CN113795509A

CN113795509A - 抗-sema3a抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

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Publication number: CN113795509A
Application number: CN202080034499.1A
Authority: CN
Inventors: L·托马斯; R·R·巴雷特; K·L·博瓦特; R·加内桑; P·古普塔; F·韩; D·刘; J·普雷斯特尔; S.辛格; S·文卡塔拉马尼; H·H·吴; N·齐佩尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-12-14
Also published as: IL287758A; EP3966239A1; JOP20210300A1; WO2020225400A1; JP2022531698A; US20220144929A1; MA55872A; CR20210559A; AU2020267874A1; JP2023130473A; BR112021019854A2; CO2021014768A2; SG11202110842QA; AR122266A1; TW202108621A; TWI836069B; SA521430793B1; CA3137377A1; KR20220007128A; US20200385446A1

Abstract

本发明是关于靶向信号素3A(semaphorin 3A，Sema3A)的抗体及其片段。更特定而言，公开抗‑Sema3A抗体及用于治疗各种疾病或病症的方法。

Description

抗-SEMA3A抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

【技术领域】

本发明概言之是关于靶向信号素3A(semaphorin 3A，Sema3A)的抗体及其片段。更特定而言，公开抗-Sema3A抗体及用于治疗各种疾病或病症的使用方法。亦公开包含抗-Sema3A抗体的药物组合物及试剂盒。

【先前技术】

缺血性视网膜病变的特征在于视网膜血管系统的损失或功能障碍，其导致血流减少及低氧症。视网膜缺血导致促进视网膜新血管形成的促血管生成生长因子的上调，此可导致失明。然而，当存在进入玻璃体(即眼睛的通常无血管的区)的强健病理性新血管形成时，不发生缺血性视网膜的血管重建。

该等异常新血管的生长产生对视力的大部分威胁，此乃因其可渗漏、导致出血或导致瘢痕形成，此可最终导致视网膜剥离。当前对于缺血性视网膜病变的治疗试图停止病理学血管的生长，但不解决驱动其生长的潜在缺血。此外，对于糖尿病性视网膜病变的标准治疗涉及用雷射破坏视网膜的一部分以试图停止新血管生长并保存中央视力。然而，该等治疗在某种程度上是低效的。尽管一些患者可维持稳定视力许多年，但高百分比的遭受视网膜病变的患者最终遭受完全视力丧失。

因此，仍然存在对有效治疗眼或视网膜疾病的新治疗方法的未满足的需求。

【发明内容】

Sema3A是属3类信号素家族(Sema3)的内源性分泌蛋白，其最初被鉴别为轴突导向分子并涉及血管路径形成及网络形成。神经周期蛋白1及2(Nrp1及Nrp2)及A/D型神经丛蛋白(Plxn)在内皮细胞(EC)表面上用作Sema3受体复合物的配体结合及信号转导亚单位。作为Sema3家族的特殊成员，Sema3A首先排他地结合至Nrp1，且然后与神经丛蛋白A1-4组合为复合物(Nrp1/PlexA1-4)。在此受体复合物中，Nrp1用作结合组件，而PlexA1-4用作信号转导组件。

人信号素3A是如SEQ ID NO:22中所公开且可以NCBI参照序列NP_006071.1获得的蛋白质。此外，人Sema3A由基因ID:10371(NCBI)编码。

Sema3A在肿瘤血管生成及转移中已经研究了多年，但其对视网膜新血管形成的效应仍不清楚。本发明者已例证信号素3A由低氧视网膜神经节细胞分泌，并用作血管推斥提示。Sema3A通过诱导该等细胞中的细胞骨架塌陷推斥新血管远离缺血区。不期望受限于理论，本发明者已假设此将解释为何不发生缺血区的血管重建，且相反Sema3A的上调导致病理性新血管形成进入玻璃体区中。

信号素3A由缺血/无血管视网膜中的低氧神经元分泌，藉此抑制视网膜的血管再生并增强病理性视网膜前新血管形成。

本发明者通过研发靶向Sema3A的抗体解决此病理情况。因此，本发明提供特异性结合至Sema3A、优选人Sema3A的单克隆抗体。

在第一方面中，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)、及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在另一实施方案中，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

-重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；且

-轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列。

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

a.分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

b.分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

c.分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；或

d.分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。

-重链，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的氨基酸序列、优选由其组成；及

-轻链，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列、优选由其组成。

在特定实施方案中，本发明是关于抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

b.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

c.包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链；或

d.包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

在尤其优选实施方案中，抗-Sema3A抗体是人类化抗-Sema3A抗体。

在第二方面中，本发明提供结合至如SEQ ID NO:22中所绘示的人Sema3A的氨基酸区370-382内的至少一个氨基酸残基的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明提供结合至如SEQ ID NO:21(DSTKDLPDDVITF)中所述的氨基酸区内的至少一个氨基酸残基的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。在优选实施方案中，本发明提供结合如SEQ ID NO:21中所述的氨基酸区的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在第三方面中，本发明提供用作药剂的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明提供用于抑制SemaA的血管抑制效应(vasorepressiveeffect)及/或用于改良视网膜的血管重建的抗-Sema3A或抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防视网膜或眼疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在第四方面中，本发明提供用于治疗或预防选自由以下组成的群的疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段：视网膜病变、缺血性视网膜病变、糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养性萎缩、近视性变性、视网膜动脉阻塞、眼内炎、葡萄膜炎、囊样黄斑水肿、由任何视网膜疾病继发的脉络膜新生血管膜、视神经疾病、青光眼、视网膜剥离、毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、创伤性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、视网膜新血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、福斯氏营养性萎缩(Fuch's dystrophy)、黄斑毛细血管扩张症、尤塞氏综合征(usher syndrome)及斯特格氏病(Stargardt disease)。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗或预防选自由以下组成的群的疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段：糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、缺血性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新血管形成、青光眼及脉络膜新血管形成。优选地，该疾病是糖尿病黄斑水肿及/或糖尿病黄斑缺血。

在优选实施方案中，本发明提供通过促进缺血性视网膜内血管再生(血管重建)及预防眼的玻璃体区的病理性新血管形成用于治疗糖尿病黄斑缺血的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在另一优选实施方案中，本发明提供通过降低血液视网膜屏障的渗透性用于治疗糖尿病黄斑水肿的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在另一优选实施方案中，本发明提供用于抑制Sema3A诱导的血液视网膜屏障渗透性及/或Sema3A诱导的缺血性区域的血管消退的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在第五方面中，本发明提供包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段及药物上可接受的载剂的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段或包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段是通过非经肠投与途径、静脉内投与途径、玻璃体内投与途径或皮下投与途径、优选通过玻璃体内途径来投与。

在第六方面中，本发明提供一或多种分离的聚核苷酸，其包含：

-编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及

-编码如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的轻链或如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供包含一或多种分离的聚核苷酸的表达载体，该一或多种分离的聚核苷酸包含编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供包含一或多种分离的聚核苷酸的病毒载体，该一或多种分离的聚核苷酸包含编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供包含表达载体或一或多种分离的聚核苷酸的宿主细胞，该表达载体或一或多种分离的聚核苷酸包含编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQID NO:20中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供产生抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的方法，其包含获得包含表达载体或一或多种分离的聚核苷酸的宿主细胞，该表达载体或一或多种分离的聚核苷酸包含编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列；及培养该宿主细胞。

在一个实施方案中，产生抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的方法进一步包含回收及纯化该抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

【附图说明】

图1：Sema3A于人眼中的定位

此图显示与年龄匹配对照(年龄ctrl)及患有糖尿病但无眼部病状的个体(DMctrl)相比，在来自具有糖尿病视网膜病变或原发性开角型青光眼(POAG)病史的人供体的预先指定的视网膜样品中，Sema3A在人眼中的定位。在视网膜血管的血管系统壁中发现Sema3A。另外，在视网膜神经节细胞层中观察到未鉴别但独特的Sema3A荧光物体。

图2：细胞渗透性分析中的效能

在transwell分析中测量FITC-聚葡萄糖在人视网膜微血管内皮细胞中的渗透。抗TNP是对抗三硝基苯酚的对照抗体。抗-Sema3A是本发明的抗体(纯系I)。显示相对于重组人Sema3A的显著性。

图3：HRMEC(Xcelligence)中的细胞骨架塌陷

Sema3A-F在人视网膜内皮细胞中均诱导细胞骨架塌陷。本发明的抗体(纯系I)对Sema3A具有特异性，且仅预防Sema3A诱导的塌陷。

图4：对活体内尖端细胞密度及无血管区域的效能

(A)及(C)在小鼠幼崽中氧诱导的视网膜病变的模型中研究尖端细胞密度及无血管区域。将动物自P7至P12暴露于75％氧气，且在P12恢复至含氧量正常后，接受单次玻璃体内注射抗体。抗TNP是对抗三硝基苯酚的对照抗体。抗-Sema3A是本发明的抗体(纯系I)。在P17，制备视网膜平铺片，用同工凝集素B4染色并对尖端细胞进行计数及测定视网膜无血管区域的大小。

(B)显示尖端细胞密度与无血管区域之间的相关性。

【实施方式】

定义

抗体或免疫球蛋白的一般结构为本领域技术人员熟知，该等分子是异四聚体糖蛋白，通常约150,000道尔顿，由两条相同的轻(L)链及两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个二硫键与重链共价连接以形成异二聚体，且异三聚体分子经由异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键形成。尽管轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两条重链之间的二硫键的数目根据免疫球蛋白同型而变化。每条重链及轻链亦具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在氨基末端具有可变结构域(V_H＝可变重链)，之后是三个或四个恒定结构域(C_H1、C_H2、C_H3及C_H4)，以及C_H1与C_H2之间的铰链区。每条轻链具有两个结构域，即氨基末端可变结构域(V_L＝可变轻链)及羧基末端恒定结构域(C_L)。V_L结构域与V_H结构域非共价缔合，而C_L结构域通常经由二硫键与C_H1结构域共价连接。据信特定氨基酸残基在轻链及重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人，1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。

可变结构域内的某些结构域在不同抗体之间广泛地不同，即是“超变的”。该等超变结构域含有直接参与每一特定抗体对其特异性抗原决定子的结合及特异性的残基。轻链及重链可变结构域二者中的超变性集中在三个称为互补决定区(CDR)或超变环(HVL)的区段中。CDR是通过Kabat等人，1991于以下中的序列比较来定义：Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.，而HVL是根据如Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所述的可变结构域的三维结构在结构上定义。在该两种方法导致CDR的鉴别略微不同的情况下，结构定义优选。如Kabat所定义，CDR-L1位于轻链可变结构域中约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，且CDR-L3位于约残基89-97处；CDR-H1位于重链可变结构域中约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，且CDR-H3位于约残基95-102处。因此，重链及轻链的CDR1、CDR2、CDR3定义对给定抗体特异的独特及功能性质。

重链及轻链中的每一者内的三个CDR由框架区(FR)分开，该等框架区含有倾向于较少变化的序列。自重链及轻链可变结构域的氨基末端至羧基末端，FR及CDR按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的大部分β-片构形使每条链内的CDR彼此紧密接近，以及与来自其他链的CDR紧密接近。所得构形有助于抗原结合位点(参见Kabat等人，1991,NIH Publ.第91-3242号，第I卷，第647-669页)，但并非所有CDR残基皆一定直接参与抗原结合。

FR残基及Ig恒定结构域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合及/或介导抗体效应物功能。一些FR残基被认为以至少三种方式对抗原结合具有显著影响：通过非共价直接结合至表位、通过与一或多个CDR残基相互作用及通过影响重链与轻链之间的界面。恒定结构域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应物功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

基于恒定结构域的氨基酸序列，将脊椎动物免疫球蛋白的轻链分配为两种明显不同的类别卡帕(kappa,κ)及兰姆达(lambda，λ)之一。通过比较，根据恒定结构域的序列，将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配为五大类之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步分成亚类(同型)，例如分别为IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。天然免疫球蛋白类别的亚单元结构及三维构形是众所周知的。

术语“抗体”、“抗-Sema3A抗体”、“人类化抗-Sema3A抗体”及“变体人类化抗-Sema3A抗体”在本文以最广泛意义使用，且具体而言包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，例如可变结构域及抗体中展现期望生物学活性(例如结合Sema3A)的其他部分。

术语“单克隆抗体”(mAb)是指实质上同源的抗体群体的抗体；即，除了可以微量存在的天然存在的突变外，该群体中的个别抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原决定子，即“表位”。因此，修饰语“单克隆”指示针对相同表位的抗体的实质上同源的群体，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。应理解，单克隆抗体可通过业内已知的任何技术或方法制得；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人，1975,Nature256:495)、或业内已知的重组DNA方法(例如，参见美国专利第4,816,567号)、或使用噬菌体抗体文库重组产生的单克隆、使用Clackson等人，1991,Nature352:624-628及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术的分离方法。

嵌合抗体由来自一个物种(例如，非人哺乳动物，例如小鼠)的抗体的重链及轻链可变区以及另一物种(例如人)抗体的重链及轻链恒定区组成，且可通过将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体的可变区的DNA序列与来自第二(例如人)物种的抗体的恒定区的DNA序列连接并用含有连接序列的表达载体转变宿主以使其产生嵌合抗体来获得。或者，嵌合抗体亦可为其中重链及/或轻链的一或多个区或结构域与来自另一免疫球蛋白类别或同型或来自共有序列或种是序列的单克隆抗体中的相应序列相同、同源或为其变体的抗体。嵌合抗体可包括此类抗体的片段，条件是抗体片段展现其亲代抗体的期望生物学活性，例如结合至相同表位(例如，参见美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。

术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗-Sema3A抗体片段”、“人类化抗-Sema3A抗体片段”、“变体人类化抗-Sema3A抗体片段”是指全长抗-Sema3A抗体的一部分，其中保留可变区或功能能力，例如特异性Sema3A表位结合。抗体片段的实施例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双价抗体、线性抗体、单链抗体、微小抗体、自抗体片段形成的双价抗体及自抗体片段形成的多特异性抗体。

可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶等酶处理全长抗体以产生有用的抗体片段。木瓜酶消解用于产生两个相同的抗原结合抗体片段，称为“Fab”片段(各自具有单一抗原结合位点)及残余“Fc”片段。Fab片段亦含有轻链的恒定结构域及重链的C_H1结构域。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能交联抗原的F(ab')₂片段。

Fab'片段与Fab片段的区别在于存在额外残基，包括C_H1结构域的C-末端处抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。F(ab')₂抗体片段是由铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。抗体片段的其他化学偶合亦是已知的。

“Fv”片段含有完整的抗原识别及结合位点，其由紧密、非共价缔合的一个重链及一个轻链可变结构域的二聚体组成。在此构形中，每一可变结构域的三个CDR相互作用以界定V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段是包含抗体的V_H及V_L结构域的单链Fv变体，其中结构域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别及结合抗原。scFv多肽亦可任选含有位于V_H及V_L结构域之间的多肽连接体，以促进形成scFv结合抗原期望的三维结构(参见例如Pluckthun,1994,In The Pharmacology of monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。

其他识别的抗体片段包括包含一对串联Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)以形成一对抗原结合区的那些抗体片段。该等“线性抗体”可为双特异性或单特异性的，例如Zapata等人1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所述。

人类化抗体或人类化抗体片段是一种特定类型的嵌合抗体(其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体)或其片段，其能够结合至预定抗原，且其包含一或多个实质上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的FR及一或多个实质上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。此通常称为“输入”序列的非人氨基酸序列通常取自“输入”抗体结构域、特定而言可变结构域。一般而言，人类化抗体至少包括非人抗体的CDR或HVL，其插入人重链或轻链可变结构域的FR之间。

本发明阐述特异性人类化抗-Sema3A抗体，其含有源自插入人种是序列重链及轻链可变区FR之间的鼠类或嵌合抗体的CDR。应理解，某些鼠类FR残基对于人类化抗体的功能可为重要的，且因此某些人种是序列重链及轻链可变结构域残基经修饰为与相应鼠类序列的那些相同。

本文所用的表达“本发明的抗体”及“本发明的抗-Sema3A抗体”是指本文所述的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。优选地，该表达是指包含以下的任何抗体：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ IDNO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在一方面中，人类化抗-Sema3A抗体包括至少一个、且通常两个可变结构域(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中所含有的可变结构域)的实质上全部，其中全部或实质上全部CDR对应于非人免疫球蛋白的那些CDR，且在本文中具体地，CDR是鼠类序列，且FR是人免疫球蛋白共有序列或种是序列的那些FR。在另一方面中，人类化抗-Sema3A抗体亦包括通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白Fc区的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变结构域。若适当，抗体亦可包括重链的C_H1、铰链、C_H2、C_H3及/或C_H4区中的一或多者。

人类化抗-Sema3A抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。举例而言，恒定结构域可为补体固定恒定结构域，其中期望人类化抗体展现细胞毒性活性，且同型通常是IgG₁。在不期望该细胞毒性活性的情况下，恒定结构域可为另一同型，例如IgG₂。替代人类化抗-Sema3A抗体可包含来自一种以上免疫球蛋白类别或同型的序列，且选择特定恒定结构域以优化期望效应物功能在业内的普通技术范围内。在具体实施方案中，本发明提供抗体，其为IgG1抗体，更特定而言为特征在于降低的效应物功能的IgG1抗体。

优选地，本发明的抗-Sema3A抗体是格式化为IgG1KO的人类化抗体。

人类化抗-Sema3A抗体的FR及CDR或HVL无需精确对应于亲代序列。举例而言，可通过取代、插入或缺失改变(例如诱变)输入CDR或HVL或共有序列或种是FR序列中的一或多个残基，使得所得氨基酸残基不再与任一亲亲序列中相应位置中的原始残基相同，但抗体仍保留与Sema3A结合的功能。该改变通常并非广泛的，且将为保守改变。通常，至少75％、更通常至少90％、且最经常大于95％、或大于98％或大于99％的人类化抗体残基将对应于亲代共有序列或种是FR及输入CDR序列的那些。

影响重链及轻链可变区之间的界面(“V_L-V_H界面”)的免疫球蛋白残基是影响两条链相互之间的接近或取向的那些。可参与链间相互作用的某些残基包括V_L残基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及V_H残基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(利用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1987)中所述的编号系统)。美国专利第6,407,213号亦论述诸如V_L残基43及85及V_H残基43及60等残基亦可参与此相互作用。尽管该等残基仅适用于人IgG，但其跨物种亦适用。选择合理预期参与链间相互作用的重要抗体残基用于取代至共有序列中。

术语“共有序列”及“共有抗体”是指包含在任何特定类别、同型或亚单元结构的所有免疫球蛋白中的每一位置最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列，例如人免疫球蛋白可变结构域。共有序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。“共有”序列、结构或抗体应理解为涵盖如某些实施方案中所述的共有人序列，且是指包含在任何特定类别、同型或亚单元结构的所有人免疫球蛋白中的每一位置最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共有序列含有在每一位置具有存在于一或多种已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其可不与任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列完全重复。可变区共有序列并非自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白获得。Kabat等人，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.及其变体。重链及轻链共有序列的FR及其变体提供制备人类化抗-Sema3A抗体的有用序列。参见例如美国专利第6,037,454号及第6,054,297号。

人种是序列天然存在于人群体中。那些种是基因的组合产生抗体多样性。抗体的轻链的种是抗体序列来自保守的人种是κ或λV基因及j基因。类似地，重链序列来自种是v-、d-及j-基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“The Immunoglobulin Facts Book”AcademicPress,2001)。

“分离的”抗体是已经自其天然环境的组分中鉴别及分离及/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的那些物质，且可为酶、激素或其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一方面中，抗体将纯化至按抗体重量计至少大于95％分离。

术语“抗体性能”是指有助于抗体识别抗原或抗体在活体内有效性的因素/性质。在优选实施方案中，其是指抗体防止视网膜细胞中细胞骨架塌陷的能力。抗体的氨基酸序列的变化可影响抗体性质(例如折迭)，且可影响物理因素，例如抗体与抗原结合的初始速率(k_a)、抗体自抗原的解离常数(k_d)、抗体对抗原的亲和常数(Kd)、抗体的构形、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。

如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致”或“一致性百分比”是指当为了最大对应性进行比较及比对时，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。为了确定一致性百分比，将序列比对以用于最佳比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入缺口以用于与第二氨基酸序列或第二核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置一致。两个序列之间的一致性百分比是该等序列所共享的一致位置数的函数(即，一致性％＝一致位置数/总位置数(例如重迭位置)×100)。在一些实施方案中，若适当(例如，排除延伸超出所比较的序列的额外序列)，在序列内引入缺口后，经比较的两个序列具有相同长度。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导及/或恒定结构域序列。对于两个序列之间的序列比较，“相应”CDR是指两个序列中相同位置中的CDR(例如，每一序列的CDR-H1)。

两个序列之间的一致性百分比或相似性百分比的测定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实施例是Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中所修饰。该算法纳入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)实施，以获得与编码所关注蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)实施，以获得与所关注蛋白质同源D氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可如Altschul等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述利用缺口BLAST。或者，可使用PSI-Blast以实施检测分子之间的远程关系的迭代搜索(同上)。当利用BLAST、缺口BLAST及PSI-Blast程序时，可使用各别程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实施例是Myers及Miller，CABIOS(1989)的算法。将该算法纳入ALIGN程序(2.0版)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分及4的空位罚分。用于序列分析的额外算法为业内已知且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设定搜索的灵敏度及速度的控制选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对发现所比较的两个序列中的相似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。ktup对于蛋白质序列可设定为2或1，或对于DNA序列可设定为1至6。若ktup未指定，则缺省值对于蛋白质为2且对于DNA为6。或者，可使用如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所述的CLUSTALW算法实施蛋白质序列比对。

本文所用表述“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用，且所有该等名称皆包括其后代。因此，“转变体”及“转变细胞”包括原代个体细胞及自其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。

出于治疗目的，术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜及农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛及诸如此类。优选地，哺乳动物是人。

本文所用的“疾病”或“病症”是任何会受益于本文所述人类化抗-Sema3A抗体治疗的病况。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理状况。

术语“玻璃体内注射”具有其在业内的正常含义，且是指将抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段引入患者的玻璃体中。

术语“皮下投与”是指通过自药物容器相对缓慢、持续递送，在动物或人患者的皮肤下、优选在皮肤与下伏组织之间的囊内引入抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。将皮肤捏起或拉起并远离下伏组织可产生囊。

术语“皮下输注”是指通过自药物容器相对缓慢、持续递送一段时间(包括但不限于30分钟或更短、或90分钟或更短)，在动物或人患者的皮肤下、优选在皮肤与下伏组织之间的囊内引入药物。任选，输注可通过皮下植入药物递送泵来进行，该药物递送泵植入动物或人患者的皮肤下，其中泵在预定的时间段(例如30分钟、90分钟或跨越治疗方案的长度的时间段)内递送预定量的药物。

术语“皮下推注”是指在动物或人患者的皮肤下的药物投与，其中推注药物递送少于大约15分钟，在另一方面中少于5分钟，且在又一方面中少于60秒。在又一方面中，投与是在皮肤与下伏组织之间的囊内，其中囊可通过将皮肤捏起或拉起并远离下伏组织而产生。

术语“治疗有效量”用于指减轻或改善所治疗病症的一或多种症状的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的量。在减轻或改善所治疗病症的一或多种症状时，其是具有有益的患者结果的量。根据欲治疗的病况，可以习用方式测量效能。举例而言，在特征在于表达Sema3A的细胞的眼/视网膜疾病或病症中，可通过测定反应率，例如视力恢复或通过评价直至疾病进展的延迟时间来测量效能。

本文所用术语“治疗”及“疗法”及诸如此类意指包括对疾病或病症的治疗性以及预防性或抑制性措施，其导致任何临床上期望或有益的效应，包括(但不限于)一或多种症状的缓和或缓解、使疾病或病症消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，藉此预防或去除疾病或病症的一或多种体征。作为另一实施例，该术语包括在疾病临床表达后投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，在发作后及临床症状已发展后投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段(其中无论该治疗是否导致改善疾病，该投药法仍会影响疾病或病症的临床参数)包括本文使用的“治疗”或“疗法”。此外，与不使用抗-Sema3A抗体组合物或其抗原结合片段时的症状相比，只要本发明的组合物单独或与另一治疗剂的组合可以缓和或改善所治疗病症的至少一种症状，即应认为该结果是有效治疗该根本病症，不论该病症的所有症状是否缓和。

术语“包装插页”用于指通常包括于治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、投与、禁忌症及/或关于使用该等治疗产品的警告的信息。

本发明的抗体

在第一方面中，本发明是关于抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。优选地，该抗体是人类化抗-Sema3A抗体、更优选人类化单克隆抗-Sema3A抗体。

在初始表征中，通过将鼠类抗体的CDR放置于人共有重链及轻链可变结构域的FR中且进一步通过工程化具有不同改变的FR，产生靶向Sema3A变体的抗体文库。

此产生针对Sema3A的人类化抗体，其具有如本文公开的增强性质。本发明的抗体的序列示于下表1中。

表1：

在一个实施方案中，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。

其中：

在优选实施方案中，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

-分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

-分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；或

-分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。

a.包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链，该抗体称作“纯系I”；

b.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链，该抗体称作“纯系II”；

c.包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链，该抗体称作“纯系III”；或

d.包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链，该抗体称作“纯系IV”。

通过在Fc区中引入突变制备IgG1-KO突变体。用以降低或抑制效应物功能的突变为本领域技术人员所熟知，且充分公开于先前技术中，例如于Wang等人，Protein Cell2018,9(1):63-73及Stewart等人Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014,2:29中。通常，为了降低Fc的效应物功能而在IgG1 Fc区中引入的突变的非限制性清单包含：

-L234A及L235A；

-L234A、L235A及N297Q；

-L234A、L235A及P329G；或

-L234A、L235A及D265A；

其中残基根据Kabat的EU索引编号。

在优选实施方案中，本发明的抗体包含Fc区中的两个突变L234A及L235A以降低效应物功能。

本文公开及SEQ ID NO:1至6中绘示的CDR根据Kabat编号呈现，且在下表2中用Kabat位置概述。

表2：

CDR	Kabat序列	Kabat位置	SEQ ID NO:
				HCDR1	SYYMS	31-35	1
HCDR2	TIIKSGGYAYYPDSVKD	50-66	2
				HCDR3	GGQGAMDY	99-106	3
LCDR1	RASQSIGDYLH	24-34	4
				LCDR2	YASQSIS	50-56	5
LCDR3	QQGYSFPYT	89-97	6

本发明的抗-Sema3A抗体以高亲和性结合至人Sema3A。在关于此方面的实施方案中，本发明的抗-Sema3A抗体以K_D<50pM结合至人Sema3A。在另一实施方案中，如实施例4中所例示，本发明的抗-Sema3A抗体以K_D<35pM结合至人Sema3A。在优选实施方案中，本发明的抗-Sema3A抗体以K_D<30pM结合至人Sema3A。

本发明的抗-Sema3A抗体亦结合至cyno-Sema3A、小鼠Sema3A、大鼠Sema3A及兔Sema3A。

本发明的抗-Sema3A抗体以小于100pM、优选小于80pM、更优选小于70pM的功能功效预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷。在优选实施方案中，本发明的抗-Sema3A抗体以69pM的功能功效预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷，如实施例4中所例示。

在另一方面中，如实施例5中所述，证明本发明的抗-Sema3A抗体具有低免疫原性风险。此依赖于计算机预测抗体的免疫原性。免疫原性风险通常通过各种众所周知的方法来评价，例如通过用于预测T细胞表位的计算机算法，该等T细胞表位是主要的免疫原性影响因素。

实际上已报导，通过使用基于计算矩阵方法(可以名称EpiMatrix(由EpiVax生产)获得)的算法可预测所关注蛋白质中存在的含有T细胞表位的序列。本领域技术人员可参考Van Walle等人，Expert Opin Biol Ther.2007年3月；7(3):405-18及Jawa等人，ClinImmunol.2013年12月；149(3):534-55。

本发明者已显示，本发明的抗体比先前技术中提及及本文阐述的靶向Sema3A的其他抗体或片段显示更有利的性质。

本发明者比较WO2014123186(Chiome Bioscience)中公开的靶向Sema3A的抗体的结合亲和性与本发明的抗体的亲和性。公开WO2014123186的抗体，其用于治疗阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)。本实施例8显示本发明的抗体证明比Chiome Bioscience公开的先前技术抗体对人Sema3A具有更高的结合亲和性。

本发明者亦比较本发明的抗体的性质与WO2017074013(Samsung)中公开的ScFv片段。公开该等片段，其用于治疗各种癌症。实施例9显示本发明的抗体证明比WO2017074013公开的先前技术抗体片段对人Sema3A具有更高的结合亲和性。

更高的结合亲和性延长玻璃体内注射抗体后Sema3A的中和的时间，且允许降低的注射频率。更高的结合亲和性进一步允许投与更低的剂量，从而限制潜在副作用。因此，本发明的抗体提供优于先前技术抗体的技术优势。改良的结合亲和性及降低的注射频率显著改善有需要的患者的治疗效能。其亦为患者提供有价值的益处，尤其改良的药物依从性及顺从性。

本发明者亦比较本发明的抗体及如实施例11中所述的靶向Sema3A的市售抗体的功能功效。本发明者已显示，在相同条件下，本发明的抗体预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷(实施例3)，而市售抗体则不能(实施例11)。

人类化及氨基酸序列变体

基于SEQ ID NO:1至6中绘示的序列下鉴别的CDR组，可改造其他变体抗-Sema3A抗体及抗体片段。应理解，在该等变体抗-Sema3A抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但周围区域(例如FR区)可经改造。抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的核苷酸改变引入抗-Sema3A抗体DNA、或通过肽合成来制备。该等变体包括(例如)本文实施例的抗-Sema3A抗体的氨基酸序列内残基的缺失、及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构筑体，条件是最终构筑体具有期望特征。氨基酸改变亦可改变人类化或变体抗-Sema3A抗体的转译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。

抗体的另一类型的氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。术语“改变”在此上下文中意指缺失抗体中发现的一或多个碳水化合物部分、及/或添加抗体中先前不存在的一或多个糖基化位点。

在一些方面中，本发明包括编码本文所述抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子是通过业内已知的各种方法制备。该等方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情形下)或通过先前制备的抗-Sema3A抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变及盒式诱变来制备。

在某些实施方案中，抗-Sema3A抗体是抗体片段。已研发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白水解消解而衍生(参见例如Morimoto等人,1992,Journalof Biochemical and Biophysical Methods24:107-117；及Brennan等人,1985,Science229:81)。或者，片段可直接在重组宿主细胞中产生。举例而言，Fab'-SH片段可直接自大肠杆菌回收且化学偶合以形成F(ab')₂片段(例如，参见Carter等人，1992,Bio/Technology10:163-167)。通过另一种方法，可直接自重组宿主细胞培养物分离F(ab')₂片段。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练从业者将是显而易见的。

抗-Sema3A抗体及其抗原结合片段可包括修饰。

在某些实施方案中，可期望使用抗-Sema3A抗体片段而非完整抗体。可期望修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此可通过(例如)将补救受体结合表位纳入抗体片段中来达成。在一种方法中，可改变(例如突变)抗体片段的适当区，或者可将表位纳入肽标签中，然后例如通过DNA或肽合成将肽标签在任一末端或中间融合至抗体片段。例如，参见WO 96/32478。

在其他实施方案中，本发明包括抗-Sema3A抗体的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、离氨酰基及氨基末端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或麸氨酰基)、麸酰氨酰基及天冬酰氨酰基残基、或丝氨酰基、或苏氨酰基残基的修饰。另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶合至抗体。若适用，可通过化学合成或通过抗体的酶促或化学裂解进行该等修饰。通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或氨基或羧基末端残基反应的有机衍生剂反应，可将抗体的其他类型的共价修饰引入分子中。

可以化学或酶促方式完成抗体上存在的任何碳水化合物部分的去除。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.,118:131阐述。抗体上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用各种内切及外切糖苷酶来达成，如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol 138:350中所述。

另一种类型的有用的共价修饰包含以美国专利第4,640,835号、美国专利第4,496,689号、美国专利第4,301,144号、美国专利第4,670,417号、美国专利第4,791,192号及美国专利第4,179,337号中的一或多者中所述的方式将抗体与多种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)之一连接。

表位结合

在第二方面中，本发明是关于识别特异性“Sema3A抗原表位”及“Sema3A表位”的抗体。具体而言，本发明的抗体结合至具有SEQ ID NO:22的人Sema3A的表位。

在一方面中，本发明是关于结合至如SEQ ID NO:22中所述的人Sema3A的氨基酸区370-382内的至少一个氨基酸残基的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在另一方面中，本发明是关于结合至SEQ ID NO:21的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

序列SEQ ID NO:21及22绘示于下表5中。

表5

本文所用术语“Sema3A抗原表位”及“Sema3A表位”是指能够结合至抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的分子(例如肽)或分子的片段。该等术语进一步包括(例如)由本发明的任何抗体或抗体片段识别的Sema3A抗原决定子，其具有选自SEQ ID NO:1-3的重链CDR及SEQ ID NO:4至6的轻链CDR的轻链及重链CDR组合。

Sema3A抗原表位可包括于蛋白质、蛋白质片段、肽或诸如此类中。表位是最常见的蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(即模拟Sema3A抗原的抗体结合性质的有机化合物)或其组合。

已发现，本发明的抗体或抗体片段结合至人Sema3A的独特表位。优选地，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:22的人Sema3A的细胞外结构域的氨基酸区370-382内的至少一个氨基酸残基。此表位位于Sema3A及神经丛蛋白A受体受体的界面附近。抗体与此表位的结合抑制配体Sema3A、受体神经丛蛋白A及辅受体Nrp1的信号传导完整全受体(holoreceptor)复合物的形成，从而导致干扰该信号传导的生物学效应。

在表位结合的上下文中，词组“在氨基酸区X-Y…内结合”意指抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至序列中指示的氨基酸区内的至少一个、优选所有氨基酸残基。

在另一方面中，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的SEQ ID NO:22中绘示的氨基酸序列。优选地，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:22。

治疗用途

在第三方面中，本发明是关于抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用作药剂。

在一个实施方案中，本发明提供抗-Sema3A或抗原结合片段，其用于抑制SemaA的血管抑制效应及/或用于改良视网膜的血管重建。

优选地，本发明提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防视网膜或眼疾病。实际上，本发明者已研发靶向Sema3A的抗体，其对以下方面极为有帮助：

-将血管生成重新定向至缺血性区，以改良视网膜的血管重建；

-预防玻璃体区的病理性新血管生成；以及

-防止血液视网膜屏障破坏。

如先前所提及，Sema3A是由低氧视网膜神经节细胞分泌的血管推斥提示。通过结合至神经周期蛋白-1，其活化内皮细胞上神经丛蛋白受体的细胞内信号传导，从而导致肌动蛋白纤维的解装配。此导致尖端细胞的丝状伪足中的细胞骨架塌陷，该等尖端细胞系指导新血管生长并阻止视网膜中缺血性区的血管再生的专门内皮细胞。本发明者已显示，用中和Sema3A-抗体调节血管推斥作用将增加TIP细胞的数量，并将血管生成重新定向至缺血性区，例如患有糖尿病黄斑缺血的人中的病理性扩大的中心凹无血管区。

因此，在第四方面中，本发明是关于用于治疗或预防选自由以下组成的群的疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段：视网膜病变、缺血性视网膜病变、糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养性萎缩、近视性变性、视网膜动脉阻塞、眼内炎、葡萄膜炎、囊样黄斑水肿、由任何视网膜疾病继发的脉络膜新生血管膜、视神经疾病、青光眼、视网膜剥离、毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、创伤性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、视网膜新血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、福斯氏营养性萎缩、黄斑毛细血管扩张症、尤塞氏综合征及斯特格氏病。

本发明的抗-Sema3A抗体尤其可用于治疗或预防糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、缺血性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新血管形成及脉络膜新血管形成。

在优选实施方案中，该疾病是糖尿病黄斑缺血且本发明的抗体促进缺血性视网膜内的血管再生(血管重建)且预防眼的玻璃体区的病理性新血管形成。

在另一优选实施方案中，该疾病是糖尿病黄斑水肿且本发明的抗体降低血液视网膜屏障的渗透性。

在优选方面中，本发明的抗体可用于治疗糖尿病黄斑水肿(DME)及/或糖尿病黄斑缺血(DMI)。在优选实施方案中，本发明的抗体可用于治疗患有DME及DMI的患者。优选地，本发明的抗体用于治疗由超过15％、20％、25％及更优选30％的中心凹无血管区(FAZ)扩大所定义的DMI。

抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段是通过任何适宜方式(包括玻璃体内、经口、非经肠、皮下、腹膜内、肺内及鼻内)投与。非经肠输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜腔内或皮下投与。此外，通过脉冲输注、具体而言利用降低剂量的抗体适宜地投与抗-Sema3A抗体。在一个方面中，通过注射、最佳静脉内或皮下注射给予剂量，此部分地端视投与时间长短而定。优选地，抗-Sema3A抗体是经由玻璃体内注射至眼中来给予。

为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将取决于多种因素，例如如上文所定义的欲治疗疾病的类型、疾病的严重程度及进程、投与抗体是用于预防目的亦是治疗目的、先前疗法、患者的临床史及对抗体的反应、以及主治医师的判断。将抗体适宜地一次性或经一系列治疗投与给患者。

在优选实施方案中，本发明的抗体每次注射可适用的剂量范围通常为1mg/眼至10mg/眼，优选介于1.5mg/眼与5mg/眼之间，更优选介于2mg/眼与3mg/眼之间，且甚至更优选为约2.5mg/眼。

术语“抑制”在本文中与“改善”及“减轻”在相同的上下文中使用，以意指减轻或减少疾病的一或多种特征。

抗体组合物将以与良好医疗实践一致的方式调配、投药及投与。在此上下文中需考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、药剂的递送位点、投与方法、投与时间安排及从业医师所知的其他因素。欲投与的抗体的“治疗有效量”将由该等考虑因素决定，且是预防、改善或治疗由本发明的抗体解决的眼或视网膜疾病所必需的最小量。

抗体不必(但任选)与一或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。这些其他药剂的有效量端视调配物中所存在抗-Sema3A抗体的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其他因素而定。该等其他药剂通常以与上文所用相同的剂量及投与途径来使用或是上文所用剂量的约1％至99％。

在另一方面，本发明亦是关于抗-Sema3A抗体或抗原结合片段，其用于治疗或预防非眼科疾病，例如自体免疫性关节炎、神经病性疼痛、骨质疏松症及癌症。

治疗方法

在另一方面中，本发明亦涵盖治疗或预防有需要的患者的眼或眼部疾病的任何方法，该方法包含投与本发明的抗-Sema3A抗体。

优选地，本发明是关于使用本发明的抗体抑制SemaA3的血管抑制效应的方法。更优选地，本发明是关于用于改良视网膜的血管重建的该方法。

优选地，本发明是关于治疗或预防眼或视网膜疾病的方法，其包含向有需要的患者投与药物有效量的本发明的抗体。优选地，该疾病选自由以下组成的群：视网膜病变、缺血性视网膜病变、糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养性萎缩、近视性变性、视网膜动脉阻塞、眼内炎、葡萄膜炎、囊样黄斑水肿、由任何视网膜疾病继发的脉络膜新生血管膜、视神经疾病、青光眼、视网膜剥离、毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、创伤性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、视网膜新血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、福斯氏营养性萎缩、黄斑毛细血管扩张症、尤塞氏综合征及斯特格氏病。更优选地，该疾病选自由以下组成的群：糖尿病视网膜病变(包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变)、缺血性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新血管形成、青光眼及脉络膜新血管形成。在又一优选实施方案中，该疾病是糖尿病黄斑水肿及/或糖尿病黄斑缺血。

本文所述的所有公开的技术特征皆适用于该治疗方法。

药物组合物及其投与

可将包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的组合物投与患有眼或视网膜疾病或处于患有眼或视网膜疾病的风险下的个体。本发明进一步提供抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于预防或治疗眼或视网膜疾病或Sema3A疾病的药剂。本文所述的所有公开的技术特征皆适用于抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段在制造药剂中的该用途。本文所用术语“个体”意指可投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的任何哺乳动物患者，包括(例如)人及非人哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿类动物及狗。特别意欲使用本文所述方法治疗的个体包括人。抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段可单独或与其他组合物组合投与。

已知各种递送系统，且其可用于投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。引入方法包括(但不限于)玻璃体内、眼药水、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段可通过(例如)输注、浓注或注射投与，且可与其他生物活性剂一起投与。投与可为全身或局部投与。在优选实施方案中，投与是通过玻璃体内注射。用于该等注射的调配物可在(例如)预填充的注射器中制备。

抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段可作为药物组合物投与，该等药物组合物包含治疗有效量的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段及一或多种药物上相容的成分。

在典型实施方案中，根据常规程序将药物组合物调配成适于静脉内或皮下投与给人的药物组合物。通常，用于通过注射投与的组合物是无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。若需要，药物组合物亦可包括增溶剂及局部麻醉剂(例如利多卡因(lignocaine))以减轻注射位点的疼痛。通常，各成分是单独供应或以单位剂型混合在一起，例如，作为于指示活性剂的量的气密性密封容器(例如安瓿或小药囊)中的干燥冻干粉剂或无水浓缩物。在药物组合物欲通过输注来投与的情况下，其可用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分配。在药物组合物是通过注射来投与的情况下，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以便在投与之前混合各成分。

此外，药物组合物可以药物试剂盒形式来提供，该药物试剂盒包含(a)容器，其含有呈冻干形式的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段；及(b)第二容器，其含有药物上可接受的注射用稀释剂(例如无菌水)。药物上可接受的稀释剂可用于重构或稀释冻干的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。任选，该等容器可附带有监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告反映制造、使用或销售机构批准人投与。

有效治疗或预防眼或视网膜疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的量可通过标准临床技术测定。另外，可任选采用活体外分析来帮助鉴别最佳剂量范围。欲用于调配物中的精确剂量亦将取决于投与途径及病况的阶段，且应根据从业医师的判断及每一患者的情况来决定。可根据自活体外或动物模型测试系统衍生的剂量反应曲线来推断有效剂量。

举例而言，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗效能可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，用于测定ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)。展现大治疗指数的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段优选。

可使用自该等细胞培养分析及动物研究获得的数据来调配用于人的剂量范围。抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的剂量通常在循环浓度范围内，其包括ED₅₀，具有很小毒性或无毒性。该剂量可端视所用剂型及所用投与途径在此范围内变化。对于该方法中使用的任何抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，可最初从细胞培养分析估计治疗有效剂量。可在动物模型中调配剂量以达成循环血浆浓度范围(包括IC₅₀，即达成症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)，如在细胞培养物中所测定。该信息可用于更准确地测定人中有用的剂量。可通过(例如)高效液相层析、ELISA及诸如此类测量血浆中的含量。

对于抗-Sema3A抗体的玻璃体内注射，通常治疗之间的较长间隔优选。由于其改良的结合亲和性及功效，本发明的抗-Sema3A抗体可以更长的间隔投与。

在一个实施方案中，每6周、优选每7周、优选每8周、优选每9周、优选每10周、优选每11周且更优选每12周投与抗-Sema3A抗体。在又一优选实施方案中，每3个月投与一次本发明的抗-Sema3A抗体。

由于可投与眼的体积严格受限，故抗-Sema3A抗体可调配成高浓度是极为重要的。此外，抗-Sema3A抗体的功效是极为重要，此乃因强效抗体可在甚至更低的剂量下发挥其效应，且藉此延长活性亦及治疗之间的间隔。

本发明的抗体可调配成极高剂量，包括但不限于20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。优选地，本发明的抗体可调配于约50mg/ml的液体调配物中。

可投与患者的典型剂量为约2.5mg/眼。可用于该调配物的典型缓冲剂组分包含(例如)乙酸钠、PS20及海藻糖二水合物。

在一个实施方案中，用10mM组氨酸缓冲剂、240mM蔗糖、0.02w/v％聚山梨醇酯20于pH 5.5下调配抗-Sema3A抗体，最终蛋白质浓度为60mg/mL。

在一些实施方案中，包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的药物组合物可进一步包含与结合剂偶联或未偶联的治疗剂。

关于组合投与的治疗方案，在具体实施方案中，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时投与。在另一具体实施方案中，在投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段之前或之后，在投与抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时且高达若干个月、例如至少1小时、5小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月，投与治疗剂。

聚核苷酸、载体、宿主细胞及重组方法

在第六方面中，本发明涵盖包含编码抗-Sema3A抗体的序列的分离的聚核苷酸、包含该等聚核苷酸的载体及宿主细胞、及用于产生抗体的重组技术。分离的聚核苷酸可编码任何期望形式的抗-Sema3A抗体，包括(例如)全长单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段、双价抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。

包含编码抗-Sema3A抗体或其片段或链的序列的聚核苷酸可与一或多个调控或控制序列融合，如业内已知，且可包含于适宜表达载体或宿主细胞中，如业内已知。编码重链或轻链可变结构域的聚核苷酸分子中的每一者可独立地融合至编码恒定结构域例(例如人恒定结构域)的聚核苷酸序列，使得能够产生完整抗体。或者，聚核苷酸或其部分可融合在一起，从而提供用于产生单链抗体的模板。

为了重组产生，将编码抗体的聚核苷酸插入可复制的载体中，用于选殖(DNA的扩增)或表达。有许多用于表达重组抗体的适宜载体可以利用。载体组分通常包括(但不限于)以下一或多者：信号序列、复制起点、一或多个标记物基因、增强子组件、启动子及转录终止序列。

抗-Sema3A抗体亦可呈融合多肽产生，其中抗体与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的氨基末端具有特异性裂解位点的其他多肽)融合。所选异源信号序列通常是会被宿主细胞识别及处理(即，由信号肽酶裂解)的序列。对于不会识别及处理抗-Sema3A抗体信号序列的原核宿主细胞，可由原核信号序列取代该信号序列。信号序列可为(例如)碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导序列及诸如此类。对于酵母分泌，天然信号序列可经(例如)自酵母转化酶α-因子(包括酵母属(Saccharomyces)及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、酸性磷酸酶、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶获得之前导序列或WO90/13646中阐述的信号取代。在哺乳动物细胞中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。该前体区的DNA在阅读框连接至编码人类化抗-Sema3A抗体的DNA。

表达及选殖载体含有能使载体在一或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在选殖载体中，此序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA进行复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母及病毒，该等序列是众所周知。质体pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性(Gram-negative)细菌，2-υ.质体起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)可用于哺乳动物细胞中的选殖载体。通常，哺乳动物表达载体无需复制起点组分(通常可仅使用SV40起点，此乃因其含有早期启动子)。

表达及选殖载体可含有编码可选标记物以促进表达的鉴别的基因。典型可选标记物基因编码赋予对抗生素或其他毒素(例如胺苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)或四环素)的抗性的蛋白质，或另一选择为，是补体营养缺陷型缺陷的蛋白质，或在其他替代方案中供应复合培养基中不存在的特定营养物，例如编码芽孢杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实施例利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些成功地用异源基因转变的细胞产生赋予抗药性的蛋白质，且因此在选择方案中存活。该显性选择的实施例使用药物新霉素、霉酚酸及潮霉素。哺乳动物细胞的常见可选标记物是能够鉴别胜任摄取编码人类化抗-Sema3A抗体的核酸的细胞的那些，例如DHFR(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及-II(例如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鸟氨酸去羧酶及诸如此类。首先通过在含有胺甲喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转变体来鉴别经DHFR选择基因转变的细胞。当采用野生型DHFR时，适当宿主细胞系DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如DG44)。

或者，经编码抗-Sema3A抗体、野生型DHFR蛋白及另一可选标记物(例如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转变或共转变的宿主细胞(特定而言含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过使细胞在含有可选标记物的选择剂(例如氨基糖苷抗生素，例如康霉素、新霉素或G418)的培养基中生长来选择。例如，参见美国专利第4,965,199号。

当在作为宿主细胞的酵母细胞中实施重组产生的情况下，可使用酵母质体YRp7中存在的TRP1基因(Stinchcomb等人，1979,Nature 282:39)作为可选标记物。TRP1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供选择标记物，例如ATCC号44076或PEP4-1(Jones,1977,Genetics 85:12)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1病灶则提供通过在色氨酸不存在下生长来检测转变的有效环境。类似地，Leu2p-缺陷型酵母菌株(例如ATCC 20,622及38,626)由具有LEU2基因的已知质体补充。

此外，衍生自1.6μm环状质体pKD1的载体可用于克鲁维酵母属酵母的转变。或者，报导用于乳酸克鲁维酵母的大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。亦已公开用于克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体(Fleer等人，1991,Bio/Technology 9:968-975)。

表达及选殖载体通常含有启动子，该启动子由宿主生物体识别，并与编码抗-Sema3A抗体或其多肽链的核酸分子可操作地连接。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子(例如tac启动子)。其他已知细菌启动子亦是适宜。用于细菌系统的启动子亦含有与编码人类化抗-Sema3A抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。

许多真核启动子序列是已知的。实际上，所有真核基因皆具有位于转录起始的位点上游约25-30个碱基的富含AT的区。在许多基因的转录起始上游70-80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，其可为将多A尾添加至编码序列的3'端的信号。所有该等序列皆适宜地插入真核表达载体中。

与酵母宿主一起使用适宜启动序列的实施例包括3-磷酸甘油酸盐激酶或其他糖酵解酶(例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸去氢酶、己糖激酶、丙酮酸盐去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、3-磷酸甘油酸盐变位酶、丙酮酸盐激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶及葡萄糖激酶)的启动子。

诱导型启动子具有由生长条件控制转录的额外优点。该等启动子包括醇去氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸盐去氢酶及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶的酵母启动子区。用于酵母表达的适宜载体及启动子进一步阐述于EP73,657中。酵母增强子亦有利地与酵母启动子一起使用。

抗-Sema3A抗体自哺乳动物宿主细胞中的载体的转录受以下启动子控制：例如自病毒(例如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40))的基因体获得的启动子；来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，或来自热休克启动子，条件是该等启动子与宿主细胞系统兼容。

SV40病毒的早期及晚期启动子方便捷地作为SV40限制性片段获得，该限制性片段亦含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子便捷地作为HindIII E限制性片段获得。使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号中。此系统的修饰阐述于美国专利第4,601,978号中。亦参见Reyes等人，1982,Nature297:598-601，其公开在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下小鼠细胞中人p-干扰素cDNA的表达。或者，劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma)长末端重复序列可用作启动子。

可用于重组表达载体的另一有用组件是增强子序列，其用于增加高等真核生物对编码抗-Sema3A抗体的DNA的转录。现在已知许多来自哺乳动物基因(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎儿蛋白及胰岛素)的增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实施例包括复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、病毒复制起点的晚期侧上的多瘤增强子及腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强组件的说明，亦参见Yaniv,1982,Nature 297:17-18。增强子可在抗-Sema3A抗体编码序列的5'或3'位剪接至载体中，但优选位于启动子的5'位点。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体亦可含有终止转录及稳定mRNA所必需的序列。该等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔3'非转译区获得。该等区含有转录为编码抗-Sema3A抗体的mRNA的非转译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。在一些实施方案中，抗-Sema3A抗体可使用CHEF系统表达。(参见例如美国专利5,888,809；其公开内容以引用方式并入本文中)。

用于选殖或表达本文载体中的DNA的适宜宿主细胞系上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的适宜原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门杆菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门杆菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志贺杆菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如公开于1989年4月12出版的DD 266,710中的地衣芽孢杆菌41P))，假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌选殖宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其他菌株(例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110(ATCC 27,325))亦适宜。该等实施例是阐释性的而非限制性的。

除了原核生物之外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)是编码抗-Sema3A抗体的载体的适宜选殖或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见焙用酵母在低等真核宿主微生物中最常用。然而，许多其他属、种及菌株通常可获得且可用于本文，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主，例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗威亚酵母(yarrowia)(EP402,226)；毕赤酵母属酵母(Pichia pastors)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉菌(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；红面包霉菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyce)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及丝状真菌，例如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)及黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗-Sema3A抗体的适宜宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实施例包括植物及昆虫细胞，包括(例如)来自宿主的多种杆状病毒株及变体以及相应的允许性昆虫宿主细胞，该等宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(鳞翅目幼虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白线斑蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)(蚕)。用于转染的多种病毒株是可公开获得的，例如加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体及家蚕NPV的Bm-5株，且该等病毒尤其可用于草地贪夜蛾细胞的转染。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿及烟草的植物细胞培养物亦可用作宿主。

本发明的抗-Sema3A抗体亦可纳入病毒载体中，即将编码抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸引入病毒载体中，且然后在感染病毒后在患者体内表达。

在另一方面中，抗-Sema3A抗体的表达在脊椎动物细胞中实施。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为广泛可用的常规程序及技术。有用的哺乳动物宿主细胞系的实施例是由SV40转变猴肾CV1是(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系(经亚选殖以在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，1977，J.Gen Virol.36:59)、幼小仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO,Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如DG44)、小鼠赛特利细胞(sertoli cell)(TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL 34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2,HB 8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等人，1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。

用上述用于抗-Sema3A抗体产生的表达或选殖载体转变宿主细胞，并在习用营养培养基中培养，若适当，该培养基经修饰以用于诱导启动子、选择转变体或扩增编码期望序列的基因。

可在多种培养基中培养用于产生本文所述抗-Sema3A抗体的宿主细胞。市售培养基(例如Ham氏F10(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,Mo.)、最小必需培养基((MEM),(Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)及杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma-Aldrich Co.))适于培养宿主细胞。另外，Ham等人，1979,Meth.Enz.58:44,Barnes等人，1980,Anal.Biochem.102:255、美国专利第4,767,704号、美国专利第4,657,866号、美国专利第4,927,762号、美国专利第4,560,655号、美国专利第5,122,469号、WO 90/103430及WO 87/00195中的一或多者中所述的培养基中的任一者可用作宿主细胞的培养基。若需要，该等培养基中的任一者可补充有激素及/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(例如庆大霉素(gentamicin))、痕量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以本领域技术人员已知的适当浓度包括其他补充物。培养条件(例如温度、pH及诸如此类)是先前用于选择表达的宿主细胞的那些条件，且对于普通本领域技术人员是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌至培养基中。若抗体在细胞内产生，可破坏细胞以释放蛋白质作为第一步骤。可(例如)通过离心或超滤去除微粒碎片，即宿主细胞或溶解的片段。Carter等人，1992,Bio/Technology 10:163-167阐述分离分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下在约30分钟内解冻细胞糊。可通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自该等表达系统的上清液。在任一前述步骤中可包括诸如PMSF等蛋白酶抑制剂以抑制蛋白质水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。可使用多种方法自宿主细胞分离抗体。

自细胞制备的抗体组合物可使用(例如)羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析及亲和层析来纯化，其中亲和层析是典型纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类及同型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(例如，参见Lindmark等人，1983J.Immunol.Meth.62:1-13)。建议蛋白G用于所有小鼠同型及人γ3(例如，参见Guss等人，1986EMBO J.5:1567-1575)。亲和配体所附接的基质最经常为琼脂糖，但可使用其他基质。机械上稳定的基质(例如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使得可达成较使用琼脂糖更快的流速及更短的处理时间。在抗体包含C_H3结构域的情况下，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。端视欲回收的抗体而定，亦可使用其他蛋白质纯化技术，例如离子交换管柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶上层析、肝素SEPHAROSE^TM上层析、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸管柱)上层析、层析聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可使包含所关注抗体及污染物的混合物经受使用pH介于约2.5-4.5的溶析缓冲液的低pH疏水相互作用层析，通常在低盐浓度(例如，约0-0.25M的盐)下实施。

亦包括如本文定义的在低、中及高严格条件下与编码Sema3A-抗体或抗体片段的分离的聚核苷酸序列代表的核苷酸序列的全部或部分(例如编码可变区的部分)杂交的核酸。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗-Sema3A多肽(例如重链或轻链可变区)的核酸或其补体的一部分或全部至少80％、例如至少90％、至少95％或至少98％一致。本文所述类型的杂交核酸可用作(例如)选殖探针、引子(例如PCR引子)或诊断探针。

在一个实施方案中，本发明是关于一或多种分离的聚核苷酸，其包含编码如SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及编码如SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

应理解，在该等抗-Sema3A抗体及抗体片段中，编码CDR的核酸序列保持不变(就其编码的氨基酸而言，不变，由于密码子的简并性，DNA序列的等效形式是可能的)，但周围区(例如FR区)可经改造。

制品

在另一方面中，包括含有用于治疗上述病症的材料的制品。该制品包含容器及标签。适宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及试管。容器可自诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳有效治疗病况的组合物，且可具有无菌输液埠。例如，容器可为静脉溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关的卷标指示组合物用于治疗选择的病况。制品可进一步包含第二容器，其包含药物上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可进一步包括自商业及使用者角度来看合意的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的包装插页。

本发明进一步阐述于以下实施例中，该等实施例并不意欲限制本发明的范畴。

实施例

实施例1：DME及PDR患者的玻璃体中Sema3A的上调

通过免疫组织化学研究来自具有糖尿病视网膜病变史的人供体的样品的视网膜中的Sema3A的表达。免疫染色方案如下：

1.解冻载玻片并使样品在室温(RT)下风干30min；

2.用pap笔盒绘制并使其干燥；

3.抗原于RT下在1％SDS中修复5min；

4.将载玻片在PBS中洗涤3次，持续5min；

5.于RT下在1％BSA/0.3％Triton X100/PBS溶液(封闭溶液)中将切片封闭30min；

6.在封闭溶液中1:200稀释兔抗-Sema3a(abcam，ab23393)第1抗体。将载玻片上的切片于RT下培育过夜；

7.将载玻片在PBS中冲洗3次，持续5min；

8.将第2抗体与在DAPI/0.3％Triton X100/PBS溶液中以1:400稀释的驴抗兔Alexa fluor546(invitrogen,A10040)一起培育。将载玻片上的切片于RT下培育3小时；

9.将载玻片在PBS中冲洗3-5次，持续5min；

10.用Aquamount对切片加盖玻片，且风干；

11.影像切片及40x放大的等级强度。

对每个人供体三个切片的组进行Sema3A免疫染色。Sema3A标记是由先前针对此特定任务训练的观察者使用5点分级方案(0＝无检测，1＝低强度，少量斑点，2＝中等强度，若干斑点，3＝明亮强度，广泛染色，及4＝非常明亮强度，丰富检测)在该等区中的每一者中独立地评价。观察者不知道眼供体的健康状况。在视网膜内，Sema3A与视网膜血管的血管系统壁相关。与无眼部病状的糖尿病患者相比，在患有糖尿病黄斑水肿的患者中，视网膜血管系统及视网膜实质中Sema3A的表达增加(图1)。

实施例2：细胞渗透性分析中的效能

通过FITC-聚葡萄糖在人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)的单层中的渗透来测量跨细胞渗透性。

简言之，使用Millipore试剂盒(“活体外血管渗透性分析”目录号ECM642)及人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)测量活体外内皮渗透性。该分析试剂盒提供具有细胞培养插入物的96孔接收器板。插入物含有1μm孔，并用I型大鼠尾胶原涂覆。HRMEC以25000个细胞/孔的密度接种至插入物中，并使细胞生长为单层达3天。用重组VEGF-A、Sema3A以及抗体处理细胞过夜。将试剂盒中提供的高分子量FITC-聚葡萄糖溶液添加至插入物中，从而使荧光分子通过内皮细胞单层。通过测量接接受器板孔溶液在485nM/535nM(激发及吸收)下的荧光来测定活体外渗透性。

本发明者测试根据本发明的实施例性抗体：纯系I。该抗体包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。

本发明的抗-Sema3A抗体完全抑制由Sema3A诱导的渗透性，但不抑制由VEGF-A诱导的渗透性(图2)。重要的是，Sema3A的渗透性独立于VEGF-A。使用针对TNP的对照抗体证实此效应是由于本发明的抗体对Sema3A的特异性靶所致。

实施例3：细胞分析中细胞骨架塌陷的测量

通过使用XCELLigence系统(如由ACEA Biosciences销售的Real Time CellAnalysis Instruments)测量人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的细胞骨架塌陷来评价本发明的实施例性抗体(纯系I)的细胞活性。该系统经由细胞阻抗测量细胞附着及铺满。HRMEC内源性表达神经周期蛋白-1(Nrp1)及神经丛蛋白，其是3类信号素完整全受体的组分。通过结合至此受体复合物，信号素诱导内皮中F-肌动蛋白纤维的塌陷。在此功能分析中，将重组Sema3A蛋白添加至人视网膜微血管内皮细胞的汇合层，降低了细胞阻抗，此是由于细胞骨架塌陷及随后的细胞收缩，以细胞阻抗的降低来测量。

简言之，用Attachment Factor涂覆E-Plates View。以20000个细胞/孔的密度接种细胞，且然后在XCELLigence装置中在其正常生长条件下过夜使其生长为单层。

在3mM CaCl2存在下，添加Sema3A(或其他3类信号素)具有及不具有本发明的抗-Sema3A抗体的组合。将细胞指数相对于添加物质之前的时间点正规化。刺激5h后进行计算。

本发明的抗-Sema3A抗体可完全防止Sema3A诱导的细胞骨架塌陷。本发明的抗-Sema3A抗体不能预防由其他测试信号素(B、C、E及F)诱导的细胞骨架塌陷，证实本发明的抗体对Sema3A的特异性(图3)。

实施例4：亲和性及细胞功效

A)亲和性

用于此实验的运行缓冲液及所有稀释液(除所述的外)在具有0.01％Tween20的PBS-T-EDTA中进行[将100μL 100％Tween20添加至2LPBS-T-EDTA中以使最终Tween 20浓度为0.01％]。根据制造商的建议，将GLM传感器芯片正规化并预处理。将传感器芯片用EDC/s-NHS的相等混合物在水平方向上以30μl/min的流速活化300sec，并在水平方向上以30μl/min的流速用人Fab黏合剂(10μg/ml，于10mM乙酸盐中，pH 5.0中)固定300sec，从而在表面上产生约6739-7414RU的人Fab黏合剂。将传感器芯片用1M乙醇胺HCl在水平方向上以30μl/min的流速不活化300sec。将传感器芯片用18sec的10mM甘氨酸(pH 2.1)以100μl/min的流速水平稳定1次及垂直稳定1次。

本发明者测试根据本发明的实施例性抗体(纯系I)。以25μL/min的流速将该抗体(0.5μg/ml)垂直捕获于人Fab黏合剂表面上300sec，从而产生约180RU的捕获含量。通过以40μl/min的流速水平注射PBS-T-EDTA达60sec来稳定基线。将分析物以40μL/min的流速水平注射于捕获的抗体上600sec且解离7200sec。分析物的浓度为0nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM及10nM。通过以100μl/min的流速水平一次及垂直一次注射10mM甘氨酸(pH 2.1)达18秒再生表面。以25μl/min的流速垂直注射PBS-T-EDTA达60sec一次。

自原始数据中减去中间点(interspot)(与传感器表面的相互作用)及空白(具有0.01％Tween20或0nM分析物的PBS-T-EDTA)。然后将感测图整体拟合至1:1朗缪尔结合(Langmuir binding)，以提供结合速率(ka)、解离速率(KD)及亲和性(K_D)值。

B)细胞功效

为了在细胞骨架塌陷分析中测定功能功效，将Sema3A浓度反应曲线增加浓度的抗体组合作为IC₅₀转换实验。实施Gaddum Schild图以计算pA2值(将Sema3A浓度反应曲线转换2倍所需的抗体浓度的负对数)。功效(以pM表示)自pA2值计算为＝功效(10；-X)。

结果概述于下表6中。

表6：

实施例5：本发明的抗体的免疫原性的评价

本发明者评价根据本发明的实施例性抗体纯系I的预测的免疫原性。该抗体包含分别包含SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链及轻链。

出于此目的，其使用用于预测T细胞表位的计算机工具(由EpiVax研发的EpiMatrix)。

通过筛选许多人抗体分离株的序列，EpiVax已鉴别若干被认为具有调控潜力的高度保守的HLA配体。实验证据表明，该等肽中的许多实际上在大多数个体中是主动致耐受性的。该等高度保守、调控及混杂的T细胞表位现在称为Tregitope(De Groot等人Blood.2008Oct 15；112(8):3303-11)。在存在大量Tregitope下，可有效地控制人类化抗体中含有的新表位的免疫原性潜力。

出于抗体免疫原性分析的目的，EpiVax已研发Tregitope调整的EpiMatrix评分及抗治疗性抗体反应的相应预测。为了计算Tregitope调整的EpiMatrix评分，自EpiMatrix蛋白评分中扣除Tregitope的评分。已显示Tregitope调整的评分与23种商业抗体的组的观察到的临床免疫反应充分相关(De Groot等人Clin Immunol.2009年5月；131(2):189-201)。

在EpiMatrix量表上的结果概述于下表7中。

表7：

本发明的抗体的序列的评分在EpiMatrix量表的低端，指示本发明的抗体具有强烈有限的免疫原性潜力。该EpiMatrix量表为本领域技术人员熟知，且尤其可参见出版物Mufarrege等人Clin Immunol.2017年3月；176:31-41的图2。

实施例6：对活体内尖端细胞密度及无血管区的效能(氧诱导的视网膜病变OIR模型)

在氧诱导的视网膜病变(OIR)的小鼠模型中研究本发明的实施例性抗体(纯系I)对缺血性无血管区域的血管重建的效应。从出生后第7天至出生后第12天，将一窝C57Bl/6J小鼠暴露于75％氧气的气氛。此导致中央视网膜中血管的退化及无血管区域的形成。在返回至正常含氧条件后，此区域变得缺血。幼崽在出生后第12天在用异氟烷麻醉下在每只眼中接受0.5μl溶液中的10μg抗体的单次玻璃体内注射。在出生后第17天，处死动物并摘出眼。将眼固定于福尔马林(formalin)中，且制备视网膜平铺片，其中用同工凝集素B4染色视网膜血管。在沿整个视网膜的无血管前端(视网膜的血管化外周区域及无血管中心区域之间的边界)对尖端细胞(起始新血管形成的专门内皮细胞)的数目进行计数。

通过显示丝状伪足延伸的其特殊形态鉴别尖端细胞。为了分析，将尖端细胞的数目正规化为无血管前端的长度。使用共焦显微镜及影像分析软件测定无血管区域的大小。

本发明的抗-Sema3A抗体在小鼠OIR模型中增加尖端细胞密度(图4)。此外，其显示无血管区域的减少。尖端细胞密度与无血管区域的大小之间存在负相关，指示两个参数的机械依赖性。使用针对TNP的对照抗体确认此效应是由于本发明的抗体对Sema3A的特异性靶。

总之，抗-Sema3A抗体在氧诱导的视网膜病变的动物模型中减小缺血性无血管区域的大小，指示对糖尿病黄斑缺血的有益效应。

实施例7：兔眼中抗-Sema3A及安维汀(Avastin)t_1/2的比较

结果概述于下表8中。

表8：

玻璃体、视网膜及房水中的计算的半衰期分别为3.9、4.1及3.3天。该等半衰期与文献中报导的临床使用的重组人类化单克隆IgG1抗体安维汀(抗VEGF，贝伐珠单抗(bevacizumab)，Bakri等人，Opthalmology,2007)的半衰期相似，其亦在内部实验中得到证实。该等结果如预期，此乃因全长IgG的玻璃体内清除率主要取决于其分子大小，此与本发明的抗体及安维汀相似。因此，预期人PK(包括本发明的抗体及安维汀的眼部半衰期)是相似的。报导的安维汀的人眼部半衰期为9.73±1.48天(Hutton-Smith,2016)。

实施例8：本发明的抗体与Chiome抗体之间的结合亲和性的比较

出于比较目的，本发明者研发针对WO2014123186(Chiome Bioscience)中公开的Sema3A的人类化抗体，其具有以下特征：

-重链是如WO2014123186中的SEQ ID NO:11中所示，且

-轻链是如WO2014123186中的SEQ ID NO:12中所示。

本发明者已研发该抗体的2种形式：

-一种在IgG1KO Fc上格式化，在下文中称为“Chiome抗体A”及

-一种在裸IgG1KO-FcRn上格式化，在下文中称为“Chiome抗体B”。

根据BioRad制造商手册，经由6个水平通道上的直接胺偶合，将高表面密度的抗人Fab抗体(GE Healthcare)固定在GLM芯片(BioRad)上。

在6个垂直通道中的5个上以最小表面密度将本发明的抗体(纯系I)及Chiome抗体捕获于抗人Fab抗体表面上用于动力学结合分析。在PBS-T-EDTA缓冲液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0nM的浓度制备人Sema3A。PBS-T-EDTA缓冲液注射液用作动力学数据分析的双重参照。将人Sema3A溶液及PBS-T-EDTA缓冲液中的每一者以40μL/min的流速在6个水平通道上同时注射10min，随后是2hr解离期。通过以100μL/min的流速注射18sec 10mM pH2.1甘氨酸HCl(GE Healthcare)、之后以25μL/min的流速注射60sec PBS-T-EDTA来再生表面。将结合感测图拟合至1:1朗缪尔模型以计算结合速率、解离速率及亲和性。

本发明的抗体及Chiome抗体与人Sema3A结合的的动力学及亲和性数据列于下表9中。

表9：

样品名称	至HuSema3A的KD
		Chiome抗体A	56.4nM
Chiome抗体B	55.9nM
		本发明的抗体(纯系I)	32.0pM

结论

结果显示，证明本发明的抗体比Chiome Bioscience公开的先前技术抗体对人Sema3A具有更优异的结合亲和性。

实施例9：本发明的抗体与Samsung scFv之间的结合亲和性的比较

已对如WO2017074013(Samsung)中公开的scFv片段进行比较。

出于比较目的，本发明者已研发具有下表10中公开的特征的3个公开的片段。

表10：

根据BioRad制造商手册，经由6个水平通道上的直接胺偶合，将高表面密度的抗His抗体(GE Healthcare)固定在GLM芯片(BioRad)上。在6个垂直通道中的5个上以最小表面密度将Samsung ScFv抗体捕获于抗His抗体表面上用于动力学结合分析。在PBS-T-EDTA缓冲液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0nM的浓度制备人Sema3A。PBS-T-EDTA缓冲液注射液用作动力学数据分析的双重参照。将人Sema3A溶液及PBS-T-EDTA缓冲液中的每一者以40μL/min的流速在6个水平通道上同时注射10min，随后是1hr解离期。通过以100μL/min的流速注射18sec 10mM pH2.1甘氨酸HCl(GE Healthcare)、之后以25μL/min的流速注射60sec PBS-T-EDTA来再生表面。将结合感测图拟合至1:1朗缪尔模型以计算结合速率、解离速率及亲和性。

使用相似方法进行本发明的抗体与人Sema3A(纯系I)的结合，但使用山羊抗人IgG(Invitrogen)来捕获本发明的抗体。本发明的抗体及Samsung ScFv与食蟹猴、小鼠、大鼠或兔Sema3A的结合亦使用相同方法进行。

本发明的抗体及Samsung scFv的动力学及亲和性数据列于下表11中。

表11：

结论

本发明的抗体对人、食蟹猴、小鼠或兔Sema3A的结合亲和性高于如WO2017074013中公开的3个Samsung scFv。

实施例10：根据本发明的两种抗体的亲和性的比较

本发明者已研发两种具有如SEQ ID NO:1至6中所绘示CDR的抗体。两种抗体在Fc区中的差异在于：

一种抗体包含L234A及L235A的组合(抗体A)，且

另一抗体包含突变H435A(抗体B)，

残基是根据Kabat的EU索引编号。

在两种抗体对具有如SEQ ID NO:1至6中所绘示的CDR的人Sema3A的结合亲和性方面未显示统计学差异。因此，在本发明的针对Sema3A的抗体中维持对人Sema3A的亲和性。

实施例11：针对Sema3A的市售抗体的功效

为了比较，本发明者测试靶向Sema3A的市售抗体的细胞活性。该抗体是由Creative Biolabs以参考“Anti-Human SEMA3A Therapeutic Antibody,Humanized(CAT#:TAB-556CL)”商品化。该市售抗体在下文中称为“Creative Biolabs抗体”。

通过用实施例3中公开的相同方案测量人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的细胞骨架塌陷来评价Creative Biolabs抗体的细胞活性。刺激后5h进行功效的计算及测定。

在该等条件下，Creative Biolabs抗体对Sema3A诱导的细胞骨架塌陷不显示任何活性。Creative Biolabs抗体实际上不能预防Sema3A诱导的细胞骨架塌陷。

因此，证明Creative Biolabs抗体不能预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷，而在相同条件下，本发明的抗体则能预防。此确认本发明的抗体的令人惊讶及出乎意料的效应。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际有限公司

<120> 抗-SEMA3A抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

<130> 01-3361

<150> EP19173454.0

<151> 2019-05-09

<160> 22

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区 - variant 1

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区 – 变体2

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区 – 变体3

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区变体4

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区 - 变体a

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区 – 变体b

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区 - 变体c

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 I

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 - 克隆 I

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 II

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 17

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 III

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 - 克隆 III

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 IV

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 - 克隆 IV

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位

<400> 21

Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe

1 5 10

<210> 22

<211> 751

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu Lys Leu Ser Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe Asn Gly Leu Ala

20 25 30

Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu Glu Arg Ser Arg

35 40 45

Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe Asp Leu Val Asn

50 55 60

Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser Tyr Thr Arg Arg

65 70 75 80

Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys Glu Cys Ala Asn

85 90 95

Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His Leu Tyr Ala Cys

100 105 110

Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile Glu Ile Gly His

115 120 125

His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser His Phe Glu Asn

130 135 140

Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu Thr Ala Ser Leu

145 150 155 160

Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala Asp Phe Met Gly

165 170 175

Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His His Pro Ile Arg

180 185 190

Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro Lys Phe Ile Ser

195 200 205

Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp Asp Lys Val Tyr

210 215 220

Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His Ser Gly Lys Ala

225 230 235 240

Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp Phe Gly Gly His

245 250 255

Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile

260 265 270

Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His Phe Asp Glu Leu

275 280 285

Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys Asn Pro Val Val

290 295 300

Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys Gly Ser Ala Val

305 310 315 320

Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe Leu Gly Pro Tyr

325 330 335

Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro Tyr Gln Gly Arg

340 345 350

Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys Thr Phe Gly Gly

355 360 365

Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe Ala Arg

370 375 380

Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met Asn Asn Arg Pro

385 390 395 400

Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr Gln Ile Val Val

405 410 415

Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val Met Phe Ile Gly

420 425 430

Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile Pro Lys Glu Thr

435 440 445

Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met Thr Val Phe Arg

450 455 460

Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr Lys Gln Gln Gln

465 470 475 480

Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu Pro Leu His Arg

485 490 495

Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys Leu Ala Arg Asp

500 505 510

Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg Tyr Phe Pro Thr

515 520 525

Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn Gly Asp Pro Leu

530 535 540

Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His Gly His Ser Pro

545 550 555 560

Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser Thr Phe Leu Glu

565 570 575

Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp Gln Phe Gln Arg

580 585 590

Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp Asp His Ile Ile

595 600 605

Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln Gln Lys Asp Ser

610 615 620

Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe Ile Gln Thr Leu

625 630 635 640

Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His Leu Glu Glu Leu

645 650 655

Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr Lys Glu Met Ser

660 665 670

Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg Asp Phe Met Gln

675 680 685

Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu Phe Cys Glu Gln

690 695 700

Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg Pro Gly His Thr

705 710 715 720

Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys Lys Gly

725 730 735

Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro Arg Ser Val

740 745 750

Claims

1.一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)、及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

2.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列。

3.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

该重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；且

该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

4.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，及

轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

5.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

6.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

重链，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选是由其组成；及

轻链，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选是由其组成。

7.如权利要求1的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

8.一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其结合至如SEQ ID NO:22中所述的人Sema3A的氨基酸区370-382内的至少一个氨基酸残基。

9.一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其结合至SEQ ID NO:21。

10.如权利要求1至9中任一项的抗体或抗原结合片段，其用作药剂。

11.如权利要求10所使用的抗体或抗原结合片段，其用于抑制SemaA3的血管抑制效应(vasorepressive effect)。

12.如权利要求10所使用的抗体或抗原结合片段，其用于改良视网膜的血管重建。

13.如权利要求1至9中任一项的抗体或抗原结合片段，其用于治疗或预防眼或视网膜疾病。

14.如权利要求13所使用的抗体或抗原结合片段，其中该疾病选自由以下组成的群：视网膜病变、缺血性视网膜病变；糖尿病视网膜病变，包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变；糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养性萎缩、近视性变性、视网膜动脉阻塞、眼内炎、葡萄膜炎、囊样黄斑水肿、由任何视网膜疾病继发的脉络膜新生血管膜、视神经疾病、青光眼、视网膜剥离、毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、创伤性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、视网膜新血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、福斯氏营养性萎缩(Fuch's dystrophy)、黄斑毛细血管扩张症、尤塞氏综合征(usher syndrome)及斯特格氏病(Stargardt disease)。

15.如权利要求13或14所使用的抗体或抗原结合片段，其中该疾病选自由以下组成的群：糖尿病视网膜病变，包括增殖性糖尿病视网膜病变及非增殖性糖尿病视网膜病变；缺血性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、糖尿病黄斑缺血、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新血管形成、青光眼及脉络膜新血管形成。

16.如权利要求13至15所使用的抗体或抗原结合片段，其中该疾病是糖尿病黄斑水肿及/或糖尿病黄斑缺血。

17.如权利要求13至15所使用的抗体或抗原结合片段，其中：

该疾病是糖尿病黄斑缺血，且

该抗体或抗原结合片段促进缺血性视网膜内的血管再生(血管重建)且预防眼的玻璃体区的病理性新血管形成。

18.如权利要求13或15所使用的抗体或抗原结合片段，其中：

该疾病是糖尿病黄斑水肿，且

该抗体或抗原结合片段降低血液视网膜屏障的渗透性。

19.如权利要求18所使用的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段抑制Sema3A诱导的该血液视网膜屏障的渗透性及/或Sema3A诱导的缺血性区域的血管消退。

20.一种药物组合物，其包含如权利要求1至19中任一项的抗体或抗原结合片段及药物上可接受的载剂。

21.如权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求20的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段是通过非经肠投与途径、静脉内投与途径、玻璃体内投与途径或皮下投与途径来投与。

22.如权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求20的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段是通过玻璃体内途径投与。

23.一或多种分离的聚核苷酸，其包含：

编码如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中所示的重链或如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的重链可变区的序列；及

编码如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的轻链或如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的轻链可变区的序列。

24.一种表达载体，其包含如权利要求23的一或多种分离的聚核苷酸。

25.一种宿主细胞，其包含如权利要求23的一或多种分离的聚核苷酸或如权利要求24的表达载体。

26.一种产生抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：

a.获得如权利要求25的宿主细胞；及

b.培养该宿主细胞。

27.如权利要求26的方法，其进一步包含回收及纯化该抗体或其抗原结合片段。