KR20230086338A - 항-muc1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암 또는 종양의 진단용 조성물, 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

항-MUC1 항체 및 이의 용도 {Anti-MUC1 antibody and Use Thereof}

본 발명은 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암 또는 종양의 진단용 조성물, 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

다양한 암에서 MUC1 (mucin1)의 비정상적인 과발현과 암의 형질전환과 관련된 여러 단백질의 상호작용으로 MUC1은 잠재적인 종양학적 표적이 되었다. MUC1은 뮤신 패밀리의 구성원이며 알파 도메인과 베타 도메인으로 구성된다. 매우 반복적인 서열을 포함하는 알파 도메인은 강하게 글리코실화되어 암으로의 변이 과정에서 방출된다. 대조적으로, 베타 도메인은 세포막에 고정되고 세포질을 향한다.

MUC1의 C-말단 도메인(MUC1-C)은 여러 신호전달 수용체, 특히 수용체형 티로신 키나아제 예를 들어 인간 상피 성장 인자 수용체 (HER) 패밀리 수용체의 4가지 구성원, 섬유 아세포 성장인자 수용체-3 (FGFR-3), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 등과의 상호작용을 통해 발암 과정에서 중요한 분자 역할을 한다. MUC1-C는 작은 세포외 도메인(ECD), 막관통 도메인(TM) 및 세포질 도메인(CD)으로 구성된다.

갈렉틴-3은 MUC1-C의 N-글리코실화 부위에 결합하고 수용체 티로신 키나아제(RTK: receptor tyrosine kinases)의 브리지 역할을 한다. MUC1-C 세포질 도메인은 고유의 동종이량체화 역할 및 일부 신호 전달 경로의 중재자와 직접 상호작용을 한다. MUC1-C 동종이량체를 핵과 미토콘드리아에 수송하여 p53 유전자의 발현과 MUC1-C와 p53의 직접 결합에 의한 아폽토시스의 억제, E-cadherin/-catenin의 복합체 감소로 인한 세포 접착 및 이동의 억제, 유방암 세포의 극성 손실들 다양한 세포 행동을 유도한다 (Wei, X.; Xu, H.; Kufe, D. Human MUC1 oncoprotein regulates p53-responsive gene transcription in the genotoxic stress response. Cancer Cell. 2005, 7, 167-178.). MUC1-C 의존성 유전자 시그니처는 유방암 및 폐암의 결과 불량과 관련이 있으며, 암의 형질전환에서 MUC1-C의 중요성을 강화시킨다.

MUC1의 다양한 절단형이 존재하고, MUC1-C*는 암에서 고도로 발현된다. 인터페론 감마 및 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor-alpha)와 같은 염증유발성 사이토카인의 방출에 의해 여러 프로테아제 (ADAM17, MMP)를 활성화시키는 것으로 알려져 있기 때문에, MUC1은 단백질 분해에 의해 작은 세포외 도메인 MUC1-C*로 절단된다. MUC1-C*는 45개 아미노산 (AA) ECD (세포외 도메인)를 포함하고 전이 관련 단백질의 성장 인자 수용체 역할을 한다.

MUC1-C는 중요한 발암성 수용체 중 하나로, 그것은 암세포의 극성의 상실, 암의 줄기 세포성, 상피 간엽 전환의 원인이 되고, 전이, 암세포의 후성적 프로그래밍, 및 PD-L1(programmed death-ligand 1) 발현 유도에 의한 면역억제 인자로서 기능한다. 따라서, MUC1-C 기능의 억제는 다양한 암에서 효과적인 항암 전략으로 제안되었다 (Li, Y.; Cozzi, P.J.MUC1 is a promising therapeutic target for prostate cancer therapy. Curr. Cancer Drug. Targets 2007, 7, 259-271.).

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 항-MUC1 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 MUC1에 목적하는 결합력을 나타내는 항-MUC1 항체를 개발하고, 이러한 항-MUC1 항체가 목적하는 암 또는 종양 치료제 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 MUC1에 대한 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 또는 암의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MUC1 (Mucin 1)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 또는 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 종양 또는 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 또는 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 진단방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 종양 또는 암의 진단 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합단편은 MUC1에 목적하는 결합력을 나타내며, 목적하는 암/종양의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MUC1-C ECD에 대해 선택된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 클론의 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 재조합 인간 MUC1-C 항원을 이용한 바이오패닝에는 Fc 바인더가 사전에 제거된 인간 천연 scFv 항체 라이브러리를 사용하였다. 마지막 패닝으로부터의 콜로니를 무작위로 배양하고, ELISA를 통해 scFv 상등액을 항원 결합에 대해 시험하였다.
도 2는 MUC1 양성 유방암 세포에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다. 유방암 세포 표면 중 MUC1 발현을 FACS (flow cytometry)를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 항체의 전이 활성에 대한 효능 평가 결과이다. BT-20 및 T47D 세포에 대한 in vitro 매트리겔 침윤 분석을 수행하였고, 분석에 대한 이미지를 나타내었다.
도 4는 본 발명에 따른 항체로 ZR75-1 세포를 표면염색한 결과를 나타낸 것이다. Alexa 488로 접합된 항-인간 IgG Ab 및 Alexa 647 이차항체로 접합된 항-마우스 IgG Ab로 염색하였다. 이미지를 공초점 현미경 (CLSM system; LSM 700, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 시각화하였다. 마우스 IgG를 포함하는 KC-001 항체로 FACS 분석을 수행하였다.
도 5는 Octet® RED 96 시스템을 포함하는 BLI (biolayer interferometry)를 이용하여 본 발명에 따른 항체의 친화도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 항체에 대한 용융온도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 종류의 유방암 및 비종양성 유선(NNM)에서 각 강도 등급의 백분율 (면역 반응성에 대한 기준; 음성 (0), 매우 약함 (0.5), 약함 (1), 중등 (2), 강함 (3)) 및 유방암에서 MUC1 면역 반응성을 면역조직화학 분석한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MUC1 (Mucin 1)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체는 특히, MUC1의 C-말단 도메인(MUC1-C)에 특이적으로 결합한다. MUC1-C는 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG (서열번호 9)서열번호 9의 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 MUC1-C-특이적 결합을 나타내었고 세포 표면의 막 근위 MUC1-C에 결합하며, MUC1-C 도메인이 암 침윤의 중요한 조절인자로 고려되는데 MUC1 발현 유방암 세포의 침윤에 있어서 중요한 억제적 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 MUC1에 특이적으로 결합하는 항-MUC1 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 MUC1에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.

구체적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MUC1 단백질의 C-말단 (예를 들어, 서열번호 9) 내의 5개, 7개, 10개, 12개 이상 또는 바람직하게는 15개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(에피토프)를 인식하거나 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.

"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.

본 발명에 있어, 상기 MUC1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

MUC1 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, MUC1 항체의 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, MUC1 항체의 결합 친화성은 10^-6 M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5 M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9 M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5 M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10 M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9 M 내지 10^-10 M, 10^-5 M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9 M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5 M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8 M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5 M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7 M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

상기 MUC1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 7 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 서열의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 8 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 서열의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 7의 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 MUC1를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-MUC1 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 MUC1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암 또는 종양 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 MUC1의 면역억제 기작 방해 용도 및 이를 통한 암 또는 종양의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.

상기 조성물에 적용되는 질환인 종양은 전형적으로 면역치료요법에 반응하는 종양 또는 암, 및 지금까지 면역요법에 관련되지 않은 종양 또는 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유선암, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.

특히, 유선암에서 MUC1이 강하게 발현됨을 확인하였으며, 본 발명에 따른 MUC1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 유선암의 예방 또는 치료에 적합하게 사용될 수 있다.

"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 또는 종양을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 또는 종양 발전의 억제, 암 또는 종양의 경감 또는 암 또는 종양의 제거를 의미한다.

경우에 따라서, 상기 항체 이외에 다른 암 또는 종양 치료제를 병용함으로써 암 또는 종양세포를 효과적으로 표적화하고, T 세포 활성을 증가시켜, 암 또는 종양세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.

경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 종양 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 MUC1의 발현 여부와 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 종양 또는 암을 진단할 수 있다.

상기 조성물은 진단용 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

일 실시예에서 상기 키트는 병, 바이알, 백, 주사기 또는 시린지를 포함할 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 또는 금속으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기에 포함된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 추가로 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 등을 포함할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. MUC1에 결합하는 항체의 선별

MUC1-C 특이적 항체를 스크리닝하기 위해, 서열번호 9의 서열을 포함하는 MUC1-C 항원을 사용하여 파지 디스플레이를 수행하였다.

인간 MUC1 항원은 58 AA sense 5'-AGGCCCAGGCGGCCTCTGTGGTGGTACAA-3', anti-sense 5'-AGGCCAGCCAGGCCCCCAGCCCCAGACTG-3', 45 AA sense 5'-GGGGCCCAGGCGGCCGGTACCATCAATGTCCACGAC-3' 및 anti-sense 5'- GCTGGCCAGCCAGGCCAGCCCCAGACTGGGCAGAG-3'을 사용하여 PCR 하였다. 항체의 농축을 위한 바이오패닝은 인간 노멀 IgG 또는 재조합 MUC1-C 단백질로 코팅된 면역관(maxisorp, Nunc, Rochester, NY, USA) 또는 자기 비드(Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 일반적인 IgG. 파지를 인간 IgG 코팅 비드에 미리 흡착시켜 인간 Fc 결합제를 제거한 후, 상청액 중의 파지를 고정화 항원과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 파지 항원을 0.1% Tween 20/PBS로 5회 세척하고, 결합된 파지를 0.25% 트립신(Gibco, Waltham, MA, USA)으로 용출시켰다. 용출된 파지는 지수 증식기의 대장균 ER2738에 직접 감염시켜 증폭되었다. 하룻밤 배양된 파지를 PEG 침전(최종 5% w/v 폴리에틸렌글리콜 8000(PEG8000), 0.5 M NaCl)로 정제하고 다음 패닝 사이클에 사용하였다. 4 라운드 패닝을 수행하여 항체 결합제를 농축하였다. 3번째와 4번째의 패닝으로부터의 개별 콜로니를 무작위로 선택하고, MUC1-C 항원 결합에 대해 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 테스트하고, 양성 ELISA 신호를 나타내는 클론을 DNA 시퀀싱에 적용하였다.

인간 비변형 항체 라이브러리를 증폭하고 면역 튜브 및 MUC1-C 항원으로 코팅된 자기 비드를 사용하여 패닝하였다. 비특이적 결합제를 제거하기 위해 IgG를 미리 제거하였다. 4 라운드 패닝 후 개별 파지로 형질감염된 박테리아 클론에서 파생된 세포질 추출물을 MUC1-C 항원, 인간 Fc 및 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 ELISA에 의해 검증하였다. scFv를 발현하지 않는 클론은 세포질 추출물을 이용한 도트 블롯 분석을 통해 제외시켰다. 결합 클론의 서열분석 결과 (도 1)를 통해 scFv의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 도메인을 IgG의 도메인으로 옮긴 후, 전체 크기의 IgG1을 발현시켰다.

실시예 2. 유방암 세포에서 MUC1 발현

488nm 아르곤 레이저와 615nm 적색 다이오드 레이저를 갖춘 FACS (Becton-Dickinson, BD Biosciences)를 통해 유방암 세포에서 MUC1의 천연형 (natural form) 발현을 확인하였다. 세포를 회수하고 FACS 완충액(PBS 중 2% FBS)으로 세척하였다. 세포를 추천 IgG(4 g/mL)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미결합 항체를 세척한 후, Alexa Fluor 488 표지 염소 항-인간 IgG 항체 또는 647 표지 염소 항-마우스 IgG 항체와 1시간 동안 인큐베이션한 후, Kaluza 소프트웨어(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 샘플을 분석하였다.

암세포주는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 유지되었다. ZR-75-1은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 입수하였고, BT-20 및 MCF-7 세포주는 KCLB (Korean Cell Bank, Seoul, Korea)에서 입수하였다.

KC-001을 FACS 분석하여 이들 항체가 ZR-75-1, BT-20 및 MCF-7 유방암 세포주의 표면에 결합할 수 있는지 확인하였다. 도 2에서와 같이 KC-001 항체는 세포주마다 다른 결합능을 보였다. MCF-7과 ZR-75-1 세포 집단에서 단일 피크 이동을 나타내었지만 및 BT-20 세포주는 뚜렷한 이중 피크를 갖는 이동 패턴을 보였다. ZR-75-1 및 BT-20 세포의 이러한 개별 피크는 여러 반복 실험을 통해 나타났으며 이러한 결과는 각 암세포주에서 다양한 MUC1-C 발현이 원인일 수 있다. 전반적으로, 이러한 결과는 SKM1 항체가 유방암 세포에서 세포 표면-발현된 MUC1-C와 특이적으로 상호작용함을 나타내는 반면, 이중 피크 염색에 대한 정확한 메커니즘은 해명되지 않았다.

실시예 3. 유방암 세포에서의 침윤 활성 저해

MUC1-C 도메인은 암 침윤의 중요한 조절인자로 고려된다. 침윤 챔버를 사용하여 KC-001 항체가 암세포의 전이성 침윤에 영향을 미쳤는지 테스트하였다.

BT-20 및 T47D 세포에 대한 in vitro 매트리겔 (Matrigel) 침윤 분석을 수행하였다. BD 매트리겔 기저막 매트릭스(BD BioScience, 농도 약 10 mg/mL)를 PBS와 1:4로 혼합하고, 밤새 트랜스웰 인서트(Corning, Corning, NY, USA)로 중합시켰다. 3X10⁵개의 세포를 매트리겔 코팅 삽입물에 직접 접종하였다. 트랜스웰 인서트는 최종적으로 무혈청 배지에 넣고 하부 구획은 10% FBS를 보충 (주화성 구배를 얻기 위해)한 배지로 채워졌다. 인간 MUC1-C 항체 KC-001를 침윤 챔버의 상부 구획에 첨가하고 밤새 배양하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험이 각 샘플에 대해 2회씩 수행되었다. 48시간의 인큐베이션 후, 챔버를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, PBS 중 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 샘플을 세척하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 필터를 통과하여 하부 챔버로 들어가는 세포를 위상차 현미경을 사용하여 계수하였다.

분석에 대한 이미지를 도 3에 나타내었다. 10 μg / mL KC-001 항체 및 IgG 대조군과 함께 48h BT-20 및 T47D 세포 배양 후, 더 낮은 챔버로 세포를 옮겨 고정시킨 다음, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 역상 현미경 (inverted microscopy, 배율 200배)를 이용하여 카운팅 하였다. 정확한 측정을 위해 랜덤 필드를 스캔하고 (웰 필터 당 3개의 필드), BT-20 및 T47D 세포에 대한 3개의 독립적인 실험으로 시야별로 하부 챔버로 이동한 총 세포의 평균값을 나타내었다 s: 유의하지 않음(p>0.05), *p≤0.05, **≤0.01, ***≤0.001.

도 3에 나타낸 바와 같이, 비침습성 세포주 ZR-75-1의 경우, 챔버를 통과한 세포는 거의 없었다. 그러나, T47D 및 BT20 세포에 대하여 24 시간 항체 배양하여 침윤 분석한 설정에서, KC-001 항체 (10μg/mL로 처리)는 컨트롤 그룹과 비교하여 상당히 효과적인 침윤 억제를 보였다. BT-20 세포는 T47D 세포 보다 민감한 억제 효과를 보였다. 세포 증식 속도의 변화에 의한 침윤 간섭의 가능성에 관해서는 배가 시간이 비교적 길어 (Expasy Cellosaurus 웹 데이터베이스에서 BT20: 66~70시간, T47D:32~56시간, ZR-75-1:54~80시간) 시험한 세포주가 24시간 이내에 이러한 수준의 침윤 저해를 나타낼 가능성은 낮다. 이러한 결과는 KC-001 항체가 MUC1 발현 유방암 세포의 침윤에 있어서 중요한 억제적 역할을 하고 있는 것을 시사하고 있다.

실시예 4. 세포 표면의 막 근위 MUC1-C에 결합

KC-001 항체로 ZR-75-1 세포주에 대한 면역형광 염색을 수행하여 항체의 세포 표면 결합을 관찰하였다(도 4). KC-001항체 및 2차 항체는 천공되지 않은 세포를 염색하였다. 각 항체로 염색된 영역이 병합되어 유사한 영역에서 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 정도는 다르지만, 세포주간에 염색 패턴은 유사했다. KC-001 항체와 Minerva에 의해 개발된 항체 (MIN-C2)가 유방암 세포 표면에서 유사한 결합 부위를 공유함을 시사한다.

실시예 5. 결합 친화도

Octet® RED 96 시스템 (ForteBio, Pall Life Sciences, Westborough, MA, USA)을 포함하는 BLI (biolayer interferometry)를 이용하여 KC-001 항체의 친화도를 분석하였다. 모든 샘플은 런닝 버퍼에 희석되었다. 흑색의 평평한 바닥 폴리 프로필렌 플레이트의 웰에 각 샘플과 반응 버퍼를 로딩했다. 재조합 hMUC1-항원을 아민 반응성 바이오센서 (AR2G, ForteBio, 프리몬트, 캘리포니아, 미국)에 고정했다. MUC1-C 항체는 키네틱 완충액으로 2배(0.626-20 nM)로 단계 희석하였다. 항체의 동역학 파라미터 및 해리 상수는 ForteBio의 Octet 시스템에 의해 제공된 데이터 분석 소프트웨어(ver9)를 사용하여 계산되었으며, 항원/항체 결합은 1:2 결합으로 모델링되었다.

AR2G 센서칩(5μg/mL)에 MUC1-C 항원을 고정한 다음, 연속적으로 희석한 KC-001 항체 샘플을 Octet 기기에 적용하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 결합 커브는 농도 의존적 방식으로 증가하였고, 해리 상수(Kd: dissociation constant)는 6.49 nM이었다.

발현 및 결합 친화도, 암세포 증식 및 침윤 저해능을 바탕으로, KC-001 항체는 MUC1-C-특이적 결합을 나타내었고, 새로운 기능을 가지는 치료 후보제로 고려될 수 있음을 보여주었다.

실시예 6. 용융 온도

Quantstudio3 실시간 PCR 시스템에서 Thermal Shift Assay를 수행하였다. 단백질 용융 반응 믹스를 96-웰 PCR 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1℃/분의 가열 속도로 25℃ 내지 99℃로 가열하였다. 형광 강도는 Ex/Em:490/530nm에서 측정하였다.

PTS (Protein Thermal Shift) Software를 통해 볼츠만 방법(형광 강도 대 온도 플롯에서) 및 미분 방법(d(형광)/dT 대 온도 플롯에서)을 사용하여 각 형광 프로파일에서 Tm을 계산하였다.

PTS 어세이 방법을 사용하여 열안정성을 측정하였다. PTS 시스템은 real-time PCR을 이용하여 Tm값에 대한 특정한 형광 프로필을 생성하였다. IgG가 PTS dye와 혼합되어 가열되고 IgG의 hydrophobic한 부분이 노출되어 염료에 결합, 형광 방출이 크게 증가한다. 이러한 원리를 이용하여 PTS Assay 실시하였으며 Avastin (WO2017117202A Buffered formulations of bevacizumab(Avastin))의 경우 약 77.8℃를 나타내었다. KC-001 항체의 경우 Avastin 대비 하였을 때, 82.68℃로 열에 대한 안정성이 뛰어나다는 것을 알 수 있다.

실시예 7. 인간 유선암 조직 어레이 (Tissue Array)에서 MUC1에 대한 면역조직화학검사

면역염색은 VECTASTAIN ABC Kit를 사용하여 수행하였다. 조직은 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 전자레인지에 미리 뜨꺼워진 Antigen Unmasking Solution (citrate-based, pH 6.0; Vector Laboratory, H-3300)에 조직을 넣은 후 추가로 12분동안 전자레인지에서 가열하였다. 가열 후 충분히 식힌 후 수돗물에 5분동안 수세하였다. 증류수에 가볍게 수세한 후 내인성 퍼옥시다제 (endogenous peroxidase)를 제거하기 위해 0.3%의 H₂O₂가 함유된 메탄올에 30분동안 조직을 처리하였다. PBS (Phosphate buffered saline)에 수세한 후 염소 정상 차단 혈청 (goat normal blocking serum)으로 실온에서 40분동안 반응시켰으며, 1:700으로 희석한 KC-001 항체에 4^oC에서 오버나이트 (overnight) 반응시켰다. PBS에 수세한 후 1:1000으로 희석한 퍼옥시다제 접합 2차 염소 항-인간 항체 (peroxidase-conjugated secondary goat anti-human antibody)에 실온에서 40분동안 반응시켰다. PBS에 수회 수세한 후 DAB (3,3'-diaminobenzidine) 퍼옥시다제 기질 (Vector Laboratory, SK-4100)에 1분 동안 발색시켰다.

비종양성 및 종양성 유선조직에서 MUC1 발현은 그 발현강도에 따라 아주약함 (very weak, 0.5), 약함 (weak, 1.0), 중간 (intermediate, 2.0), 강함 (strong, 3.0)으로 구별하여 그레이딩 (grading)하였다.

종양은 조직 정보에 근거하여 종양의 분화도에 따라 WD ChC (well differentiated carcinoma), MD ChC (moderately differentiated carcinoma), PD ChC (poorly differentiated carcinoma)로 분류하였으며, 각 개체별로 그레이딩한 MUC1의 발현값을 종양별로 비교 분석하였으며, 비종양성 유선조직 (non-neoplastic mammary glands, NNM)에서의 MUC1 발현과 비교하였다.

도 7에서와 같이, MUC1은 유선암과 비종양성 젖샘의 상피세포의 세포질에서 주로 염색되었다. 종양별로 보면, MUC1은 검사한 모든 WD MC와 MD MC에서 종양세포의 세포질내에서 양성반응을 나타내었다. 유선암의 경우 분화정도와 관계없이 거의 대부분의 종양의 종양세포들은 세포질내에서 MUC1을 강하게 발현하는 것으로 나타났다.

한편, 비종양성 유선의 경우 매우 미약한 반응부터 강한 반응까지 다양하게 나타났는데, 약한반응이 43.8%, 중간이상의 다소 강한 반응이 56.2%로 나타났다. MUC1에 대한 평균발현강도는 유선암의 약 50%정도로 낮았다

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Scripps Korea Antibody Institute <120> Anti-MUC1 antibody and Use Thereof <130> P21-B277 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 <400> 2 Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 3 Ala Gly Trp Gly Ile Arg Gly Val Thr Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 4 Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Arg Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 <400> 5 Glu Ala Ser 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 <400> 6 Met Gln Gly Leu His Pro Ile Thr 1 5 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Trp Gly Ile Arg Gly Val Thr Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Arg Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Leu His Pro Ile Thr 100 <210> 9 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muc1 <400> 9 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly 50 55 60

Claims (9)

1. 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
   서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MUC1 (Mucin 1)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
   
2. 제1항에 있어서, 서열번호 7의 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
   
3. 제1항에 있어서, 서열번호 8의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
   
5. 제4항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
   
7. 다음 단계를 포함하는 MUC1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
   (a) 제6항의 세포를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
   
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암 진단용 조성물.
   

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