KR101996627B1 - Vcam-1-d6에 결합하는 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 CDR을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

VCAM-1-D6에 결합하는 항체 및 그 용도 {Antibody Binding to Sixth Ig-like domain of VCAM-1 and Uses Thereof}
본 발명은 VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 CDR을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
폐암은 보다 일반적인 유형의 암 중 하나이며, 전세계적으로 남성 암 사망의 주요 원인이고, 여성 암 사망의 두 번째 원인이다. 종래, 폐암 환자는 외과적 절제, 백금 기반 화학 요법 및 방사선 요법을 단독으로 또는 조합하여 치료하여 왔다. 최근 상피 성장인자 수용체 (EGFR) 및 미분화 림프종 키나아제 (ALK)가 폐암의 표적 치료에 가장 효과적인 분자로 확인된 바 있다.
엘로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib) 및 크리조티닙(crizotinib)을 포함하는 특정 티로신 키나아제 억제제는 EGFR 돌연변이와 ALK 유전자 재배열을 성공적으로 타겟하였다. 또한, 인간화 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항체인 베바시주맙은 병원에서 폐암을 치료하기 위해 사용되고 있다. 그러나, 현재 치료 처방의 이용 가능성에도 불구하고, 폐암 치료에서 극복할 주요 장애물은 폐암 세포의 침윤 및 전이이다. 이 과정에서, 악성 종양 세포가 먼저 혈관에 침투한 다음, 새로운 조직으로 분출하고, 그곳에서 증식하여 전이성 이차 종양을 생산할 수 있다. 따라서, 폐암 세포 침윤에 대한 신규 표적 식별은 폐암 환자를 치료하기 위한 더 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요하다.
혈관 세포 접착 분자-1 (vascular cell adhesion molecule-1: VCAM-1)은 90kDa의 당 단백질이며, 주로 인간 종양 괴사 인자 알파 (hTNFα)를 포함한 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)에 대한 응답으로 활성화된 내피세포 상에서 주로 발현된다. VCAM-1은 I형 막 관통 단백질이며, 세포외 도메인 (extracellular domain), 7개의 상동 면역글로불린 (Ig) 유사 도메인 (homologous immunoglobulin (Ig)-like domain), 막 관통 도메인 (transmembrane domain) 및 사이토졸 도메인 (cytosolic domain)을 포함한다. 염증 반응 동안, α4β1 인테그린 발현 백혈구 (α4β1 integrin-expressing leukocyte)는 VCAM-1을 발현하는 내피세포에 접착하고, 활성화된 내피를 통해 이행(transmigration)이 촉진된다. VCAM-1의 여섯번째 Ig 유사 도메인 (sixth Ig-like domain of VCAM-1: VCAM-1-D6)이 백혈구의 이행을 매개하는 데 중요하며, VCAM-1 매개 염증에서 역할을 할 가능성이 있음이 시사된 바 있다.
최근 종양의 진행 및 전이에서 VCAM-1의 역할에 대하여 시사된 바 있다. VCAM-1은 신장암, 위암, 췌장암, 유방암, 및 난소암을 포함하는 수 종의 암에서 과발현된다. 또한, 유방암 세포에서 VCAM-1의 발현은 α4 인테그린 카운터 수용체를 발현하는 백혈구와 상호작용 하도록 하여 폐에 전이를 향상시킨다. VCAM-1의 발현은 또한 종양 형성, 종양 혈관 신생 및 위암(gastric carcinoma)의 전이와 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 폐암 세포 침윤에서 VCAM-1과 표적 도메인의 역할에 대하여는 아직 명확하게 밝혀진 바 없다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 정상 폐 조직과 비교하여 폐암 조직에서 VCAM-1의 발현이 증가하고, VCAM-1 고발현은 폐암 환자의 감소된 생존률과 연관성이 있음을 밝혀내었다. 또한, siRNA 매개 VCAM-1 넉다운 (knockdown) 및 재조합 VCAM-1-D6 단백질을 사용한 경쟁적 저해 실험을 통해 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인이 매트리겔(Matrigel)로의 폐암 세포 이동에 필요하고, 매트리겔로 폐암 세포 이동을 조절하는 중요 도메인임을 입증하였다. 더욱이, VCAM-1-D6에 특이적인 VCAM-1 차단 단클론항체를 개발하여, 상기 항체가 매트리겔로 폐암 세포 이동을 특이적으로 저해함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 서열번호 1 또는 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2 또는 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3 또는 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7 또는 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 8 또는 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9 또는 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 폐암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서는 폐암 조직에서 VCAM-1의 발현이 증가하고, VCAM-1 고발현은 폐암 환자의 감소된 생존률과 연관성이 있음을 확인한 결과 및 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인이 폐암 세포의 이동에 필요함을 확인하고, VCAM-1-D6에 특이적인 VCAM-1 차단 단클론 항체를 개발하였다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 목적하는 결합력 및 친화도를 나타내면서도, 폐암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 시판중인 항-VCAM-1 항체를 사용하여 정상 폐 (n = 10)와 폐암 (n = 9) 조직에서 VCAM-1에 대한 면역조직화학 검사 결과를 나타내는 대표적 이미지이다.
도 1b는 VCAM-1에 대한 면역조직화학 분석을 정량화한 결과를 보여주는 점 그래프이다. 각 점은 3 개의 독립적인 영역/시료에서 정량된 VCAM-1 발현의 평균을 나타낸다.
도 1c는 NCBI Gene Expression Omnibus 데이터베이스에서 얻은 폐암 환자 유전자 프로파일링 데이터에 대하여 VCAM-1 발현 분석을 수행한 결과를 도시한 박스 그래프이다.
도 1d는 VCAM-1 발현 수준으로 분류되는 폐암 환자의 전체 생존률을 나타내는 카플란-마이어 플롯 (kaplan-meier plot)이다 (고발현군, n = 102; 저발현군, n = 102).
도 2a는 hTNFα의 존재하에서 배양된 스크램블 siRNA 또는 VCAM-1 siRNA 형질감염 A549 세포에서 VCAM-1의 발현을 나타내는 이뮤노블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 hTNFα의 존재하에서 배양된 스크램블 siRNA 또는 VCAM-1 siRNA 형질감염 A549 세포의 매트리겔로 이동을 나타낸 이미지이다.
도 2c는 스크램블 siRNA 또는 VCAM-1 siRNA 형질감염 A549 세포군에서 매트리겔로의 세포 이동을 정량화한 결과를 나타낸 것으로, 대조군 값의 백분율로 표시되어 있다.
도 2d는 hTNFα의 존재하에서 배양된 VCAM-1-D6-Fc- 또는 Fc 처리된 A549 세포의 매트리겔로의 이동을 도식화한 이미지이다.
도 2e는 VCAM-1-D6-Fc- 또는 Fc 처리된 A549 세포 중 매트리겔로 이동한 세포 수를 계수한 결과를 나타낸 것으로, 대조군 값의 백분율로 표시되어 있다.
도 2f는 폐암 환자 조직에서 CLEC14a 양성 종양 혈관의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 것으로, 종양 내피 마커인 CLEC14a 대한 시판 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다.
도 3a는 hVCAM-1-D6-Fc, mVCAM-1-D6-Fc 및 Fc에 대한 VCAM-1-D6 huMab 클론 1 및 2의 결합 특이도를 도시한 막대 그래프이다.
도 3b는 hVCAM-1-ext 및 mVCAM-1-ext에 대한 VCAM-1-D6 huMab 클론 1 및 2의 결합 특이도를 도시한 막대 그래프이다.
도 3c는 hVCAM-1-ext에 대한 VCAM-1-D6 huMab 클론 1의 결합 친화도를 나타낸 결과를 도시한 것이다.
도 3d는 mVCAM-1-ext에 대한 VCAM-1-D6 huMab 클론 1의 결합 친화도를 나타낸 결과를 도시한 것이다.
도 4a는 IncuCyte FLR live content imaging system을 이용하여 대조군 IgG, 51-10C9(VCAM-1-D1 항체; 시판 항체(BD pharmingen)), VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2의 관(tube) 형성 억제 효과를 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 4b는 관 형성정도를 각각 3구역 다르게 사진을 찍어 수동 계수한 후 관의 개수를 막대바로 환산한 값을 나타낸 결과이다 (*는 p value <0.05를 의미함).
도 5a는 Leica (Wetzlar, Germany) DM IL LED 광학 현미경을 통해 대조군 IgG, 51-10C9(VCAM-1-D1 항체; 시판 항체(BD pharmingen)), VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2의 HUVEC 이동도 저해 효과를 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 5b는 HUVEC 이동 정도를 각각 3구역 다르게 사진을 찍어 세포 이동을 측정 후 이동 정도를 막대바로 환산한 값을 나타낸 결과이다 (*는 p value <0.05를 의미함).
도 6a는 hTNFα의 존재 또는 부재하에서 A549 및 NCI-H1299 폐암 세포에서의 VCAM-1 발현을 이뮤노블랏한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 hTNFα의 부재 또는 존재하에서 A549 및 NCI-H1299 세포의 매트리겔로의 이동에 대조군인 IgG 처리와 비교하여, VCAM-1-D6 huMab 처리의 영향을 나타낸 결과를 도시한 것이다.
도 6c는 대조 IgG 또는 VCAM-1-D6 huMab의 존재하에서 매트리겔로 이동하는 A549 및 NCI-H1299 세포 수를 나타낸 결과로, 모의 대조값의 백분율로 표시된다.
도 6d는 VCAM-1-D6 huMab 또는 VCAM-1-D6 키메릭 Mab의 존재 또는 부재에서 hTNFα 처리 HUVEC을 거쳐 U937 세포의 내피 투과 이동을 나타낸 이미지이다.
도 6e는 정량하여 대조값의 백분율로 표시한 이동된 세포 숫자를 나타낸 결과이다.
도 6f는 hTNFα의 존재 또는 부재하에서 A549 세포의 매트리겔로의 이동에 대한 VCAM-1-D6 huMab의 특이적 효과를 VCAM-1-D1 차단 항체 또는 대조 IgG와 비교하여 도시한 이미지이다.
도 6g는 대조 IgG, VCAM-1-D1 차단 항체 및 VCAM-1-D6 huMab의 존재하에서 매트리겔로 이동하는 세포 수를 나타낸 결과로, 모의 대조값의 백분율로 표시된다.
도 6h는 VCAM-1-D6 huMab가 VCAM-1 발현 세포의 표면에서 VCAM-1의 하향 조절에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 7은 7개의 Ig 유사 도메인 (D1-D7)을 포함하는 VCAM-1의 구조 및 폐암 세포 침윤에 대한 VCAM-1-D6 huMab의 저해 메커니즘을 도시한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 서열번호 1 또는 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2 또는 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3 또는 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7 또는 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 8 또는 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9 또는 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인에 특이적으로 결합하는 항-VCAM-1-D6 도메인 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 (모노클로날) 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 일 실시예에서, 상기 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인에 결합하는 항체는 인간 항체이다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 본 발명은 서열번호 1 또는 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2 또는 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3 또는 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7 또는 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 8 또는 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9 또는 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 서열번호 22 또는 24의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 서열번호 23 또는 25의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 서열번호 13 내지 16으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역 FR 및/또는 서열번호 17 내지 21로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역 FR을 포함한다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
상기 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, 상기 항체의 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 VCAM-1의 VCAM-1-D6 도메인을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-VCAM-1-D6 도메인 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 서열번호 26 또는 27의 중쇄 가변영역 코딩 서열 및/또는 서열번호 28 또는 29의 경쇄 가변영역 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
여기에 사용된 용어 "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 예방 또는 치료 용도일 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암에 대한 불응, 전이 또는 재발암을 포함한다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환 또는 폐암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 발전의 억제, 경감 또는 제거를 의미한다.
경우에 따라서, 상기 항체 이외에 다른 혈관신생 관련 질환 또는 폐암 치료제를 병용함으로써 폐암 세포를 효과적으로 표적화하여 치료 효과를 증대시킬 수 있다. 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 항체와 함께 사용될 수 있다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 폐암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 폐암에서 VCAM-1의 발현 증가 및 감소된 생존과의 연관성 확인
정상 폐암과 폐암 환자의 조직에서 VCAM-1 발현을 알아보기 위하여, 시판 항-VCAM-1 항체를 이용하여 면역조직화학을 실시하였다. 정상적인 폐 또는 폐암 조직을 프린팅한 조직 슬라이드를 SuperBioChips Laboratories (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 슬라이드를 먼저 마우스 항-VCAM-1 단클론 항체 (1 : 200, Abcam, Cambridge, MA, USA)와 인큐베이션하고, 비오틴화 염소 항-마우스 IgG (1 : 200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 인큐베이션하였다. VECTASTAIN ABC Reagent (Vector Laboratories)를 이용하여 면역 반응성 단백질을 시각화하였다. 발색 반응을 위해 슬라이드를 신선한 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로 클로라이드(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 용액 (Vector Laboratories)과 인큐베이션하였다. 모든 시료를 Meyer 's 헤마톡실린 (Vector Laboratories)으로 대비염색하였다. 올림푸스 BX51 현미경 (올림푸스, 도쿄, 일본)를 사용하여 광 현미경으로 VCAM-1의 발현을 관찰하였고, Paint Shop Pro X 소프트웨어 (Corel, 오타와, 온 캐나다)를 사용하여 RGB 이미지를 수득하였다. 배경 삭제 후, Image J 소프트웨어 버전 1.48v (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)에서 신호 밀도를 측정하여 VCAM-1 발현을 정량하였다.
VCAM-1 발현은 정상 폐 (n = 10) 조직에 비해 폐암 (n = 9)에서 높았다 (도 1a, b).
정상적인 폐 및 폐암 환자의 조직에서 VCAM-1 발현을 추가로 확인하기 위해 NCBI (National Cancer for Biotechnology Information) GEO (Gene Expression Omnibus) 데이터베이스에서 입수한 폐암 환자 유전자 발현 프로파일링 데이터 (GSE31210)를 분석하였다. 폐암 환자는 모든 환자의 VCAM-1 발현 중앙값보다 환자의 VCAM-1 발현이 더 낮은지 또는 더 높은지에 기초하여, 낮은 VCAM-1 발현 또는 높은 VCAM-1 발현의 2 개의 군으로 분류하였다.
VCAM-1 발현은 정상 폐 조직 (n = 20)에 비해, 폐암 조직 (n = 226)에서 유의하게 증가하였다 (p = 0.00015, 도 1c). 이를 종합하면, 이러한 발현 데이터는 증가된 VCAM-1의 발현이 폐암에서 역할을 한다는 것을 암시한다.
VCAM-1 발현과 폐암 환자의 생존 사이의 관련성을 설명하기 위해, 생물 정보학 기반의 생존 분석을 실시하였다. 낮은 VCAM-1 발현군 (n = 102)에서 5 년 전체 생존율은 91%인 반면, 비율은 높은 VCAM-1 발현군 (n = 102)에서 80%로 유의하게 감소하였다 (p = 0.0493, 도 1d). 이러한 데이터는 VCAM-1 고발현과 낮은 생존율 사이의 관련성을 나타내고, 증가된 VCAM-1 발현은 폐암과 밀접한 관련이 있음을 제시한다.
실시예 2. 폐암 세포 침윤의 조절에서 VCAM-1의 VCAM-1-D6 역할
폐암 세포 침윤에서 VCAM-1의 역할을 확인하기 위해, 인간 폐암 세포주 A549에서 VCAM-1을 표 1의 siRNA를 매개로 넉다운하고, VCAM-1을 유도하기 위해 hTNFα 존재하에서 배양하였다.
[표 1]
Figure 112017113260207-pat00001
먼저, 이뮤노블랏 어세이를 사용하여 스크램블 siRNA-에 비해 VCAM-1 siRNA- 형질감염 세포에서 VCAM-1의 감소 수준을 확인하였다 (도 2a). A549 세포를 50-80%의 밀집 (confluence)까지 성장시키고, LipofectamineRNAiMAX 형질감염 제제를 사용하여 제조사의 지시에 따라 인간 VCAM-1을 표적으로 하는 ON-TARGETplusSMARTpoolsiRNA (GE Healthcare Dharmacon, Lafayette, CO, USA)로 일시적 형질감염하였다.
이뮤노블랏 어세이는 세포 용해물을 도데실 황산나트륨 - 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 용해하고 습윤 이동 시스템 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막에 옮겨 실시하였다. 5% (w/v) 탈지 분유를 포함하는 트리스 완충 생리 식염수 (Tris-buffered saline) 및 Tween (TBST; 10mM Tris-HCl, pH 7.5,150mM NaCl 및 0.05 % (v/v) Tween 20)으로 차단한 후, 막을 토끼 항-VCAM-1 단클론 항체 (1 : 1000; Abcam) 또는 마우스 항-β-액틴 단클론 항체 (1 : 1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, HRP (horseradish peroxidase) 접합된 염소 항-토끼 IgG (1 : 5000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 또는 말 항-마우스 IgG (1 : 5000; Cell Signaling Technology)로 인큐베이션하였다. TBST로 여러 번 세척한 후 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 단백질 밴드를 시각화하였다.
중요한 것은, VCAM-1 넉다운에 의해 A549 세포의 매트리겔로의 이동이 넉다운 세포 대조군에 비해 유의하게 감소하였다는 것이다 (p <0.001, 도 2b, c). 이러한 결과에 따르면, VCAM-1이 폐암 세포의 침윤을 조절하는 것을 시사하고 있다.
VCAM-1-D6 도메인이 폐암 세포에서의 침윤에서 역할을 하는지 확인하기 위하여, VCAM-1-D6 Fc 융합 단백질 (VCAM-1-D6-Fc)을 제조하였다. 인간 VCAM-1-D6 (아미노산 511-595: 서열번호 34) 및 마우스 VCAM-1-D6 (아미노산 511-595: 서열번호 35)를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭하였다. PCR 산물은 2 개의 비대칭 SfiI 부위를 이용하여 3' 말단 클로닝 사이트에 인간 IgG1의 힌지 영역 및 CH2-CH3 도메인을 포함하는 변형된 pCEP4 포유동물 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 서브클로닝되었다. 구조물을 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. Fc 융합 단백질을 ExpiFectamineTM Transfection 키트 (Gibco)를 사용하여 Expi293FTM 세포로 형질감염하였다. 7일 후, 배양 상등액을 회수하여 융합 단백질을 단백질 A-세파로스 비드 (GenScript, Piscataway, NJ, USA)를 이용한 친화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제하였다. NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 단백질 농도를 정량한 후 PBS (phosphate-buffered saline)에서 투석을 실시한 다음, SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 시료의 순도를 분석하였다. 최종 풀링된 분획 (pooled fraction)은 등분하여 -80℃에서 저장하였다.
hTNFα의 존재하에서 배양된 A549 세포를 VCAM-1-D6-Fc와 함께, 또는 음성 대조군으로 Fc 단독과 함께 처리하여 경쟁적 차단 실험을 실시하였다. 중요한 것은 모의 처리 세포와 비교하여, 매트리겔로의 A549 세포 이동이 VCAM-1-D6-Fc 추가에 의해 농도 의존적 방식으로 저해된 것이며, Fc에 의해서는 저해되지 않았다는 것이다 (도 2d 및 2e).
A549 세포 생존율에 영향이 있기 때문이 아니라 세포 침윤에 의한 영향임을 확실하게 하기 위하여, VCAM-1 siRNA 및 VCAM-1-D6-Fc 처리는 해당 대조군에 비해 A549 세포 생존율에 영향을 주지 않은 반면, 아폽토시스 (apoptosis) 유도제인 5- 플루오로우라실 (5-FU)는 A549 세포 생존율을 유의하게 감소시켰음을 확인하였다 (도 2f). 이러한 결과는 VCAM-1-D6 도메인이 VCAM-1 매개 폐암 세포 침윤에 중요하다는 것을 시사하고 있다.
또한, 면역조직화학적 염색에 의해 검출된 VCAM-1의 균일하게 강한 발현을폐암 통해 폐암 조직 전체는 폐암 조직에서 매우 특이적인 내피 염색 패턴과는 전혀 다름을 확인하였다 (도 2g). 이러한 결과는 대부분의 VCAM-1 염색 세포가 내피가 아니라 암세포임을 시사하고 있다.
실시예 3. 인간 및 마우스 VCAM-1의 VCAM-1-D6에 특이적인 인간 단클론항체 선별
인간 및 마우스 VCAM-1-D6에 대한 인간 단클론 항체를 분리하기 위하여, 인간 합성 scFv (single-chain variable fragment) 라이브러리를 미리 클리어링 (clearing)하여 Fc 결합제를 제거하였다. 파지 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays)를 통해 Fc에 결합하는 약 90 %의 scFv를 제거하였다. VCAM-1-D6-Fc-코팅된 자성 비드를 사용하여 인간 (hVCAM-1-D6-Fc) 또는 마우스 (mVCAM-1-D6-Fc) VCAM-1-D6 융합 단백질로 교대로 라이브러리를 바이오패닝하였다.
96개의 파지 클론을 무작위로 선택하고, 헬퍼 파지 감염을 감지하고, 파지 효소 효소 면역어세이를 사용하여 인간 및 마우스 VCAM-1-D6에 대한 반응성을 시험하였다. DNA 시퀀싱 후, 인간과 마우스 VCAM-1-D6 모두를 인식하면서 상이한 CDR 서열을 가지는 2 개의 클론을 선별하고 IgG로 변환하였다.
[표 2] 2개의 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 CDR/중쇄 및 경쇄 가변영역
Figure 112017113260207-pat00002
PCR을 이용하여 선택된 scFv 클론의 중쇄 가변영역 (VH) 및 경쇄 가변영역 (VL) 유전자 (클론 1 및 2)를 증폭하였다. VH 유전자는 5' EcoRI 부위와 3' ApaI 부위 및 VL 유전자는 5' HindIII 부위 및 3' BsiWI 부위에서 엔지니어링되었다. 적절한 제한효소 (New England BioLabs, Beverly, MA, USA)로 PCR 단편을 절단하고, 바이시스토론성 (bicistronic) 포유 동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 클로닝하였으며, 이는 VH 클로닝 부위 중 인간 IgG1의 CH1 / 힌지 / CH2 / CH3 도메인 및 VL 클로닝 부위중 불변 카파쇄 (kappa chain)을 코딩한다.
HEK (human embryonic kidney) 293F 세포에서 발현하고 정제하였다. SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 통해 모든 IgG 클론이 90% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다.
정제한 VCAM-1-D6 (VCAM-1-D6 huMab)에 특이적인 인간 단클론 항체의 이종간 반응성을 조사하기 위해, 96 웰 마이크로 타이터 플레이트를 hVCAM-1-D6-Fc, mVCAM-1-D6-Fc 또는 Fc로 코팅하고, ELISA를 실시하였다. VCAM-1-D6 huMab은 인간 및 마우스 VCAM-1-D6-Fc에 특이적으로 결합하지만, Fc 단독에는 결합하지 않았다 (도 3a).
결합 특이도를 추가로 확인하기 위해, 96 웰 마이크로 타이터 플레이트를 정제된 인간 및 마우스 VCAM-1 세포 외 도메인 (hVCAM-1-ext 및 mVCAM-1-ext)으로 코팅하였고, ELISA를 실시하였다. 클론 1은 hVCAM-1-ext 및 mVCAM-1-ext에 강한 결합을 나타낸 반면, 클론 2는 mVCAM-1-ext에 비해 hVCAM-1-ext에 대해 약한 결합 친화도를 나타내었다 (도 3b). 따라서, 클론 1을 VCAM-1-D6에 대한 인간 단클론 항체의 대표로 사용하였다 (이하, VCAM-1-D6 huMab).
마지막으로, VCAM-1-D6 huMab의 인간 및 마우스 VCAM-1에 대한 결합 친화성을보다 정확하게 측정하기 위해 Octet biolayer interferometry 시스템을 사용하여 라벨 없이 동태 분석을 실시하였다. hVCAM-1-ext 및 mVCAM-1-ext에 결합하는 VCAM-1-D6 huMab (클론 1)의 Kds는 약 3.78 및 10.54nM이었다 (도 3c, 3d).
실시예 4. 관 형성 어세이 (Tube formation assay)
48 웰 플레이트의 각 웰에 매트리겔 (Matrigel: Corning, Tewksbury, MA, USA) 150μl를 첨가하여 37 ℃에서 30분간 중합하였다. 20ng/ml의 hTNFα를 함유하는 EGM-2 (endothelial growth medium-2)에서 24시간 배양한 1 X 105개의 HUVEC을 매트리겔 코팅 플레이트에 파종하여 20μg/ml의 대조군 IgG, 51-10C9, VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2를 함유하는 EGM- 2 중 37 ℃에서 21 시간 동안 배양하였다.
IncuCyte FLR 라이브 콘텐츠 이미징 시스템 (Essen Bioscience Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 이미지를 얻고 전체 관(tube)의 지점을 계산하여 관 형성을 정량하였다.
대조군 IgG, 51-10C9(VCAM-1-D1 항체; 시판 항체(BD pharmingen)), VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2를 각각 처리하여 HUVEC tube 형성 억제능을 비교 분석한 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 대조군으로 사용한 대조군 IgG와 51-10C9은 HUVEC 관 형성에 저해능이 없는 반면, VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2는 통계적으로 유의미한 저해능을 나타내었다.
실시예 5. 이동도 어세이 (Migration assay)
3 X 104개의 HUVEC을 ImageLock 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종하여 20ng / ml의 hTNFα를 포함 EGM에서 37℃, 24시간 유지하였다. 이후, 96 핀 WoundMaker (96-pin WoundMaker)로 상처를 제작하였다. PBS로 2 회 세척한 후 손상된 HUVEC 배양액을 20μg/ml 대조군 IgG, 51-10C9, VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2와 37℃에서 10 시간 인큐베이션한 다음, 0.2 % (w / v) 크리스탈 바이올렛 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)으로 염색하였다.
정량 분석을 위해, Leica (독일, Wetzlar) DM IL LED 광학 현미경을 사용하여 상처 10 시간 후에 이미지를 포착하고 이동한 거리를 수동으로 측정하였다.
대조군 IgG, 51-10C9(VCAM-1-D1 항체; 시판 항체(BD pharmingen)), VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2를 각각 처리하여 HUVEC 이동 정도를 비교분석하였다.
도 5a 및 도 5b에 따르면, 대조군으로 사용한 대조군 IgG와 51-10C9은 HUVEC 이동에 저해능이 없는 반면, VCAM-1-D6-키메릭 Mab, VCAM-1-D6-humab 클론 1 또는 VCAM-1-D6- humab 클론 2는 통계적으로 유의미한 HUVEC 이동 저해능을 나타내었다.
실시예 6. VCAM-1-D6 huMab의 VCAM-1 발현 폐암 세포 침윤 특이적 저해 효과
hTNFα의 부재 또는 존재하에서 배양한 인간 폐암 세포주 A549 및 NCI-H1299에서 VCAM-1의 발현을 확인하였다. 이뮤노블랏 분석을 통해, hTNFα에 반응하여 A549 및 NCI-H1299 세포에서 VCAM-1 발현이 매우 증가함을 확인하였다 (도 6a). 다음으로, 폐암 세포의 침윤에 대한 VCAM-1-D6 huMab의 영향을 알아보기 위해 hTNFα의 부재 또는 존재하에서 배양한 세포를 VCAM-1-D6 huMab 또는 음성대조군인 IgG으로 처리하고 침윤 어세이를 수행하였다.
1.5X105 A549 또는 NCI-H1299 세포를 6웰 플레이트에 플레이팅하여 하룻밤 부착되도록 하고, 20ng/mL의 hTNFα(R & D systems, Minneapolis, MN, USA)로 24시간 동안 37℃에서 처리하였다. 세포 침윤 어세이에 대하여, 100μL의 매트리겔 (Matrigel)로 미리 코팅한 트랜스웰 인서트 (transwell insert: Corning, Tewksbury, MA, USA)의 상단부에 5X104 A549 세포 또는 NCI-H1299 세포를 로딩하고, 하단 챔버를 10% (v / v) FBS를 포함한 완전한 배지로 채웠다.
세포 침윤에 대한 VCAM-1 넉다운 효과를 확인하기 위해 트랜스웰 침투 분석은 스크램블 siRNA- 및 VCAM-1 siRNA- 형질감염된 A549 세포를 사용하여 수행되었다. 세포 침윤에서 Fc 융합 단백질의 효과를 확인하기 위해, 0,10,20 또는 40μg / mL의 VCAM-1-D6-Fc 융합 단백질 또는 40μg / mL Fc 도메인 단독의 존재하에서 37℃, 24시간 동안 트랜스웰 침윤 분석을 수행하였다.
항-VCAM-1-D6 huMab 세포 침윤 억제능을 확인하기 위해 20μg / mL 항체 [대조 IgG, 항-VCAM-1-D6 huMab 또는 VCAM-1-D1 차단 항체 (51-10C9, BD Bioscience)] 존재하에서 37℃, 24시간 동안 트랜스웰 침투 분석을 수행하였다. 막의 상단 표면을 면봉으로 닦아 비침윤 세포를 제거한 후, 막을 4 % (v / v) 포름알데히드로 고정하고, 0.2 % (w / v) 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 세포 침윤의 정도를 필터당 3 개의 랜덤 필드 (200 배의 배율로)에서 막을 통해 이동한 세포를 계수하여 정량하였다.
매트리겔로 A549 및 NCI-H1299 세포의 이동은 VCAM-1-D6 huMab에 의해 특이적으로 저해되었으나, IgG 대조군 항체에 의해서는 저해되지 않았다 (도 6b, 도 6c).
또한, VCAM-1-D6 huMab의 폐암 세포 침윤에 대한 특이적 억제 효과를 추가로 확인하기 위해, hTNFα의 부재 또는 존재하에서 배양한 인간 폐암 세포주 A549를 VCAM-1-D6 huMab 또는 시판중인 VCAM-1-D1 차단 항체 (51-10C9, BD Bioscience) 를 처리한 다음 침윤 분석을 실시하였다. VCAM-1-D6 huMab과 VCAM-1-D6 키메릭 단클론 항체 (VCAM-1-D6 chimeric Mab: 미국등록특허 제7,655,417호 참조)가 매트리겔로의 A549 세포 이동 및 활성화된 HUVEC (human umbilical vein endothelial cells)을 거쳐 U937 내피세포 투과 이동 (transendothelial migration)하는 것에 유사한 저해 효과를 나타냄을 확인하였다 (도 6d, 6e). 매트리겔로의 A549 세포 이동은 VCAM-1-D1 차단 항체보다 VCAM-1-D6 huMab에 의해 더 강력하게 억제됨을 확인하였다 (도 6f, 6g).
이를 통해, VCAM-1 매개 폐암 세포 침윤 조절에서 VCAM-1-D6 도메인의 특이적 역할을 입증하고, VCAM-1-D6 huMab을 이용하여 in vivo에서 VCAM-1 발현 폐암 세포의 침윤을 억제할 수 있음을 시사하고 있다.
더욱이, VCAM-1-D6 huMab을 처리하여도 VCAM-1 발현 세포의 표면에서 발현되는 VCAM-1 수준이 변경되지 않음을 확인하였다 (도 6h). 이러한 결과는 VCAM-1-D6 huMab이 VCAM-1-D6에 결합하여 VCAM-1-D6-차단 항체 역할을 함으로써, 잠재적으로 구조를 변경시켜 폐암 세포 침윤에 필요한 VCAM-1 매개 신호 전달의 저해를 초래하는 것으로 판단된다.
종합하면, 종양 미세 환경 및 임의의 세포 외 자극에 대한 응답 중의 스트레스 상태에서, VCAM-1 발현이 폐암 세포의 표면에서 갑자기 증가하여 폐암 세포의 침윤을 촉진할 수 있다. VCAM-1-D6 huMab은 VCAM-1에 결합하고 VCAM-1 발현 인간 폐암 세포의 침윤을 차단할 수 있다 (도 7).
구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.
<110> Scripps Korea Antibody Institute <120> Antibody Binding to Sixth Ig-like domain of VCAM-1 and Uses Thereof <130> P17-B273 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 Gly Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Tyr Ser Val Phe Ile Val Thr Thr Ser Gln Ser Tyr Tyr Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 5 Val Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 6 Gly Arg Tyr Ser Ala Ser Leu Met Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 7 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 8 Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 9 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 10 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 11 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 12 Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 14 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 15 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 16 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 17 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 18 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 19 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 20 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 21 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 22 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Val Phe Ile Val Thr Thr Ser Gln Ser Tyr Tyr Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 23 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 23 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 24 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Tyr Ser Ala Ser Leu Met Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 25 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 26 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 26 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatcctg gtggtggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatatagt 300 gtttttattg ttacgacgtc gcagtcttat tatgatgcta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgt 374 <210> 27 <211> 364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 27 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctatcctg gtagtggtag tatatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtcgt 300 tattcggcgt cgcttatggc tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tcag 364 <210> 28 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 28 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataattctg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgataata atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgttct agcctgagtg gttatgtctt cggcggaggc 300 accaagctga cggtccta 318 <210> 29 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 29 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg gggctgatta ttactgtggt acttgggatg atagcctgaa tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 30 ggagauagac uuacugaaa 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 31 caaaguuggc ucacaauua 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 32 gaaggaugcg ggaguauau 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 33 ccuuggagcc ucaaauaua 19 <210> 34 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VCAM-1-D6 <400> 34 Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro 20 25 30 Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu 35 40 45 Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser 50 55 60 Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys 65 70 75 80 Glu Val Glu Leu Ile 85 <210> 35 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse VCAM-1-D6 <400> 35 Pro Lys Glu Thr Thr Ile Trp Val Ser Pro Ser Pro Ile Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ser Pro Val Asn Leu Thr Cys Ser Ser Asp Gly Ile Pro Ala Pro 20 25 30 Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Asn Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu 35 40 45 Ser Glu Asn Thr Thr Leu Thr Phe Met Ser Thr Lys Arg Asp Asp Ser 50 55 60 Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ile Ser Arg Lys 65 70 75 80 Ser Val Glu Leu Ile 85

Claims (11)

  1. VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로,
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR1, 서열번호 8의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 22 또는 24의 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 23 또는 25의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 26 내지 29로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제4항의 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제6항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  8. 다음 단계를 포함하는 VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)의 VCAM-1-D6 (Sixth Ig-like domain of VCAM-1) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제7항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물.
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Int. J. Mol. Sci., Vol 18, Pages 1-13(2017.02.15.)*

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