema3)에 속하는 내인성 분비 단백질이며, 이것은 원래 축삭 유도 분자로 식별되었으며 혈관 경로탐색 및 망상구조 형성과 관련되었다. 뉴로필린 1 및 2(Nrp1 및 Nrp2) 및 타입 A/D 플렉신(Plxns)은 내피 세포(EC) 표면 상의 Sema3 수용체 복합체의 리간드 결합 및 신호 전달 서브유닛으로 작용한다. Sema3 계열의 특별한 구성원으로서 Sema3A는 처음에는 Nrp1에만 결합한 다음 플렉신A1-4와 복합체(Nrp1/PlexA1-4)로서 조합된다. 이러한 수용체 복합체에서, Nrp1은 결합 요소로서 작용하는 반면 PlexA1-4는 신호 전달 요소로서 작용한다.
인간 세마포린 3A는 서열번호 22에 개시되어 있고 NCBI 참조 서열 NP_006071.1 하에 이용 가능한 단백질이다. 또한, 인간 Sema3A는 유전자 ID: 10371(NCBI)에 의해 암호화된다.
Sema3A는 수년 동안 종양 혈관신생 및 전이에 대해 연구되었지만 망막 신혈관화에 미치는 영향은 여전히 불분명하다. 본 발명자들은 세마포린 3A가 저산소성 망막 신경절 세포에 의해 분비되고 혈관반발 신호(vasorepulsive cue)로 작용한다는 것을 예시하였다. Sema3A는 이러한 세포에서 세포골격 붕괴를 유도함으로써 허혈성 영역에서 신생혈관을 격퇴한다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 본 발명자들은 이것이 허혈성 영역의 혈관재생이 일어나지 않고 대신에 Sema3A의 상향조절이 유리체 영역으로의 병리학적 신혈관화를 유도하는 이유를 설명할 것이라는 가설을 세웠다.
세마포린 3A는 허혈성/무혈관성 망막에서 저산소성 뉴런에 의해 분비되어 망막의 혈관 재생을 억제하고 병리학적 망막앞 신혈관화를 강화시킨다.
본 발명자들은 Sema3A를 표적으로 하는 항체를 개발함으로써 이러한 병리학적 상황을 해결하였다. 따라서, 본 발명은 Sema3A, 바람직하게는 인간 Sema3A에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기서:
- 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하고;
- 경쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a. 각각 서열번호 7 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
b. 각각 서열번호 8 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
c. 각각 서열번호 9 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
d. 각각 서열번호 10 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 중쇄; 및
- 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 경쇄.
특정 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
d. 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
특히 바람직한 양태에서, 항-Sema3A 항체는 인간화 항-Sema3A 항체이다.
제2 측면에서, 본 발명은 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 인간 Sema3A의 아미노산 영역 370-382 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 21 (DSTKDLPDDVITF)에 제시된 바와 같은 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 영역에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 SemaA의 혈관억제 효과(vasorepressive effect)를 억제하고/하거나 망막의 혈관재생을 개선하기 위한 항-Sema3A 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 망막 또는 눈 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 동맥 폐쇄, 내안구염, 포도막염, 낭포성 황반 부종, 망막 질환에 따른 맥락막 신생 혈관 막, 시신경병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유도성 망막 혈관병증, 망막 신혈관화, 폴립성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세동맥류, 푹스 각막이상증(Fuch's dystrophy), 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군(usher syndrome) 및 스타가르트병(Stargardt disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신혈관화, 녹내장 및 맥락막 신혈관화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 바람직하게는, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 허혈성 망막 내 혈관 재생(혈관재생)을 촉진하고 눈의 유리체 영역의 병리학적 신혈관화를 방지함으로써, 당뇨병성 황반 허혈의 치료에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시킴으로써, 당뇨병성 황반 부종의 치료에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 혈액 망막 장벽의 Sema3A 유도된 투과성 및/또는 허혈성 영역의 Sema3A 유도된 혈관퇴행(vasoregression)을 억제하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비경구 경로, 정맥내 경로, 유리체내 경로 또는 피하 투여 경로, 바람직하게는 유리체내 경로에 의해 투여된다.
제6 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 제공한다:
- 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및
- 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1: 인간의 눈에서 Sema3A의 국소화.
당해 도면은 당뇨병성 망막병증 또는 원발성 개방각 녹내장(POAG)의 병력이 있는 인간 기증자로부터의 사전지정된 망막 샘플에서 인간 눈의 Sema3A의 국소화를 연령 일치 대조군(Age ctrl) 및 당뇨병은 있지만 안구 병리는 없는 대상체(DM ctrl)와 비교하여 보여준다. Sema3A는 망막 혈관의 혈관벽에서 발견되었다. 또한, 망막 신경절 세포층에서 정체불명의 독특한 Sema3A 형광 물체가 관찰되었다.
도 2: 세포 투과성 분석에서의 효능.
인간 망막 미세혈관 내피 세포에서 FITC-덱스트란의 투과는 트랜스웰 분석으로 측정된다. 항-TNP는 트리니트로페놀에 대한 대조 항체이다. 항-Sema3A는 본 발명에 따른 항체(클론 I)이다. 재조합 인간 Sema3A에 비한 유의도가 표시된다.
도 3: HRMEC(Xcelligence)의 세포골격 붕괴.
Sema3A-F는 모두 인간 망막 내피 세포에서 세포골격 붕괴를 유도한다. 본 발명의 항체(클론 I)는 Sema3A에 특이적이며 Sema3A-유도 붕괴만을 방지한다.
도 4: 생체내 정단 세포 밀도 및 무혈관 영역에 대한 효능.
(A) 및 (C) 정단 세포 밀도 및 무혈관 영역은 마우스 새끼의 산소-유도 망막병증 모델에서 조사되었다. 동물은 P7에서 P12까지 75% 산소에 노출되었으며 P12에 정상산소 상태로 돌아온 후 항체의 단일 유리체내 주사를 제공받았다. 항-TNP는 트리니트로페놀에 대한 대조 항체이다. 항-Sema3A는 본 발명에 따른 항체(클론 I)이다. P17에서, 망막 플랫마운트를 준비하고, 이소렉틴 B4로 염색하여 정단 세포의 계수 및 망막 무혈관 영역의 크기 결정에 사용하였다.
(B) 정단 세포 밀도와 무혈관 영역 사이의 상관 관계가 표시된다.
정의
항체 또는 면역글로불린의 일반화된 구조는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 이들 분자는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 전형적으로 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 중쇄에 공유적으로 연결되어 이종이량체를 형성하고, 이종삼량체 분자는 이종이량체의 동일한 2개의 중쇄 사이에 공유 이황화 결합을 통해 형성된다. 경쇄와 중쇄가 하나의 이황화 결합으로 연결되어 있지만, 두 중쇄 사이의 이황화 결합의 수는 면역글로불린 이소형에 따라 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄내 이황화 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노-말단에 가변 도메인(VH = 가변 중쇄)에 이어 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4) 뿐만 아니라 CH1과 CH2 사이의 힌지를 갖는다. 각각의 경쇄는 두 개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(VL = 가변 경쇄) 및 카복시-말단 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL 도메인은 VH 도메인과 비공유적으로 결합하는 반면 CL 도메인은 일반적으로 이황화 결합을 통해 CH1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다(Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.)
가변 도메인 내의 특정 도메인은 상이한 항체 간에 광범위하게 다르며, 즉, "초가변성"이다. 이러한 초가변 도메인은 특이 항원 결정기에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관여하는 잔기를 함유한다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변성은 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 루프(HVL)로 알려진 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. CDR은 카바트(Kabat) 등(문헌 참조; Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)의 서열 비교에 의해 정의된 반면 HVL은 Chothia 및 Lesk(문헌 참조; 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917)에 의해 기술된 바와 같이 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 구조적으로 정의된다. 이러한 두 가지 방법이 CDR의 약간 상이한 식별을 초래하는 경우, 구조적 정의가 선호된다. 카바트에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서 CDR-L1은 약 잔기 24-34에, CDR-L2는 약 잔기 50-56에, CDR-L3은 약 잔기 89-97에 위치하고; 중쇄 가변 도메인에서 CDR-H1은 약 잔기 31-35에, CDR-H2는 약 잔기 50-65에, CDR-H3은 약 잔기 95-102에 위치한다. 따라서 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 주어진 항체에 특이적인 고유하고 기능적인 특성을 정의한다.
각각의 중쇄 및 경쇄 내의 3개의 CDR은 덜 가변적인 경향이 있는 서열을 함유하는 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단에서 카복시 말단까지, FR 및 CDR이 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. FR의 대개 β-시트 구성은 각 사슬 내의 CDR을 다른 사슬의 CDR 뿐만 아니라 서로에 대해서도 매우 근접하게 만든다. 생성된 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만(참조; Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), 모든 CDR 잔기가 항원 결합에 반드시 직접적으로 관여하는 것은 아니다.
FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 효과기 기능을 매개한다. 일부 FR 잔기는 적어도 세 가지 방식으로 항원 결합에 중요한 영향을 미치는 것으로 생각된다: 에피토프에 직접 비공유 결합함으로써, 하나 이상의 CDR 잔기와 상호작용함으로써, 및 중쇄와 경쇄 사이의 계면에 영향을 미침으로써. 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 항체 의존성 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 Ig 효과기 기능을 매개한다.
척추동물 면역글로불린의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 두 개의 명확하게 구별되는 클래스, 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정된다. 이에 비해, 포유류 면역글로불린의 중쇄는 불변 도메인의 서열에 따라 다섯 가지 주요 클래스 중 하나로 지정된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. IgG 및 IgA는 서브클래스(이소형), 예를 들어, 각각 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 나뉜다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라고 한다. 천연 면역글로불린 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.
용어 "항체", "항-Sema3A 항체", "인간화 항-Sema3A 항체" 및 "변이체 인간화 항-Sema3A 항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다중특이 항체(예를 들어, 이중특이 항체), 및 원하는 생물학적 활성, 예를 들어 Sema3A에 대한 결합을 나타내는 항체의 가변 도메인 및 기타 부분과 같은 항체 단편을 포함한다.
용어 "단클론 항체"(mAb)는 실질적으로 균일한 항체 집단의 항체를 지칭하며; 즉, 그 집단의 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 결정기, "에피토프"에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론"은 동일한 에피토프에 대해 지시된 항체의 실질적으로 균일한 집단을 나타내며 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법(Kohler et al., 1975, Nature 256:495), 또는 당업계에 알려진 재조합 DNA 방법(예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조), 또는 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기술된 방법을 사용한 파지 항체 라이브러리를 사용하여 재조합적으로 생산된 단클론의 단리 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 기술 또는 방법론에 의해 제조될 수 있음을 이해해야 한다.
키메라 항체는 하나의 종(예를 들어, 마우스와 같은 비인간 포유동물)으로부터의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 다른 종(예를 들어, 인간) 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 구성되며 첫 번째 종(예를 들어, 마우스)으로부터의 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 두 번째(예를 들어 인간) 종으로부터의 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결하고 키메라 항체를 생산할 수 있도록 숙주를 연결된 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 키메라 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이 다른 면역글로불린 클래스 또는 이소형으로부터 또는 컨센서스 또는 생식계열 서열로부터의 단클론 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나, 상동성이거나, 변이체일 수 있다. 키메라 항체는 항체 단편이 예를 들면 동일한 에피토프에 대한 결합과 같은 모 항체의 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함할 수 있다(예를 들면, 참조; 미국 특허 제4,816,567호; and Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
용어 "항체 단편", "항원 결합 단편", "항-Sema3A 항체 단편", "인간화 항-Sema3A 항체 단편", "변이체 인간화 항-Sema3A 항체 단편"은 가변 영역 또는 기능적 능력, 예를 들면 특이 Sema3A 에피토프 결합이 유지되는 전장 항-Sema3A 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
전장 항체는 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리하여 유용한 항체 단편을 생성할 수 있다. 파파인 소화는 각각이 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 하는 두 개의 동일한 항원 결합 항체 단편, 및 잔류 "Fc" 단편을 생성하는데 사용된다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
Fab' 단편은 CH1 도메인의 C-말단에서 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가 잔기의 존재에 의해 Fab 단편과는 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
"Fv" 단편은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유한다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv 변이체이다. 단일쇄 Fv는 항원을 인식하고 결합할 수 있다. scFv 폴리펩티드는 임의로 또한 scFv에 의한 항원 결합을 위한 원하는 3차원 구조의 형성을 용이하게 하기 위해 VH 및 VL 도메인 사이에 위치한 폴리펩티드 링커를 함유할 수 있다(예를 들어, 참조; Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).
다른 인식된 항체 단편은 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하기 위해 한 쌍의 탠덤 Fd 단편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 것들을 포함한다. 이러한 "선형 항체"는, 예를 들면, 문헌[Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기술된 바와 같이 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
인간화 항체 또는 인간화 항체 단편은 미리 결정된 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 실질적으로 비인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 아미노산 서열 변이체를 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. 종종 "임포트" 서열이라고 하는 이러한 비인간 아미노산 서열은 전형적으로 "임포트" 항체 도메인, 특히 가변 도메인에서 취해진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 비인간 항체의 CDR 또는 HVL을 포함한다.
본 발명은 인간 생식계열 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 뮤린 또는 키메라 항체로부터 유래된 CDR을 함유하는 특이 인간화 항-Sema3A 항체를 기술한다. 특정 뮤린 FR 잔기는 인간화 항체의 기능에 중요할 수 있고 따라서 특정 인간 생식계열 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기가 상응하는 뮤린 서열의 것과 동일하도록 변형되는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 표현 "본 발명의 항체" 및 "본 발명의 항-Sema3A 항체"는 본원에 기술된 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 바람직하게는 상기 표현은 서열번호 1의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.
하나의 측면에서, 인간화 항-Sema3A 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv 단편에 함유된 것과 같은)을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고, 본원에서 구체적으로, CDR은 뮤린 서열이고, FR은 인간 면역글로불린 컨센서스 또는 생식계열 서열이다. 또 다른 측면에서, 인간화 항-Sema3A 항체는 또한 면역글로불린 Fc 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함한다. 대개, 항체는 경쇄 뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다를 함유할 것이다. 항체는 또한 적절한 경우 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
인간화 항-Sema3A 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 면역글로불린의 임의의 클래스, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함한 임의의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 도메인은 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내는 것이 요구되는 경우 보체 고정 불변 도메인일 수 있고, 이소형은 전형적으로 IgG1이다. 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 불변 도메인은 다른 이소형, 예를 들어, IgG2일 수 있다. 대안적인 인간화 항-Sema3A 항체는 하나 이상의 면역글로불린 클래스 또는 이소형으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 원하는 효과기 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 당업계의 통상의 기술 내에 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 IgG1 항체, 보다 특히 감소된 효과기 기능을 특징으로 하는 IgG1 항체인 항체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 IgG1KO로 포맷된 인간화 항체이다.
인간화 항-Sema3A 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모 서열에 정확히 상응할 필요는 없다. 예를 들면, 임포트 CDR 또는 HVL의 하나 이상의 잔기, 또는 컨센서스 또는 생식계열 FR 서열은 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변경(예를 들어, 돌연변이)되어 생성된 아미노산 잔기가 어느 한 부모 서열에서 상응하는 위치에 있는 원래의 잔기와 더 이상 동일하지 않지만, 그럼에도 불구하고 항체는 Sema3A에 대한 결합 기능을 유지한다. 이러한 변경은 전형적으로 광범위하지 않으며 보존적 변경이 될 것이다. 통상적으로, 인간화 항체 잔기의 적어도 75%, 보다 자주 적어도 90%, 가장 빈번하게는 95% 초과, 또는 98% 초과 또는 99% 초과는 부모 컨센서스 또는 생식계열 FR 및 임포트 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 사이의 계면("VL-VH 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는 서로에 대한 두 사슬의 근접성 또는 배향에 영향을 주는 것들이다. 사슬간 상호작용에 관여할 수 있는 특정 잔기는 VL 잔기 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, 및 98과 VH 잔기 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, 및 103을 포함한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)]에 제시된 번호매김 시스템 사용). 미국 특허 제6,407,213호는 또한 VL 잔기 43 및 85와 VH 잔기 43 및 60과 같은 잔기가 또한 이러한 상호작용에 관여할 수 있음을 논의한다. 이러한 잔기는 인간 IgG에 대해서만 표시되지만, 종에 걸쳐 적용 가능하다. 사슬간 상호작용에 관여할 것으로 합리적으로 예상되는 중요한 항체 잔기가 컨센서스 서열로의 치환을 위해 선택된다.
용어 "컨센서스 서열" 및 "컨센서스 항체"는 임의의 특정 클래스, 이소형 또는 서브유닛 구조의 모든 면역글로불린, 예를 들어 인간 면역글로불린 가변 도메인의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 컨센서스 서열은 특정 종의 면역글로불린 또는 다수 종의 면역글로불린을 기반으로 할 수 있다. "컨센서스" 서열, 구조, 또는 항체는 특정 양태에 기술된 바와 같은 컨센서스 인간 서열을 포함하고, 임의의 특정 클래스, 이소형 또는 서브유닛 구조의 모든 인간 면역글로불린의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 컨센서스 서열은 하나 이상의 알려진 면역글로불린에 존재하지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체를 정확하게 복제하지 않을 수 있는 아미노산을 각 위치에 포함하는 아미노산 서열을 함유한다. 가변 영역 컨센서스 서열은 자연적으로 생성된 항체 또는 면역글로불린(참조; Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), 및 이의 변이체로부터 수득되지 않는다. 중쇄 및 경쇄 컨센서스 서열의 FR, 및 이의 변이체는 인간화 항-Sema3A 항체의 제조에 유용한 서열을 제공한다. 예를 들면, 미국 특허 제6,037,454호 및 제6,054,297호를 참조한다.
인간 생식계열 서열은 인간 집단에서 자연적으로 발견된다. 이러한 생식계열 유전자의 조합은 항체 다양성을 생성한다. 항체의 경쇄에 대한 생식계열 항체 서열은 보존된 인간 생식계열 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자에서 유래한다. 유사하게, 중쇄 서열은 생식계열 v-, d- 및 j-유전자에서 유래한다(LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 항체의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 또는 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있다. 하나의 측면에서, 항체는 항체의 중량을 기준으로 적어도 95% 초과의 단리도로 정제될 것이다.
용어 "항체 성능"은 항원의 항체 인식 또는 생체내 항체의 유효성에 기여하는 인자/특성을 지칭한다. 바람직한 양태에서, 이것은 망막 세포에서 세포골격 붕괴를 방지하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체의 아미노산 서열의 변화는 접힘(folding)과 같은 항체 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 항원에 대한 항체 결합의 초기 속도(ka), 항원으로부터의 항체의 해리 상수(kd), 항원에 대한 항체의 친화 상수(Kd), 항체의 형태, 단백질 안정성, 및 항체의 반감기와 같은 물리적 요인에 영향을 미칠 수 있다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "동일한" 또는 "동일성 퍼센트"는, 최대 일치성(maximum correspondence)을 위해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 지정된 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬한다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 그후 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성=동일한 위치의 #/위치의 총 #(예를 들어, 중첩 위치)x100). 일부 양태에서, 비교되는 2개의 서열은 적절한 경우 서열 내에 갭이 도입된 후 동일한 길이이다(예를 들어, 비교되는 서열을 능가하여 확장하는 추가 서열 제외). 예를 들면, 가변 영역 서열을 비교할 때, 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열 사이의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 서열 둘 다(예를 들어, 각 서열의 CDR-H1)에서 동일한 위치에 있는 CDR을 지칭한다.
두 서열 사이의 동일성 퍼센트 또는 유사성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적 예는 Karlin과 Altschul의 알고리즘이다(참조; Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). 이러한 알고리즘은 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다(참조; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410). BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이=12로 수행하여, 관심 단백질을 암호화하는 핵산과 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3으로 수행하여, 관심 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 수득하기 위해, 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast는 분자(Id.) 간의 원연 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 기본 매개변수(예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)가 사용될 수 있다. 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘이다(참조; Myers and Miller, CABIOS (1989)). 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 가중 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12, 갭 페널티 4가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가 알고리즘은 당업계에 알려져 있으며 문헌(Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5)에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌(Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8)에 기술된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 감도와 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup=2인 경우, 비교되는 두 서열의 유사한 영역은 정렬된 잔기의 쌍을 살펴봄으로써 발견되고; ktup=1인 경우, 단일 정렬된 아미노산이 검사된다. ktup은 단백질 서열의 경우 2 또는 1로, DNA 서열의 경우 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup이 지정되지 않은 경우 기본값은 단백질의 경우 2이고 DNA의 경우 6이다. 대안적으로, 문헌[Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기술된 바와 같이 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 단백질 서열 정렬이 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 이러한 모든 명칭은 이들의 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 횟수에 관계없이 1차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다.
치료 목적상 용어 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물을 포함한 포유동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등으로 분류되는 모든 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용되는 "질환" 또는 "장애"는 본원에 기술된 인간화 항-Sema3A 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 병태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
용어 "유리체내 주사"는 당업계에서의 통상의 의미를 가지며 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자의 유리체에 도입하는 것을 지칭한다.
용어 "피하 투여"는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 기저 조직 사이의 주머니 내에, 약물 용기로부터 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해 도입하는 것을 지칭한다. 피부를 꼬집거나 잡아당겨 기저 조직에서 떼어내면 주머니가 생길 수 있다.
용어 "피하 주입"은 약물을 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 기저 조직 사이의 주머니 내에 30분 이하, 또는 90분 이하를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일정 기간 동안 약물 용기로부터 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해 도입하는 것을 지칭한다. 임의로, 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서 펌프는 30분, 90분 또는 치료 섭생의 길이에 걸친 기간과 같은 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 양의 약물을 전달한다.
용어 "피하 볼루스"는 동물 또는 인간 환자의 피부 아래 약물 투여를 지칭하며, 여기서 볼루스 약물 전달은 대략 15분 미만, 또 다른 측면에서 5분 미만, 여전히 또 다른 측면에서 60초 미만이다. 또 다른 측면에서, 투여는 피부와 기저 조직 사이의 주머니 내에 이루어지며, 여기서 주머니는 피부를 꼬집거나 잡아당겨 기저 조직에서 떼어냄으로써 생성될 수 있다.
용어 "치료학적 유효량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 경감 또는 개선시키는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 지칭하기 위해 사용된다. 이렇게 함으로써 그 양은 유익한 환자 결과를 갖는다. 효능은 치료할 병태에 따라 통상적인 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면, Sema3A를 발현하는 세포를 특징으로 하는 눈/망막 질환 또는 장애에서, 효능은 반응 속도, 예를 들어 시력 회복을 결정함으로써 또는 질환 진행까지의 지연 시간을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료" 및 "요법" 등은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 경감 또는 완화, 퇴행, 진행의 감속 또는 중지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 임상적으로 바람직하거나 유익한 효과를 초래하는 질환 또는 장애에 대한 치료적 및 예방적, 또는 억제적 조치를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 치료라는 용어는 질환 또는 장애의 증상이 시작되기 전 또는 이후에 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 상기 용어는 질환의 증상을 퇴치하기 위해 질환의 임상적 발현 후에 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여함을 포함한다. 또한, 개시 후 및 임상 증상이 발병한 후 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는, 치료가 질환 또는 장애의 임상 매개변수에 영향을 미치는 경우, 치료가 질환의 개선을 유도하는지 여부에 관계없이, 본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "요법"을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 조성물이 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 치료할 장애의 적어도 하나의 증상을, 항-Sema3A 항체 조성물 또는 이의 항원 결합 단편의 사용 부재하에의 그 증상과 비교하여, 경감시키거나 개선시키는 한, 장애의 모든 증상이 완화되는지 여부에 관계없이 결과는 기저 장애의 효과적인 치료로 간주되어야 한다.
용어 "포장 삽지"는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 나타내는데 사용된다.
본 발명의 항체
제1 양태에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간화 항-Sema3A 항체, 보다 바람직하게는 인간화 단클론 항-Sema3A 항체이다.
초기 특성화에서, Sema3A 변이체를 표적으로 하는 항체의 라이브러리는 뮤린 항체의 CDR을 인간 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR에 배치하고 추가로 상이한 변경으로 FR을 조작함으로써 생성되었다.
이것은 본원에 개시된 바와 같이 향상된 특성을 갖는 Sema3A에 대해 지시된 인간화 항체를 야기한다. 본 발명의 항체의 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
하나의 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 1의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 4의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기서:
- 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열(H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하고;
- 경쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열(L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
바람직한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 각각 서열번호 7 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
- 각각 서열번호 8 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
- 각각 서열번호 9 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
- 각각 서열번호 10 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어진 중쇄; 및
- 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어진 경쇄.
특정 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(상기 항체를 "클론 I"이라고 함);
b. 아미노산 서열 of 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(상기 항체를 "클론 II"라고 함);
c. 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(상기 항체를 "클론 III"이라고 함); 또는
d. 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(상기 항체를 "클론 IV"라고 함).
IgG1-KO 돌연변이체는 Fc 영역에 돌연변이를 도입함으로써 만들어졌다. 효과기 기능을 감소 또는 억제하는 돌연변이는 숙련가에게 잘 알려져 있으며 선행 기술에, 예를 들면, 문헌[Wang et al, Protein Cell 2018, 9(1):63-73 and Stewart et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:29]에 충분히 개시되어 있다. 전형적으로, Fc의 효과기 기능을 감소시키기 위해 IgG1 Fc 영역에 도입된 돌연변이의 비제한적인 목록은 다음을 포함한다:
- L234A 및 L235A;
- L234A, L235A, 및 N297Q;　
- L234A, L235A, 및 P329G; 또는
- L234A, L235A, 및 D265A;
여기서 잔기는 카바트의 EU 지수에 따라 번호가 매겨진다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 Fc 영역에 두 개의 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함한다.
본원에 개시되고 서열번호 1 내지 6에 나타낸 CDR은 카바트 넘버링에 따라 제공되고 카바트 위치와 함께 하기 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00004
본 발명의 항-Sema3A 항체는 인간 Sema3A에 높은 친화도로 결합한다. 이러한 측면에 관한 양태에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 KD < 50pM로 인간 Sema3A에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 실시예 4에 예시된 바와 같이 KD < 35pM로 인간 Sema3A에 결합한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 KD < 30pM로 인간 Sema3A에 결합한다.
본 발명의 항-Sema3A 항체는 또한 시노-Sema3A, 마우스 Sema3A, 래트 Sema3A 및 토끼 Sema3A에 결합한다.
본 발명의 항-Sema3A 항체는 100pM 미만, 바람직하게는 80pM 미만, 보다 바람직하게는 70pM 미만의 기능적 역가(functional potency)로 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포골격 붕괴를 방지한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 실시예 4에 예시된 바와 같이 69pM의 기능적 역가로 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포골격 붕괴를 방지한다.
추가의 측면에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 실시예 5에 기술된 바와 같이 낮은 면역원성 위험을 갖는 것으로 입증되었다. 이것은 항체의 면역원성의 인실리코(in silico) 예측에 의존한다. 면역원성 위험은 전형적으로 주요 면역원성-영향 인자인 T 세포 에피토프를 예측하기 위한 컴퓨터 알고리즘에 의한 것과 같은 잘 알려진 다양한 방법에 의해 평가된다.
관심 단백질에 존재하는 T-세포 에피토프를 포함하는 서열은 EpiMatrix(EpiVax에 의해 생산됨)라는 이름으로 이용 가능한 컴퓨터 매트릭스 접근법을 기반으로 하는 알고리즘을 사용하여 예측될 수 있다고 실제로 보고되었다. 당업계의 숙련가는 문헌[Van Walle et al., Expert Opin Biol Ther. 2007 March; 7(3): 405-18 and Jawa and al., Clin Immunol. 2013 Dec;149(3):534-55]을 참조할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 선행 기술에서 언급되고 본원에 기술된 Sema3A를 표적으로 하는 다른 항체 또는 단편보다 더 유리한 특성을 나타낸다는 것을 보여주었다.
본 발명자들은 WO2014123186호(Chiome Bioscience)에 개시된 Sema3A를 표적으로 하는 항체의 결합 친화도를 본 발명의 항체의 친화도와 비교하였다. WO2014123186호의 항체는 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위해 개시된다. 본 실시예 8은 본 발명의 항체가 Chiome Bioscience에 의해 개시된 선행 기술 항체보다 인간 Sema3A에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 입증되었음을 보여준다.
본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 항체의 특성을 WO2017074013호(Samsung)에 개시된 바와 같은 ScFv 단편과 비교하였다. 이들 단편은 다양한 암의 치료에 사용하기 위해 개시된다. 본 실시예 9는 본 발명의 항체가 WO2017074013호에 개시된 선행 기술의 항체 단편보다 인간 Sema3A에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 입증되었음을 보여준다.
더 높은 결합 친화도는 항체의 유리체내 주사 후 Sema3A의 중화를 위한 시간을 연장하고 주사 빈도를 감소시킨다. 더 높은 결합 친화도는 추가로 더 낮은 용량의 투여를 허용하여 잠재적인 부작용을 제한한다. 따라서, 본 발명의 항체는 선행 기술의 항체를 능가하는 기술적 이점을 제공한다. 개선된 결합 친화도 및 감소된 주사 빈도는 이를 필요로 하는 환자의 치료 효능을 상당히 개선시킨다. 이것은 또한 환자를 위한 귀중한 이점, 특히 개선된 약물 준수 및 순응도를 제공한다.
본 발명자들은 또한 본 실시예 11에 기술된 바와 같이 본 발명의 항체 및 Sema3A를 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 기능적 역가를 비교하였다. 본 발명자들은 동일한 조건하에서 본 발명의 항체가 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포골격 붕괴를 방지하는 반면(실시예 3), 상업적으로 이용 가능한 항체는 그렇지 않다는 것을 보여주었다(실시예 11).
인간화 및 아미노산 서열 변이체
추가 변이체 항-Sema3A 항체 및 항체 단편은 서열번호 1 내지 6에 도시된 서열 하에 확인된 CDR 세트를 기반으로 조작될 수 있다. 상기 변이체 항-Sema3A 항체 및 항체 단편에서 CDR의 아미노산 서열은 변하지 않고 남아 있지만 주변 영역, 예를 들어, FR 영역은 조작될 수 있음을 이해해야 한다. 항-Sema3A 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-Sema3A 항체 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들면, 본원 실시예의 항-Sema3A 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성을 갖는 한, 최종 작제물에 도달하기 위해 삭제, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경하는 것과 같이 인간화 또는 변이체 항-Sema3A 항체의 번역후 과정을 변경할 수 있다.
항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경하는 것을 포함한다. 이러한 맥락에서 용어 "변경"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나 항체에 이전에 존재하지 않았던 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항-Sema3A 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 항-Sema3A 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 단리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 항-Sema3A 항체의 이전에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 항-Sema3A 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위해 개발된 기술들이 있다. 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래될 수 있다(예를 들어, 참조; Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; and Brennan et al., 1985, Science 229:81). 대안적으로, 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접 생산될 수 있다. 예를 들면, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(예를 들어, 참조; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). 또 다른 접근법에 의해, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또 다른 기술은 숙련된 의사에게 명백할 것이다.
항-Sema3A 항체 및 이의 항원 결합 단편은 변형을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 온전한 항체보다는 항-Sema3A 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들면, 회수 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 항체 단편 내로 통합함으로써 달성될 수 있다. 하나의 방법에서, 항체 단편의 적절한 영역이 변경(예를 들어, 돌연변이)될 수 있거나, 에피토프가 펩티드 태그 내로 통합된 다음, 예를 들면, DNA 또는 펩티드 합성에 의해 양쪽 말단 또는 중간에서 항체 단편에 융합될 수 있다. 예를 들면, WO 96/32478호를 참조한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체의 공유 변형을 포함한다. 공유 변형은 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 리시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복실 측쇄 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴, 또는 트레오닐 잔기의 변형을 포함한다. 또 다른 유형의 공유 변형은 글리코시드를 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것을 포함한다. 이러한 변형은 화학적 합성에 의해 또는 적용 가능한 경우 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 다른 유형의 공유 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 아미노- 또는 카복시-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다.
항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin 등(참조; Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52)에 의해 및 Edge 등(참조; Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131)에 의해 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.
유용한 공유 변형의 또 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호 중 하나 이상에 제시된 방식으로 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결하는 것을 포함한다.
에피토프 결합
제2 측면에서, 본 발명은 특이 "Sema3A 항원 에피토프" 및 "Sema3A 에피토프"를 인식하는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 서열번호 22를 갖는 인간 Sema3A의 에피토프에 결합한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 인간 Sema3A의 아미노산 영역 370-382 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 21에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
서열번호 21 및 22의 서열은 하기 표 5에 나타나 있다.
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본원에서 사용되는 용어 "Sema3A 항원 에피토프" 및 "Sema3A 에피토프"는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합할 수 있는 분자(예를 들어, 펩티드) 또는 분자의 단편을 지칭한다. 이들 용어는, 예를 들면, 서열번호 1 내지 3의 중쇄 CDR 및 서열번호 4 내지 6의 경쇄 CDR로부터 선택된 경쇄 및 중쇄 CDR 조합을 갖는 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 단편에 의해 인식되는 Sema3A 항원 결정기를 추가로 포함한다.
Sema3A 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩티드 등에 포함될 수 있다. 에피토프는 가장 일반적으로 단백질, 짧은 올리고펩티드, 올리고펩티드 모방체(즉, Sema3A 항원의 항체 결합 특성을 모방하는 유기 화합물) 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간 Sema3A의 독특한 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22를 갖는 인간 Sema3A의 세포외 도메인의 아미노산 영역 370-382 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합한다. 이러한 에피토프는 Sema3A와 플렉신 A 수용체의 계면에 가깝게 위치한다. 이러한 에피토프에 대한 항체의 결합은 리간드 Sema3A, 수용체 플렉신 A 및 공동-수용체 Nrp1의 신호전달 홀로수용체 복합체(signaling holoreceptor complex)의 형성을 억제하여, 이러한 신호전달의 생물학적 효과를 방해한다.
에피토프 결합의 맥락에서, 어구 "아미노산 영역 X-Y... 내에 결합한다"는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열에 명시된 아미노산 영역 내의 아미노산 잔기의 적어도 하나, 바람직하게는 전부에 결합한다는 것을 의미한다.
또 다른 측면에서, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%에 결합한다. 바람직하게는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22에 결합한다.
치료적 용도
제3 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 SemaA의 혈관억제 효과를 억제하고/하거나 망막의 혈관재생을 개선하기 위한 항-Sema3A 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 망막 또는 눈 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명자들은 Sema3A를 표적으로 하는 항체를 실제로 개발하였으며, 이것은 다음을 위해 매우 유용하다:
- 망막의 혈관재생을 개선하기 위해 허혈성 영역으로 혈관신생을 재지정하는 것;
- 유리체 영역의 병리학적 신혈관화를 방지하는 것; 및
- 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하는 것.
이전에 언급한 바와 같이, Sema3A는 저산소성 망막 신경절 세포에 의해 분비되는 혈관반발 신호이다. 뉴로필린-1에 결합함으로써, 이것은 내피 세포 상의 플렉신 수용체의 세포내 신호전달을 활성화하여 액틴 섬유의 분해를 야기한다. 이것은 새로운 혈관의 성장을 지시하고 망막의 허혈성 영역의 혈관 재생을 방지하는 특수한 내피 세포인 정단 세포의 사상체에서 세포골격 붕괴를 초래한다. 본 발명자들은 중화 Sema3A-항체로 혈관반발 작용을 조절하면 정단 세포의 수가 증가하고 당뇨병성 황반 허혈을 가진 인간에서 병리학적으로 확대된 중심와 무혈관 영역과 같은 허혈성 영역으로 혈관신생을 재지시한다는 것을 보여주었다.
따라서, 제4 측면에서, 본 발명은 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 동맥 폐쇄, 내안구염, 포도막염, 낭포성 황반 부종, 망막 질환에 따른 맥락막 신생 혈관 막, 시신경병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유도성 망막 혈관병증, 망막 신혈관화, 폴립성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세동맥류, 푹스 각막이상증, 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 항-Sema3A 항체는 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신혈관화 및 맥락막 신혈관화를 치료 또는 예방하는데 특히 유용하다.
바람직한 양태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 허혈이고 본 발명의 항체는 허혈성 망막 내의 혈관 재생(revascularization)을 촉진하고 눈의 유리체 영역의 병리학적 신혈관화를 방지한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종이고 본 발명의 항체는 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시킨다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 혈액 망막 장벽의 Sema3A 유도된 투과성 및/또는 허혈성 영역의 Sema3A 유도된 혈관퇴행을 억제하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 당뇨병성 황반 부종(DME) 및/또는 당뇨병성 황반 허혈(DMI)의 치료에 유용하다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 DME 및 DMI를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유용하다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 중심와 무혈관 구역(FAZ)의 15%, 20%, 25%, 보다 바람직하게는 30% 이상의 확대에 의해 정의된 바와 같이 DMI를 치료하는데 사용된다.
제5 측면에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유리체내, 경구, 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항-Sema3A 항체는 특히 항체 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 적절하게 투여된다. 하나의 측면에서, 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 바람직하게는, 항-Sema3A 항체는 눈에 유리체내 주사를 통해 제공된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 재량과 같은 다양한 요인에 따라 좌우될 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
바람직한 양태에서, 주사당 적용 가능한 본 발명의 항체의 용량 범위는 통상적으로 1mg/눈 내지 10mg/눈, 바람직하게는 1.5mg/눈 내지 5mg/눈, 보다 바람직하게는 2mg/눈 내지 3mg/눈 및 훨씬 더 바람직하게는 약 2.5mg/눈이다.
용어 "억제(suppression)"는 질환의 하나 이상의 특징의 경감 또는 감소를 의미하기 위해 "개선(amelioration)" 및 "경감(alleviation)"과 동일한 맥락으로 본원에서 사용된다.
항체 조성물은 우수한 의료 업무와 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요소는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 약제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요인을 포함한다. 투여될 항체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 본 발명의 항체에 의해 다루어지는 눈 또는 망막 질환을 예방, 개선 또는 치료하는데 필요한 최소량이다.
항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 이들과 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항-Sema3A 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 이전에 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 또는 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 자가면역 관절염, 신경병증성 통증, 골다공증 및 암과 같은 비-안과적 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Sema3A 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
치료 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 환자에서 눈 또는 안구 질환을 치료 또는 예방하기 위한 임의의 방법을 포함하며, 상기 방법은 본 발명의 항-Sema3A 항체의 투여를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 SemaA3의 혈관억제 효과를 억제하기 위해 본 발명에 따른 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 망막의 혈관재생을 개선하기 위한 상기 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여, 눈 또는 망막 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 질환은 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 동맥 폐쇄, 내안구염, 포도막염, 낭포성 황반 부종, 망막 질환에 따른 맥락막 신생 혈관 막, 시신경병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유도성 망막 혈관병증, 망막 신혈관화, 폴립성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세동맥류, 푹스 각막이상증, 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 질환은 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신혈관화, 녹내장 및 맥락막 신혈관화로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈이다.
본원에 기술된 모든 개시된 기술적 특징은 상기 치료 방법에 적용 가능하다.
약제학적 조성물 및 이의 투여
항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 눈 또는 망막 질환이 있거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 추가로 눈 또는 망막 질환 또는 Sema3A 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 본원에 기술된 모든 개시된 기술적 특징은 약제의 제조에 있어서의 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상기 용도에 적용 가능하다. 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는, 예를 들어, 인간 및 영장류, 설치류, 및 개와 같은 비인간 포유동물을 포함하여, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미한다. 본원에 기술된 방법을 사용한 치료를 위해 특별히 의도된 대상체는 인간을 포함한다. 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는데 사용될 수 있다. 도입 방법은 유리체내, 점안액, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들면, 주입, 볼루스 또는 주사에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 바람직한 양태에서, 투여는 유리체내 주사에 의해 이루어진다. 이러한 주사용 제형은, 예를 들면, 미리 채워진 주사기로 제조될 수 있다.
항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료학적 유효량의 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 상용성인 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
전형적인 양태에서, 약제학적 조성물은 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 주사에 의한 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약제는 또한 주사 부위의 통증을 완화하기 위해 가용화제 및 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 단위 투여 형태, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 봉지와 같은 기밀하게 밀폐된 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축액으로서 함께 혼합되어 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병을 사용하여 분배될 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 용기 및 (b) 주사용 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 동결건조된 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 이러한 용기(들)와 임의로 관련된 것은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형식의 통지일 수 있으며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다.
눈 또는 망막 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되도록 시험관내 분석을 임의로 사용할 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 장애의 단계에 따라 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 환자 개개인의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
예를 들면, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 독성 및 치료 효능은 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 바람직하다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은 전형적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 임의의 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해, 치료학적 유효량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 반-최고 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA 등에 의해 측정될 수 있다.
항-Sema3A 항체의 유리체내 주사의 경우, 일반적으로 치료 사이의 간격이 더 긴 것이 바람직하다. 개선된 결합 친화도 및 효능으로 인해, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 더 긴 간격으로 투여될 수 있다.
하나의 양태에서 항-Sema3A 항체는 6주마다, 바람직하게는 7주마다, 바람직하게는 8주마다, 바람직하게는 9주마다, 바람직하게는 10주마다, 바람직하게는 11주마다, 보다 바람직하게는 12주마다 투여된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 3개월마다 1회 투여된다.
눈에 투여될 수 있는 양은 엄격히 제한되기 때문에, 항-Sema3A 항체를 고농도로 제형화하는 것이 매우 중요하다. 또한, 강력한 항체는 더 낮은 용량에서도 이의 효과를 발휘하여 활성 및 또한 치료 사이의 간격을 연장할 수 있기 때문에 항-Sema3A 항체의 효능은 매우 중요하다.
본 발명의 항체는 20mg/ml, 30mg/ml, 40mg/ml, 50mg/ml, 60mg/ml, 70mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml, 또는 100mg/ml를 포함하지만 이에 제한되지 않는 매우 높은 용량으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 약 50mg/ml의 액체 제형으로 제형화될 수 있다.
환자에게 투여될 수 있는 전형적인 투여량은 약 2.5mg/눈이다. 이러한 제형에 사용될 수 있는 전형적인 완충 성분은 예를 들어 아세트산 나트륨, PS20, 및 트레할로스 이수화물을 포함한다.
하나의 양태에서, 항-Sema3A 항체는 60mg/mL의 최종 단백질 농도로 pH 5.5에서 10mM 히스티딘 완충액, 240mM 수크로스, 0.02w/v% 폴리소르베이트 20으로 제형화된다.
일부 양태에서, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 결합제에 접합되거나 접합되지 않은 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
조합 투여를 위한 치료 섭생과 관련하여, 특정 양태에서, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료제와 동시에 투여된다. 또 다른 특정 양태에서, 치료제는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 전에 또는 후속적으로, 적어도 1시간 및 최대 수 개월, 예를 들면 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 하루, 일주일, 한 달, 또는 3개월까지 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 전에 또는 후속적으로 투여된다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
제6 측면에서, 본 발명은 항-Sema3A 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 숙주 세포, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 전장 단클론 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이 항체를 포함하는 임의의 원하는 형태의 항-Sema3A 항체를 암호화할 수 있다.
항-Sema3A 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(들)는 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합될 수 있고, 당업계에 공지된 바와 같이 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오티드 분자는 인간 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 독립적으로 융합되어, 온전한 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부는 함께 융합되어, 단일 쇄 항체의 생산을 위한 주형을 제공할 수 있다.
재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝(DNA 증폭)을 위해 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터에 삽입된다. 재조합 항체를 발현시키기 위한 많은 적합한 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
항-Sema3A 항체는 또한 항체가 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드와 같은 이종 폴리펩티드와 융합되는 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 항-Sema3A 항체 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵 신호 서열로 대체될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, 지단백질, 열-안정성 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은, 예를 들면, 효모 인버타제 알파-인자(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 산 포스파타제, 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제, 또는 WO90/13646호에 기술된 신호로부터 수득된 리더 서열로 대체될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 단순 헤르페스 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 해독틀에서 인간화 항-Sema3A 항체를 암호화하는 DNA에 결찰된다.
발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 무관하게 복제할 수 있게 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아인 2-υ에 적합하다. 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 및 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 구성 요소는 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기점은 전형적으로 초기 프로모터를 포함하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 식별을 용이하게 하기 위해 선별 마커를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 마커 유전자는 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, 대안적으로, 보체 영양요구성 결핍이거나, 또 다른 대안에서, 복합 배지에 존재하지 않는 특정 영양소, 예를 들어 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급하는 단백질을 암호화한다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 저지하기 위한 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이러한 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하여 선별 요법에서 살아남는다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포에 대한 일반적인 선별 마커는 DHFR(디하이드로엽산 환원효소), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II(예를 들어 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같은 인간화 항-Sema3A 항체를 암호화하는 핵산을 차지하기에 적격인 세포의 식별을 가능하게 하는 마커이다. DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 식별된다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들어 DG44)이다.
대안적으로, 항-Sema3A 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 또 다른 선별 마커를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR를 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커에 대한 선별제(selection agent)를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
숙주 세포로서 효모 세포에서 재조합 생산이 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)에 존재하는 TRP1 유전자가 선별 마커로서 사용될 수 있다. TRP1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, 1977, Genetics 85:12)에 대한 선별 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈에서 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, ATCC 20,622 및 38,626과 같은 Leu2p-결핍 효모 균주는 LEU2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보체화된다.
또한, 1.6μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 개시되어 있다(Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-Sema3A 항체 또는 이의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 박테리아 프로모터가 또한 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 인간화된 항-Sema3A 항체를 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된 Shine-Dalgamo(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
많은 진핵생물 프로모터 서열이 알려져 있다. 거의 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 시작으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견된 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 추가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터에 적절하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기에 적합한 촉진 서열(promoting sequence)의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 이점을 갖는다. 이들은 알콜 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 제EP 73,657호에 추가로 기술되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항-Sema3A 항체 전사는, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열충격 프로모터로부터 제어되며, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이어야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기술되어 있다. 또한 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 p-인터페론 cDNA의 발현을 개시하는 문헌[Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 또 다른 유용한 요소는 인핸서 서열이며, 이것은 고등 진핵생물에 의해 항-Sema3A 항체를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키는데 사용된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자로부터 알려져 있다(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 예는 복제 기점의 후기 쪽에 있는 SV40 인핸서(bp 100-270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 쪽에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸스 요소에 대한 설명에 대해서는 문헌[ Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 참조한다. 인핸서는 항-Sema3A 항체-암호화 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 번역되지 않은 영역으로부터 이용 가능하다. 이 영역은 항-Sema3A 항체를 암호화하는 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 구성 요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026호 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다. 일부 양태에서, 항-Sema3A 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 제5,888,809호 참조; 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨.)
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 장내세균(Enterobacteriaceae), 예를 들어 대장균속(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실러스(Bacilli), 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 제DD 266,710호에 개시된 바실러스 리케니포르미스 41 P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 복제 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주도 적합하다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
원핵생물에 더하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항-Sema3A 항체-암호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 윅커라미이(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii)(ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 서모톨레란스(K. thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 파스토르스(Pichia pastors)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라다움(Tolypocladium), 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스퍼길러스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스퍼길러스 니거(A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종 및 균주가 일반적으로 이용 가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항-Sema3A 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 예를 들어 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄믹스 모리(Bombyx mori)(누에)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포를 포함하여 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄믹스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항-Sema3A 항체는 또한 바이러스 벡터에 포함될 수 있으며, 즉, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 도입된 다음 바이러스 감염 후 환자의 체내에서 발현된다.
또 다른 측면에서, 항-Sema3A 항체의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양물(조직 배양물)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었으며 기술이 널리 이용 가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR1(CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예를 들어, DG44), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개의 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간종양 세포주(Hep G2)이다.
숙주 세포는 항-Sema3A 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본원에 기술된 항-Sema3A 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄의 F10(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코 개질된 이글 배지((DMEM), Sigma-Aldrich Co.)와 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, WO 90/103430호, 및 WO 87/00195호] 중의 하나 이상에 기술된 배지 중의 어느 것이 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지 중 어느 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 겐타마이신), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 기타 보충제가 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 조건이며, 통상의 숙련가들에게 자명할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내, 주변세포질 공간에서 생산되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로서 세포가 파괴되어 단백질을 방출할 수 있다. 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편은, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 문헌[Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 기술한다. 간단히 말해서, 세포 페이스트를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동한다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 상기 단계들 중 어느 단계에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 숙주 세포로부터 항체를 단리하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 좌우된다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2 또는 감마4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 참조; Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 감마3에 권장된다(예를 들어, 참조; Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). 친화성 리간드가 부착된 기질은 대개 아가로스이지만 다른 기질도 이용 가능하다. 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 기질은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 이온-교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 기타 기술이 또한 회수하고자 하는 항체에 따라 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있으며, 이것은 전형적으로 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터)에서 수행된다.
본원에 정의된 바와 같은 저, 중 및 고 엄격도 조건하에 Sema3A-항체 또는 항체 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부(예를 들어, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 혼성화하는 핵산이 또한 포함된다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 전형적으로 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 항-Sema3A 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 이의 보체를 암호화하는 핵산의 일부 또는 전부의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기술된 유형의 혼성화 핵산은, 예를 들면, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머, 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)에 관한 것이다.
상기 항-Sema3A 항체 및 항체 단편에서 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 변경되지 않은 채로 유지되지만(이들이 암호화하는 아미노산과 관련하여 변경되지 않으며, 코돈의 축퇴성으로 인한 DNA 서열의 등가물은 가능함) 주변 지역, 예를 들어 FR 영역은 조작될 수 있는 것으로 이해해야 한다.
제조 물품
또 다른 측면에서, 상기 기술된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다. 조성물 중의 활성제는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 용기 상의 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 조성물이 해당 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침이 있는 포장 삽지를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되어 있으며, 이것은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: DME 및 PDR 환자의 유리체에서 Sema3A의 상향조절
당뇨병성 망막병증의 병력이 있는 인간 기증자로부터의 샘플의 망막에서 Sema3A의 발현을 면역조직화학에 의해 조사하였다. 면역염색 프로토콜은 다음과 같았다:
1. 슬라이드를 해동하고 샘플을 실온(RT)에서 30분 동안 공기 건조시킨다;
2. 팝 펜 박스(pap pen box)를 인출하여 건조시킨다;
3. RT에서 5분 동안 1% SDS에서 항원을 회복시킨다;
4. 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 3회 세척한다;
5. RT에서 30분 동안 1%BSA/0.3% Triton X100/PBS 용액(차단 용액)에서 절편을 차단한다;
6. 차단 용액에 토끼-항 Sema3a(abcam, ab23393) 1차 항체를 1:200으로 희석한다. 슬라이드 상의 절편을 RT에서 밤새 배양한다;
7. 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 3회 헹군다;
8. DAPI/0.3% Triton X100/PBS 용액에서 1:400 희석으로 당나귀 항-토끼 Alexa fluor546(invitrogen, A10040)과 함께 2차 항체를 배양한다. 슬라이드 상의 절편을 RT에서 3시간 동안 배양한다;
9. 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 3-5회 헹군다;
10. Aquamount로 절편을 커버슬립하고 공기 건조시킨다;
11. 40x 배율로 절편을 이미지화하고 강도의 등급을 매긴다.
각 인간 기증자당 3개의 절편 세트를 Sema3A에 대해 면역염색하였다. Sema3A 표지화는 5점 등급 체계(0=검출 없음, 1=낮은 강도, 소수의 반점, 2=중간 강도, 여러 점, 3= 밝은 강도, 광범위한 염색, 4 = 매우 밝은 강도, 풍부한 검출)를 사용하여 이러한 특정 작업에 대해 이전에 훈련된 관찰자에 의해 이들 영역 각각에서 독립적으로 평가되었다. 관찰자들은 눈 기증자의 건강 상태를 알지 못했다. 망막 내에서, Sema3A는 망막 혈관의 혈관벽과 연관되었다. 망막 혈관계 및 망막 실질에서 Sema3A의 발현은 눈 병리가 없는 당뇨병 환자에 비해 당뇨병성 황반 부종 환자에서 증가하였다(도 1).
실시예 2: 세포 투과성 분석에서의 효능
세포관통 투과성은 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)의 단층에서 FITC-덱스트란의 침투에 의해 측정하였다.
간단히 말해서, 시험관내 내피 투과성은 Millipore 키트('시험관내 혈관 투과성 검정' 카탈로그 번호 ECM642) 및 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)를 사용하여 측정하였다. 검정 키트는 세포 배양 삽입물을 갖는 96웰 리시버 플레이트를 제공한다. 삽입물은 1μm 기공을 포함하고 I형 래트-꼬리 콜라겐으로 코팅되어 있다. HRMEC를 25000개 세포/웰의 밀도로 삽입물에 시딩하고 세포를 3일 동안 단층으로 성장되게 하였다. 세포를 밤새 재조합 VEGF-A, Sema3A 및 본 발명에 따른 항체로 처리하였다. 키트 내에 제공된 고분자량 FITC-덱스트란 용액을 삽입물에 첨가하여, 형광 분자가 내피 세포 단층을 통과하도록 하였다. 시험관내 투과성은 485nm/535nM(여기 및 흡수)에서 리시버 플레이트 웰 용액의 형광을 측정함으로써 결정하였다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 예시적인 항체를 시험하였다: 클론 I. 상기 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명에 따른 항-Sema3A 항체는 Sema3A에 의해 유도된 투과성은 완전히 억제하였지만 VEGF-A에 의해 유도된 투과성은 그렇지 못했다(도 2). 중요하게도, Sema3A의 투과성 효과는 VEGF-A와는 독립적이다. TNP에 대해 지시된 대조 항체의 사용은 효과가 본 발명의 항체에 의한 Sema3A의 특정 표적에 기인함을 확인시켜준다.
실시예3: 세포 분석에서 세포골격 붕괴의 측정
본 발명에 따른 예시적인 항체(클론 I)의 세포 활성은 XCELLigence 시스템(ACEA Biosciences에 의해 상용화된 바와 같은 실시간 세포 분석 기기)을 사용하여 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)에서 세포골격 붕괴의 측정에 의해 평가하였다. 시스템은 세포 임피던스(cellular impedance)를 통해 세포 부착 및 합류를 측정한다. HRMEC는 클래스-3 세마포린 홀로수용체의 구성요소인 뉴로필린-1(Nrp1) 및 플렉신을 내인성으로 발현한다. 이 수용체 복합체에 결합함으로써, 세마포린은 내피에서 F-액틴 섬유의 붕괴를 유도한다. 이러한 기능적 검정에서, 인간 망막 미세혈관 내피 세포의 합류 층에 재조합 Sema3A 단백질을 추가하면 세포 임피던스의 감소로서 측정되는 세포골격 붕괴 및 후속적인 세포의 수축으로 인해 세포 임피던스가 낮아진다.
간단히 말해서 E-플레이트 뷰를 부착 인자(Attachment Factor)로 코팅하였다. 세포를 20000개 세포/웰의 밀도로 시딩한 다음 XCELLigence 장치 내부의 정상적인 성장 조건하에서 밤새 단층으로 성장하도록 하였다.
3mM CaCl2의 존재하에 본 발명에 따른 항-Sema3A 항체를 포함하거나 포함하지 않는 Sema3A(또는 다른 클래스-3 세마포린)를 첨가하였다. 세포 지수는 물질 첨가 전의 시점으로 정규화하였다. 계산은 자극한지 5시간 후에 수행하였다.
Sema3A에 의해 유도된 세포골격 붕괴는 본 발명에 따른 항-Sema3A 항체에 의해 완전히 예방할 수 있다. 시험된 다른 세마포린(B, C, E 및 F)에 의해 유도된 세포골격 붕괴는 본 발명에 따른 항-Sema3A 항체로 예방할 수 없었으며, 이것은 Sema3A에 대한 본 발명의 항체의 특이성을 확인시켜준다(도 3).
실시예 4: 친화도 및 세포 효능
A) 친화도
이 실험을 위한 실행 완충액 및 모든 희석액(명시된 경우 제외)은 0.01% Tween20을 갖는 PBS-T-EDTA에서 수행하였다[100% Tween20 100ul를 PBS-T-EDTA 2L에 첨가하여 최종 Tween 20 농도를 0.01%로 만들었다]. GLM 센서칩은 제조업체의 권장 사항에 따라 정규화하고 사전-조정하였다. 센서칩을 수평 방향으로 300초 동안 30μl/min의 유속으로 EDC/s-NHS의 동일한 혼합물로 활성화하고 수평 방향으로 300초 동안 30μl/min의 유속으로 인간 Fab 결합제(10mM 아세테이트 pH 5.0에서 10μg/ml)로 고정화하여 표면에 ~6739-7414RU의 인간 Fab 결합제를 야기하였다. 센서칩을 수평 방향으로 300초 동안 30μl/min의 유속으로 1M 에탄올아민 HCl로 불활성화시켰다. 센서칩을 수평으로 1회, 수직으로 1회 100μl/min의 유속으로 18초 동안 10mM 글리신, pH 2.1로 안정화시켰다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 예시적인 항체(클론 I)를 시험하였다. 상기 항체(0.5μg/ml)를 25μl/분의 유속으로 300초 동안 수직으로 인간 Fab 결합제 표면 상에 포획하여 ~180RU 포획 수준을 야기하였다. 기준선은 수평으로 40μl/min의 유속으로 60초 동안 PBS-T-EDTA를 주입하여 안정화시켰다. 분석물을 40μl/min의 유속으로 600초 동안 포획된 항체 위에 수평으로 주입하고 7200초 동안 해리(dissociation)하였다. 분석물의 농도는 0nM, 0.625nM, 1.25nM, 2.5nM, 5nM, 및 10nM이었다. 수평으로 1회, 수직으로 1회 100μl/min의 유속으로 18초 동안 10mM 글리신, pH 2.1을 주입하여 표면을 재생시켰다. PBS-T-EDTA를 수직으로 1회 25μl/min의 유속으로 60초 동안 주입하였다. 인터스팟(센서 표면과의 상호작용) 및 블랭크(0.01% Tween20 또는 0nM 분석물을 갖는 PBS-T-EDTA)를 미가공 데이터에서 뺐다. 그후 센서그램을 1:1 랭뮤어 결합(Langmuir binding)에 전체적으로 맞추어 온-레이트(ka), 오프-레이트(kd) 및 친화도(KD) 값을 제공하였다.
B) 세포 효능
세포골격 붕괴 분석에서 기능적 효능을 결정하기 위해, Sema3A 농도 반응 곡선을 IC50 이동 실험으로서의 항체 농도 증가와 결부시켰다. pA2 값(Sema3A 농도 반응 곡선을 계수 2만큼 이동시키는데 필요한 항체 농도의 음의 로그)을 계산하기 위해 Gaddum Schild 플롯을 수행하였다. pM 단위의 효능은 =POTENCY(10;-X)로서 pA2 값으로부터 계산하였다.
결과는 하기 표 6에 요약되어 있다.
Figure pct00006
실시예 5: 본 발명의 항체의 면역원성의 평가
본 발명자들은 본 발명에 따른 예시적인 항체인 클론 I의 예측된 면역원성을 평가하였다. 상기 항체는 각각 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
이러한 목적을 위해, 이들은 T 세포 에피토프를 예측하기 위한 in silico 도구(EpiVax에 의해 개발된 EpiMatrix)를 사용하였다.
많은 인간 항체 단리물의 서열을 스크리닝함으로써, EpiVax는 조절 가능성이 있는 것으로 여겨지는 몇 가지 고도로 보존된 HLA 리간드를 확인하였다. 실험 증거는 이러한 펩티드 중 다수가 사실상 대부분의 대상체에서 적극적으로 관용원성(tolerogenic)이라는 것을 시사한다. 이러한 고도로 보존된 조절성의 잡다한 T 세포 에피토프는 현재 트레지토프(Tregitopes)로 알려져 있다(De Groot et al. Blood. 2008 Oct 15;112(8):3303-11). 인간화 항체에 포함된 네오-에피토프의 면역원성 가능성은 상당한 수의 트레지토프의 존재하에서 효과적으로 제어될 수 있다.
항체 면역원성 분석의 목적을 위해, EpiVax는 트레지토프-조정된 EpiMatrix 스코어 및 항치료 항체 반응의 해당 예측을 개발하였다. 트레지토프-조정된 EpiMatrix 스코어를 계산하기 위해, 트레지토프의 스코어를 EpiMatrix 단백질 스코어로부터 차감하였다. 트레지토프-조정된 스코어는 23개의 시판 항체 세트에 대해 관찰된 임상 면역 반응과 잘 상관관계가 있는 것으로 나타났다(De Groot et al. Clin Immunol. 2009 May;131(2):189-201).
EpiMatrix 척도에 대한 결과는 아래 표 7에 요약되어 있다.
Figure pct00007
본 발명의 항체의 서열은 EpiMatrix 척도의 최저점에서 점수를 매겼으며, 이것은 본 발명의 항체가 면역원성에 대해 강력하게 제한된 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 EpiMatrix 척도는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있으며 특히 간행물[Mufarrege et al. Clin Immunol. 2017 Mar;176:31-41]의 도 2에서 찾아볼 수 있다.
실시예 6: 생체내 정단 세포 밀도 및 무혈관 영역에 대한 효능(산소 유도 망막병증 OIR 모델)
허혈성 무혈관 영역의 혈관재생에 대한 본 발명에 따른 예시적인 항체(클론 I)의 효과를 산소-유도 망막병증(OIR)의 마우스 모델에서 조사하였다. C57Bl/6J 마우스의 한배새끼를 출생후 7일부터 출생후 12일까지 75% 산소 대기에 노출하였다. 이것은 중심 망막의 혈관 퇴행 및 무혈성 영역의 형성을 야기한다. 정상산소 상태로 돌아간 후, 이 영역은 허혈성으로 된다. 새끼는 출생후 12일째에 이소플루란으로의 마취하에 각 눈에 0.5μl 용액 중의 10μg 항체의 단일 유리체내 주사를 받는다. 출생후 17일에, 동물을 희생시키고 눈을 적출한다. 눈을 포르말린으로 고정하고, 망막 혈관이 이소렉틴 B4로 염색된 망막 플랫마운트를 제조한다. 정단 세포(새로운 혈관의 형성을 개시하는 특수화된 내피 세포)의 수는 전체 망막(망막의 혈관성 말초 영역과 무혈관 중심 영역 사이의 경계)을 따라 무혈관 전면에서 계수한다.
정단 세포는 사상위족(filopodia) 확장을 보이는 이들의 특별한 형태에 의해 확인하였다. 분석을 위해, 정단 세포의 수를 무혈관 전면의 길이로 정규화한다. 무혈관 영역의 크기는 공초점 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 결정한다.
본 발명의 항-Sema3A 항체는 마우스 OIR 모델에서 정단 세포 밀도를 증가시킨다(도 4). 또한, 이것은 무혈관 영역의 감소를 보여준다. 정단 세포 밀도와 무혈관 영역의 크기 사이에는 음의 상관관계가 있으며, 이것은 두 매개변수의 기계적 의존성(mechanistic dependence)을 나타낸다. TNP에 대해 지시된 대조 항체의 사용은 효과가 본 발명의 항체에 의한 Sema3A의 특정 표적에 기인함을 확인시켜준다.
전반적으로, 본 발명의 항-Sema3A 항체는 산소 유도된 망막병증의 동물 모델에서 허혈성 무혈관 영역 크기를 감소시켜, 당뇨병성 황반 허혈의 치료에 유익한 효과를 나타낸다.
실시예 7: 토끼 눈에서 항-Sema3A 및 아바스틴(Avastin) t 1/2 의 비교
결과는 아래 표 8에 요약되어 있다.
Figure pct00008
계산된 반감기는 유리체, 망막 및 수양액에서 각각 3.9, 4.1 및 3.3일이었다. 이러한 반감기는 임상적으로 사용된 재조합 인간화 단클론 IgG1 항체 아바스틴(항-VEGF, 베바시주맙, Bakri et al., Opthalmology, 2007)에 대한 문헌에 보고된 것과 유사하며, 이것은 또한 본 발명자들에 의해 실험적으로 확인되었다. 전장 IgG의 유리체내 청소율이 이들의 분자 크기에 주로 의존하고, 이것이 본 발명의 항체 및 아바스틴에 대해 유사하기 때문에, 이러한 결과는 예상한 바와 같았다. 따라서, 본 발명의 항체 및 아바스틴의 안구 반감기를 포함한 인간 PK는 유사할 것으로 예상된다. 아바스틴의 보고된 인간 안구 반감기는 9.73±1.48일이다(Hutton-Smith, 2016).
실시예 8: 본 발명의 항체와 Chiome 항체 간의 결합 친화도의 비교
비교 목적을 위해, 본 발명자들은 다음과 같은 특징을 갖는 WO2014123186호(Chiome Bioscience)에 개시된 Sema3A에 대해 지시된 인간화 항체를 개발하였다:
- 중쇄는 WO2014123186호의 서열번호 11에 나타낸 바와 같고,
- 경쇄는 WO2014123186호의 서열번호 12에 나타낸 바와 같다.
본 발명자들은 이 항체의 2가지 형태를 개발하였다:
- 다음에서 "Chiome 항체 A"로 지칭되는 IgG1KO Fc에서 포맷된 것 및
- 다음에서 "Chiome 항체 B"로 지칭되는 IgG1KO-FcRn null에서 포맷된 것.
높은 표면 밀도의 항-인간 Fab 항체(GE Healthcare)를 BioRad 제조업체의 매뉴얼에 따라 6개의 수평 채널에 걸친 직접 아민 커플링을 통해 GLM 칩(BioRad) 위에 고정시켰다.
본 발명의 항체(클론 I) 및 Chiome 항체는 동적 결합 분석을 위해 최소 표면 밀도로 6개의 수직 채널 중 5개에 걸쳐 항-인간 Fab 항체 표면 위에 포획하였다. 인간 Sema3A는 100, 50, 25, 12.5, 10, 6.25, 5, 2.5, 1.25, 0.625 및 0nM의 농도로 PBS-T-EDTA 완충액(BioRad)에서 제조하였다. PBS-T-EDTA 완충액 주입은 동적 데이터 분석을 위한 이중 참조로 사용하였다. 인간 Sema3A 용액 및 PBS-T-EDTA 완충액 각각을 40μL/min의 유속으로 10분 동안 6개의 수평 채널에 동시에 주입한 다음 2시간의 해리 단계를 수행하였다. 표면을 100μL/min의 유속으로 10mM pH 2.1 글리신 HCl(GE Healthcare)을 18초 주입한 다음 25μL/min의 유속으로 60초 PBS-T-EDTA를 주입함으로써 재생시켰다. 결합 센서그램을 1:1 랭뮤어 모델에 맞춰 온-레이트, 오프-레이트, 및 친화도를 계산하였다.
인간 Sema3A에 결합하는 본 발명의 항체 및 Chiome 항체의 동역학 및 친화도 데이터는 아래 표 9에 나열되어 있다.
Figure pct00009
결론
결과는 본 발명의 항체가 WO2014123186호(Chiome Bioscience)에 개시된 선행 기술 항체보다 인간 Sema3A에 대해 보다 우수한 결합 친화성을 갖는 것으로 판명되었음을 보여준다.
실시예 9: 본 발명의 항체와 Samsung scFv 간의 결합 친화도의 비교
WO2017074013호(Samsung)에 개시된 바와 같은 scFv 단편을 비교하였다.
비교 목적을 위해, 본 발명자들은 하기 표 10에 개시된 특징을 갖는 3개의 개시된 scFv 단편("Samsung scFv")을 개발하였다.
Figure pct00010
높은 표면 밀도의 항-His 항체(GE Healthcare)를 BioRad 제조업체의 매뉴얼에 따라 6개의 수평 채널에 걸친 직접 아민 커플링을 통해 GLM 칩(BioRad) 위에 고정시켰다. Samsung scFv 항체를 동적 결합 분석을 위해 최소 표면 밀도로 6개의 수직 채널 중 5개에 걸쳐 항-His 항체 표면 위에 포획하였다. 인간 Sema3A는 100, 50, 25, 12.5, 10, 6.25, 5, 2.5, 1.25, 0.625 및 0nM의 농도로 PBS-T-EDTA 완충액(BioRad)에서 제조하였다. PBS-T-EDTA 완충액 주입은 동적 데이터 분석을 위한 이중 참조로 사용하였다. 인간 Sema3A 용액 및 PBS-T-EDTA 완충액 각각을 40μL/min의 유속으로 10분 동안 6개의 수평 채널에 동시에 주입한 다음 1시간의 해리 단계를 수행하였다. 표면을 100μL/min의 유속으로 10mM pH 2.1 글리신 HCl(GE Healthcare)을 18초 주입한 다음 25μL/min의 유속으로 60초 PBS-T-EDTA를 주입함으로써 재생시켰다. 결합 센서그램을 1:1 랭뮤어 모델에 맞춰 온-레이트, 오프-레이트, 및 친화도를 계산하였다.
인간 Sema3A에 대한 본 발명의 항체(클론 I)의 결합은 유사한 방법을 사용하여 수행하였지만 염소 항-인간 IgG(Invitrogen)를 사용하여 본 발명의 항체를 포획하였다. 시노몰로지(Cynomology), 마우스, 래트 또는 토끼 Sema3A에 대한 본 발명의 항체 및 Samsung ScFv의 결합을 또한 동일한 방법을 사용하여 수행하였다.
본 발명의 항체와 Samsung scFv의 동역학 및 친화도 데이터는 아래 표 11에 나열되어 있다.
Figure pct00011
결론
본 발명의 항체는 WO2017074013호에 개시된 바와 같은 3개의 Samsung scFv보다 인간, 시노, 마우스 또는 토끼 Sema3A에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다.
실시예 10: 본 발명에 따른 두 항체의 친화도의 비교
본 발명자들은 서열번호 1 내지 6에 도시된 바와 같은 CDR을 갖는 2개의 항체를 개발하였다. 2개의 항체는 Fc 영역에서 다음과 같이 다르다:
· 하나의 항체는 조합 L234A 및 L235A를 포함하고(항체 A),
· 다른 하나의 항체는 돌연변이 H435A를 포함하며(항체 B),
잔기는 카바트의 EU 지수에 따라 번호가 매겨진다.
서열번호 1 내지 6에 도시된 바와 같은 CDR을 갖는 인간 Sema3A에 대한 두 항체의 결합 친화도에는 통계적 차이가 나타나지 않았다. 따라서, 인간 Sema3A에 대한 친화도는 본 발명에 따른 Sema3A에 대해 지시된 항체에서 유지된다.
실시예 11: Sema3A에 대해 지시된 상업적으로 이용 가능한 항체의 효능
비교를 위해, 본 발명자들은 Sema3A를 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 세포 활성을 시험하였다. 상기 항체는 참조 "항-인간 SEMA3A 치료 항체, 인간화(CAT#: TAB- 556CL )" 하에 Creative Biolabs에 의해 상업화된다. 상기 상업적으로 이용 가능한 항체는 이하 "Creative Biolabs 항체"로 지칭될 것이다.
Creative Biolabs 항체의 세포 활성은 실시예 3에 개시된 동일한 프로토콜을 사용하여 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)에서 세포골격 붕괴의 측정에 의해 평가하였다. 효능의 계산 및 결정은 자극 5시간 후에 수행하였다.
이러한 조건하에서, Creative Biolabs 항체는 Sema3A에 의해 유도된 세포골격 붕괴에 대한 활성을 나타내지 않았다. Sema3A에 의해 유도된 세포골격 붕괴는 실제로 Creative Biolabs 항체에 의해 예방될 수 없었다.
따라서, Creative Biolabs 항체는 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포골격 붕괴를 예방하지 못하는 것으로 판정된 반면 동일한 조건에서 본 발명의 항체는 그러하였다. 이것은 본 발명의 항체의 놀랍고도 예상치 못한 효과를 확인시켜준다.
<110> Boehringer Ingelheim International GMBH <120> ANTI-SEMA3A ANTIBODIES AND THEIR USES FOR TREATING EYE OR OCULAR DISEASES <130> 01-3361 <150> EP19173454.0 <151> 2019-05-09 <160> 22 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH - 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Clone IV <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 21 Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 22 <211> 751 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu Lys Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe Asn Gly Leu Ala 20 25 30 Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu Glu Arg Ser Arg 35 40 45 Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe Asp Leu Val Asn 50 55 60 Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser Tyr Thr Arg Arg 65 70 75 80 Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys Glu Cys Ala Asn 85 90 95 Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His Leu Tyr Ala Cys 100 105 110 Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile Glu Ile Gly His 115 120 125 His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser His Phe Glu Asn 130 135 140 Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu Thr Ala Ser Leu 145 150 155 160 Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala Asp Phe Met Gly 165 170 175 Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His His Pro Ile Arg 180 185 190 Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro Lys Phe Ile Ser 195 200 205 Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp Asp Lys Val Tyr 210 215 220 Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His Ser Gly Lys Ala 225 230 235 240 Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp Phe Gly Gly His 245 250 255 Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile 260 265 270 Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His Phe Asp Glu Leu 275 280 285 Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys Asn Pro Val Val 290 295 300 Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys Gly Ser Ala Val 305 310 315 320 Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe Leu Gly Pro Tyr 325 330 335 Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro Tyr Gln Gly Arg 340 345 350 Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys Thr Phe Gly Gly 355 360 365 Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe Ala Arg 370 375 380 Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met Asn Asn Arg Pro 385 390 395 400 Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr Gln Ile Val Val 405 410 415 Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val Met Phe Ile Gly 420 425 430 Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile Pro Lys Glu Thr 435 440 445 Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met Thr Val Phe Arg 450 455 460 Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr Lys Gln Gln Gln 465 470 475 480 Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu Pro Leu His Arg 485 490 495 Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys Leu Ala Arg Asp 500 505 510 Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg Tyr Phe Pro Thr 515 520 525 Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn Gly Asp Pro Leu 530 535 540 Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His Gly His Ser Pro 545 550 555 560 Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser Thr Phe Leu Glu 565 570 575 Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp Gln Phe Gln Arg 580 585 590 Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp Asp His Ile Ile 595 600 605 Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln Gln Lys Asp Ser 610 615 620 Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe Ile Gln Thr Leu 625 630 635 640 Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His Leu Glu Glu Leu 645 650 655 Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr Lys Glu Met Ser 660 665 670 Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg Asp Phe Met Gln 675 680 685 Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu Phe Cys Glu Gln 690 695 700 Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg Pro Gly His Thr 705 710 715 720 Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys Lys Gly 725 730 735 Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro Arg Ser Val 740 745 750

Claims (27)

  1. - 서열번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    - 서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    - 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    - 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    - 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    - 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    여기서
    - 상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    - 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    - 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    a. 각각 서열번호 7 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
    b. 각각 서열번호 8 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
    c. 각각 서열번호 9 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
    d. 각각 서열번호 10 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    - 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 중쇄; 및
    - 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    a. 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    b. 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    c. 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    d. 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 서열번호 22에 기재된 인간 Sema3A의 아미노산 영역 370 내지 382 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 서열번호 21에 결합하는 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, Sema3A의 혈관억제 효과(vasorepressive effect)를 억제하는데 사용하기 위한, 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제10항에 있어서, 망막의 혈관재생을 개선하는데 사용하기 위한, 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 또는 망막 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 상기 질환이 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 동맥 폐쇄, 내안구염, 포도막염, 낭포성 황반 부종, 망막 질환에 따른 맥락막 신생 혈관 막, 시신경병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유도성 망막 혈관병증, 망막 신혈관화, 폴립성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세동맥류, 푹스 각막이상증(Fuch's dystrophy), 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군(usher syndrome) 및 스타가르트병(Stargardt disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 질환이 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신혈관화, 녹내장 및 맥락막 신혈관화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 질환이 당뇨병성 황반 허혈이고,
    - 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 허혈성 망막 내 혈관 재생(revascularization)을 촉진하여 눈의 유리체 영역의 병리학적 신혈관화를 방지하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 질환이 당뇨병성 황반 부종이고,
    - 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시키는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 혈액 망막 장벽의 Sema3A 유도된 투과성 및/또는 허혈성 영역의 Sema3A 유도된 혈관퇴행(vasoregression)을 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 비경구 경로, 정맥내 경로, 유리체내 경로 또는 피하 투여 경로에 의해 투여되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 유리체내 경로에 의해 투여되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물.
  23. - 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열; 및
    - 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 또는 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들).
  24. 제23항의 단리된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 발현 벡터.
  25. 제23항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드(들) 또는 제24항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. a. 제25항에 따른 숙주 세포를 수득하는 단계; 및
    b. 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항-Sema3A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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