CN108290942B

CN108290942B - 与人及小鼠信号素3a交联的抗体及其用途

Info

Publication number: CN108290942B
Application number: CN201680062739.2A
Authority: CN
Inventors: 南都铉; 申镛在; 李在铉
Original assignee: Banzhan Biotechnology Co ltd; Social Welfare Legal Person Samsung Life Public Welfare Foundation
Current assignee: Banzhan Biotechnology Co ltd; Social Welfare Legal Person Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: AU2016346595B2; AU2016346595A1; CN108290942A; WO2017074013A1

Abstract

本发明提供对人信号素3A及小鼠信号素3A具有交联能力的抗体。本发明的抗体可用作在信号素3A表达高的成胶质母细胞瘤、胰腺癌、肝癌等多种癌症中抑制信号素3A的抗体治疗剂。认为信号素3A为糖尿病视网膜病、自身免疫性关节炎、神经病变性疼痛、骨质疏松症的治疗靶标，因此本发明的抗体或抗原结合片段不仅用作抗癌治疗剂，而且还可以用作多种相关疾病的治疗剂。本发明的抗体具有高抗信号素3A结合性及基于其的信号素3A功能抑制性，因此抑制来源于多种癌症的癌细胞的生长，通过对信号素3A的下游信号传递物质中ERK的磷酸化进行抑制来抑制癌细胞的迁移，从而对于癌症的预防及治疗非常有效。

Description

与人及小鼠信号素3A交联的抗体及其用途

技术领域

本专利申请要求于2015年10月27日向韩国专利局提出的韩国专利申请第10-2015-0149272号以及于2016年9月26日向韩国专利局提出的韩国专利申请第10-2016-0123233号的优先权,上述专利申请的全部内容在此引入本说明书作为参考。

本发明涉及与人及小鼠信号素3A交联的抗体及其用途。

背景技术

信号素3A为由免疫球蛋白样(Ig-like，immunoglobulin-like)C2型结构域、PSI结构域、Sema结构域组成的分泌性蛋白，公知为与NRP1和PLXNA1结合并诱导相关信号传递。并且，据报道，在信号素3A高的特异性癌症中的癌细胞生长速度高，而且因癌细胞的迁移增加而促进癌细胞转移，患者预后也不好。目前，对于作为抗癌靶，并没有有关抑制信号素3A的抗癌剂，因此通过中和信号素3A来抑制相关信号传递的抗信号素3A抗体会成为新的抗癌治疗对策。

抑制信号素3A的抗体在信号素3A表达高的成胶质母细胞瘤、胰腺癌、肝癌等癌症中可作为治疗剂而使用于抗癌治疗方法中。并且，信号素3A为对参与癌症生长的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophage，AM)的迁移起重要作用的因子，可期待针对信号素3A的抗体在多种癌症中的抗肿瘤效果。认为信号素3A为糖尿病视网膜病、自身免疫性关节炎、神经病变性疼痛、骨质疏松症的治疗靶标，因此信号素3A不仅用作抗癌治疗剂，而且还可以用作多种相关疾病的治疗剂。

发明内容

技术问题

本发明人为开发与作为参与癌细胞生长的因子的信号素3A结合且可预防及治疗癌症的抗体而作出努力，结果开发了呈现与人信号素3A及小鼠信号素3A交联的能力和抑制癌细胞生长及迁移的能力而具有优秀的预防及治疗癌症的效果的抗体，由此完成本发明。

本发明的目的在于，提供针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段。

本发明的再一目的在于，提供对针对人信号素3A的抗体的重链可变区进行编码的核酸分子。

本发明的另一目的在于，提供对针对人信号素3A的抗体的轻链可变区进行编码的核酸分子。

本发明的还有一目的在于，提供包含上述核酸分子的重组载体(recombinantvector)。

本发明的又一目的在于，提供利用上述重组载体转化而成的宿主细胞。

本发明的又一目的在于，提供用于预防或治疗癌症的药剂学组合物。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供针对人信号素3A的抗体(克隆名A08)或其抗原结合片段，包括：(a)包括重链互补决定区(CDR，complementarity determiningregion)氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2及SEQ ID NO:3的CDRH3；以及(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:4的CDRL1、SEQ ID NO:5的CDRL2及SEQ ID NO:6的CDRL3。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供针对人信号素3A的抗体(克隆名C10)或其抗原结合片段，包括：(a)包括重链互补决定区氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:7的CDRH1、SEQ ID NO:8的CDRH2及SEQ ID NO:9的CDRH3；以及(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:10的CDRL1、SEQ ID NO:11的CDRL2及SEQ ID NO:12的CDRL3。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供针对人信号素3A的抗体(克隆名F11)或其抗原结合片段，包括：(a)包括重链互补决定区氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:13的CDRH1、SEQ ID NO:14的CDRH2及SEQ ID NO:15的CDRH3；以及(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:16的CDRL1、SEQ ID NO:17的CDRL2及SEQ ID NO:18的CDRL3。

本发明人为开发与作为参与癌细胞生长的因子的信号素3A结合且可预防及治疗癌症的抗体而作出努力，结果开发了呈现与人信号素3A及小鼠信号素3A交联的能力和抑制癌细胞生长及迁移的能力而具有优秀的预防及治疗癌症的效果的抗体。

本发明的抗体对人信号素3A具有特异性结合能力。尤其，本发明的抗体对人信号素3A及小鼠信号素3A具有交联能力。

在本说明书中，在提出针对人信号素3A的抗体时所使用的术语“抗体(antibody)”为针对人信号素3A的特异性抗体，与人信号素3A特异性结合，且不仅包括完全抗体形态的抗原结合片段，而且还包括抗体分子的抗原结合片段。

完全抗体为具有两个全长的轻链及两个全长的重链的结构，各个轻链以二硫键与重链相连接。重链不变域具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)及伊普西龙(ε)类，并具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)及阿尔法2(α2)子类。轻链的不变域具有卡帕(κ)及兰布达(λ)类(Cellular and Molecular Immunology，Wonsiewicz，M.J.，Ed.，Chapter 45，pp.41-50，W.B.Saunders Co.Philadelphia，PA(1991)；Nisonoff，A.，Introduction to Molecular Immunology，2nd Ed.，Chapter 4,pp.45-65，sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1984))。

在本说明书中，术语“抗原结合片段”是指具有抗原结合能力的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')₂及Fv等。抗体片段中的Fab为具有轻链及重链的可变域和轻链的不变域及重链的第一个不变域(C_H1)的结构，具有一个抗原结合部位。与Fab不同地，Fab'具有在重链C_H1结构域的C-末端包含一个以上半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)，F(ab')₂抗体在Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键的过程中生成。Fv为仅具有重链可变域及轻链可变域的最小的抗体片段，生成Fv片段的重组技术已在PCT国际公开专利申请WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086及WO88/09344中公开。双链Fv(two-chain Fv)中的重链可变域与轻链可变域以非共价键相连接，单链Fv(single-chain Fv，scFv)中的重链的可变域与轻链的可变域通过肽键以非共价键相连接，或者可通过直接连接在C-末端来形成如双链Fv等二聚体结构。这种抗体片段可利用蛋白水解酶来获得(例如，可利用木瓜蛋白酶对整个抗体进行限制性切割来获得Fab，利用胃蛋白酶进行切割来获得F(ab')₂片段)，优选地，可通过基因重组技术来制作。

根据本发明的一实例，本发明的抗体为scFv形态或完全抗体形态。并且，重链不变域可选自伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)或伊普西龙(ε)中的一种同种型中。

在本说明书中，术语“重链”是指包括包含具有用于对抗原赋予特异性的充分的可变域序列的氨基酸序列的可变结构域V_H及三个不变结构域C_H1、C_H2及C_H3的全长重链及其的片段。并且，在本说明书中，术语“轻链”是指包括包含具有用于对抗原赋予特异性的充分的可变域序列的氨基酸序列的可变结构域V_L及不变结构域C_L的全长轻链及其的片段。

在本说明书中，术语“重链互补决定区(CDR，complementarity determiningregion)”是指免疫球蛋白重链及轻链的高变区(hypervariable region)的氨基酸序列(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))。重链(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及轻链(CDRL1、CDRL2及CDRL3)分别包括三个CDRs。当抗体与抗原或抗原决定部位结合时，CDR提供重要的接触残基。

在可对人信号素3A进行特异性识别的范围内，本发明的人信号素3A抗体或其的抗原结合片段可包含所附的序列表中所记载的氨基酸序列的变体。例如，为了改善抗体的结合亲和度和/或其他生物学特性而可对抗体的氨基酸序列产生变化。例如，这种变形包括抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。

这种氨基酸变异基于等氨基酸的侧链取代体的如疏水性、亲水性、电荷、大小相对的相似性来实现。从对氨基酸的侧链取代体大小、形态及种类的分析可知，精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带有正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形态相似。因此，基于这种考虑因素，在生物学上可将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸称为功能对等物。

在导入变异时，可考虑氨基酸的疏水指数(hydropathic index)。各个氨基酸可根据疏水性和电荷而赋有如下疏水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸盐(-3.5)；天门冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

疏水性氨基酸指数在蛋白质的互动性生物学功能(interactive biologicalfunction)赋予中非常重要。利用具有相似的疏水指数的氨基酸来进行取代才能保持相似的生物学活性是已公知的事实。在参照疏水指数来导入变异的情况下，优选地，在疏水指数差为±2以内的氨基酸之间进行取代，更优选地，在疏水指数差为±1以内的氨基酸之间进行取代，更加优选地，在疏水指数差为±0.5以内的氨基酸之间进行取代。

另一方面，具有相似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代导致具有等同的生物学活性的蛋白质也是广为人知的。如美国专利第4554101号中公开，对各个氨基酸残基赋予了如下的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天门冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天门冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在参照亲水性值来导入变异的情况下，优选地，在亲水性值差为±2以内的氨基酸之间进行取代，更优选地，在亲水性值为±1以内的氨基酸之间进行取代，更加优选地，在亲水性值为±0.5以内的氨基酸之间进行取代。

在本领域中已公知为，没有改变分子的整体活性的蛋白质中的氨基酸的交换(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最经常发生的交换为氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。

若考虑具有如上所述的生物学等同活性的变异，则被解释为，本发明的抗体或编码其的核酸分子还包括与序列表中所记载的序列呈现实质同一性(substantialidentity)的序列。上述实质同一性是指，以使上述本发明的序列与任意的其他序列最大限度地相对应的方式对准，并使用在本领域中通常使用的算法来对所对准的序列进行分析的情况下，呈现最少61％的同源性、更优选地，呈现70％的同源性、更加优选地，呈现80％的同源性、最优选地，呈现90％的同源性的序列。用于比较序列的对准方法为在本领域中已公知的。在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson and Lipman，Methods in Mol.Biol.24：307-31(1988)；Higgins and Sharp，Gene 73:237-44(1988)；Higgins and Sharp，CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet et al.，Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.，Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)and Pearson et al.，Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)中公开了与对准有关的多种芳基及算法。可在美国国立生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biological Information)等访问NCBI Basic Local AlignmentSearch Tool(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-10(1990))，可通过互联网并与如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx等序列分析程序联动来利用。可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问BLSAT。可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html确认利用如上所述的程序的序列同源性比较方法。并且，能够以在本领域中通常使用的IMGT(http://www.imgt.org/)顺序为基准来表示抗体可变域内框架区(FR，framework region)及CDRs序列顺序分析。

根据本发明的一实例，A08抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，A08抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，C10抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，C10抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，F11抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

根据本发明的一实例，F11抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

本发明的抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fvs(sdFV)、抗独特型(抗-Id)抗体、以及如上所述的这些抗体的抗原决定部位-结合片段等，但不限定于此。

本发明的抗体基本上由“重链的可变域(V_H)-连接体-轻链的可变域(V_L)”组成。在本发明的scFv抗体中，上述连接体是指对重链及轻链的可变性部位起人工连接作用的规定长度的氨基酸序列。

本发明的scFv抗体可由V_H(SEQ ID NO:19)-连接体-V_L(SEQ ID NO:20)；V_H(SEQ IDNO:21)-连接体-V_L(SEQ ID NO:22)；以及V_H(SEQ ID NO:23)-连接体-V_L(SEQ ID NO:24)表示。

本发明的抗体或抗原结合片段与人信号素3A及小鼠信号素3A特异性交联。本发明的抗体或抗原结合片段不仅与人信号素3A特异性结合，而且还可以与小鼠信号素3A特异性结合，在利用小鼠肿瘤模型的功效评价中，可确认更准确的前临床结果。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供对与包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的人信号素3A及小鼠信号素3A交联的抗体的重链可变区进行编码的核酸分子。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供对包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的与人信号素3A及小鼠信号素3A交联的抗体的轻链可变区进行编码的核酸分子。

在本说明书中，术语“核酸分子”意味着统筹包括DNA(gDNA及cDNA)及RNA分子，在核酸分子中作为基本组成单位的核苷酸不仅包括天然核苷酸，而且还包括糖或碱基部位变形的相似物(analogue)(Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，Chemical Reviews，90:543-584(1990))。对本发明的上述重链可变区及轻链可变区进行编码的核酸分子序列可变形。上述变形包括核苷酸的添加、缺失或非保存性取代或保存性取代。

还被解释为，对人信号素3A抗体进行编码的本发明的核酸分子还包括对如上所述的核苷酸序列呈现实质同一性的核苷酸序列。上述实质同一性是指，以使上述本发明的核苷酸序列与任意的其他序列最大限度地相对应的方式对准，并使用在本领域中通常使用的算法来对所对准的序列进行分析的情况下，呈现最少80％的同源性、更优选地，呈现最少90％的同源性、最优选地，呈现最少95％的同源性的核苷酸序列。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含如上所述的核酸分子的重组载体。

在本说明书中，术语“载体(vector)”为用于在宿主细胞表达目的基因的工具，包括：质体载体；粘粒载体；如噬菌体载体、腺病毒载体、还原病毒载体及腺相关病毒载体等病毒载体等。

根据本发明的优选实例，在本发明的载体对轻链可变区进行编码的核酸分子及对重链可变区进行编码的核酸分子与启动子可启动性地结合(operatively linked)。

在本说明书中，术语“可启动性地结合”是指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列、或转录因子结合位置的阵列)与其他核酸序列之间的功能性结合，由此，上述调节序列对上述其他核酸序列的转录和/或翻译进行调节。

可通过本领域中公知的多种方法来建立本发明的重组载体系统，其具体方法在Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)所公开，该文献引入本说明书作为参考。

本发明的载体可作为用于典型地进行克隆或者用于表达的载体来实现。并且，本发明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主来实现。

例如，在本发明的载体为表达载体并将真核细胞作为宿主的情况下，可利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌酸启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼氏病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的启动子及劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子)，通常将多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

本发明的载体为了容易地对从其表达的抗体进行纯化而可与其他序列融合。例如，融合的序列为谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖-结合蛋白质(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)及6x His(六聚组氨酸(hexahistidine)；Quiagen，USA)等。

并且，由本发明的载体表的蛋白质为抗体，因此，即使没有用于纯化的额外的序列，也可以通过蛋白A柱等来容易地对所表达的抗体进行纯化。

另一方面，本发明的表达载体作为选择性标记，包括本领域中通常使用的抗生素抗性基因，例如，对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那徽素、遗传霉素、新霉素及四环素抗性的基因。

根据本发明又一实施方式，本发明提供利用上述重组载体转化而成的宿主细胞。

作为可对本发明的载体稳定且连续地进行克隆及表达的宿主细胞，也可以利用本领域中公知的任意宿主细胞，例如，上述载体的适合真核细胞宿主细胞包括猴肾细胞7(COS7：monkey kidney cells)、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO：Chinese hamsterovary)细胞、W138、幼仑鼠肾(BHK：baby hamster kidney)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞株、HuT78细胞及HEK-293细胞，但不限定于此。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于预防或治疗癌症的药剂学组合物，包含：(a)如上所述的本发明的人信号素3A抗体或其抗原结合片段的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体(carrier)。

本发明的药剂学组合物利用如上所述的本发明的人信号素3A抗体或其抗原结合片段作为有效成分，因此，对于两者之间的共同内容，为了避免本说明书过于复杂而不进行反复记载，而省略其记载。

如以下实施例所证实，本发明的人信号素3A抗体具有高抗信号素3A结合性及基于其的信号素3A功能抑制性，因此抑制来源于多种癌症的癌细胞的生长，通过对信号素3A和作为下游信号传递物质的ERK的磷酸化进行抑制来抑制信号素3A信号传递，从而抑制癌细胞的迁移。因此，本发明的抗体对于癌症的预防及治疗非常有效。

可利用本发明的组合物预防或治疗的癌症包括本领域中公知的多种癌症，例如，包括乳腺癌、大肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、脑癌、子宫癌、鼻咽癌、喉癌、结肠癌、卵巢癌、直肠癌、大肠癌、阴道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、尿管癌、尿道癌、前列腺癌、支气管癌、膀胱癌、肾癌及骨髓癌。

具体地，可利用本发明的组合物预防或治疗的癌症为信号素3A表达癌症。

本发明的药剂学组合物所包含的药剂学上接受的载体通常在做制剂时所利用，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钾、藻酸盐、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟苯酸酯、丙基羟苯酸酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。本发明的药剂学组合物除了包含上述成分之外，还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、矫臭剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细记载在Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)中。

本发明的药剂学组合物能够以非口服方式进行给药，例如，能够静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药量根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药路径、排泄速度及反应敏感性等因素而为多种，通常，熟练的医师可对所希望的治疗或预防中有效的给药量容易地下决定及开处方。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的一天给药量为0.0001～100mg/kg。在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指在癌症的预防或治疗中充分使用的量。

对于本发明的药剂学组合物，根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方式，可利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂进行制剂化来以单位容量形态制备或者通过装入多容量容器内来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以为提取剂、散剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，并且还可包括分散剂或稳定剂。

发明的效果

以下，概括本发明的特征及优点。

(a)本发明提供对人信号素3A及小鼠信号素3A具有交联能力的抗体。

(b)本发明的抗体可用作在信号素3A表达高的成胶质母细胞瘤、胰腺癌、肝癌等多种癌症中抑制信号素3A的抗体治疗剂。

(c)认为信号素3A为糖尿病视网膜病、自身免疫性关节炎、神经病变性疼痛、骨质疏松症的治疗靶标，因此本发明的抗体或抗原结合片段不仅用作抗癌治疗剂，而且还可以用作多种相关疾病的治疗剂。

(d)本发明的抗体具有高抗信号素3A结合性及基于其的信号素3A功能抑制性，因此抑制来源于多种癌症的癌细胞的生长，通过对信号素3A的下游信号传递物质中ERK的磷酸化进行抑制来抑制癌细胞的迁移，从而对于癌症的预防及治疗非常有效。

附图说明

图1为示出用于识别抗信号素3A scFv抗体片段的噬菌体展示筛选过程的示意图。

图2为示出噬菌体展示筛选结果的曲线图。

图3为对与人信号素3A结合的52种scFv抗体片段的结合力进行分析的结果。

图4为再次对52种信号素3A scFv的结合力进行验证的结果。

图5a及图5b为对31种信号素3A scFv的序列进行确认的结果。

图6为用于生产scFv抗体片段的噬菌粒载体的结构图。

图7为经纯化的3种信号素3A scFv抗体片段的考马斯亮蓝染色结果。

图8为示出将3种抗信号素3A抗体片段按浓度进行间接酶联免疫吸附测定(Indirect ELISA)的结果的曲线图。

图9为利用夹心酶联免疫吸附测定法(Sandwich ELISA)来确认信号素3A分泌细胞的结果。

图10为利用抗信号素3A来确认细胞生长抑制能力的结果。

图11为利用抗信号素3A scFv和U87-MG细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图12为利用抗信号素3A scFv和131细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图13为利用抗信号素3A scFv和83细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图14a、图14b、图14c及图14d为通过高效液相色谱(HPLC)分析法来确认抗信号素3A IgG的纯度的结果。

图15为通过考马斯亮蓝染色来确认抗信号素3A IgG的大小的结果。

图16为确认对人信号素3A及小鼠信号素3A的结合能力的结果。

图17a、图17b、图17c、图17d、图17e及图17f为对3种抗信号素3A IgG对人信号素3A及小鼠信号素3A的结合能力进行表面等离子共振(SPR)分析的结果。

图18为利用抗信号素3A IgG和U87-MG细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图19为利用抗信号素3A IgG和131细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图20为利用抗信号素3A IgG和83细胞来确认细胞迁移抑制能力的结果。

图21为确认抑制ERK磷酸化的抗信号素3A抗体功效的结果。

图22为确认信号素3A IgG的成胶质母细胞瘤细胞生长促进能力的结果。

图23为对基于抗信号素3A IgG浓度的细胞生长程度进行测定的结果。

图24为确认动物模型中的肿瘤大小通过抗信号素3A IgG而减小的结果。

图25为测定动物模型中的肿瘤重量通过抗信号素3A IgG而发生变化的结果。

图26为测定动物模型的体重随着抗信号素3A IgG的给药而发生变化的结果。

图27为向动物模型给药抗信号素3A IgG后实施免疫荧光染色来确认细胞凋亡效果的结果。

图28为向动物模型给药抗信号素3A IgG后确认TAM分布的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更详细说明发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，而对于本领域普通技术人员而言，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限定于这些实施例是显而易见的。

实施例1：利用人信号素3A重组蛋白的筛选

利用那个以往所制作的合成scFv抗体片段噬菌体文库(Yang et al.，Mol.Cells.27:225-235，2009)并通过噬菌体展示筛选来识别与人信号素3A结合的scFv抗体片段。噬菌体展示筛选过程图如1所示。

详细地，为了将导入在大肠杆菌宿主ER2537内的噬菌粒(phagemid)载体以噬菌体(phage)形态回收，将下位库样品分别在400ml的培养基(SB/氨苄青霉素/2％的葡萄糖)培养2小时。若在O.D600吸光度达到0.5～0.7左右，则在5000g离心分离20分钟来去除上清液后，使其悬浮在400ml的第二培养基(SB/氨苄青霉素)内，然后，添加10¹²pfu(空斑形成单位(plaque forming unit))的辅助噬菌体(VCSM13)，培养1小时。之后，添加70μg/ml的卡那徽素抗生素后，在30℃的温度下培养过夜，以使噬菌体文库可向宿主细胞外分泌。接着，利用聚乙二醇(PEG，polyethylene glycol)溶液使通过离心分离来获得的培养物仅沉淀出噬菌体形态，从而仅获得噬菌体文库。

利用以如上所述的方式获得的噬菌体文库来实施噬菌体展示筛选，反复进行这种筛选过程。以约2.5×10¹²pfu程度整合所计数的下位后，在涂敷有在TBS中以10μg/ml程度稀释的rhSema3A-Fc蛋白的免疫试管(immunotube)中处理1小时。利用含有3％的全脂乳的封闭液对处理前的免疫试管及噬菌体离子处理1小时，来防止非特异性结合。利用TBST(0.1％Tween20)溶液清洗免疫试管后，静置100mM的TEA十分钟，从而回收与信号素3A结合的噬菌体。为了确认所回收的噬菌体(output)数量而使宿主细胞受感染后在培养基进行计数。将以3000rpm离心分离剩余的回收溶液15分钟来沉淀的ER2537与500μl的培养基(SB)混合后，涂抹于15cm的培养基并进行培养后添加5ml的SB培养基(50％的丙三醇(glycerol))来回收并保管((-80℃))菌落。

接着，为了反复进行筛选，从所保管的前次噬菌体溶液中取50μl来进行噬菌体粒子扩增工作。培养作为宿主细胞的ER2537后，放入辅助噬菌体并通过PEG沉淀来分离所回收的噬菌体粒子，并以相同地方式将其使用于下次筛选。经确认，随着反复进行筛选，相比于筛选前，筛选后的噬菌体粒子的比率增加，这意味着经过筛选来使对信号素3A具有特异性的噬菌体粒子扩增。其数值在图2中明示。

实施例2：用于抗信号素3A scFv后补筛选的ELISA及序列分析

在第四次筛选中回收的噬菌体粒子通过感染宿主细胞ER2537来在培养基中确认为菌落。取该菌落并接种在包含200μl的SB/氨苄青霉素的培养基的96孔板后，在37℃的温度下培养2～3小时。然后，为了诱导scFv-pⅢ蛋白表达，对每孔处理最终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)，在30℃的温度下培养过夜。以3000rpm离心分离所培养的孔板来去除上清液后，为了存在于培养细胞的周质(periplasm)内的噬菌体粒子，每孔放入40μl的TES溶液(20％w/v的蔗糖，50mM的Tris，1mM的EDTA，pH 8.0)并在4℃的温度下静置30分钟，来溶解细胞。之后，处理60μl的0.2X TES溶液并在4℃的温度下放置30分钟，利用渗透压来分解细胞后，以3000rpm离心分离孔板15分钟来获得上清液的scFv-pⅢ蛋白。

在涂敷有预先准备的信号素3A蛋白的96孔板中的每对应的孔中添加25μl的所获得的上清液后，在室温下进行结合1小时后，利用TBST和蒸馏水来清洗6次。之后，利用结合有可与scFv-pⅢ的HA-标签结合的HRP的抗HA抗体来在室温下进行结合1小时后，再次利用TBST(0.1％Tween20)和蒸馏水来清洗6次。利用TMB来诱导发色反应后，利用H₂SO₄溶液停止发色反应，在O.D 450nm测定其值。所分析出的总菌落数为86个，其中52个菌落(结合能力倍数>2)对信号素3A呈现出高结合能力(图3)。使用BSA溶液作为对照组，通过ELISA进行重新确认来从该52个菌落中选出结合能力高的31个菌落(图4)。之后，从31个菌落回收噬菌粒后，进行DNA序列分析，筛选出共5个具有其他序列的菌落。存在A08为3个，F11为21个，C10为2个具有相同的DNA序列的菌落，除此之外，经确认，A10、E10菌落具有不同的DNA序列(图5)。具有最多相同序列的菌落为F11、A08、C10，因此，将它们选择为最终的信号素3A scFv后补。

实施例3：生产抗信号素3A scFv蛋白及确认信号素3A结合能力

噬菌粒的基本结构可在图6中确认，在如上所述的过程中所记载的宿主细胞ER2537的情况下，由于抑制位于噬菌体(phage)pⅢ前的琥珀密码子(amber codon(UAG))，无法单独表达scFv。因此，利用作为非抑制性宿主(non-suppressor strain)的表达菌株(TOP10F’)来将噬菌粒转化到表达菌株内。之后，通过DNA序列分析确认到，各噬菌粒没有产生突变并被导入的表达菌株，将该表达菌株取为菌落后，接种在3ml的LB/氨苄青霉素培养基后，在37℃的温度下培养过夜。之后，将3ml的培养过夜的培养液移至400ml的培养基(SB/氨苄青霉素)并在OD600进行培养，直到成为0.5～0.7，添加最终浓度为1mM的IPTG并在30℃的温度下培养过夜。离心分离培养液后利用40ml的TES溶液溶解表达宿主后，投入60ml的O.2X TES来回收周质内的噬菌体粒子，通过0.45μm的过滤器来过滤所回收的上清液。为了His-tag纯化而将1ml的Ni-NTA微球(Qiagen)添加到经过滤的溶液中所存在的scFv蛋白中，并在常温下进行结合1小时，之后，填充于重力柱(gravity column，Bio-rad)中并通过200mM的咪唑溶液来进行回收。各菌落被表达及纯化后，通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色(coomassie blue staining)来确认大小为约28kDa的scFv，其结果在图7中明示。经纯化的scFv形态的各菌落的DNA序列在表1及表2中记载。

表1

3种抗信号素3A scFv抗体片段的重链FR部位及CDR部位序列信息

表2

3种抗信号素3A scFv抗体片段的轻链FR部位及CDR部位序列信息

为了测定对人信号素3A的各抗体片段蛋白的各浓度的结合能力，将scFv分别按2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.62ng/ml的浓度对分别涂敷有200ng的信号素3A、BSA的96孔中进行处理，来分析OD值的变化。在对信号素3A的结合能力的大小为A08、C10、F11的scFv的情况下，可通过OD值的变化来确认，相比于BSA，浓度越高，与信号素3A结合的scFv越多，其可在图8中确认。

实施例4：确认抗信号素3A scFv的细胞生长抑制能力和细胞迁移抑制能力

通过ELISA来确认对信号素3A蛋白的结合能力后，为了验证对细胞实际分泌的信号素3A抗癌能力，利用细胞增殖分析法和细胞迁移分析，首先，通过夹心酶联免疫吸附测定法确认是否分泌信号素3A，结果，来源于患者的细胞中的559分泌少量信号素3A，相反，131和83分泌过多信号素3A。将培养基和NPC使用为阴性对照组，将U87-MG细胞使用为阳性对照组(图9)。为了执行细胞增殖分析法，利用5×10³个559细胞和131细胞来处理50μg/ml的抗信号素3A scFv。处理后经过4天后，利用EZ-Cytox细胞存活率检测试剂盒(DaeilLab.Service)来测定细胞生长速度。分泌少量信号素3A的559细胞经过抗信号素3A scFv处理后，细胞生长速度没有发生改变，相反，分泌过多信号素3A的131细胞经过抗信号素3AscFv处理后，相比于对照组，呈现出70％的细胞生长速度(图10)。

为了利用抗信号素3A scFv的细胞迁移抑制能力，利用作为分泌过多信号素3A的细胞U87-MG、131、83来执行细胞迁移分析法。首先，在transwell(康宁(Corning))中放入多聚-L-鸟氨酸(PLO，Poly-L-Ornithine)并在室温下进行涂敷30分钟后，自然干燥。在U87-MG细胞的情况下，在未包含100μl的生长因子的DMEM培养液中添加5×10⁴个U87-MG细胞和50μg/ml的3种信号素3A scFv并放入transwell，在下孔中放入包含10％的胎牛血清(FBS，Fetal bovine serum)的600μl的DMEM培养液，并在37℃的温度下培养过夜。在不包含生长因子(EGF and bFGF)的100μl的NBA培养液中分别放入1×10⁵个作为来源于患者的细胞的131细胞和83细胞和3种信号素3A scFv，在下孔中放入包含生长因子的NBA培养基，并在37℃的温度下培养过夜。之后，在12孔中，每transwell中准备600μl的甲醇(Methanol)、苏木精(Hematoxylin)、伊红(Eosin)中的一种后，将transwell放置于甲醇中1分钟后，在苏木精中静置5分钟并对核进行染色。然后，用水清洗，干燥并在伊红中放置30秒钟，来对细胞质进行染色，再次用水清洗，并用棉棒擦拭干净transwell内侧。在图11中可观察到，核被苏木精染色，细胞质被伊红染色。

U87-MG细胞的情况下，将没有处理信号素3A scFv抗体片段的对照组视为100％的细胞全部迁移时，放入A08抗体片段的细胞呈现出减少78％的细胞迁移，放入C10抗体片段的细胞呈现出减少70％的细胞迁移，放入F11抗体片段的细胞呈现出减少74％的细胞迁移(图11)。在作为来源于患者的细胞的131、83的情况下，放入A08抗体片段的细胞分别呈现出减少11％、21％的细胞迁移，放入C10抗体片段的细胞分别呈现出减少19％、44％的细胞迁移，放入F11抗体片段的细胞分别呈现出减少7％、28％的细胞迁移(图12、图13)。在3种信号素3A抗体片段中，相比于细胞株U87-MG，作为来源于患者的细胞的131、83细胞呈现出更大的细胞迁移抑制效果，可用作抑制癌细胞的细胞迁移的抗癌剂。

实施例5：将抗信号素3A片段抗体生产为IgG

为了抗信号素3A抗体片段的形态转换为IgG形态，利用Expi 293F表达系统(lifetechnologies)转化信号素3A scFv的重链序列和轻链序列的基因。为了获得包含在培养液中的信号素3A IgG，利用

蛋白纯化系统和Amicon离心分离过滤器来进行纯化，A08的生产量为118mg/L，C10的生产量为138mg/L，F11的生产量为330mg/L。为了确认经纯化的抗信号素3A抗体的纯度，导入高效液相色谱法。IgG的大小为150kD，因此想，相当于在标记峰值16.388分钟出现的物质。在该峰值检测出3种信号素3A抗体(A08、C10、F11)，经确认，纯度为98％、98.5％、99％。进行SDS PAGE及考马斯亮蓝染色来确认基于大小的抗信号素3A IgG形态。在不进行还原的条件下，在IgG的大小为150kD中检测到带，在进行还原的条件下，二硫键被破坏，从而重链序列和轻链序列的大小分别为50kD、25kD(图15)。

为了对信号素3A的3种信号素3A抗体的结合能力，以两种浓度条件(500nM、50nM)执行ELISA。将BSA利用为阴性对照组，将小鼠信号素3A和人信号素3A蛋白使用为实验组。经确认，3种信号素3A抗体对人信号素3A和小鼠信号素3A具有结合能力，可在图16中确认。除了人信号素3A以外，也对小鼠信号素3A具有结合能力是因为，相比于其他蛋白质，种间特异性低，人信号素3A和小鼠信号素3A序列的相似性达到98％以上，因此，认为对人信号素3A及小鼠信号素3A具有交联能力(图16)。

为了测定对3种抗信号素3A抗体的人信号素3A、小鼠信号素3A的结合力，利用Biacore系统的SPR分析来进行分析。经测定，对人信号素3A的结合力为A08(KD＝1.187E-9)、C10(KD＝5.312E-10)、F11(KD＝5.617E-10)，对小鼠信号素3A的结合力为A08(KD＝4.221E-9)，C10(KD＝3.090E-9)，F11(KD＝3.272E-10)。因此确认，3种抗信号素3A抗体呈现出交叉反应性(cross-reactivity)，尤其，F11对人信号素3A及小鼠信号素3A的结合力最高。

实施例6：确认抗信号素3A IgG的细胞迁移抑制能力

如在前确认到的抗信号素3A scFv的癌细胞迁移抑制，在此对转换为IgG形态的3种信号素3A抗体(A08、C10、F11)的癌细胞迁移抑制能力进行验证。利用分泌过多信号素3A的U87-MG、131、83细胞和2μg/ml的抗信号素3A抗体来执行细胞迁移法。通过如图11至图13所示的方法来执行细胞迁移法，并已经在前面说明。在U87-MG细胞中，A08呈现出最高的细胞迁移抑制能力，为50％(图18)，在131、83细胞中，F11的效果最高，为74％、52％，相比于对照组，呈现出低的细胞迁移能力(图19、图20).

曾报道过，在大肠癌中，信号素3A所参与的细胞迁移与ERK信号机制有关的研究((Neufeld，G et al.，Cold Spring Harbor perspectives in medicine,2012)；在成胶质母细胞瘤中，信号素3A与Rho/ROCK信号机制和ERK信号机制有关的研究(Zohrabian，V.M.，Anticancer research，119-123,2009)。

在37℃的温度下处理1×10⁶个83细胞和F11(50μg/ml)30分钟后，执行蛋白质免疫印迹法来确认是否抑制ERK的磷酸化。在8％的凝胶中进行SDS-PAGE蛋白质电泳，并利用抗体探测p-ERK，ERK，β-肌动蛋白。将对照组与处理F11的实验组进行比较，结果确认，ERK和β-肌动蛋白没有发生变化，ERK的磷酸化降低(图21)。由此确认，抗信号素3A抗体对信号素3A的下游信号传递物质中ERK磷酸化进行抑制来抑制细胞迁移。

实施例7：抗信号素3A IgG的细胞生长抑制能力

为了确认信号素3A是否参与成胶质母细胞瘤细胞的生长，对131、83细胞处理重组人信号素3A后，观察细胞生长变化。进行利用Edu的细胞增殖实验(proliferation assay)，结果确认，细胞生长分别增加20％、15％(图22)。

接着，利用131细胞来处理作为抗信号素3A抗体的F11，结果确认，随着抗体的浓度呈现出细胞生长抑制，相比于对照组，作为最高浓度2μM中呈现出40％的抑制(图23)。

实施例8：利用131皮下(Subcutaneous)模型的抗信号素3A IgG的功效评价

为了在体内中抗信号素3A F11的抗癌效果，制作利用分泌过多信号素3A的成胶质母细胞瘤131细胞的移植瘤模型(xenograft model)。将抗信号素3A F11分别以5mg/kg、25mg/kg的量注射3周(i.v.)后，确认肿瘤大小，结果确认，相比于对照组，注射25mg/kg(3次/周)的组的肿瘤的大小减小60％(图24)。计算个体组的肿瘤重量变化结果，与肿瘤大小比对相似(图25)。

没有确认到基于所注入的抗信号素3A抗体的特异性重量变化(图26)。对于对照组和呈现出最高功效的组3(Group3)组织(F11 25mg/kg，3次/周)进行免疫荧光染色，经确认，在处理抗信号素3A抗体的组的组织中，信号素3A和p-ERK明显减少。并且，相比于对照组，TUNEL阳性细胞增加，从而观察到细胞凋亡效果(图27)。有很多有关信号素3A参与TAM浸润(TAM infiltration)的论文(Casazza A，et al.Cancer cell.2013；24(6):695-709/HuZQ，et al.Oncotarget.2016.)。因此，为了证实，通过作为巨噬细胞标记的Iba1染色来确认基于信号素3A抗体的TAM分布减少(图28)。

序列表

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION

<120> 与人及小鼠信号素3A交联的抗体及其用途

<130> PP160085

<150> KR 15/0149272

<151> 2015-10-27

<150> KR 16/0123233

<151> 2016-09-26

<160> 24

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08重链CDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08重链CDR2

<400> 2

Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08重链CDR3

<400> 3

Ala Lys Asn Leu Gly Arg Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08轻链CDR1

<400> 4

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08轻链CDR2

<400> 5

Asp Asp Asn

1

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A08轻链CDR3

<400> 6

Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10重链CDR1

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10重链CDR2

<400> 8

Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10重链CDR3

<400> 9

Ala Arg Tyr Leu Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10轻链CDR1

<400> 10

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10轻链CDR2

<400> 11

Ser Asp Ser

1

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C10轻链CDR3

<400> 12

Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11重链CDR1

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11重链CDR2

<400> 14

Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11重链CDR3

<400> 15

Ala Lys Leu Asn Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11轻链CDR1

<400> 16

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11轻链CDR2

<400> 17

Ala Asp Ser

1

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F11轻链CDR3

<400> 18

Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成A08 scFv A/a的重链可变区

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Leu Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成A08 scFv A/a的轻链可变区

<400> 20

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 21

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成C10 scFv A/a的重链可变区

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Leu Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成C10 scFv A/a的轻链可变区

<400> 22

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 23

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成F11 scFv A/a的重链可变区

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Asn Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成F11 scFv A/a的轻链可变区

<400> 24

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.一种针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其包括：

(a)包括重链互补决定区氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2及SEQ ID NO:3的CDRH3；以及

(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:4的CDRL1、SEQ ID NO:5的CDRL2及SEQ ID NO:6的CDRL3。

2.根据权利要求1所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述重链可变区包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述轻链可变区包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

4.一种针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其包括：

(a)包括重链互补决定区氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:7的CDRH1、SEQ ID NO:8的CDRH2及SEQ ID NO:9的CDRH3；以及

(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:10的CDRL1、SEQ ID NO:11的CDRL2及SEQ ID NO:12的CDRL3。

5.根据权利要求4所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述重链可变区包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

6.根据权利要求4所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述轻链可变区包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

7.一种针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其包括：

(a)包括重链互补决定区氨基酸序列的重链可变区，上述重链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:13的CDRH1、SEQ ID NO:14的CDRH2及SEQ ID NO:15的CDRH3；以及

(b)包括轻链互补决定区氨基酸序列的轻链可变区，上述轻链互补决定区氨基酸序列为SEQ ID NO:16的CDRL1、SEQ ID NO:17的CDRL2及SEQ ID NO:18的CDRL3。

8.根据权利要求7所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

9.根据权利要求7所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段，其中上述轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

10.一种核酸分子组，其选自：

核酸分子组(a)，其由下列核酸分子组成：

编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列的核酸分子，及

编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核酸分子；

核酸分子组(b)，其由下列核酸分子组成：

编码SEQ ID NO:21的氨基酸序列的核酸分子，及

编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸分子；及

核酸分子组(c)，其由下列核酸分子组成：

编码SEQ ID NO:23的氨基酸序列的核酸分子，及

编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的核酸分子。

11.一种重组载体，其包含根据权利要求10所述的核酸分子组。

12.重组载体组，其选自：

重组载体组(a)，其由下列重组载体组成：

包含编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列的核酸分子的重组载体，及

包含编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核酸分子的重组载体；

重组载体组(b)，其由下列重组载体组成：

包含编码SEQ ID NO:21的氨基酸序列的核酸分子的重组载体，及

包含编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸分子的重组载体；及

重组载体组(c)，其由下列重组载体组成：

包含编码SEQ ID NO:23的氨基酸序列的核酸分子的重组载体，及

包含编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的核酸分子的重组载体。

13.一种宿主细胞，其利用权利要求11所述的重组载体或权利要求12所述的重组载体组转化而成。

14.一种用于预防及治疗受试者中与信号素3A过表达相关的癌症的药剂学组合物，其包含：

(a)药剂学有效量的权利要求1至9中任一项所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段；以及

(b)药剂学上接受的载体。

15.根据权利要求14所述的用于预防及治疗癌症的药剂学组合物，其中上述癌症为乳腺癌、大肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、脑癌、子宫癌、鼻咽癌、喉癌、结肠癌、卵巢癌、直肠癌、阴道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、尿管癌、尿道癌、前列腺癌、支气管癌、膀胱癌、肾癌或骨髓癌。

16.权利要求1至9中任一项所述的针对人信号素3A的抗体或其抗原结合片段用于制备预防及治疗受试者中与信号素3A过表达相关的癌症的药物的用途。

17.权利要求16的用途，其中上述癌症为乳腺癌、大肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、脑癌、子宫癌、鼻咽癌、喉癌、结肠癌、卵巢癌、直肠癌、阴道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、尿管癌、尿道癌、前列腺癌、支气管癌、膀胱癌、肾癌或骨髓癌。