KR20190018399A - 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편 - Google Patents

인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 Ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체 및 그의 항체 단편은 EGFR에 대한 결합을 최소화하고, EGFRvⅢ만 특이적으로 인지하는 특징을 가진다. EGFRvⅢ는 고도로 암 특이적 항원이므로 본 발명에서 개발된 항체 및 항체단편은 암 조기 진단, 예방 및 치료에 적용이 가능하다. 또한 고도의 암특이성을 바탕으로 항체 또는 항체단편에 약물이나 T cell을 결합한 Antibody-Drug Conjugates(ADC)나 Chimeric Antigen Receptor-T(CAR-T) 기술을 적용하여 치료효능의 극대화가 가능하며, 정상세포에 발생 가능한 독성을 최소화 할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체단편에 직접 방사성동위원소나 형광물질을 결합하여 이미징하는 방법 또는 ELISA나 IHC법을 통해 EGFRvⅢ 돌연변이의 조기진단이 가능하다.

Description

인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 Ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편{Antibody and Fragment Thereof Binding Human Epidermal Growth Factor Receptor Variant Ⅲ}
본 발명은 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 Ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편에 관한 것이다.
기존 항암요법에서는 제한적이고 비특이적인 항암효과를 가진다거나 심각한 전신독성이 나타나는 등의 부작용들이 나타난다. 이로 인해 새로운 암 치료법의 필요성이 대두 되었다. 최근 암의 발생에 대한 분자생물학적 기전과 신호전달 기전에 대한 이해가 증가하면서, 특정 분자를 표적으로 하는 분자 표적 치료제(Molecular targeted therapy)에 대한 관심이 높아지고 있으며, 암 발생에 영향을 주는 신호전달 물질을 표적으로 하는 치료에 대하여 많은 연구가 이루어지고 있다.
위와 같은 표적 치료제 영역에서, 암 치료를 위한 단일 클론 항체(Monoclonal Antibody)의 사용은 성공을 거두고 있다. 항체약물 결합체들은 림프종과 고형암 치료를 위해 강력하고 새로운 치료의 옵션이 되었으며, 최근 들어 면역 조절 항체들도 임상에서 상당한 성공을 거두고 있다. 치료항체들의 개발은 암 혈청학, 단백질 엔지니어링 기술과 그 작용, 저항성의 기작들 및 면역 시스템과 암 세포들 간의 상호 작용에 대한 깊은 이해를 바탕으로 한다.
그 중에서 상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR)는 여러 암 종에서 가장 많은 연구가 이루어진 분자 표적 중의 하나이다. EGFR은 원형-종양 유전자(proto-oncogene) c-erb B의 170 킬로달톤 막 지단백질 산물이다. EGFR 유전자의 서열은 알려져 있다. EGFR 유전자는 원래 조류 적아세포증(avian erythroblastosis) 바이러스에서 동정된 erbB 종양유전자의 세포 동족체(homolog)이다. 유전자 증폭에 의한 상기 종양 유전자의 활성화는 다양한 인간 종양에서 관찰되었다.
EGFR는 많은 암 종에서 과발현, 증폭, 돌연변이화 되는 것이 보고된다. 그러한 과발현, 돌연변이화된 EGFR은 암세포의 성장 및 생존을 촉진하고, 암세포가 항암치료 내성을 가지게끔 하는 것이 보고된 바 있다. EGFR 과발현은 일부 폐, 유방, 결장, 위, 뇌, 방광, 두경부, 난소, 신장 및 전립선 암종에서 관찰되었다. 상피 성장 인자(EGF) 및 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파)는 EGFR에 결합하여 세포 증식 및 종양 성장을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 크기 변이체 EGFR 유전자 및 증폭이 몇몇 인간 암에서 보고되기도 하였다.
EGFR 돌연변이체는 EGFR 유전자 증폭에 의해 수반되는 유전자 재배열에 의해 유발된다. 다음과 같이 알려져 있는 8개의 주요 EGFR 변이체들이 있다: (ⅰ) EGFRvI은 EGFR의 세포외 도메인의 대부분이 결여되어 있으며, (ii) EGFRvⅡ는 EGFR의 세포외 도메인에서 83 aa 인-프레임(in-frame) 결실로 구성되어 있으며, (iii) EGFRvⅢ은 EGFR의 세포외 도메인에서 267 aa 인-프레임 결실로 구성되어 있으며, (iv) EGFRvⅣ는 EGFR의 세포질 도메인에 결실을 포함하며, (v) EGFRvⅤ는 EGFR의 세포질 도메인에 결실을 포함하며, (vi) EGFR.TDM/2-7은 EGFR의 세포외 도메인에 엑손 2-7의 복제를 포함하며, (vii) EGFR.TDM/18-25는 EGFR의 세포외 도메인에 엑손 18-26의 복제를 포함하며, (viii) EGFR.TDM/18-26는 EGFR의 티로신 키나아제에 엑손 18-26의 복제를 포함한다. 또한, 엑손 11 및 14의 접합부에서 신규한 히스티딘 잔기를 도입하는 제 2 결실을 갖는 희귀한 제 2의 EGFRvⅢ 돌연변이체(EGFRvⅢ/△12-13)가 있다.
EGFR의 돌연변이의 하나인 상피 성장 인자 수용체 변이체 Ⅲ(Epidermal Growth Factor Receptor Variant Ⅲ: EGFRvⅢ)의 경우, 야생형(wild type) EGFR의 엑손 2번에서 7번까지가 소실된 형태이다. EGFRvⅢ는 인간 암에서 가장 통상적으로 발생하는 상피 성장 인자(EGF)의 변이체로, 교모세포종(Glioblastoma multiforme: GBM) 환자 중 약 30%의 환자에서 발현되며, 정상조직에서는 발현되지 않는다. 보다 상세하게는, 세포 표면에 발현할 경우 wild type EGFR의 6번 내지 273번 아미노산이 사라지고, 5번 아미노산과 274번 아미노산이 접합됨과 동시에 그 사이에 글리신 아미노산이 삽입된 형태로 구성된다. 교모세포종 외에도, 폐암(lung cancer) 환자에게서도 빈번히 발견되는 돌연변이로, EGFRvⅢ는 세포외부분에 존재하는 리간드 결합 부위의 일부가 소실이 되어 리간드가 결합할 수 없지만, 더욱 강화된 종양형성 잠재력을 보인다. 즉, 리간드 독립적인 방식으로 구조적 신호화(signaling)를 통해 종양 진행에 기여한다.
한편, 돌연변이 단백질들과 암 줄기세포 간의 상관관계는 명확하지 않다. 교아세포 종양들은 유전자 재배열과 증폭을 통해 발현되는 EGFR 변형체인 EGFRvⅢ를 자주 발현한다고 알려져 있다. 항상 티로신 인산화 사이트가 활성화된 형태로 존재하기 때문에 강한 종양형성(tumorigenicity) 특성을 보인다. 그러나, 이러한 변형에도 불구하고 EGFRvⅢ의 발현은 제한적이다. 암 줄기세포는 EGFRvⅢ이 CD133과 함께 높게 발현되어 있고, EGFRvⅢ+/CD133+ 세포는 높은 재생과 종양 개시 능력을 가지는 것으로 정의된다. EGFRvⅢ+ 세포는 줄기/전구체 마커들과 함께 연관되어 있는 반면 분화 마커들은 EGFRvⅢ- 세포들에서 발견되었다. EGFRvⅢ 발현은 정상적인 세포 배양에서 손실되었지만 종양 원형체 배양에서는 유지되었으며 또한 세포 배양된 세포들은 EGFRvⅢ+/CD133+를 동시에 발현하고 재생되며 종양 개시 능력을 가진다.
EGFR 신호전달체계를 저해해서 암세포의 성장을 저해하기 위한 접근법으로는 단일 클론항체(monoclonal antibody) 또는 타이로신 카이네이즈 저해제(tyrosine kinase inhibitor) 등이 있다. EGFR의 돌연변이형인 EGFRvⅢ의 경우 정상세포에서는 발현되지 않고, 암세포에서만 발현하는 고도의 암특이성 덕분에 매력적인 진단 및 치료 표적이다. 일반적으로 EGFRvⅢ 돌연변이를 가진 암환자 군에서는 EGFR이 같이 발현되는 양상을 보인다. 요약하면, EGFRvⅢ은 EGFR이 증폭/과발현된 암환자에게서 빈번하게 나타나는 돌연변이로 정상세포에서는 발현되지 않는 단백질이기 때문에 EGFRvⅢ 발현 암환자군의 암 진단 및 표적 치료에 최적화된 암 특이적 항원인 것으로 사료된다.
다만 기존에 개발된 EGFR 표적 치료제는 EGFRvⅢ 돌연변이형을 가진 암세포에는 효능을 보이지 않는 것으로 알려져 있다. 특히 현재까지 개발된 EGFR 특이적 타이로신 카이네이즈 저해제들은 EGFRvⅢ 돌연변이를 가진 암종에서는 효능이 거의 없는 것으로 알려져 있다.
게피티닙(Gefitinib)은 약명(상표명) Iressa이고, AstraZeneca 및 Teva에서 판매 중인 EGFR inhibitor로 적응증은 유방암, 폐암 등인 약물이다. Gefitinib을 EGFRvⅢ 돌연변이 암세포에 처리를 하였을 때, EGFRvⅢ와 그 하부신호전달물질인 Akt의 인산화를 억제하지 못하고, 그 때문에 암세포의 성장도 억제하지 못하는 것으로 보고된다.
엘로티닙(Erlotinib)은 약명 Tarceva로 Genentech, Roche에서 판매중이며 적응증은 non-small cell lung cancer(NSCLC)인 타이로신 카이네이즈 저해제 약물이다. 엘로티닙(Erlotinib)의 경우 위 게피티닙(Gefitinib)과 마찬가지로 EGFRvⅢ 돌연변이 암종에서 암세포성장억제능을 보이지 않는 것으로 나타난다.
세툭시맙(Cetuximab)은 약명 Erbitux로 Bristol-Myers Squibb사와 Merck 사에 의하여 판매되는 EGFR inhibitor로, 적응증은 전이성 대장암, 전이성 비소 세포폐암, 두경부암 등인 약물이다. 세툭시맙은 키메라(마우스-인간) 단일 클론항체이다. 그러나, 세툭시맙은 EGFRvⅢ 돌연변이 암세포들에 대한 항원 특이성이 매우 떨어지고, 암세포 성장 억제능이 나타나지 않는 문제점이 있어 왔다.
또한, 이 외에 현재까지 개발된 치료제들도 EGFR을 표적하는 동시에 EGFRvⅢ도 표적하기 때문에, 특이성을 높일 필요가 있어 EGFRvⅢ만을 특이적으로 표적하는 진단 및 치료제 개발에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 암 치료용 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 EGFRvⅢ에 높은 친화력으로 결합하는 항-EGFRvⅢ 항체를 개발하고, 이러한 항-EGFRvⅢ 항체가 암세포의 이동을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 EGFRvⅢ에 결합하는 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방용 또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
일 양상은 EGFRvⅢ에 결합하는 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 일 실시예에서, 신규항체의 서열은 서열번호 1 또는 7을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2 또는 8을 포함하는 CDRH2 또는 서열번호 3 또는 9를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역을 가지고, 서열번호 4 또는 10을 포함하는 CDRL1, 서열번호 5 또는 11을 포함하는 CDRL2, 또는 서열번호 6, 12 또는 21을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 21로 표시되는 CDRL3 경쇄가변영역은 서열번호 6으로 표시되는 CDRL3 경쇄가변영역의 일부 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 6으로 표시되는 CDRL3 경쇄가변영역의 일부 아스파틱산(aspartic acid)이 글루타민산(glutamic acid)로 치환된 것일 수 있다. 상기 서열번호 21로 표시되는 CDRL3 경쇄가변영역을 가지는 항체는 EGFRvⅢ 항원과의 결합 친화력이 높은 특징이 있다. 즉, EGFRvⅢ는 고도로 암 특이적 항원이므로 상기 항체가 EGFRvⅢ 항원에 대하여 높은 결합 친화력을 가짐으로써, 암의 조기 진단, 예방 및 치료에 적용이 가능하다.
EGFR은 원형-종양 유전자(proto-oncogene) c-erb B의 170킬로달톤 막 지단백질 산물일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "EGFRvⅢ"는 MR1 scFv에 의해 인식되고 아미노 말단 부근 2-7 엑손의 801 염기쌍 인프레임 결실에 의해 특징되는 표피성장인자 수용체의 돌연변이 Ⅲ형을 의미한다. EGFRvⅢ는 약 50∼60%의 교모세포종(glioblastoma)에서 고발현되고, 약 70∼80%의 유방 및 난소 암종 및 약 16%의 비소세포 폐 암종에서 존재하는 것으로 나타난다. EGFRvⅢ는 세포표면에서 발현되고, 결실 접합부에서 종양 특이 세포 표면 에피토프(epitope)를 생성한다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 바이러스, 세균 등 항원을 비활성화시키고 신체에 침입한 미생물에 대항하여 세포 외부 자극을 유도하는 당단백질을 의미하며, 특히 면역항체를 의미한다. 본 발명은 항-EGFRvⅢ 항체에 관한 것이므로, 특별히 다른 지칭이 없는 경우에 수식 없이 사용된 '항체'라는 용어는 EGFRvⅢ의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-EGFRvⅢ 항체를 의미할 수 있다. 본 발명의 범위에는 EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태(IgG)이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄(High Chain: HC 또는 CH)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역(Variable Region: VR) 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄(Low Chain: LC 또는 CL)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일 클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 본 발명은 단일 클론 항체이면서 완전인간항체일 수 있다.
상기 단일 클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체 중 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일 클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 일 실시예에서 본 발명은 의도치 않은 면역반응을 최소화할 수 있는 완전인간항체에 관한 것이다.
상기 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (Complementary Determining Region: CDR. 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인(Variable Region of High Chain)을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인(Variable Region of Low Chain)을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (Complementary Determining Region: CDR. 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에서 사용된 용어 "골격 영역"(Frame Region: FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 1을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2를 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 3을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역을 가지고, 서열번호 4를 포함하는 CDRL1, 서열번호 5를 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 6을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 EGFRvⅢ에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 7을 포함하는 CDRH1, 서열번호 8을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 9를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역을 가지고, 서열번호 10을 포함하는 CDRL1, 서열번호 11을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 12를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 EGFRvⅢ에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 1을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2를 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 3을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역을 가지고, 서열번호 4를 포함하는 CDRL1, 서열번호 5를 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 21을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 EGFRvⅢ에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 13 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 가지는 골격 영역(FR)을 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 서열번호 13을 포함하는 HC F1, 서열번호 14를 포함하는 HC F2, 서열번호 15를 포함하는 HC F3, 서열번호 16을 포함하는 HC F4, 서열번호 17을 포함하는 LC F1, 서열번호 18을 포함하는 LC F2, 서열번호 19를 포함하는 LC F3, 서열번호 20을 포함하는 LC F4를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "항체 결합 단편"이란, 항원결합능력을 지니는 항체의 단편을 의미한다. "Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. "Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술을 의미한다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 Ⅲ 단백질 또는 유전자 VⅢ 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열을 유전자 Ⅲ 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 Ⅲ 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 EGFRvⅢ을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상기 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press,New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome에서 확인할 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL
Figure pat00001
프로모터, pR
Figure pat00002
프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6xHis(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다. 다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다. 상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방용 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방용 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFRvⅢ에 높은 친화도로 결합하여 EGFRvⅢ을 과발현하는 암세포의 이동을 억제할 수 있으므로, 암의 예방 및 치료에 사용 가능하다. "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
"EGFRvⅢ을 과발현하는 암"은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 유의적으로 더 높은 수준으로 EGFRvⅢ을 암 세포표면에 갖고 있는 암을 의미한다. 상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 EGFRvⅢ을 과발현하는 암이고, 예를 들어 교모세포종, 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 폐암, 유방암, 식도암, 허파암, 난소암, 전립선암 및 편평상피암 등일 수 있다.
다른 양상으로, 본 발명은 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하기 위한 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여일 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 정맥 주사 형태로 투여되는 것일 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체를 통해 샘플에서의 EGFRvⅢ 발현 수준을 측정함으로써 암을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 EGFRvⅢ에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 EGFRvⅢ에 대한 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 예를 들어 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 암 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이를 통해 EGFRvⅢ 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 및 그의 항체 단편은 EGFR에 대한 결합을 최소화하고, EGFRvⅢ만 특이적으로 인지하는 특징을 가진다. EGFRvⅢ는 고도로 암 특이적 항원이므로 본 발명에서 개발된 항체 및 항체단편은 암 조기 진단, 예방 및 치료에 적용이 가능하다. 또한 고도의 암 특이성을 바탕으로 항체 또는 항체단편에 약물이나 T cell을 결합한 Antibody-Drug Conjugates(ADC)나 Chimeric Antigen Receptor-T(CAR-T) 기술을 적용하여 치료효능의 극대화가 가능하며, 정상세포에 발생 가능한 독성을 최소화 할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체단편에 직접 방사성동위원소나 형광물질을 결합하여 이미징하는 방법 또는 ELISA나 IHC법을 통해 EGFRvⅢ 돌연변이의 조기진단이 가능하다.
도 1은 교모세포종 환자유래세포들에서 EGFR/EGFRvⅢ의 발현양상을 웨스턴블로팅으로 확인한 결과이다.
도 2는 EGFR 대비 EGFRvⅢ에 3배 이상의 결합력을 보이는 항체단편 55 종을 선별한 결과이다.
도 3은 최종 2종의 클론을 인간 IgG1 항체의 형태로 변환하여 생산 후 분석한 결과이다.
도 4는 ELISA 방법으로 EGFRvⅢ에 대한 결합 특이성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 면역조직화학염색법을 이용해 EGFRvⅢ 돌연변이 교모세포종 조직 (EGFRvIII +/EGFR +) GBM4에서 결합양상을 촬영한 현미경 사진이다.
도 6은 H1L2 항체(a) 및 H1L2mut 항체(b)의 응답 단위(response unit)를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. EGFRvⅢ 특이적 항체를 이용한 세포패닝
항체 선별은 파지 디스플레이 (phage display) 기반 세포 패닝 (cell panning)법으로 진행되었다. 항체 선별을 위해 특허 WO2016114567에서 제시하는 항체 라이브러리를 사용했다. 이 인간 항체 라이브러리는 2개의 하위 라이브러리 (OPAL-L, OPAL-K)로 구성되어 있다.
항체 선별에 사용한 암환자 유래세포는 삼성서울병원 난치암연구사업단 (Samsung medical center, Institute for Refractory Cancer Research)에서 분양을 받아 사용했다. 분양 받은 환자유래세포들은 모두 교모세포종 (Glioblastoma multiforme) 환자 유래세포로 GBM1, GBM2, GBM3, GBM4, GBM5, GBM6, GBM7, GBM8 총 8종이다. 이들 세포의 EGFRvⅢ의 발현정도는 각 세포들의 20 ㎍ lysate를 이용하여 웨스턴블로팅 실험을 통해 확인되었다. 세포패닝에 사용된 암환자유래세포는 GBM7 (EGFR -/EGFRvⅢ -)과 GBM8 (EGFR -/EGFRvⅢ +)를 사용하였다. GBM7 세포는 세포표면에 비특이적인 결합을 보이는 항체단편들의 음성선택을 위해 사용하였으며, GBM8 세포는 EGFRvⅢ에 결합하는 항체단편을 확보하기 위해 사용했다.
상세하게, 대장균 숙주 TG1 내에 도입되어 있는 다양한 인간항체 가변영역 유전자가 삽입되어 있는 파지미드 (phagemid) 벡터를 항체단편이 표면에 발현된 파지 (phage) 형태로 회수하기 위해, 2개의 하위 라이브러리 (OPAL-L, OPAL-K) 샘플을 각 400 mL 의 배양배지 (SB/ampicillin/2% glucose) 내에 첨가하여 37℃, 220 rpm에서 약 2시간 동안 배양한다. OD600에서 흡광도가 0.5까지 배양된 숙주 세포들은 5,000g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거 후 400 mL 의 2차 배양배지 (SB/ampicillin) 내에 부유시킨 다음, 1012 pfu (plaque forming unit)의 helper 파지(VCSM13)를 첨가하여 37 ℃, 120 rpm에서 1시간 재배양한다. 이후 kanamycin 항생제 (helper 파지 내 도입된 항생제 유전자)를 최종농도 70 ㎍/mL 농도로 첨가한 후, 30℃, 220 rpm에서 밤샘 배양을 통해 인간항체 단편이 발현된 파지 (phage)들이 숙주 세포에서 만들어질 수 있도록 한다. 다음 날 원심 분리된 배양물은 PEG (polyethylene glycol) 8000 용액을 이용하여 파지 입자만 침전 시켜, 파지 라이브러리를 회수한다. 각 하위 라이브러리로부터 회수된 파지를 계수하기 위해 각 샘플을 희석한 다음 다시 숙주세포 (TG1)에 감염시켜 LB/ampicillin 고체배양배지에서 계수한다.
파지 디스플레이 스크리닝은 반복 회차 패닝을 통해 실시하였다. 계수된 하위 라이브러리를 약 1.0 x 1013 pfu 수준이 되도록 취합한 후, EGFR 및 EGFRvⅢ 항원을 발현하지 않는 GBM7 세포에 처리하여 4 ℃에서 1시간 결합 시키고, GBM7 세포에는 결합하지 않는 파지들을 포함하는 상층액만을 회수한다. 이는 항체 파지 라이브러리에서 EGFRvⅢ를 제외한 다른 세포 막단백질에 결합하는 파지들을 제거하여 EGFRvⅢ 외 비특이적인 결합을 방지하는 단계다. 회수한 상층액을 GBM8 (EGFR -/EGFRvⅢ +) 세포에 처리하여 4℃에 1시간 동안 결합을 시킨다. 차가운 완전배지를 이용하여 5번 세포를 세척하여 비특이적인 결합을 제거한 후, 37℃로 옮겨 30분 동안 배양하여 항원-항체 복합체의 수용체 매개 세포내재화 (Receptor-mediated endodytosis)를 유도한다. 차가운 PBS를 이용하여 세포를 세척하고, 0.1 M Glycine 버퍼(pH 2.0)를 이용하여 최종 세척을 해서 세포표면에 결합중인 세포 내재화되지 않은 파지입자들을 제거한다. 2 M Tris 버퍼(pH 8.0)를 이용하여 중화를 진행하고, 100 mM TEA (Triethylamine) 0.5 ㎖을 첨가하여 10분 간 정치하여 세포를 용해시키고, 2 M Tris 버퍼(pH 8.0) 1 mL로 중화를 시킨다. 미리 TG1 대장균을 OD600 = 0.5 ~ 0.8으로 준비를 해 둔 뒤, TG1 대장균 배양액 8.5 mL에 중화된 회수 파지 용액 1.5 mL을 혼합하여, 37℃ 120rpm에서 1시간 동안 배양하여 TG1 대장균에 회수한 파지를 감염시키고 이를 LB/ampicillin 고체배지에서 계수하였다. 잔여 회수용액은 15 ㎝ LB/ampicillin 고체배지에 도말하여 밤샘 배양 후, 다음 날 5 mL의 SB 배양배지를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관 (-80 ℃) 하였다.
계속되는 패닝 회차를 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 50 μL 를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 숙주세포에 배양 후 helper 파지(VCSM13)를 첨가하여 회수된 파지 입자들은 PEG8000을 이용한 침전을 통해 준비되었고, 이를 이용하여 다음 회차 패닝을 전 회차 패닝과 동일한 방법으로 진행하였다. 세포 패닝은 총 4 회차까지 진행하여, GBM8 세포에 특이적으로 결합하는 인간항체단편 발현 파지들을 enrich 시켰다.
실시예 2. EGFRvⅢ 특이적 항체 단편 선별
EGFRvⅢ 돌연변이를 가진 GBM8 세포를 이용한 4회의 세포패닝이 종료된 후, 최종 회차에서 회수된 파지 입자들은 숙주세포 (TG1)에 감염을 통해 LB/ampicillin 고체배양배지에서 콜로니로써 확인되었다. 이 콜로니들을 취하여 200 μL SB/ampicillin 배양배지가 담긴 96 well plate 내 각각 접종 후 배양하였다(37 ℃, ~3시간). 이후 scFv-pⅢ 단백질의 발현 유도를 위해 각 well에 최종농도 1 mM의 IPTG를 처리하고 30℃ 에서 밤샘 배양하였다. 이후 배양 plate는 원심분리 및 상층액 제거 후 각 well 내 배양세포의 periplasm 부위를 회수하기 위하여 40 μL의 4℃ 로 유지해두었던 TES 용액(20% w/v sucrose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 처리하여 4℃ 에서 30분 동안 정치함으로써 세포를 용해시켰다. 이후 다시 0.2X TES 용액 60 μL를 처리하여 30분 동안 정치하였고, 최종적으로 plate를 원심분리한 후 상층액을 회수함으로써 scFv-pⅢ 단백질을 소규모로 생산하였다. 한편, 재조합 EGFRvⅢ ECD-Fc 단백질과 EGFR ECD-Fc 단백질을 각각 96 well plate에 coating하고, 및 연이어 3% skim milk를 이용해 blocking된 96 well plate를 동시에 준비한 다음 회수된 periplasm 부위 중 25 μL를 취하여 각 well에 첨가 후 1시간 동안 결합시켰다. TBST를 이용, 3 ~ 4회 세척 과정을 거친 다음, HRP가 결합된 항 HA 항체를 1시간 결합시킨 후 다시 세척 및 TMB substrate를 이용한 발색반응을 유도한 후 OD450에서 그 값을 측정하였다. 최종적으로, 55개의 클론 (EGFRvⅢ/EGFR 결합능 배수 > 3) 들이 선별되었다.
이 후 DNA 서열 분석을 수행하였으며, 2종의 EGFRvⅢ 특이적 항체단편 클론 서열을 확보하였다.
실시예 3. EGFRvⅢ 특이적 항체단편의 IgG로 변환, 생산 및 정제
3-1. H1L2 및 H2L1 항체의 생산 및 정제
상기 실시에 2에서 선별된 2종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH1-Hinge-CH2-CH3-stop codon-XhoI'로 구성되며, 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-HindⅢ-CL-stop codon-XhoI' 으로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 IDT에서 합성을 진행했다.
이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Invitrogen)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편을 각각 EcoRI (NEB)와 XhoI (NEB) 제한 효소를 사용하여 절단하고, Infusion-HD cloning kit (Takara)를 이용해 클로닝함으로써, 완전 인간 IgG1 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 확보되었으며, 임시발현은 Expi293TM Expression System (Invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 Expi293 cell 이며, Expi293TM Expression Medium를 배지로 사용하여 37 ℃, 80% humidity, 8 % CO2, 130 rpm 조건에서 부유배양방식으로 배양되었다. 50 mL scale로 항체 생산을 진행하였으며, 임시발현은 세포를 2.9x106 cells/mL의 농도로 준비한 후, Expi293 transfection reagent (Invitrogen)를 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 중쇄 DNA:경쇄 DNA= 2(33.3 ㎍):1(16.7 ㎍) 의 비율로 제조사에서 제공하는 프로토콜을 이용해 진행 하였으며, 5일간 배양하였다. 상기 배양된 세포를 원심분리하여, 상층액 각 50 mL을 취하고, 0.2 ㎛ 필터시스템으로 필터를 한 후, AKTA Prime plus (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime plus (GE healthcare)에 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE healthcare)을 설치하고 배양액을 5 mL/min의 유속으로 흘려준 후, 세척은 PBS를 5 mL/min의 유속으로 6 분간 흘려주었다. IgG elution buffer (Thermo Scientific)를 이용하여 용출하였으며. 이를 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (Millipore)을 이용해 PBS buffer로 교환하여 최종적 두 항체의 정제를 완료하였고, H1L2, H2L1으로 각각 명명하였고 서열은 다음과 같다(표 1).
제시하는 서열은 KABAT numbering을 기준으로 분류하였다. 항체는 SDS-PAGE 실험을 통해 Reducing과 non-reducing 조건에서 분석되었으며, non-reducing 조건에서 안정적인 pairing이 됨을 확인하였다.
3-2. H1L2mut 항체의 생산 및 정제
포유세포에서 항체를 포함하는 단백질을 제조할 경우, post-translational modification 과정에 의해 단백질의 물리이화학적 또는 생화학적 활성의 변화가 발생할 수 있다. 단백질의 활성에 크게 영향을 끼치는 post-transcriptional modification은 크게 N-glycosylation, Deamidation, Isomerization, Oxidation, Non-enzymatic cleavage가 있다. 예를 들어 항체의 CDR영역에 N-glycosylation motif (Asn-Xaa-Ser/Thr)가 존재할 경우, Asparagine (Asn)에 큰 당쇄의 생성으로 인해 항체의 결합능 저하가 발생한다. 또한, 치료용 단백질에 Asp-Asp motif가 존재할 경우 특정 조성이나 보관 조건(pH 4.5~7.2, 온도 2~37℃)에서 non-enzymatic post-translational modification인 isomerization과 racemization이 발생하여 단백질의 활성에 저하를 가지고 올 수 있다(Jennifer Zhang et al., Analytical Biochemistry, 2010). 항체의 CDR 영역은 표적 항원의 인식에 중요한 부위이며, H1L2 항체의 경우 Asp-Asp motif (DD sequence)가 존재한다. 따라서, post-translational modification에 의한 활성 저하를 막기 위해, 상기 실시예 2에서 정제한 경쇄의 CDR-L3 영역의 아미노산 서열을 일부 치환한 H1L2 돌연변이 항체를 생산, 정제를 완료였다. 상기 H1L2 돌연변이 항체를 H1L2mut로 명명하였고, 서열은 다음과 같다(표 1).
항체 아미노산 서열
H1L2 H1L2mut H2L1
HC F1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
CDR-H1 SYGMH SYGMH DYAMH
F2 WVRQAPGKGLEWVS WVRQAPGKGLEWVS WVRQAPGKGLEWVS
CDR-H2 AISSSGDSTYYADSVKG AISSSGDSTYYADSVKG AISGSGGSTYYADSVKG
F3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
CDR-H3 DWSLMDV DWSLMDV GGSSRPFDY
F4 WGQGTLVTVSS WGQGTLVTVSS WGQGTLVTVSS
LC F1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC
CDR-L1 SGNNIGSKSVH SGNNIGSKSVH SGSSSNIGNNIVN
F2 WYQQLPGTAPKLLIY WYQQLPGTAPKLLIY WYQQLPGTAPKLLIY
CDR-L2 TTNNKHS TTNNKHS QDSKRPS
F3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC
CDR-L3 AAWDDSLSGYV AAWD E SLSGYV AAWDDSLKGWV
F4 FGGGTKLTVL FGGGTKLTVL FGGGTKLTVL
실시예 4. 효소면역측정법(ELISA)을 통한 EGFRv Ⅲ 특이적 항체의 특이성 확인
생산된 두 종의 완전인간항체를 이용하여, EGFRvⅢ에 대한 특이성을 확인하기 위해, EGFRvⅢ ECD-Fc 재조합단백질, EGFR ECD-Fc (R&D systems) 재조합단백질에 대한 결합양상을 ELISA를 통해 확인하였다. 96 well ELISA 전용 plate 에 1 ㎍/mL 농도로 100 μL로 각각의 단백질을 코팅을 한 후, 3% 탈지유로 블로킹을 진행을 하고 생산된 각각의 H1L2, H2L1 인간항체를 25 nM 농도에서 1/2씩 희석을 하여 3 반복으로 항체를 처리하고 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후 0.1% PBST 용액을 이용하여 3회 세척한 다음, 2차 항체인 anti-human (Fab')2-HRP 항체 (Thermo) 를 1시간 처리하여 각각의 항원과 결합중인 H1L2, H2L1 인간항체를 탐지하였다. 이후 3회 세척 과정을 거친 후 기질인 TMB (Thermo)를 100 μL 처리하고 5분 정치 후 반응정지용액 (Cell signaling technology)을 이용하여 반응을 멈추고 난 다음 OD450에서 흡광도를 측정했다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, H1L2와 H2L1은 EGFRvⅢ 재조합 단백질에만 특이적인 결합양상을 보이는 반면, 대조항체로 사용한 Cetuximab의 경우 EGFRvⅢ-ECD와 EGFR-ECD 모두에 결합함을 확인했다.
실시예 5. 면역조직화학염색법( Immunohistochemistry )을 통한 EGFRv Ⅲ 특이성 확인
면역조직화학염색을 위하여 파라핀 포매 조직을 준비하였다. 파라핀 포매 조직을 제작하기 위하여 오리엔트바이오㈜ 에서 BALB/c-nude 마우스 (5 주령)를 구입하였다. 마우스는 입고 후 1주간 삼성서울병원 실험동물연구센터에서 검역을 진행한 이후, 1주간 추가적인 순화기간을 가진 후 7주령이 되는 시점에서 뇌교모세포종 환자유래세포를 이용한 이종이식모델 제작을 진행하였다. BALB/c-nude 마우스 (7 주령)에 GBM4 세포 2 x 106 세포를 Matrigel® Basement Membrane Matrix (Corning®)과 Hank's Balanced Salt Solution (Gibco)을 1:1로 섞은 용액 200 μL에 세포를 희석한 후 100 μL를 마우스 우측등쪽 피하층에 1cc 주사기를 이용하여 이식하였다. GBM4 세포의 경우 EGFRvⅢ 돌연변이와 EGFR을 같이 발현하고 있는 교모세포종 세포이다. 30일 지난 시점에서 마우스를 경추탈골하여 희생하였으며, 피하이식하여 생성된 종양조직을 파라핀 카세트에 넣고 500 mL 크기의 보관통에 24시간 동안 고정하였다. 24시간 이후 흐르는 2차 DW로 파라핀 카세트를 세척한 후 2차 DW가 채워진 500 mL 보관통에 파라핀 카세트를 넣은 후 파라핀 포매 조직 제작을 진행하였다. 제작된 GBM4 세포의 피하이식동물모델 종양 파라핀 블록을 회전형 박절기 (Leica slide section) 장비를 이용하여 4 ㎛ 두께로 박절하였다. 박절하여 생성된 절편은 붓과 핀셋으로 집어 45℃의 부유 온수조에 올려서 절편을 신전하였다. 신전된 절편은 실란코팅 (Silane coating)된 마이크로 유리 슬라이드 (MUTO PURE CHEMICAL Co.) 가운데 위치시키고 24 시간 동안 건조시켜 사용하였다. 면역조직화학염색 진행을 위하여 준비된 절편 슬라이드를 45 ℃가 유지되는 신전기에 올려두고 1시간 동안 기다린 후, 완전히 파라핀 절편이 신전된 것을 확인하고, 10 분 간 실온에서 휴지기를 가졌다. 절편 슬라이드는 Xylene (대정화금) 이 들어있는 통에 완전히 담가 10 분 간 기다린 후, 깨끗한 xylene이 들어있는 새로운 토에 옮겨 10 분 간 파라핀 제거를 진행하였다. 이후에 100% 알코올이 담겨있는 통에 절편슬라이드를 옮겨 완전히 담그고 10분 후 깨끗한 100% 알코올이 담겨있는 통에 옮겨 10 분 간 기다린 후 다음단계를 진행하였다. 동일한 방법으로 95%, 90%, 80% 알코올이 들어있는 통에 순차적으로 절편슬라이드를 담가 수화시키는 작업을 진행하고 최종적으로 DW가 들어있는 통에 옮겨 담아 5분간 기다리고 재수화 작업을 완료하였다. 재수화가 완료된 절편슬라이드는 파라핀 블럭 제작 시 발생하는 항원성 소실문제를 해결하기 위한 항원성부활(Antigen Retrieval)를 진행한다. 항원성의 부활을 위하여 1x DAKO REALTM target retrieval solution (DAKO)을 이용하였다. 1x DAKO REALTM target retrieval solution (DAKO)을 500 mL 통에 넣고 절편 슬라이드를 완전히 담근 후 700 W의 전자레인지에서 1분 간 가열하고, 실온에서 10 분 간 휴지기를 가지고 이를 3회 반복하였다. 가장 마지막 회 차에서는 가열 후 30분간 실온에서 휴지기를 거처 용액이 실온이 될 때까지 기다린다. 항원성 부활작업을 진행한 절편슬라이드는 Tween20 0.2%가 포함된 TBST 용액 (바이오세상)에 담가 10분 씩 2회 세척하였다. 이 후 내인성 과산화효소활성 억제를 위하여 습윤조건 슬라이드 보관함에 위치시킨 후 30% H2O2 용액(JUNSEI)을 메탄올을 이용하여 3% H2O2용액으로 제작하여 1 mL 파이펫을 이용하여 절편 슬라이드에 도포하였고, 실온에서 12분간 기다린 후 다음 단계를 진행하였다. 도포된 3% H2O2용액을 제거하기 위하여, TBST 용액에 완전히 담그고 10분씩 2회 씻어 주었다. 다음으로 준비된 절편 슬라이드를 습윤조건 슬라이드 보관함 위에 위치시킨 후 1% Bovine Serum Albumin 용액 (Santa Cruz Biotechnology)을 도포한 후 1시간 동안 기다렸다. 항체 도포를 위하여 TBST 용액에 항체를 희석하여 준비하였다. 항체 희석은 H1L2 및 H2L1 각각 1 ㎍/mL 농도가 되도록 준비되었으며, Cetuximab은 1 ㎍/mL과 100 ㎍/mL 농도로 준비하였다. EGFR발현과의 비교를 위하여 시판중인 면역조직화학용 EGFR 표적 항체를 cell signaling사에서 구입하여 1:200 희석하여 준비하였다. 절편 슬라이드에 도포된 1% Bovine Serum Albumin 용액을 흡입하여 제거였고, 준비된 항체를 각각의 슬라이드에 도포하였다. 각 항체가 도포된 슬라이드는 습윤조건 슬라이드 보관함에 넣어 4 ℃ 냉장고에서 24 시간 동안 반응시킨다. 반응 이후 Tween20 0.2%가 포함된 Tris-buffered saline 용액에 완전히 담그고 10 분씩 2 회 씻어 준다. 각 항체에 대하여 Horseradish Peroxidase (HRP)가 결합된 anti-human IgG antibody 2차 항체를 준비하여 도포하고, 1시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응시간이 끝난 후, TBST 용액에 완전히 담그고 10분씩 2회 씻어 주었다. VECTASTAIN ABC HRP Kit (VECTOR)의 A 용액 과 B 용액을 TBST 용액으로 각각 1:50이 되도록 희석한 후 희석된 용액을 1:1로 섞어 A/B혼합액을 제작하고, 각각의 슬라이드에 1mL 파이펫을 이용하여 A/B 혼합액을 도포하였다. 도포 후 슬라이드는 1 시간 동안 습윤조건 슬라이드 보관함에서 반응시켰다. 반응이 끝나는 시점에서, TBST 용액을 이용하여 10분간 2회 씻어주었다. 각 슬라이드는 DAB 용액 (Sigma)를 1 mL씩 파이펫을 이용하여 도포하여 10분간 발색 시키고, DW에 10 분간 담가 반응을 종료시켰다. 세포핵 염색을 위하여 DAKO® Mayer's hematoxylin (DAKO) 용액에 1초 간 담근 후 DW에 10 분간 씻어주었다. 이 후에 절편슬라이드의 탈수화를 위하여, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 용액에 각각 5 분씩 순차적으로 담가 탈수화를 진행하였다. 탈수화가 종료된 이후 Xylene 용액에 10 분간 담그고 기다린 이후 깨끗한 Xylene 용액에 슬라이드를 옮기고 10 분간 기다렸다. 이후에 Xylene 용액에 담겨있는 슬라이드를 꺼내어 잔여 xylene 용액이 흡수되도록 KIMTECH SCIENCE® Wipers (Yuhan-Kimberly) 2장 위에 슬라이드를 위치시킨다. 이 때 박절된 조직 절편이 있는 슬라이드면이 하늘을 향하도록 놓는다. 절편 슬라이드의 봉입을 위하여 Permount mounting 용액 (Fisher Scientific)을 스포이드를 이용하여 조직 절편 위에 1 방울 떨어트린다. 이후 슬라이드 커버 글라스를 핀셋을 이용하여 조직 절편을 덮으며, 이때 Permount mounting 용액은 균일하게 슬라이드와 커버 글라스 사이에 퍼지도록 하고, 기포가 생기는 경우 핀셋으로 커버 글라스를 눌러서 제거하였다. 봉입이 완료된 절편 슬라이드는 24 시간 동안 완전히 고정시켰다. 봉입한 절편 슬라이드의 고정이 완료되면, 절편 슬라이드는 ScanScope® AT (Aperio) 장비를 이용하여 전체 절편 슬라이드를 스캔하여 분석하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, Cetuximab은 알려진 바와 같이 EGFR과 EGFRvⅢ에 모두 결합하는 것을 확인하였다. 즉, GBM4 조직 (EGFR +/EGFRvⅢ +)에 1 ㎍/mL로 염색 진행 시 염색이 되지 않았으나, 100 ㎍/mL의 고농도에서 전반적으로 모두 염색이 됨을 확인하였다. 반면 본 발명에 따른 H1L2 항체는 1 ㎍/mL 농도로 염색 진행 시 특정 위치에서 강하게 염색이 되는 양상을 확인하였다. GBM4 조직은 EGFRvⅢ와 EGFR이 공동으로 발현되어 있기 때문에, H1L2 클론은 EGFRvⅢ를 발현하는 population에 특이적으로 결합하는 것으로 보여지며, 동일 농도에서 H2L1은 면역조직화학염색이 되지 않는 것으로 확인되었다. 이로써, EGFR에 결합을 최소화하고, EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는, 본 발명에 따른 항체들은 CAR-T 세포 기술에 적용하여, EGFRvⅢ + 종양세포만을 특이적으로 표적하여 효능을 극대화하고, 부작용을 최소화할 수 있을 것임을 확인하였다.
실시예 6. H1L2 돌연변이의 EGFRvⅢ와의 결합력 확인
상기 실시예 3에서 제조한 H1L2 및 H1L2mut 항체의 EGFRvⅢ 단백질에 대한 결합력을 측정하였다. 구체적으로, SPR 분석장비인 BIACORE T200 (GE)을 사용하여 상기 H1L2와 H1L2mut 항체의 결합상수를 측정하였다. 먼저, CM5 sensor chip (GE)을 BIACORE T200에 장착한 후 Amine coupling kit (GE)를 이용하여 항원 고정을 진행하였다. 분석에 사용된 EGFRvⅢ 재조합 단백질은 공개된 서열을 기반으로 293F (Gibco)에서 발현하였으며, affinity chromatography를 이용하여 정제하였다. 이후, CM5 sensor chip에 EGFRvⅢ 재조합 단백질을 300 RU 고정하였다. 분석은 HBS-EP+ (GE)를 이동상으로 진행되었으며, 분석에 사용된 각각의 항체들은 30 uL/분의 유속으로, association time은 180 초, dissociation time은 180 초로 진행하였다. 결합상수는 BIAEVALUATION software (GE)를 이용하여 계산하였다.
Ag : rhEGFRvIII K a (1/Ms) K d (1/s) K D (nM)
H1L2 2.132E+05 7.615E-03 35.71
H1L2mut 9.694E+04 4.777E-05 4.93
항원 (EGFRvⅢ)과 항체 (H1L2mut, H1L2)의 상호작용에 대한 표면 플라즈몬 공명 sensorgram을 도 6a 및 6b에 나타내었다. 도 6a에 나타난 바와 같이, H1L2 항체는 0~180 초의 association 구간에서는 항원과 상호작용을 하고 180~360 초의 dissociation 구간에서는 이탈되는 양상을 확인할 수 있다. 또한, 도 6b에 나타난 바와 같이, H1L2mut 항체는 0~180 초의 association 구간에서 뿐만아니라, 180~360 초의 dissociation 구간에서도 안정적인 결합양상을 보임을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 산출한 Ka, Kd, KD를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이, H1L2 항체 및 H1L2mut 항체는 EGFRvⅢ 재조합 단백질에 대한 결합력이 우수한 것을 확인할 수 있다.
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Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 7을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2 또는 8을 포함하는 CDRH2 또는 서열번호 3 또는 9를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역을 가지고, 서열번호 4 또는 10을 포함하는 CDRL1, 서열번호 5 또는 11을 포함하는 CDRL2, 또는 서열번호 6, 12 또는 21을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 EGFRvⅢ (Epidermal Growth Factor Receptor Variant Ⅲ)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 13 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 가지는 골격 영역(FR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일 클론항체이며 완전인간항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  5. 청구항 4의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  6. 청구항 5의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  7. 청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방용 또는 치료용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서 상기 암은 폐암, 대장암, 위암, 신장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 예방용 또는 치료용 조성물.
  9. 청구항 1 내지 4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  10. 청구항 9의 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
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