KR20230115661A - 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a)서열번호 1 또는 서열번호 9의 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 2 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 CDRL2, 및 서열번호 3 또는 서열번호 11의 아미노산 서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (b)서열번호 4 또는 서열번호 12의 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 아미노산 서열의 CDRH2, 및 서열번호 6 또는 서열번호 14의 CDRH3를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR);을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그 용도{Monoclonal antibody specifically binding to the pro-domain of matrix metalloprotease-7 and use thereof}

본 발명은 기질 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease, 이하 'MMP'라고도 함)-7의 프로-도메인에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 대한 항체는 신데칸-2(SDC-2)와의 상호작용을 방해하여 결장암 세포에 대한 항종양 활성을 나타낸다.

현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과는 향상되어가고 있다. 그러나, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 1, 2위를 다투는 중요한 질환 중 하나이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다.

기존의 항암제는 암 세포 뿐만 아니라, 정상 조직에도 침투하여 정상 세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에 골수 기능의 저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고, 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 큰 문제점을 보인다. 따라서, 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결할 수 있는 혁신적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제10-2014-0003485호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항 종양 활성을 가지는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

(a)서열번호 1 또는 서열번호 9의 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 2 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 CDRL2, 및 서열번호 3 또는 서열번호 11의 아미노산 서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR); 및

(b)서열번호 4 또는 서열번호 12의 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 아미노산 서열의 CDRH2, 및 서열번호 6 또는 서열번호 14의 CDRH3를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR);을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위, 및 서열번호 8 및 서열번호16으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 부위를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 대장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 암을 대상으로 하는 것일 수 있다. 바람직하게는 대장암, 또는 대장암을 포함하는 상기 군에서 선택되는 어느 둘 이상의 암을 대상으로 하는 것일 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용하는 용어 "신데칸(Syndecan)"은 세포 표면 수용체로서 세포 외 기질 분자와 수용성 리간드의 결합을 통하여 세포 행동을 조절하는 헤파란 황산염 프로테오글리칸 계열의 물질이다. 신데칸 계열의 멤버들은 멤버들 사이에 높은 수준의 보존력을 가지고 있어서 일반적으로 세포 외 기질(ECM)과 후속적으로 관련이 있는 세포 기능에 대한 세포의 유착을 조절할 수 있는 일부 기능적 중복성이 있지만 대부분 구별되는 기능적 역할을 갖는다.

예를 들어, 대장암에서의 신데칸-2은 특정한 기능적 역할을 할 수 있다. 신데칸-2의 발현은 대장암을 포함한 다양한 유형의 인간의 암과 같은 질병의 발현과 관련이 있다. 종래에 신데칸-2는 정상 세포 라인에 비하여 대장암 세포 라인에서, 또한 정상 조직 보다는 암 조직에서 높게 발현된다는 것이 확인되었다. 그러므로, 신데칸-2 의 증가는 대장암의 활동에 매우 주요한 표지가 되는 것으로 보인다. 상세하게는, 조직 내에서 신데칸-2의 증가는 세포 이동 및 침윤을 향상시킴으로 종양 세포의 성장을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "메탈로프로티나아제(Matrix Metaloproteases, 이하, MMP)"은 펩티드 내부가수분해효소(endopeptidases)를 포함하는 칼슘-의존 아연의 큰 패밀리에 속하고, 상기 칼슘-의존 아연 패밀리는 조직의 리모델링과 세포 외 기질(ECM)의 열화를 담당한다. 상기 메탈로프로티나아제의 이러한 단백질 분해 활성은 암세포를 활성화시켜 세포 성장, 전이, 혈관신생 등을 증가시킬 수 있다. 상세하게는, 메탈로프로티나아제 패밀리 중 세포의 활성화시 프로-도메인 및 catalytic-domain의 두 개의 영역으로 구성된 영역으로 분할되는 메탈로프로티나아제-7의 발현이 대장암 진행의 다양한 단계와 관련이 있는 것으로 보인다.

모든 MMP는 지모겐(zymogen)이라고 불리는 전효소 형태로 합성되고 분비되기 때문에, 단백질 분해 활성을 얻기 위해서는 메탈로프로티나아제의 활성화 과정이 필수적이라고 할 수 있다. 메탈로프로티나아제의 세포 표면 위치 측정(localization) 또한 ECM 분자를 분해하고 종양 침윤과 메탈로프로티나아제에 의한 세포 표면 수용체 분리를 촉진하는 능력을 제공하는 중요한 단계일 수 있다.

신데칸-2는 메탈로프로티나아제-7의 세포 표면 도킹 수용체로서 핵심적인 역할을 할 수 있다. 세포 외 기질에서, 메탈로프로티나아제-7 의 프로-도메인은 신데칸-2 코어 단백질의 세포 외 영역과 결합할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 항 matrix metalloprotease-7의 프로-도메인 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작뿐 아니라 matrix metalloprotease-7의 프로-도메인에 대한 길항제의 전구체 또는 구성 성분으로서 기능을 할 수 있다. 예컨대, 상기 폴리펩타이드 분자는 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디, 나노바디 등), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체 등의 구성 성분으로 포함될 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, matrix metalloprotease-7의 프로-도메인)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다.

용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 상기 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용하여, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다.

용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개 의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.

용어 "이중 특이 항체" 또는 "다중 특이 항체"는 2개(이중 특이 항체) 또는 그 이상(다중 특이 항체)의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 상기 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기한 바와 같이, 상기 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체는, 서로 다른 2종 또는 그 이상의 항원에 대한 각각의 항원 결합 부위를 포함하여, 2종 이상 또는 그 이상의 항원을 동시에 인식 및/또는 결합하는 항체로서, 상기 항원 결합 부위 중 하나는 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 matrix metalloprotease-7 항원 결합 부위 역할을 하는 상기 폴리펩타이드 분자는 다른 항원에 대한 항원 결합 부위와 이합체 또는 다합체를 형성하여 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체를 구성할 수 있다. 따라서, 일 구체에서, 본 발명의 항원 결합 부위로서 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체가 제공된다.

또 다른 예에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자 하나 이상 또는 상기 폴리펩타이드 분자가 링커에 의하여 반복하여 연결된 반복체 (이하, '제1 펩타이드')와 구조적 기능을 하는 폴리펩타이드 (이하, '제2 펩타이드'; 예컨대, 항체(IgG, IgA, IgE, IgD, IgM 등)의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 또는 항체의 Fc 단편)를 포함하는 펩타이드 복합체를 하나 이상 (예컨대 1 내지 5개, 또는 2 내지 4개) 포함하고, 상기 하나 이상의 펩타이드 복합체가 제2 펩타이드 (예컨대 Fc 단편)에서 결합되어 다합체 구조를 갖는 단백질 골격체가 제공된다.

본 발명에서 항체는 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함한다. 원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

본 발명에서 제공되는 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대,상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2,IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체의 가변 부위를 제외한 부분은 인간 항체로부터 유래한 불변부위일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 불변부위일 수 있다.

항 matrix metalloprotease-7 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 matrix metalloprotease-7 항체는 마우스 단클론항체를 이용하여 Schwaber 등의 논문에 기재된 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 matrix metalloprotease-7와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석 또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.

최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (Almagro, J. C. and Fransson, J., "Humanization of antibodies," Frontiers in Bioscience, 13(2008), 1619-1633).

다른 예는 상기 항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 저해를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 신생혈관 형성 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신생혈관 형성 저해 방법을 제공한다. 상기 신생 혈관 형성 저해 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 신생혈관 형성 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 항 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에 탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항체는 결장암 세포에서 항암 활성을 가지고 있고, 메탈로프로테아제-7 전구효소와 신데칸-2의 상호작용을 경쟁적으로 감소시키고, 동물 실험 결과, 종양 성장 억제를 나타내었고, 전이를 유의하게 억제하여 본 발명의 항체는 항암 활성을 가지는 후보 물질이 될 수 있다.

도 1은 메탈로프로테아제-7 항체의 프로 도메인의 단일 사슬 가변 단편의 생성을 나타낸 그림으로, (A 및 B) 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)은 C-말단 6x His 및 HA 태그가 있는 M13 파지미드에 대해 구축되었다.
도 2는 메탈로프로테아제-7 항체의 프로-도메인의 단일 사슬 가변 단편의 선별 및 결합특이성, 결합부위 맵핑을 나타낸 그림으로,
(A) 파지 스크리닝에서 얻은 감염된 박테리아의 콜로니를 플레이트에서 성장시키고 각 콜로니에서 단클론 scFv를 생성했다. 항원(메탈로프로테아제-7의 프로-도메인)에 대한 단일클론 결합제는 ELISA 스크리닝에 의해 확인되었다. 배경 없는 양성 신호(목표 O.D 값 > 1.0 및 배경 O.D 값 <0.2)가 선택되었다. 5개의 단일클론 항체는 중복되는 서열을 제외하고 시퀀싱을 통해 선택하였다.
(B) 인간 메탈로프로테아제-7(hMMP-7)의 개략도. 신호 펩타이드(Pre), 프로 도메인(Pro), 촉매 도메인(Cat) 및 프로 도메인의 다양한 결실 돌연변이가 표시된다(상단 패널). 정제된 GST-tagged-메탈로프로테아제-7 나선 돌연변이체를 12% SDS-PAGE로 분리하고 표시된 항체(오른쪽 하단)로 면역블롯팅했다.
(C) 조건화된 배지(CM)는 신데칸-2(HT29-SDC2)를 발현하는 HT29 또는 HT-29 세포로부터 수집된 후 표시된 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항체로 면역블롯팅되었다. 정제된 메탈로프로테아제-7 효소 또는 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 대조군으로 사용하였다.
(D) 정제된 His 태그가 지정된 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 돌연변이체를 15% SDS-PAGE로 분리하고 표시된 항체로 면역블롯팅하였다.
도 3은 기질 메탈로프로테아제-7 항체의 프로-도메인은 결장암 세포에 대한 항종양 활성을 나타내는 그림으로,
(A) 신데칸-2(HT29-SDC2) 세포를 안정적으로 발현하는 HT-29 또는 HT-29 세포의 증식을 '실시예'에 설명된 대로 MTT 분석으로 평가했다. 데이터는 평균값 ±S.D로 표시된다. 세 번의 독립적인 실험 수행되었다.
(B) 프로피디움 요오드 염색 하여 유세포 분석에 의해 세포 주기 프로파일을 얻었다.
(C) 트랜스웰 이동 분석은 50nM의 표시된 항체로 처리된 HT29 세포로 수행되었으며, 10% FBS는 하부 챔버에서 화학 유인 물질로 사용되었다. 세포(1 × 10⁶)를 젤라틴 코팅(10μg/ml) 트랜스웰 플레이트에서 24시간 동안 이동하도록 하였다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); **, p < 0.01, HT29-SDC2/대조군 세포.
(D) 세포 침윤 분석을 위해 세포를 Matrigel 코팅(30 μg/ml) 플레이트의 상부 구획에 로딩하고 24시간 동안 인큐베이션하고 0.6% 헤마톡실린 및 0.5% 에오신으로 고정 및 염색하였다. 이동되거나 침습적인 세포의 수를 세었다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p < 0.05 대 HT29-SDC2 대조군 세포.
(E)HT29-SDC2 세포(2 × 10⁵/디쉬)를 소프트 아가 플레이트에 로딩하고 14일 동안 성장하도록 하고 생존 콜로니를 계수하였다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p < 0.05, **, p < 0.01, HT29-SDC2/대조군.
도 4는 1B7과 1C3이 모두 농도 의존적 방식으로 HT-29-SDC2 세포의 종양 형성 활성을 억제하는 그림으로,
(A) 트랜스웰 이동 분석은 5, 50 또는 100nM의 표시된 항체로 처리된 HT-29-SDC2 세포로 수행되었으며, 10% FBS는 하부 챔버에서 화학 유인 물질로 사용되었다. 세포(5 × 10⁵)를 젤라틴 코팅(10μg/ml) 트랜스웰 플레이트에서 24시간 동안 이동되도록 하였다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); **, p < 0.01 처리군/대조군.
(B) 세포침윤 분석을 위해 세포를 Matrigel 코팅(30μg/ml) 플레이트의 상부 구획에 로딩하고 24시간 동안 인큐베이션하고 0.6% 헤마톡실린 및 0.5% 에오신으로 고정 및 염색하였다. 이동된(침윤된) 세포를 계수했다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p < 0.05, 처리군/대조군.
(C) HT29-SDC2 세포(1 x 10⁵/접시)를 연한천 플레이트에 로딩하고 14일 동안 성장하도록 하고 생존 콜로니를 계수하였다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p<0.05 처리군/대조군.
도 5는 1B7 및 1C3 항체가 모두 신데칸-2와 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인의 상호작용을 경쟁적으로 감소시키는 것을 나타낸 그림으로, ScFv형 단일클론항체를 세균에서 발현시켜 고순도로 정제한 후 인간 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항원에 대한 단일클론항체의 결합을 나타낸 도면으로,
(A) 단일클론항체를 세균에서 발현시켜 고순도로 정제한 후 SDS-PAGE 겔을 이용하여 단백질의 양과 순도를 확인하였다.
(B) 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인의 단일클론항체가 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항원에 특이적으로 결합함을 Western blotting으로 확인하였다.
(C) 웨스턴 블롯팅 결과는 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인의 모노클로날 항체가 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인과 신데칸-2의 상호작용을 경쟁적으로 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 1B7 및 1C3은 결장암 세포에 대한 항암 능력을 보여주는 그림으로,
(A) HCT116 세포의 증식을 MTT 분석으로 평가하였다. 데이터는 평균값 ±S.D로 표시된다. 세 번의 독립적인 실험 수행되었다.
(B) 트랜스웰 이동 분석은 50nM의 항체로 처리된 HCT116 세포로 수행되었으며, 10% FBS는 하부 챔버에서 화학 유인 물질로 사용되었다. 세포(5 × 10⁵)를 젤라틴 코팅(10μg/ml) 트랜스웰 플레이트에서 24시간 동안 이동하도록 하였다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된. (n = 3); **, p < 0.01 처리군/대조군.
(C) 세포침윤 분석을 위해 세포를 Matrigel 코팅(30 μg/ml) 플레이트의 상부 구획에 로딩하고 24시간 동안 인큐베이션하고 0.6% 헤마톡실린 및 0.5% 에오신으로 고정 및 염색하였다. 이동된(침윤된) 세포를 계수했다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p < 0.05 처리군/대조군.
(D) HCT116 세포(1 x 10⁵/디쉬)를 소프트 아가 플레이트에 로딩하고 14일 동안 성장하도록 하고 생존 가능한 집락을 계수했다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p<0.05 처리군/대조군.
(E) HCT116 세포를 50nM의 표시된 항체로 24시간 동안 처리하고 항-신데칸-2 항체와 항-메탈로프로테아제-7-특이적 항체와 항온처리하고 텍사스 레드-접합 이차 항체로 염색하거나 FITC-접합된 이차 항체로 염색하였다. 사진은 공초점 현미경으로 얻었다. 스케일 바: 10μm.
(F) HCT116 세포를 1ng/ml의 인터루킨 1 알파(IL-1α)로 처리하거나 처리하지 않고 표시된 항체(50 nM) 존재 또는 부존재 하에서 형광성 Oregon Green488-접합 젤라틴 기질로 미리 코팅된 24웰 플레이트의 커버 유리에 도말했다. 48시간 인큐베이션 후 현미경 영역을 촬영하여 대표 이미지를 나타내었다. 스케일 바: 200μm. Cover Glass의 젤라틴 형광 강도의 정량적 분석은 Image J 프로그램을 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다. (n = 3); *, p < 0.05 처리군/대조군.
도 7은 1B7은 대장암 세포의 원발성 종양 성장 및 전이를 감소시키기에 충분하다는 것을 나타낸 그림으로,
(A) 항체(최종 250nM)와 함께 사전 배양된 CT26-luc 세포(5 × 10⁶ 세포/마우스)를 6주령 수컷 BALB/c 마우스(그룹당 n = 5)의 등쪽 옆구리 아래에 피하 주사했다. 주사 부위에서 생체내 종양 발달의 대표적인 이미지가 표시된다. 각 원발성 종양의 대표적인 사진이 표시된다. 주사 후 표시된 날짜의 평균 종양 부피(mm³). 데이터는 평균 ±S.D로 표시된다.
(B) BALB/c 마우스(그룹당 n = 3)는 항체(최종 250nM)와 함께 사전 배양된 CT26-luc 세포(1 x 10⁵ 세포/마우스)를 꼬리 정맥에 주사했다. 주사 후 3주에 마우스를 희생시켰고, 폐의 전이성 종양 결절을 계수하였다. 생체 내 종양 발달의 대표적인 이미지가 표시된다. 종양 중량(g)은 실험의 종점에서 평가되었다. 열은 종양 무게의 평균 ±S.D를 나타낸다.(n=3).
도 8은 메탈로프로테아제7의 pro-domain에 대한 항체(1B7 및 1C3)의 아미노산 서열을 각각 A 및 B로 표시한 그림으로, 그림에서 적색 글씨는 complementarity-determining regions(CDRs)이고, 분홍색은 가변 경쇄 절편, 연두색은 링커, 노란색은 가변 중쇄 절편이고, 기타 검은색 글씨는 constant single-chain Fv 서열임.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: 본 발명에 사용된 재료

인간, 쥐 및 마우스 신데칸-2를 인식할 수 있는 단일클론항체는 신데칸-2의 Fc 융합 세포외 도메인을 사용하여 AdipoGen Inc.(Incheon, Korea)에서 생산하였다.

인간, 쥐, 마우스 신데칸-2를 인식하는 다클론항체는 인간 신데칸-2 세포외 도메인 펩타이드를 이용하여 AbClon(Seoul, Korea)에서 제작하였다. 단클론 항-메탈로프로테아제-7은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다. 인간 재조합 메탈로프로테아제-7 전구 효소는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 돼지 피부의 Oregon Green 488-접합 젤라틴은 Invitrogen(Waltham, MA, USA)에서 구입했다.

실시예 2:세포 배양 및 형질감염

인간 결장 선암종 세포주인 HT29 및 HCT116을 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하고 10%(v/v ) 소태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT, USA) 및 gentamycin(50g/ml: Sigma-Aldrich)이 보충된 McCoy's 5A 완전 배지에서 37℃, 5% CO₂ 함유 가습 분위기에서 유지하였다. Transfection은 제조사의 지시에 따라 Viva Magic transfection 시약(Vivagen, 경기도, 한국)을 사용하여 수행하였다. HT29 세포(4 x 10⁵ cells/well)를 6웰 플레이트에 플레이팅하고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음 발현 벡터로 형질도입시켰다.

실시예 3:벡터 구축 및 안정적인 세포주의 생성

신데칸-2를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하기 위해 HT29 세포(1 x 10⁵)를 1 μg의 빈 pcDNA3.1(대조군) 또는 pcDNA3.1-FLAG-SDC2(야생형)로 형질감염시키고 이를 4주 동안 400㎍/ml G418(EMD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 포함하는 배지에서 선택했다. 살아남은 클론을 개별적으로 분리하고 FACS 및 RT-PCR로 분석했다.

실시예 4: 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 scFv의 생성

기질 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease)-7의 프로-도메인의 단일 사슬 가변 단편(svFc)은 파지 디스플레이 분석을 사용하여 제조하였다.

요약하면, 먼저 메탈로프로테아제-7의 His-Trx-프로-도메인을 친화성 컬럼으로 정제하고 TEV 프로테아제에 의해 His-Trx 태그를 절단한다. 항원/표적 단백질(Pro-domain)을 고체상에 고정화하여 패닝(panning) 과정을 진행한 후 항체 라이브러리의 파지를 고정된 표적과 함께 배양한다. 결합되지 않은 파지는 세척에 의해 세척되었다. 세척 후 특이적으로 결합된 파지만을 용출시키고, 용출된 파지를 E. coli에 감염시켜 증폭시켰다. 이 과정을 약 2회 더 반복한다.

패닝 공정은 항원 코팅을 위해 중탄산나트륨(pH 9.6)에서, 차단을 위해 3% 탈지유를 함유한 PBS-T에서 수행하였다. 감염된 세균의 각 콜로니로부터 단일클론 scFv를 생산한 후, 항원 특이적 결합제를 확인하기 위해 항원 코팅된 플레이트와 코팅되지 않은 플레이트를 사용하여 ELISA 스크리닝을 수행하였다. Epoch microplate spectrophotometer(Biotek)를 이용하여 450nm 파장에서 positive와 background signal intensity(target OD value >1.0 and background OD value <0.2)로 항원의 특이적 결합체를 동정한 후, sequencing을 통해 중복되는 서열을 제외한 단클론 항체를 최종 선별하였다.

실시예 5:재조합 단백질의 발현 및 정제

GST 융합 단백질을 발현하기 위해 글루타티온-아가로스 비드(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)로 정제했다. His-Trx 태그가 지정된 단백질을 발현하기 위해 메탈로프로테아제-7 전구효소 (proMMP-7)을 인코딩하는 pET32a⁺ 를 사용하고 융합 단백질을 Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)으로 정제했다.

요약하면, 세포 펠렛을 수확하고 용해 완충액(20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨 및 5 mM β-머캅토에탄올, pH 6.0)으로 용해하고 Ni-NTA 친화성 컬럼에 적용했다. 각 컬럼은 2회 세척(20 mM 인산나트륨 (pH 6.0), 500 mM 염화나트륨, 5 mM β머캅토에탄올, 30 mM 이미다졸)하여 목적 단백질을 용출(20 mM 인산나트륨 (pH 6.0), 500mM 염화나트륨 5 mM β-머캅토에탄올 및 500 mM 이미다졸)하였다. 친화성 컬럼을 사용하여 정제된 모든 단백질은 고순도를 위해 크기 배제 겔 크로마토그래피에 로딩되었다. GST, His 및 메탈로프로테아제-7에 대한 항체를 사용하여 Coomassie Blue 염색 및 Western blotting에 이어 SDS-PAGE로 분획을 분석했다.

메탈로프로테아제-7의 프로-도메인의 모노클로날 항체를 암호화하는 파스미드를 BL21(DE3)에 적용하였다. 모노클로날 항체는 1mM IPTG에 의해 유도되었고 30˚에서 TB 배지에서 과발현되었다. 세포 펠렛을 12시간 배양 후 수확하고 리소자임(0.1mg/ml)이 포함된 PBS에서 초음파 처리하여 용해시켰다. 세포 용해의 상층액을 Ni-NTA 컬럼에 적용하고 두 번 세척했다(50mM 이미다졸을 포함하는 1x PBS). 세척 단계 후 컬럼을 FPLC 장비에 연결한 다음 PBS에서 항체를 100mM에서 500mM 이미다졸로 점진적으로 용출시켰다. 투석 단계를 통해 이미다졸을 제거한 후 HRP가 결합된 2차 인간 Ab를 통해 모노클로날 항체를 확인하였다.

실시예 6:메탈로프로테아제 효소 활성 분석

메탈로프로테아제의 촉매 활성은 메탈로프로테아제-7에 대한 소광된 형광 기질인 7-메톡시쿠마린-4-일 아세틸-Pro-Leu-Gly-LeuN-3(2,4-디니트로페닐)-L-2,3 디아미노프로피오닐AlaArg-NH2(Bachem, Bubendorf, Switzerland)를 사용한 펩티드 절단 분석에 의해 분석되었다. 조건화된 배지(CM)를 수집하고 10K Amicon®Ultra Centrifugal Filter Units(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 사용하여 농축했다. 반응은 37°C에서 1.5시간 동안 1μM 올리고펩티드 및 50ng의 인간 재조합 메탈로프로테아제-7 전구효소(Sigma-Aldrich) 또는 50μl의 CM 존재 하에서 200μl의 메탈로프로테아제 분석 완충액(20mM Tris HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.5mM ZnCl2, 0.001% Brij35)의 최종 부피에서 수행되었다. SpectraMax®i3 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 328 nm의 여기 파장과 395 nm의 방출 파장에서 형광을 측정했다.

실시예 7:세포 부착 모니터링

xCELLigence 시스템(Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland)을 사용하여 세포 부착을 실시간으로 모니터링했다. E16 xCelligence plate(ACEA Biosciences, Santa Clara, CA, USA)의 바닥을 젤라틴과 메탈로프로테아제-7 프로-도메인의 혼합물로 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, 무혈청 배지(50㎕/웰)로 로딩하고, 37℃에서 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 배경은 RTCA DP Analyzer(RTCA 소프트웨어 버전 1.2, ACEA Biosciences)를 사용하여 측정되었다. HT29-SDC2 세포(2 × 10⁴ 세포/웰)를 신데칸-2 모방 펩티드(50nM)와 함께 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 15분 동안 5% CO₂에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 15분 후 플레이트를 RTCA DP Analyzer에 조립하고 5% CO₂, 37°C에서 1시간 동안 2분 간격으로 세포 접착을 평가했다. 얻은 데이터는 제공된 RTCA 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.

실시예 8:면역형광 분석

세포를 12웰 플레이트의 유리 커버슬립에 로딩하여 48시간 동안 배양하고(HCT116 2 x 10⁵ 세포/웰), 실온에서 10분 동안 PBS 중 3.5% 파라포름알데히드로 고정했다. 세포를 PBS로 3회 헹구고, PBS 중 0.5% 소혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단하고, 세척하고, 4℃에서 밤새 적절한 1차 항체로 염색하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 FITC 결합 마우스 항체(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 텍사스 레드 결합 토끼 항체(Thermo Fisher Scientific)으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 커버슬립을 PBS로 세척하고 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)가 포함된 장착 용액으로 유리 슬라이드에 장착하고, 결과를 공초점 형광 현미경(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 이미지화했다.

실시예 9:면역블로팅

HT29-SDC2 세포 유래 CM(대략 85% confluency)은 TCA 침전에 의해 농축되고, SDS-PAGE 샘플 완충액으로 변성되고, SDS-PAGE에 적용된다. 단백질을 0.45μm 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)으로 옮기고 적절한 항체로 프로브하였다. 신호는 Odyssey CLx 이미저(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 감지되었고 데이터는 Image Studio Lite 소프트웨어(LI-COR Biosciences)로 분석되었다.

실시예 10:세포 증식 분석

세포 증식은 제조사의 지침에 따라 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 사용한 비색 분석으로 측정되었다.

요약하면, 세포를 0.05% 트립신/EDTA로 수확하고 48웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific)에 로딩했다. 세포를 24시간 동안 플레이트에 부착시킨 후, 항체를 24시간 동안 처리한 후 0.5 mg/ml MTT를 함유하는 배지를 각 플레이트에 첨가하고 인큐베이션을 1시간 동안 계속하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 100㎕의 산성 이소프로판올(90% 이소프로판올, 0.5% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 25mM NaCl)을 각 웰에 첨가하였다. 각 샘플 세트에서 570 nm에서의 평균 흡광도 농도는 96-well microtiter plate reader(Dynatech, Chantilly, VA, USA)를 사용하여 측정되었다.

실시예 11:세포주기 분석

세포를 6웰 플레이트(HT29, 3×10⁵개 세포/웰; HCT116, 2×10⁵개 세포/웰)에 로딩하고 48시간 동안 인큐베이션했다. 항체를 24시간 동안 처리했다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 4℃에서 PBS에 녹인 차가운 70% 에탄올 5ml로 고정하였다. 에탄올을 버리고 세포를 차가운 PBS로 세척하고 0.1 mg/ml의 propidium iodide 및 0.6% Triton-X 100 in PBS with RNase와 함께 25℃에서 45분간 배양하였다. 세포 주기 매개변수는 유세포 분석에 의해 분석되었다.

실시예 12:침윤 및 이동 분석

이동 분석을 위해 젤라틴(10μg/ml)을 Transwell 플레이트(8-μm 기공 크기; Costar, Corning, NY, USA)의 각 웰에 첨가하고 막을 25°C에서 1시간 동안 건조시켰다. Transwell plate를 24-well plate로 조립하고 하부 챔버를 10% FBS, 1% BSA 및 염기성 섬유아세포 성장인자(10μg/ml)를 포함하는 McCoy's 5A 배지로 채웠다. 세포(HT29, 1×10⁶ cells/well; HCT116, 5× 10⁵ cells/well)를 각 상부 챔버에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C로 인큐베이션하였다. 필터의 하부 표면으로 이동한 세포를 헤마톡실린과 0.5% 에오신으로 염색하고 계수하였다. 시험관 내 침윤 분석을 위해 Transwell plate는 막의 아래쪽에 젤라틴(10μg/ml)으로, 막의 위쪽에 Matrigel(3mg/ml)로 코팅되었다.

실시예 13:소프트 아가로즈의 앵커리지 독립적 성장

6-웰 배양 플레이트의 각 웰을 바닥 한천 혼합물(10% FBS 및 0.6% 한천을 함유하는 McCoy's 5A) 3 ml로 코팅하였다. 바닥층이 응고된 후, 세포(HT29, 2×10⁵ 세포/웰; HCT116, 1× 10⁵ 세포/웰)를 함유하는 상부 한천 혼합물(10% FBS 및 0.3% 한천을 함유하는 McCoy's 5A) 1ml를 각 웰에 첨가하였다. 배양물은 5% CO₂ 분위기에서 37°C에서 배양되었다. 집락 형성을 광학 현미경으로 매일 모니터링했다. 14일 후, 콜로니를 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 디지털 카메라로 사진을 찍었다.

실시예 14:젤라틴 분해 분석

돼지 피부(Invitrogen) 유래 Oregon Green 488-접합 젤라틴을 2% 자당에 1mg/ml로 용해했다. 12웰 플레이트의 커버슬립은 1 ml PBS에 희석된 40 μl의 0.5% 글루타르알데히드의 존재하에 4°C에서 20분 동안 0.2 mg/ml Oregon Green 488-접합 젤라틴으로 코팅되었다. 커버슬립을 실온에서 PBS로 3회 세척하고 실온에서 5 mg/ml NaBH4(PBS에 용해됨)와 함께 3분 동안 인큐베이션했다. 커버슬립을 위와 같이 세척하고 70% 에탄올에서 1분간 멸균한 후 건조시켰다. McCoy's 5A 배지에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 1ng/ml의 IL-1α 및 50nM의 신데칸-2 펩타이드가 있거나 없는 2 × 10⁵ HCT116 세포를 24웰 플레이트(Costar, Corning , NY, USA) 및 5% CO₂ 분위기에서 37℃에서 20-72시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 처리된 24웰 플레이트에 50nM의 신데칸-2 펩티드를 첨가하였다. 세포를 3.5% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 세척하고, 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착하고 형광 현미경으로 이미지화하였다.

실시예 15:마우스 모델

피하 모델의 경우, 합성된 항체(최종 250nM)와 함께 37°C에서 100㎕ PBS로 배양된 CT26-luc 세포(5 × 10⁶ 세포/마우스)를 6주령 수컷 BALB/c 마우스 등쪽 옆구리 아래에 피하 주사했다(n = 그룹당 5).

이미징을 위해 마우스에 150 mg/kg D-luciferin을 복강 내 주사하고 1% isoflurane으로 마취했다. D-루시페린 주입 후 10-20분에, 마우스를 IVIS 이미징 시스템(IVIS SPECTRUM; Caliper Life Sciences, Waltham, MA, USA)에 넣고 등쪽을 이미지화했다. 종양 성장은 IVIS 이미징 시스템에 의해 매주 모니터링되었고 외부 캘리퍼스 측정이 21일 동안 수행되었다(L × W × D).

생체 내 실험적 폐 전이 분석을 위해 200μl의 PBS에서 30분 동안 37°C에서 항체(최종 250nM)와 함께 배양된 CT26-luc 세포(1 x 10⁵ 세포/마우스)를 6주령 수컷 BALB/c 마우스(n = 그룹당 3마리, Orient Bio Co., Seoul, Korea) 꼬리 정맥을 통해 주입했다. 전이성 폐 종양의 성장은 IVIS 이미징 시스템에 의해 매주 모니터링되었다. 19일에 마우스를 희생시키고, 폐를 절제하고, 절제한 조직의 무게를 측정하였다.

본 발명의 통계 분석에서 모든 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 그룹 간의 차이는 Student's t-test를 사용하여 테스트되었으며 *, p < 0.05 또는 **, p < 0.01에서 유의미한 것으로 간주되었다.

상기 실시예의 결과를 하기에서 기술한다.

메탈로프로테아제-7 프로-도메인 항체의 단일 사슬 가변 단편의 생성 및 특성화

메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 특이적으로 인식하는 항-프로-도메인 항체를 찾기 위해 M13 bacteriophage display screening을 이용하여 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 항원으로 적용하였다. M13 파지미드에 대해 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 암호화하는 cDNA 라이브러리를 구축했다(도 1).

메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 대한 파지 디스플레이 scFv 라이브러리의 패닝 3회를 수행했다. 항원을 고체상에서 고정화하고 인간 항체 라이브러리로부터의 파지를 고정된 항원과 함께 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 파지를 세척한 후 고정된 항원에서 고친화도 파지가 용출된다. 용출된 파지를 대장균 숙주 세포와 함께 인큐베이션하여 항원에 대한 친화성을 갖는 항체를 표시하는 파지 하위집단의 감염 및 증폭을 허용하였다.

패닝(panning) 과정 후, 항원-코팅된 플레이트 및 코팅되지 않은 플레이트를 사용한 ELISA 스크리닝에 의해 항원-특이적 결합제를 선택하였다(도 2A). 플레이트에 비특이적으로 결합하는 항체(background OD 값 >0.2)를 제외시킨 후 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 특이적인 결합 신호를 나타내는 14개 항체(OD 값 >1.0)를 선택한 다음 중복 시퀀스를 제외하고 시퀀싱을 통해 최종적으로 5개의 단일클론 항체(1B7, 1C3, 1D4, 1D9 및 1B2)를 선택했다(도 2A).

메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 대한 이들 scFv의 결합을 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 GST-tagged-메탈로프로테아제-7의 결실 돌연변이체(예: 프로-도메인의 돌연변이체, 촉매 도메인 및 추가의 프로-도메인 단편 돌연변이체)를 생성하였고(도 2B). 각 메탈로프로테아제-7의 결실 돌연변이체들과 어떻게 인식하는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 1B7, 1C3, 1D4, 및 1D9을 포함하는 scFv 항체는 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 인식하였지만, 1B2는 메탈로프로테아제-7의 촉매 도메인을 인식하였다.

신데칸-2(HT29-SDC2)를 안정적으로 발현하는 인간 HT29 결장 선암종 세포는 메탈로프로테아제-7 mRNA의 상향 조절을 나타내었고 이들의 조절 배지는 증가된 메탈로프로테아제-7 효소 활성을 나타냈다. 따라서 본 발명자들은 이러한 항체가 진핵 세포에서 발현되는 메탈로프로테아제-7 전구 효소를 인식할 수 있는지 여부를 조사했다. 예상대로 1B7, 1C3, 1D4 항체는 HT29-SDC2 세포의 조건 배지에서 메탈로프로테아제-7 전구 효소를 인식했으며(도 2C), 이는 1B7, 1C3 및 1D4 항체가 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 인식했음을 나타낸다.

신데칸-2와 메탈로프로테아제-7의 상호작용이 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인을 구성하는 α2-나선-루프-α3 나선을 통해 매개된다는 것을 보여주었으므로, 본 발명자들은 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 대한 scFv 항체의 결합 부위를 추가로 분석한다(도 2D). 흥미롭게도 1B7, 1C3, 1D4 및 1B2 항체에서 α1 나선(α1) 및 α1-나선-루프-α2 나선 단백질 단편(α12)이 모두 검출되었다. 한편, 1D9 항체는 α1 나선 (α3)와 α2 나선-루프-α3 나선 단백질 단편(α23)을 인식하였다. 이러한 모든 데이터는 생성된 scFv 항체가 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 결합할 수 있음을 시사한다.

기질 메탈로프로테이나제-7 항체의 항-프로-도메인은 결장암 세포에 대한 항종양 활성을 나타냄.

신데칸-2와 메탈로프로테아제-7 전구 효소의 상호작용은 신데칸-2가 암 활성을 조절하는 능력에 중요하기 때문에, 이러한 항체가 HT29-SDC2 세포의 암 활성을 억제할 수 있는지 여부를 조사했다(도 3). 두 항체 모두 50nM에서 최대 24시간 동안 적용될 때 HT29 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않았거나(도 3A) 증식에 영향을 미치지 않았다(도 3B). 그러나 테스트한 5개의 항체 중에서 1B7과 1C3은 모두 신데칸-2 매개 이동 유도(도 3C), Matrigel을 통한 침윤(도 3D), 소프트 아가에서 콜로니 형성을 유의하게 감소시켰다(도 3E).

1B7과 1C3의 항암 활성을 더 확인하기 위해 HT29-SDC2 세포에 항체 농도를 다르게 하여 처리하였다(도 4). 예상대로 두 항체 모두 HT29-SDC2 세포의 이동(도 4A), 침윤(도 4B) 및 집락 형성 활성(도 4C)에 대해 용량 의존적으로 억제 효과를 나타냈다. 이러한 데이터는 1B7과 1C3이 모두 결장암 세포에서 항암 활성을 가지고 있음을 시사한다.

1B7 및 1C3는 결장암 세포에 대한 항암 능력을 보여줌.

다음 풀다운 분석을 수행하여 두 항체가 모두 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그가 지정된 메탈로프로테아제-7 전구효소(GST-proMMP7, 55KDa)을 사용하여 메탈로프로테아제-7 전구효소에 특이적으로 결합했음을 확인했다. 1B7 또는 1C3은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그된 메탈로프로테아제-7 전구효소와 함께 배양되었고, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그된 메탈로프로테아제-7 전구효소는 글루타티온-아가로스 비드에 고정되었다. 본 발명자들은 His 태그가 붙은 1B7 및 1C3 두항체가 글루타티온 비드에 고정된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그된 메탈로프로테아제-7 전구효소에 의해 함께 정제될수 있음을 발견함으로써 두 항체와 메탈로프로테아제-7 프로-도메인간의 특이적 상호작용을 검증하였다(도 5B). 두 항체가 메탈로프로테아제-7 전구효소와 신데칸-2의 상호 작용을 억제할 수 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 정제된 GST-proMMP7을 다양한 양의 scFv pro-domain 항체 존재 하에 정제된 flag-tagged 신데칸-2(Flag-SDC2)를 인큐베이션했다(도 5C). 예상한 대로 항체가 없는 경우 Flag-tagged 신데칸-2와 GST-tagged 메탈로프로테아제-7 전구효소의 상호 작용을 감지할 수 있었지만 1B7과 1C3 모두 용량 의존적으로 이러한 상호 작용을 억제하여(도 5C), 1B7과 1C3 항체 모두 메탈로프로테아제-7 전구효소와 신데칸-2의 상호작용을 경쟁적으로 감소시킨다는 것을 시사한다.

1B7 및 1C3는 결장암 세포에 대한 항암 능력을 보여줌.

1B7 및 1C3의 항암 활성을 더 확인하기 위해 HT29 세포보다 더 침습적인 HCT116 인간 결장암 세포에 각 항체를 50nM 처리하고 다양한 암 활성의 변화를 모니터링했다(도 6). 예상대로 두 항체 모두 세포 독성을 나타내지 않았다(도 6A). 그러나 1B7 또는 1C3으로 HCT116 세포를 처리하면 이동(도 6B), Matrigel을 통한 침윤(도 6C) 및 소프트 아가 콜로니 형성(그림 6D)이 감소했다. 두 항체 모두 항암 활성을 나타내었지만 1B7이 1C3보다 우수한 억제 활성을 보였다(도 6).

두 항체 모두 세포 표면에서 신데칸-2와 상호 작용하는 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 결합하기 때문에 이러한 항체가 메탈로프로테아제-7의 세포 표면 국소화를 경쟁적으로 감소시키는지 여부를 추가로 조사했다. 예상대로, 1B7 및 1C3은 메탈로프로테아제-7의 세포 표면 수준을 감소시켰고 HCT116 세포 표면에서 메탈로프로테아제-7과 신데칸-2의 공동 국소화를 감소시켰다(도 6E).

신데칸-2와의 상호작용은 메탈로프로테아제-7 전구효소의 활성 형태로의 처리를 유도하기 때문에, 항체와의 이러한 상호작용을 방해하면 메탈로프로테아제-7 활성이 감소할 것으로 예상된다. 따라서 본 발명자들은 HCT116 세포의 메탈로프로테아제-7 매개 ECM 분해에 대한 1B7 및 1C3의 영향을 추가로 조사했다(도 6F).

HCT116 세포를 형광 표지된 젤라틴(메탈로프로테아제-7의 잘 알려진 기질)으로 코팅된 플레이트에 접종하고 형광 현미경으로 젤라틴 분해를 모니터링했다. 미처리 HCT116 세포에 의한 형광 표지 젤라틴의 현저한 분해는 관찰되지 않았지만, 메탈로프로테아제-7 발현을 유도하는 인터루킨 1α(IL-1α)로 전처리된 HCT116 세포는 젤라틴 분해를 촉진한다는 것을 발견하였다. 이 분해는 1B7의 적용에 의해 상당히 감소되었지만 1C3은 그렇지 않았다(도 6F). 이러한 데이터는 1B7이 메탈로프로테아제-7 활성화를 억제할 수 있고 따라서 HCT116 세포의 세포 표면에서 메탈로프로테아제-7 활성을 억제할 수 있음을 시사한다. 이러한 데이터를 종합하면 1B7이 신데칸-2와의 상호작용을 방해함으로써 결장암 세포에 대한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 시사한다.

1B7는 대장암 세포의 원발성 종양 성장 및 전이를 감소시키기에 충분함.

생체 내 1B7 및 1C3의 항암 활성을 조사하기 위해 이종이식 마우스 모델을 사용했다(도 7). 결장암 세포의 원발성 종양 성장에 대한 항체의 효과를 평가하기 위해 루시페라제 발현 마우스 결장암 세포(CT26-luc)를 6주령 수컷 BALB/c 누드 마우스에 피하 주사하고 종양 성장을 모니터링했다. 각 항체의 부재 또는 존재 하에 주사 후 최대 22일 동안(도 7A). 1B7 처리된 마우스는 1C3 처리된 마우스보다 더 느린 종양 성장을 나타냈다(도 7A). 전이 모델에서 1B7 및 1C3의 효과를 추가로 평가하기 위해 항체가 사전 배양된 CT26-luc 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 도입했다. 폐 샘플의 분석은 1C3이 아닌 1B7이 CT-6 세포의 폐 전이를 유의하게 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 7B). 이러한 생체 내 결과는 1B7이 암 억제 효과가 있음을 시사한다.

<110> PCG-Biotech, Ltd. <120> Monoclonal antibody specifically binding to the pro-domain of matrix metalloprotease-7 and use thereof <130> P22-0007HS <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 1 Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 2 Arg Asn Asn Gln 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 3 Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Arg Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 4 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 5 Ile Ile Ser His Asp Gly Asn His Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 6 Arg Glu Arg His Leu Gly Thr Gly Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 7 Ala Gln Ala Ala Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly 1 5 10 15 Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile 65 70 75 80 Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp 85 90 95 Asp Asp Ser Leu Arg Gly Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly 115 <210> 8 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 8 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 1 5 10 15 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe 20 25 30 Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser His Asp Gly Asn His Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn 65 70 75 80 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg His Leu Gly Thr Gly Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro 115 120 125 Lys Val Thr Ser 130 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 9 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 10 Arg Asn Asn Gln 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 11 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 12 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 13 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 14 Arg Pro His Tyr Asp Ser Thr Gly Ser Met Asn Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 15 Ala Gln Ala Ala Glu Leu Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly 1 5 10 15 Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Thr Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile 65 70 75 80 Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp 85 90 95 Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Ala Lys Val Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly 115 <210> 16 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 16 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Asn Lys 1 5 10 15 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 20 25 30 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala 50 55 60 His Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro His Tyr Asp Ser Thr Gly Ser Met Asn Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Lys 115 120 125 Ala Ala Asp Val Thr Ser 130

Claims (5)

1. 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
   상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
   (a)서열번호 1 또는 서열번호 9의 아미노산 서열의 CDRL1, 서열번호 2 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 CDRL2, 및 서열번호 3 또는 서열번호 11의 아미노산 서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR); 및
   (b)서열번호 4 또는 서열번호 12의 아미노산 서열의 CDRH1, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 아미노산 서열의 CDRH2, 및 서열번호 6 또는 서열번호 14의 CDRH3를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR);을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위, 및 서열번호 8 및 서열번호16으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 대장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 암에 대한 항암 활성을 가지는 암 예방 또는 치료용 조성물.