CN117964771A - 一种特异性结合mmp7的抗体及其应用 - Google Patents
一种特异性结合mmp7的抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117964771A CN117964771A CN202410391351.3A CN202410391351A CN117964771A CN 117964771 A CN117964771 A CN 117964771A CN 202410391351 A CN202410391351 A CN 202410391351A CN 117964771 A CN117964771 A CN 117964771A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- amino acid
- acid sequence
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 58
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 101100130647 Rattus norvegicus Mmp7 gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 120
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 17
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 12
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 11
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 claims description 6
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 claims description 6
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 6
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 206010010317 Congenital absence of bile ducts Diseases 0.000 claims description 3
- 206010023129 Jaundice cholestatic Diseases 0.000 claims description 3
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005267 Obstructive Jaundice Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005271 biliary atresia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 claims description 3
- XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N (3S)-3-amino-4-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-1-[[(1R,6R,12R,17R,20S,23S,26R,31R,34R,39R,42S,45S,48S,51S,59S)-51-(4-aminobutyl)-31-[[(2S)-6-amino-1-[[(1S,2R)-1-carboxy-2-hydroxypropyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]carbamoyl]-20-benzyl-23-[(2S)-butan-2-yl]-45-(3-carbamimidamidopropyl)-48-(hydroxymethyl)-42-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-59-(2-methylsulfanylethyl)-7,10,19,22,25,33,40,43,46,49,52,54,57,60,63,64-hexadecaoxo-3,4,14,15,28,29,36,37-octathia-8,11,18,21,24,32,41,44,47,50,53,55,58,61,62,65-hexadecazatetracyclo[32.19.8.26,17.212,39]pentahexacontan-26-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@@H]4CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc5ccccc5)NC(=O)[C@@H](NC1=O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC3=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2)C(=O)NCC(=O)N4)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N 0.000 claims description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 claims description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008635 Cholestasis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 claims description 2
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 claims description 2
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108091007581 Heme transporters Proteins 0.000 claims description 2
- 101001050473 Homo sapiens Intelectin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100023353 Intelectin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 206010023421 Kidney fibrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102100021867 Natural resistance-associated macrophage protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 2
- 102100024267 Proton-coupled folate transporter Human genes 0.000 claims description 2
- 108091006618 SLC11A2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091006976 SLC40A1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091007566 SLC46A1 Proteins 0.000 claims description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003167 cholangitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000359 cholestasis Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000007870 cholestasis Effects 0.000 claims description 2
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 claims description 2
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000024557 hepatobiliary disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102000018511 hepcidin Human genes 0.000 claims description 2
- 108060003558 hepcidin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940066919 hepcidin Drugs 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007450 intrahepatic cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108010071397 lactoferrin receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004840 megacolon Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 2
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 2
- 108091006975 Iron transporters Proteins 0.000 claims 1
- 206010064911 Pulmonary arterial hypertension Diseases 0.000 claims 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 description 9
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000218691 Cupressaceae Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 101001011896 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-19 Proteins 0.000 description 2
- 101000795167 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 102100030218 Matrix metalloproteinase-19 Human genes 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 2
- 102000052074 human MMP7 Human genes 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutyl]-(4-methylphenyl)sulfonylcarbamoyl]acridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(=O)C=1C2=CC=CC=C2[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C2C=CC=CC2=1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 208000010061 Autosomal Dominant Polycystic Kidney Diseases 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000577887 Homo sapiens Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000577881 Homo sapiens Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 description 1
- 101001011906 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-14 Proteins 0.000 description 1
- 101001011884 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-15 Proteins 0.000 description 1
- 101001011886 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-16 Proteins 0.000 description 1
- 101001011887 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-17 Proteins 0.000 description 1
- 101001013139 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-20 Proteins 0.000 description 1
- 101000627851 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-23 Proteins 0.000 description 1
- 101000627852 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-25 Proteins 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000990908 Homo sapiens Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000577874 Homo sapiens Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 1
- 101000801255 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Proteins 0.000 description 1
- 201000003838 Idiopathic interstitial pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091006671 Ion Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000037862 Ion Transporter Human genes 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 description 1
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030216 Matrix metalloproteinase-14 Human genes 0.000 description 1
- 102100030201 Matrix metalloproteinase-15 Human genes 0.000 description 1
- 102100030200 Matrix metalloproteinase-16 Human genes 0.000 description 1
- 102100030219 Matrix metalloproteinase-17 Human genes 0.000 description 1
- 102100024130 Matrix metalloproteinase-23 Human genes 0.000 description 1
- 102100024131 Matrix metalloproteinase-25 Human genes 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004697 Polyetherimide Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000034841 Thrombotic Microangiopathies Diseases 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100029675 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 208000022185 autosomal dominant polycystic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000005206 focal segmental glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000854 focal segmental glomerulosclerosis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002206 pro-fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000028466 reproductive system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000029584 urinary system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明的目的是提供一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段、其融合蛋白、前体肽、包含其的检测试剂和药物组合物、以及它们的应用,所述抗体或其抗原片段能够高灵敏度地对样品中的MMP7含量进行准确检测并用于对MMP7相关疾病进行诊断、预防或治疗。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,更具体地,涉及一种特异性识别并结合MMP7的分离的抗体、其融合蛋白、前体肽及其应用。
背景技术
基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase,MMP7),也被称为基质蛋白7,是锌离子依赖性的肽链内切酶,其酶切活力调控主要是通过酶原的激活与内源性抑制剂的抑制作用,是一种可以降解细胞外基质和许多非基质蛋白的蛋白酶。MMP7对细胞外基质成分(IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、明胶和骨桥蛋白)具有广泛的底物亲和力。
研究表明,MMP7与人类纤维化疾病的进展有关。MMP7在肺上皮细胞、单核吞噬细胞和纤维细胞中表达。通过对人纤维化肺的基因表达分析,发现MMP7作为促纤维化介质在肺纤维化发展中的作用。特发性肺纤维化(IPF)患者血清中MMP7的产生上调113%,事实上,MMP7已被验证为特发性肺纤维化的血清生物标志物。MMP7在健康的成熟肾脏中几乎不表达,但在迄今为止研究的几乎所有肾脏疾病中都上调,它是肾脏疾病中表征最好的MMP之一。在ADPKD、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、IgA肾病、血栓性微血管病和局灶节段性肾小球硬化等的人肾病中已检测到肾脏MMP7过表达。而且MMP7与肝脏炎症、纤维化分级均显著相关,作为中介效应分子介导了炎症导致肝纤维化快速进展的过程,即炎症反应导致MMP7大量分泌,肝内大量堆积的MMP7进而导致了肝纤维化的快速进展。
此外,MMP7在人多系统肿瘤中特异性表达,如消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤和生殖系统肿瘤。MMP7在多种癌肿瘤细胞中大量表达,在癌前细胞和癌前病变中过表达。MMP7通过抑制癌细胞凋亡、减少细胞粘附和诱导血管生成来促进肿瘤进展。因此,MMP7可以作为一种致癌蛋白,调节各种肿瘤的发生和发展。
鉴于MMP7在多种疾病的发生和发展中的相关性,临床上进行MMP7的检测以及采用MMP7的抗体进行疾病的治疗都非常有意义。因此,设计出能够靶向结合MMP7且亲和度高、稳定性好、特异性强的抗体分子,有助于更有效检测血液及组织中MMP7的表达水平,也有助于精准对MMP7高表达病灶进行成像或给药,对肾病、肿瘤疾病、纤维化疾病等多种疾病的诊断、治疗及科学研究具有重大意义。
发明内容
发明人通过杂交瘤技术结合高通量表达的平台,筛选出了靶向MMP7的抗体。所述抗体具有亲和力高、稳定性高、特异性强等优势,由此完成了本发明。此外,还进一步提供了制备所述抗体的方法,以及基于上述抗体的检测试剂和药物组合物,从而能够以高灵敏度实现对样本中的MMP7含量的准确检测和对疾病的治疗。
在一个方面,本申请提供了一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段,包括:
(1)HCDR1,其包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(2)HCDR2,其包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和
(3)HCDR3,其包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,所述特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段进一步包括:
(1)LCDR1,其包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(2)LCDR2,其包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和
(3)LCDR3,其包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一个方面,本发明提供了一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段,包括:
(a)HCDR1,其包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(b)HCDR2,其包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(c)HCDR3,其包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(d)LCDR1,其包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(e)LCDR2,其包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(f)LCDR3,其包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一项所示的氨基酸序列,与所述氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,所述特异性结合MMP7的抗体或其抗原结合片段包括:
(a)如SEQ ID NO:1所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR1,如SEQ ID NO:2所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR2,如SEQ ID NO:3所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR3,如SEQ ID NO:13所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR1,如SEQ ID NO:14所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR2,如SEQ ID NO:15所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR3;
(b)如SEQ ID NO:4所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR4,如SEQ ID NO:5所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR2,如SEQ ID NO:6所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR3,如SEQ ID NO:16所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR1,如SEQ ID NO:17所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR2,如SEQ ID NO:18所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR3;
(c)如SEQ ID NO:7所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR1,如SEQ ID NO:8所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR2,如SEQ ID NO:9所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR3,如SEQ ID NO:19所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR1,如SEQ ID NO:20所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR2,如SEQ ID NO:21所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR3;或者
(d)如SEQ ID NO:10所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR1,如SEQ IDNO:11所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR2,如SEQ ID NO:12所示的或与其具有至少80%序列同一性的HCDR3,如SEQ ID NO:22所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR1,如SEQ ID NO:23所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR2,如SEQ ID NO:24所示的或与其具有至少80%序列同一性的LCDR3。
在一些实施方案中,本发明提供了一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段,包括:
重链可变区,其包含SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和/或
轻链可变区,其包含SEQ ID NOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与SEQ ID NOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,本发明提供了一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段,包括:
(1)具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区;
(2)具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区;
(3)具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区;或者
(4)具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,与SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比,具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸均位于FR区。在一些实施方案中,与SEQID NO s:29-32所示的氨基酸序列相比,具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸均位于FR区。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还包含Fc区,例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区或其变体,包括来自鼠IgG、人IgG、猴IgG的Fc区或其变体。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区或其组合。在一些实施方案中,所述重链恒定区为IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)重链恒定区或其变体(例如现有技术已知的LALA突变、AAA突变、DLE突变、YTE突变和LS突变),例如鼠IgG、人IgG或猴IgG重链恒定区或其变体。在一些实施方案中,所述轻链恒定区是κ或λ链恒定区或其变体。在一些实施方案中,所述重链恒定区具有如SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列,和/或所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段包括:
重链,其包含SEQ ID NOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与SEQ IDNOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;以及
轻链,其包含SEQ ID NOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,或与SEQ IDNOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个或以上)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,所述特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段包括:
(1)具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链;
(2)具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链;
(3)具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链;或者
(4)具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,与SEQ ID NOs:33-40中任一项所示的氨基酸序列相比,具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸位于FR区、重链恒定区、轻链恒定区或其组合。
在一些实施方案中,所述抗原结合片段选自:Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)、单链抗体、双链抗体(diabody)、单域抗体、微抗体(minibody)。
在一些实施方案中,本发明提供的抗体为单克隆抗体,优选为鼠IgG1/Kappa同种型、或鼠IgG2a/Kappa或鼠IgG2b/Kappa同种型。
在一些实施方案中,本发明提供的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中,本发明提供的抗体是单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体或三特异性抗体)。
本发明提供的抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在本文中,所述保守氨基酸突变是指蛋白质中保守氨基酸位点处的突变,且突变不会影响或基本上不会影响该蛋白质的性质或功能。在一些实施方案中,所述保守氨基酸突变是保守氨基酸置换,即,采用同类(具有类似的化学性质或者功能)的另一种氨基酸进行取代。作为同类氨基酸的示例,可根据氨基酸的侧链性质将其分为:(1)非极性氨基酸:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不带电荷的极性氨基酸:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性氨基酸:Asp(D)、Glu(E);(4)碱性氨基酸:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者,可基于共同的侧链特性将同类氨基酸分为:(1)疏水氨基酸:Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水氨基酸:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性氨基酸:Asp、Glu;(4)碱性氨基酸:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的氨基酸:Gly、Pro;(6)芳香族氨基酸:Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中,本发明的上述的抗体或其抗原结合片段及其变体均能够特异性地识别并结合MMP7。
在一些实施方案中,本申请所述的分离的抗体或其抗原结合片段表现出如下的生物学活性:
(1)所述分离的抗体或其抗原结合片段与除MMP7以外的其他的基质金属蛋白酶(例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP18、MMP19、MMP20、MMP22等)基本上不结合或者弱结合;
(2)所述分离的抗体或其抗原结合片段与MMP7结合的KD值<10-9 M,优选地KD值<10-10 M。
在一个方面,本发明提供了一种融合蛋白,其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,所述融合蛋白可为嵌合抗原受体(其中包含所述抗体或其抗原结合片段作为胞外结构域)、抗体可变区-Fc融合蛋白、抗体-Fc融合蛋白、多特异性抗体等。
在一个方面,本发明提供了一种前体肽,其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段或者由其生成(例如通过各种修饰、或者代谢等)如上所述的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面,本发明进一步提供了一种分离的核酸分子,其包含编码所述的抗体或其抗原结合片段、或融合蛋白、或前体肽的核苷酸序列。优选地,所述核苷酸分子包含编码如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10中任一项所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中任一项所示的HCDR2、如SEQID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中任一项所示的HCDR3、如SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22中任一项所示的LCDR1、如SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23中任一项所示的LCDR2、以及如SEQID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一项所示的LCDR3的核苷酸序列;更优选地,所述核苷酸分子包含编码选自SEQ ID NOs: 25-32中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列,或由其组成。
在一个方面,本发明进一步提供了一种重组表达载体,所述表达载体包含上述的分离的核酸分子。
在一个方面,本发明进一步提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的核酸分子或上述的重组表达载体。优选地,所述宿主细胞为真核细胞,更优选为哺乳动物细胞,例如CHO细胞、CHO-S细胞、293细胞、猴肾细胞。
在一个方面,本发明提供一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在使得所述的抗体、其抗原结合片段表达的条件下,培养本申请所述的宿主细胞。例如,可通过使用本领域已知的任意适当的常规培养基、适当的温度和培养时间等,可由本领域技术人员根据宿主细胞的具体类型常规确定。
在某些情形中,所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如,可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析、还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如,还可以使用蛋白A亲和纯化。
例如,在一些实施方案中,本发明可通过如下方法获得抗体轻、重链可变区序列:提取杂交瘤克隆株总RNA,以此为模板合成第一链cDNA后,以第一链cDNA为模板进行后续PCR扩增,获得杂交瘤细胞所对应的抗体轻、重链可变区的核酸,进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收TA克隆后,进行Sanger测序获得抗体可变区序列。
在一个方面,本发明提供了一种检测试剂,包括如上所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,所述检测试剂还包括一种或多种酶联免疫检测试剂组分,例如阳性对照液、样品稀释液、阴性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、显色试剂、洗涤液、封闭液、和/或终止液。
在一些实施方案中,所述检测试剂还包括一种或多种化学发光免疫检测组分,例如磁性微球溶液(例如链霉亲和素偶联的磁珠)、生物素化抗体溶液(例如生物素化多克隆MMP7抗体)、发光标记物(例如吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体);和/或MMP7校准品、MMP7质控品。
在一些实施方案中,所述检测试剂进一步包含其他一个或多个胆道闭锁(特别是新生儿胆道闭锁)诊断指标(直接或间接诊断指标)的检测剂,例如铁离子、和/或其他铁相关因子(包括铁离子转运蛋白SLC11A2、铁离子转运蛋白SLC40A1、血红素转运蛋白SLC46A1、乳铁蛋白受体ITLN1、和/或铁调素)、游离胆红素、胆绿素、和/或γ-谷氨酰转移酶。
BAFF(B细胞活化因子)是众多的B细胞激活剂之一,是受体TNFRSF13B/TACI、TNFRSF17/BCMA和TNFRSF13C/BAFFR的配体。在一些实施方案中,所述检测试剂进一步包含BAFF抗体和/或其他针对BAFF的检测试剂,从而可用于对SLE(系统性红斑狼疮)、卵巢癌、BA(胆道闭锁)、肝脏纤维化、特发性间质性肺炎进行联合诊断。
在一个方面,本发明提供了一种检测样品中MMP7含量的方法,包括:将所述样品与如上所述的抗体或其抗原结合片段、检测试剂、或融合蛋白、或前体肽混合;孵育,然后检测发光值或者吸光度。
在一个方面,本发明提供了如上所述的抗体或其抗原结合片段、检测试剂、或融合蛋白或前体肽在制备用于检测样品中MMP7含量的试剂或产品、用于对MMP7相关疾病进行诊断的试剂或产品、或者用于对MMP7相关疾病进行预防和/或治疗的药物中的用途。
在一个方面,本发明提供了一种药物组合物,包含如上所述的抗体或其抗原结合片段或融合蛋白或前体肽、以及药学上可接受的载体。
在本文中,MMP7相关疾病是指与健康人类相比,使患者在发病和疾病发展过程中表现出异常的MMP7表达量的疾病或病症。在一些实施方案中,所述MMP7相关疾病可为炎性疾病(例如慢性炎症)、自身免疫性疾病、癌症、纤维化疾病、心血管疾病、神经病症、眼部疾病、肺部疾病、肝胆疾病、肾病,但不限于此。
在一些实施方案中,所述MMP7相关疾病可选自胆道闭锁及胆道闭锁引起的肝纤维化、黄疸(例如梗阻性黄疸)、胆管炎、胆汁淤积、肝纤维化、肾纤维化、慢性肾病、肝内胆管细胞癌、坏死性小肠结肠炎(NEC)或败血症、卵巢癌、疼痛、膀胱炎、关节炎、干眼症、肝炎、非酒精性脂肪肝、巨结肠、红斑狼疮、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺动脉高压、特发性肺纤维化(IPF)。
附图说明
图1为M1-M4的4株抗体的SDS-PAGE纯度鉴定图;
图2为本发明的MMP7抗体用于通过化学发光检测方法来检测样本中的MMP7含量与同类产品相关性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另外定义,否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等,Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.,J. Wiley & Sons (New York,NY 1994);Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor,NY 1989);Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009);Perbal, A PracticalGuide to Molecular Cloning (1984)。
在本文中,除非上下文另有明确指示,术语“或”意在包括“和”,反之亦然。在本文中,除非另有说明,否则单数术语涵盖复数指代物,反之亦然。
在本文中,除非另有说明,术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(例如contain、containing、include、including)为开放式表述,应理解为“包括但不限于”,意味着除所列出的要素、组分和步骤外,还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
术语“抗体”在本文中是指能够特异性识别并结合抗原的蛋白质或多肽,涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体,包括但不限于表现出期望的生物学活性的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、单链抗体、单域抗体等,并可根据重链类别分为5个同种型,即IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。本文中的术语“抗原结合片段”是指全长抗体中的一部分或一段,但其保留了能够特异性识别并结合抗原的能力。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)、单链抗体(scFv)、双链抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、minibody。
当提及抗体时,本文中的术语“分离的”表示该抗体基本上不含在天然状态下与其结合的其他细胞组分,例如,分离的抗体可为从天然或自然环境中移出的抗体。
抗体的“互补决定区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域(VH或VHH)中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原结合残基(“抗原结合位点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N端开始顺序编号,通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。对于给定的抗体,可以采用本领域公知的多种编号方案确定其CDR序列,例如Chothia、Kabat、IMGT、Contact、AbM、Martin(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S.Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987);Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991);http://www.bioinf.org.uk/abs/info.html;https://www.imgt.org/;https://help.geneiousbiologics.com/hc/en-us/articles/360044625812-Numbering-Schemes;N. R. Whitelegg等,Protein Eng. 2000 Dec, 13(12):819-24)。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT编号方案定义的CDR的区域范围。
CDR | Kabat | AbM | Chothia | Contact | IMGT |
LCDR1 | L24-L34 | L24-L34 | L26-L32 | L30-L36 | L27-L32 |
LCDR2 | L50-L56 | L50-L56 | L50-L52 | L46-L55 | L50-L52 |
LCDR3 | L89-L97 | L89-L97 | L91-L96 | L89-L96 | L89-L96 |
HCDR1 | H31-H35B(Kabat编号) | H26-H35B | H26-H32 | H30-H35B | H26-H35B |
HCDR1 | H31-H35(Chothia编号) | H26-H35 | H26-H32 | H30-H35 | H26-H35 |
HCDR2 | H50-H65 | H50-H58 | H53-H55 | H47-H58 | H51-H57 |
HCDR3 | H95-H102 | H95-H102 | H96-H101 | H93-H101 | H93-H102 |
除非另有说明,在本发明中提及抗体可变区中的残基位置时,是指根据Kabat编号系统定义的编号位置。除非另有说明,否则本文中的术语“CDR”涵盖以上述任一种编号方案定义的CDR序列,例如Kabat编号。
本文中的术语“X”和“Xaa”等同,是指未指定的氨基酸(Unspecified AminoAcid),通过相关表述中的定义来指定其涵盖的范围,为了区别同一氨基酸序列中的多个“X”,对先后出现的多个X分别进行编号(即,撰写成Xn)并分别对其涵盖的范围进行定义。
本文中的术语“序列同一性”是指将待比对的两条以上的序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后,在不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时,待比对序列之间的相同氨基酸残基的百分比。氨基酸序列同一性的比对可以采用本领域已知的多种方式进行,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。
实施例
接下来,通过实施例对本发明进行进一步详细地说明,但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。除非另有说明,如下实施例中采用的各试剂、材料和设备为可根据本领域已知的常规手段制备或者可商购得到的那些。
如下实施例中采用的人基质金属蛋白酶7(hMMP7)重组蛋白为根据UniProt ID:P09237重组制备得到。在未给出特别说明的情况下,下述实施例中提及的血清样本均为在患者的监护人签署知情同意书后,收集自在医院胆外科接受肝胆手术的胆道闭锁的患儿、非BA患儿和健康儿童的血清样本。
实施例1 人基质金属蛋白酶7(hMMP7)的单克隆抗体的获得
用hMMP7免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠,在初次免疫2-3周后进行再次免疫,然后约3周后进行加强免疫。之后取小鼠尾静脉血液样本通过ELISA进行效价测定,从其中选择效价高的小鼠摘除脾脏制备脾淋巴细胞,将脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞)进行融合。用HAT选择培养液培养,筛选出杂交瘤细胞,同时用ELISA测定培养上清液,通过确定和MMP7蛋白是否有效结合的方式筛选杂交瘤,阳性的杂交瘤通过有限稀释进一步亚克隆,得到稳定的单克隆杂交瘤细胞,最终筛选得到4株单克隆杂交瘤细胞株。
实施例2 杂交瘤测序
根据文献中提到的方法(Bradbury, A. (2010). Cloning Hybridoma cDNA byRACE. Antibody Engineering. R. Kontermann and S. Dübel. Springer-VerlagBerlin Heidelberg:15-20),合成特异性引物,克隆杂交瘤细胞抗体目的基因。
杂交瘤测序过程如下:将冻存的实施例1中得到的杂交瘤细胞在37℃水浴下解冻,加入新鲜的DMEM培养基复苏培养杂交瘤细胞,并取500万杂交瘤细胞,使用RNA提取试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)抽提RNA;以抽提的RNA为模板,用反转录试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)合成第一链cDNA;然后以第一链cDNA为模板用合成的特异性引物(通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列为如下表1所示)扩增抗体序列的目的条带。将扩增到的重链和轻链的目的片段分别克隆到平端克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)中,然后分别涂布LB琼脂平板(氨苄抗性)平板;待克隆长出后,每个平板分别挑取克隆进行Sanger测序。
表1 引物序列
正向引物 | 反向引物 | |
重链可变区 | GACAGTGGATARACMGATGG(SEQ ID NO:49) | GAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG(M和R表示简并碱基)(SEQ ID NO:50) |
轻链可变区 | GGATACAGTTGGTGCAGCATC(SEQ ID NO:51) | GAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:52)GATATTGTGATGACGCAGGCT(SEQ ID NO:53)GATATTGTGATAACCCAG(SEQID NO:54)GACATTGTGCTGACCCAATCT(SEQ ID NO:55)GACATTGTGATGACCCAGTCT(SEQ ID NO:56)GATATTGTGCTAACTCAGTCT(SEQ ID NO:57)GATATCCAGATGACACAGACT(SEQ ID NO:58)GACATCCAGCTGACTCAGTCT(SEQ ID NO:59)CAAATTGTTCTCACCCAGTCT(SEQ ID NO:60) |
在下表2中示出本发明中涉及的各抗体的序列信息。
表2 抗体序列信息
重链可变区
M1 | QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGRINPKGGSTGSVPKFRSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRIGTPLDYWGQGTLVTVSSVL(SEQ ID NO:25) |
M2 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMYWVRQAPGQGLEWIGEIMPSWGDTIFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRMPFLGAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:26) |
M3 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYDMYWVRQAPGQGLEWIGWINPSMGDTVFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREPRYGAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:27) |
M4 | QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNADTEFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWPLYGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:28) |
轻链可变区
M1 | DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASRDISKRLAWYQEKPGKTNKLLIYKTSNLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQLKNYPRTFGQGTNLEIK(SEQ ID NO:29) |
M2 | DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKFLAWYQQKPGKAPKLLIYHGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQENEFPETFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:30) |
M3 | DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSIFWRLAWYQQKPGKAPKLLIYWGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQENEMPMTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:31) |
M4 | DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGHWLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHFEYPWTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:32) |
重链
M1 | QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGRINPKGGSTGSVPKFRSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRIGTPLDYWGQGTLVTVSSVLAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:33) |
M2 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMYWVRQAPGQGLEWIGEIMPSWGDTIFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRMPFLGAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:34) |
M3 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYDMYWVRQAPGQGLEWIGWINPSMGDTVFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREPRYGAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:35) |
M4 | QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNADTEFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWPLYGAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:36) |
轻链
M1 | DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASRDISKRLAWYQEKPGKTNKLLIYKTSNLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQLKNYPRTFGQGTNLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:37) |
M2 | DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKFLAWYQQKPGKAPKLLIYHGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQENEFPETFGQGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:38) |
M3 | DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSIFWRLAWYQQKPGKAPKLLIYWGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQENEMPMTFGQGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:39) |
M4 | DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGHWLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHFEYPWTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:40) |
实施例3 单克隆抗体表达载体构建
利用NCBI blast、NCBI IGBlast等对杂交瘤测序结果进行分析,找到抗体的重链可变区序列与轻链可变区序列,利用密码子优化软件在哺乳动物细胞表达系统中优化密码子,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成后,利用EcoRI/HinDIII限制性内切酶酶切位点,将密码子优化后的基因分别克隆至pcDNA3.1表达载体中,构建单克隆抗体表达质粒,并测序验证质粒构建正确。
实施例4 单克隆抗体的制备
通过将实施例3得到的表达质粒瞬时转染293F细胞获取单克隆抗体。转染前一天,将293F细胞以0.8×106/mL接种于细胞培养瓶,置于37℃、5% CO2、120rpm的细胞摇床中,以OPM-293 CD03 Medium培养液培养至细胞融合度达到80%-90%,活力大于95%时进行转染,pcDNA3.1重链表达质粒和轻链表达质粒(按照1:1的摩尔比)与聚醚酰亚胺混匀后,室温孵育10-15min,缓慢加入到HEK293细胞中,加入增强剂和辅料(购自上海奥浦迈生物科技股份有限公司),于37℃、5% CO2、120rpm的细胞摇床中继续培养。当细胞存活率<70%后,收集细胞培养物,8000 g离心10 min,收集上清液,再通过12000 g、4℃离心30 min,收集细胞上清,进行抗体纯化,将纯化后的抗体M1-M4经SDS-PAGE鉴定抗体纯度(结果见图1)。
实施例5 单克隆抗体与抗原的亲和力测定
本实施例采用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术对抗体与MMP7抗原的亲和力进行检测。
将标记的MMP7蛋白偶联固定在生物传感器芯片上,然后将纯化得到的MMP7单克隆抗体利用1×PBS调整浓度至100nM后进行2倍梯度稀释,然后在芯片表面流过,分析表面等离子体共振信号的变化,以通过使用一对一Langmuir结合模型(BIAEvaluation Software,GE Life Sciences)计算结合率(kon)和解离率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。
经检测,实施例4制备得到的MMP7单克隆抗体M1-M4的KD值<10-9 M。
实施例6 单克隆抗体性能分析-本发明MMP7抗体用于检测样本中的MMP-7含量(化学发光检测)
基于双抗体夹心法和吖啶酯发光法原理,采用本发明的MMP7抗体进行化学发光检测,除本发明的抗体外还包含:JSR链霉亲和素磁珠、生物素化抗体(二抗)和吖啶酯。
发光方式采用吖啶酯直接发光,发光仪为购自重庆科斯迈生物科技有限公司的化学发光免疫分析仪500S,采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化法进行吖啶酯活化。反应模式:两步法(样本+生物素化抗体、链霉亲和素磁珠+吖啶酯标记抗体)。
具体检测步骤如下:
1、链霉亲和素磁珠清洗
根据制造商的说明书,将购买的链霉亲和素磁珠(购自JSR)充分混匀,取出相应量的磁珠置于离心管,使用磁力架去除上清液,使用磁珠保存液清洗三次;然后,加入磁珠保存液(10mM PBS、1wt% BSA、0.4wt% Tween-20、0.5wt% NaCl和0.1wt% Proclin-300)将磁珠稀释至浓度为0.3mg/mL待用。
2、生物素化抗体稀释
将购买的生物素化抗体母液(购自CUSABIO)充分混匀,加入生物素化抗体稀释液(10mM PBS、1wt% casein、10wt%蔗糖、0.5wt% NaCl和0.1wt% Proclin-300)将抗体母液稀释至浓度为0.2μg/mL待用。
3、吖啶酯标记抗体
将本发明实施例4制备的抗体(M1)与缓冲液1(浓度为0.01M的磷酸缓冲液,pH为8.5)充分混匀得到标记液(抗体浓度为0.1mg/mL),将得到的标记液转移至7kD透析管中,缓冲液1中旋转透析,换液6次,每次1-2h;
将NHS酯化的吖啶酯(NSP-SA-NHS)与上述得到的本发明的实施例4制备的抗体M1按照20:1的分子摩尔比室温混匀并进行标记反应0.5-1h;
反应结束后,将得到的反应液转移至7kD透析管中,在缓冲液2(浓度为0.01M的磷酸缓冲液,pH为6.3)中旋转透析,换液6次,每次1-2h;
透析过夜后取出吖啶酯标记抗体,添加标记保存液(10mM PBS、1% BSA、2%海藻糖、0.5% NaCl和0.1% Proclin-300)至1mL,充分混匀后可置于2-8℃保存,使用标记保存液稀释待用。
4、配制校准品和质控品
使用抗原稀释液(10mM PBS+1wt%牛血清白蛋白)将MMP-7抗原分别稀释至0.1、0.6、3.0、15、75、300 ng/mL,分装至校准品管中。
使用上述抗原稀释液将MMP-7抗原分别稀释至2ng/mL、60ng/mL,分装至质控品管中。
5、检测
上样量:样本(包括待测血清样品、上述得到的校准品和质控品)20μL、磁珠20μL、生物素化抗体20μL、吖啶酯标记抗体50μL、预激发液100μL(购自深圳赛柏生物)、激发液100μL(购自深圳赛柏生物)。
检测流程:磁珠浓度0.5mg/mL,生物素化抗体浓度2μg/mL,吖啶酯:保存缓冲液(10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、1wt%-5wt%海藻糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300)以体积比1:100稀释使用。将各样本用生物素化抗体孵育10min,再加入磁珠和吖啶酯标记抗体孵育10min,孵育结束后洗涤4次,加入预激发液反应2min,再加入激发液马上用发光仪检测发光强度。
6、结果
(1)使用本发明中MMP7抗体检测与同类产品对比:
按照本实施例中的MMP-7化学发光检测方法与R&D的产品针对20例待测血清样品进行了相关性对比,数据如图2所示。
相关系数R2为0.9931,这说明采用本发明实施例制备的抗体能准确检测样本中的MMP-7含量,为临床诊断提供依据,能够充分满足临床体外诊断检测需求。
(2)检测灵敏度和精密度考察:
按照临床和实验室标准协会灵敏度验证分析指南文件CLSI:EP17-A2对采用本发明抗体的化学发光检测的空白限和检测限进行了研究,结果表明采用本发明抗体的化学发光检测的空白限和检测限分别可为0.03 ng/mL和0.05 ng/mL。
按照临床和实验室标准协会精密度验证分析指南文件CLSI:EP5-A3对采用本发明抗体的化学发光检测进行精密度研究,使用3个批号的试剂和校准品,对2个水平的质控品进行了检测,每天上、下午各检测两次,连续考察5天,结果表明各批次室内总精密度小于5%。
(3)抗干扰能力分析:
在MMP-7浓度约为5 ng/mL和100 ng/mL浓度水平的两个血清样本中分别添加不同浓度的干扰物(下表3中示出),以未添加组为对照,添加组和对照组两者相对偏差小于5%为干扰可接受标准,研究不同干扰物的最大浓度水平(不超过临床可见最高浓度)。
表3 抗干扰能力分析数据
干扰物名称 | 干扰浓度 |
血红蛋白 | 2g/L |
脂肪乳 | 33g/L |
胆红素 | 200mg/L |
类风湿因子 | 100U/mL |
抗鼠异嗜性抗体(HAMA) | 68ng/mL |
结果表明,表3中的各干扰物在表3中所列出的浓度时对检测结果干扰不明显。
实施例7 单克隆抗体性能分析-MMP7抗体用于诊断的性能(酶联免疫检测)
通过双夹心ELISA法测定血清中MMP7的浓度,以辅助早期诊断BA,该诊断涉及的主要试剂和耗材包括:抗人MMP-7单克隆抗体(M1)包被的酶标板、阴性对照液、阳性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液;其中,阴性对照液为不含MMP-7的稀释于样品稀释液中的健康儿童人血清及非BA患儿血清;阳性对照液为含有MMP7的稀释于样品稀释液中BA患儿血清,其中MMP7浓度为100U/mL;酶标试剂为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体(本申请的MMP-7单克隆抗体M2,浓度为0.1-111g/mL);酶底物溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液,还包括显色剂A和显色剂B,显色剂A为500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30%(g/mL)双氧水0.3mL以及余量的蒸馏水,显色剂B为500mL溶液中含有TMB 350mg、二甲亚砜20mL和柠檬酸·H2O 5.1g以及余量的蒸馏水;封闭液为0.5wt%牛血清白蛋白的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液溶液,即1升溶液中含5g BSA、8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4、0.12g H2O和0.2g KCl以及余量的水;样品稀释液为0.01mol/LpH 7.4的PBS;洗涤液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液PBST,PBST内含0.05%吐温20,即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2PO4、2 .9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5mL Tween-20以及余量的水;终止液为2mol/L H2SO4溶液。
具体操作步骤如下:
1)包被:用1×PBS将抗人MMP-7单克隆抗体(M1)稀释成1μg/mL的包被工作液,然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板(96孔Costa酶标板)中,于2-8℃包被过夜;
2)封闭:弃掉酶标板中的包被工作液,用洗涤液洗板3次,然后按照200μL/孔的用量加入封闭液,室温封闭2h左右;
3)标准品与样品的稀释与加样:将按照实施例6中的方法制备的标准品与待测血清样品分别用样品稀释液以1:100的体积比稀释至100μL,加入到各自的抗原测定孔板中,酶标板上加盖或覆膜。同时,向酶标板中分别加入阴性对照液和阳性对照液作为对照,各自设置3复孔。
4)温育:酶标板置于37℃反应60分钟,甩净孔中液体,不用洗涤。
3、加酶:每孔加酶标试剂100μL,37℃下孵育60分钟。甩净孔中液体,用洗涤液洗板3次,拍干。
4、显色:使用前15分钟,按实验用量将显色剂A和显色剂B等体积混合,避光;然后与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液混合得到酶底物溶液,向各孔加入酶底物溶液100μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
5、终止:依序每孔加终止液50μL,终止反应。各孔终止液的加入顺序应尽量与酶底物溶液的加入顺序相同。底物反应时间到达后应尽快加入终止液。
6、结果判定:
(1)在加入终止液后15min内,用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。检测标准为:以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标),OD值为横坐标(或对数坐标),使用curve expert 1.30软件绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R2值未定,以R2值越趋近于1为好),计算样品的实际浓度。其中,阳性结果判断标准为:MMP-7>16.32ng/mL。
对40例BA患儿血清、60例非BA患儿血清、50例健康儿童血清的ROC分析确立了以上参考值。
(2)特异性和敏感性检测:
采用150份BA(biliary atresia,胆道闭锁)相关患者的血清(BA患儿40例、非BA黄疸患儿60例、无肝病或黄疸患儿50例)进行了特异性和敏感性检测,基于本发明抗体采用酶联免疫检测方法进行辅助早期诊断BA的特异性为93.3%,敏感性为95.4%。
实施例8 MMP7和BAFF联合用于胆道闭锁诊断
本实施例进一步研究MMP7与BAFF联合在BA疾病及其肝纤维化进程中的相关性,以研究它们的联合对BA的诊断作用。在患者的监护人签署知情同意书后,收集和制备BA患者、对照患者的血液(包括全血、血清、血浆)标本,其中,临床标本以及数据的收集步骤包括:
胆道闭锁及其他对照组患儿的病史、尤其是肝脏损伤相关实验室检测指标从医院的电子医疗档案系统中获得。受试者的入选标准:本研究的受试者在广州市妇女儿童医疗中心肝胆外科接受肝胆手术的患儿中招募。
对照患儿和BA患儿依据以下标准判断:
(1)对照患者:0~4个月龄肝胆疾病(胆总管囊肿、肝癌或肝脏肿瘤、生理性黄疸)需手术治疗的患儿。
(2)胆道闭锁:0~4个月龄梗阻性黄疸患儿,经术中胆道造影和/或肝活检明确诊断BA。
(3)排除标准:(1)合并全身炎症反应综合征或多系统畸形的患儿;(2)原发疾病诊断不明确的患儿;(3)父母拒绝参加研究或无法获得父母授权的患儿。
对收集的血液标本,ELISA法检测血液标本中MMP7浓度和BAFF浓度,其步骤包括:将-80℃冻存的BA患者和对照患者的血清低温离心15分钟,取上清,利用酶联免疫法检试剂盒(Bio-rad公司)根椐制造商的说明书检测BAFF浓度;利用实施例6的方法检测血液中MMP7浓度。
结果发现,通过ELISA方法检测MMP7和BAFF的水平,能够非常有效区分BA与非BA(对照)受试者,通过对预测性能的接受者操作特征(ROC)曲线分析发现,其AUC达到0.95以上。
实施例9 MMP7抗体用于胆道闭锁疾病的治疗作用
目前应用猴轮状病毒(Rotavirus,RV)制备胆道闭锁(Biliary Atresia, BA)动物模型接近实际的药物病理发生过程,是常见的药效研究方法。为了证明本发明的MMP7抗体的药效,研究其是否具有防治胆道闭锁的功效及其剂量,进行如下实验。
实验动物:成年BALB/c孕鼠,无特定病原体级(SPF级),购自广东省医学实验动物中心。待孕鼠产下新生小鼠(每只孕鼠平均产8只新生鼠),平均体重1.5g,根据实验分组随机选取新生小鼠进行实验。
模型制备方法:将新生的BALB/c小鼠,于出生24小时内腹腔注射猴MMU18006轮状病毒(RV)20 μL(滴度1.0×106PFU),建立BA小鼠动物模型。详细步骤见“不同滴度轮状病毒对新生小鼠肝胆系统损伤的比较,中华实验和临床病毒学杂志,2017.01,1003-9279”,其内容全部在此引用作为参考。
给药以及指标考察:动物模型制备后,进行分组给药,将BA模型分为不同实验组别:1)对照小鼠组(RV诱导BA小鼠模型,腹腔给予1×PBS);2)BA小鼠+MMP7抗体组(本申请实施例制备的M1抗体),给药量2μg/g,腹腔注射,病毒感染后第1、3、6、9天给药,实验在第12天终止,对抗体的治疗作用进行评价。
观察发现,与对照小鼠组相比,给予MMP7抗体能够明显降低黄疸率(P<0.05),对每组小鼠进行肝脏石蜡切片HE染色实验发现,RV模型小鼠肝脏坏死灶多、炎症细胞在汇管区浸润增加、门脉汇管区周围纤维化程度加重;给予MMP7抗体后,发现肝脏坏死灶数量显著减少、炎症细胞的浸润减少以及纤维化的程度降低。
结果表明,本发明的MMP7抗体对胆道闭锁及其相关的肝脏损伤、黄疸等具有显著的治疗作用。
此外,发明人采用本发明的MMP7抗体在肝纤维化、黄疸、肾纤维化、慢性肾病等小鼠动物模型中均观察到了显著的治疗效果。
Claims (26)
1.一种特异性结合MMP7的分离的抗体或其抗原结合片段,包括:
(1)HCDR1,其包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(2)HCDR2,其包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(3)HCDR3,其包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(4)LCDR1,其包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;
(5)LCDR2,其包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和
(6)LCDR3,其包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,包括:
(a)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,如SEQ ID NO:2所示的HCDR2,如SEQ ID NO:3所示的HCDR3,如SEQ ID NO:13所示的LCDR1,如SEQ ID NO:14所示的LCDR2,如SEQ ID NO:15所示的LCDR3;
(b)如SEQ ID NO:4所示的HCDR4,如SEQ ID NO:5所示的HCDR2,如SEQ ID NO:6所示的HCDR3,如SEQ ID NO:16所示的LCDR1,如SEQ ID NO:17所示的LCDR2,如SEQ ID NO:18所示的LCDR3;
(c)如SEQ ID NO:7所示的HCDR1,如SEQ ID NO:8所示的HCDR2,如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,如SEQ ID NO:19所示的LCDR1,如SEQ ID NO:20所示的LCDR2,如SEQ ID NO:21所示的LCDR3;或者
(d)如SEQ ID NO:10所示的HCDR1,如SEQ ID NO:11所示的HCDR2,如SEQ ID NO:12所示的HCDR3,如SEQ ID NO:22所示的LCDR1,如SEQ ID NO:23所示的LCDR2,如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,包括:
(1)具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区;
(2)具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区;
(3)具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区;或者
(4)具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的重链可变区,和具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段还包含具有如SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列的重链恒定区、和/或具有如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列的轻链恒定区。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,包括:
(1)具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链;
(2)具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链;
(3)具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链;或者
(4)具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链,和具有如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的轻链。
6.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段选自:Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区、单链抗体、双链抗体、单域抗体、或minibody。
7.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
8.一种融合蛋白,其含有权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种前体肽,其含有权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者由其生成权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种分离的核酸分子,其包含编码权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求8所述的融合蛋白、或权利要求9所述的前体肽的核苷酸序列。
11.一种重组表达载体,所述表达载体包含权利要求10所述的分离的核酸分子。
12.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的重组表达载体。
13.如权利要求12所述的宿主细胞,其中,所述宿主细胞为真核细胞。
14.如权利要求12或13所述的宿主细胞,其中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
15.一种制备权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在使得所述的抗体、其抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞。
16.一种检测试剂,包括权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.如权利要求16所述的检测试剂,其中,所述检测试剂还包括一种或多种酶联免疫检测试剂组分。
18.如权利要求17所述的检测试剂,其中,所述酶联免疫检测试剂组分选自阳性对照液、样品稀释液、阴性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、显色试剂、洗涤液、封闭液、和/或终止液。
19.如权利要求16所述的检测试剂,其中,所述检测试剂还包括一种或多种化学发光免疫检测组分。
20.如权利要求19所述的检测试剂,其中,所述化学发光免疫检测组分包括磁性微球溶液、生物素化抗体溶液、发光标记物,以及任选的MMP7校准品和MMP7质控品。
21.如权利要求16-20中任一项所述的检测试剂,其中,所述检测试剂进一步包含选自如下的诊断指标的检测剂:铁离子、铁离子转运蛋白SLC11A2、铁离子转运蛋白SLC40A1、血红素转运蛋白SLC46A1、乳铁蛋白受体ITLN1、铁调素、游离胆红素、胆绿素、γ-谷氨酰转移酶、或BAFF。
22.权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的融合蛋白、权利要求9所述的前体肽、或权利要求16-21中任一项所述的检测试剂在制备用于检测样品中MMP7含量的试剂或产品、用于对MMP7相关疾病进行诊断的试剂或产品、或者用于对MMP7相关疾病进行预防和/或治疗的药物中的用途。
23.如权利要求22所述的用途,其中,所述MMP7相关疾病为炎性疾病、自身免疫性疾病、癌症、纤维化疾病、心血管疾病、神经病症、眼部疾病、肺部疾病、肝胆疾病、或肾病。
24.如权利要求22或23所述的用途,其中,所述MMP7相关疾病选自胆道闭锁、黄疸、胆管炎、胆汁淤积、肝纤维化、肾纤维化、慢性肾病、肝内胆管细胞癌、坏死性小肠结肠炎或败血症、卵巢癌、疼痛、膀胱炎、关节炎、干眼症、肝炎、非酒精性脂肪肝、巨结肠、红斑狼疮、急性呼吸窘迫综合征、肺动脉高压、特发性肺纤维化。
25.如权利要求24所述的用途,其中,所述肝纤维化为胆道闭锁引起的肝纤维化,所述黄疸为梗阻性黄疸。
26.一种药物组合物,包含:权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的融合蛋白或权利要求9所述的前体肽,以及药学上可接受的载体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410391351.3A CN117964771B (zh) | 2024-04-02 | 一种特异性结合mmp7的抗体、mmp7检测试剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410391351.3A CN117964771B (zh) | 2024-04-02 | 一种特异性结合mmp7的抗体、mmp7检测试剂及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117964771A true CN117964771A (zh) | 2024-05-03 |
CN117964771B CN117964771B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10287700A (ja) * | 1997-04-10 | 1998-10-27 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | 活性型マトリライシン(mmp−7)に対する抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 |
US20100227335A1 (en) * | 2009-03-05 | 2010-09-09 | Becton, Dickinson And Company | Matrix metalloproteinase-7 (mmp-7) monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer |
CN103370337A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-10-23 | 耶达研究及发展有限公司 | 用于产生针对金属酶的抗体的方法 |
CN106573984A (zh) * | 2014-08-13 | 2017-04-19 | 克里普索生物科技公司 | 针对mmp9的特异性抗体 |
CN113853213A (zh) * | 2019-02-10 | 2021-12-28 | 耶达研究及发展有限公司 | 抗基质金属蛋白酶7 (mmp-7)抑制性抗体及其用途 |
CN116063527A (zh) * | 2021-09-30 | 2023-05-05 | 南京北恒生物科技有限公司 | 靶向间皮素的抗体及其用途 |
KR20230115661A (ko) * | 2022-01-27 | 2023-08-03 | 에피노젠 주식회사 | 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그 용도 |
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10287700A (ja) * | 1997-04-10 | 1998-10-27 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | 活性型マトリライシン(mmp−7)に対する抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 |
US20100227335A1 (en) * | 2009-03-05 | 2010-09-09 | Becton, Dickinson And Company | Matrix metalloproteinase-7 (mmp-7) monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer |
CN103370337A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-10-23 | 耶达研究及发展有限公司 | 用于产生针对金属酶的抗体的方法 |
CN106573984A (zh) * | 2014-08-13 | 2017-04-19 | 克里普索生物科技公司 | 针对mmp9的特异性抗体 |
CN113853213A (zh) * | 2019-02-10 | 2021-12-28 | 耶达研究及发展有限公司 | 抗基质金属蛋白酶7 (mmp-7)抑制性抗体及其用途 |
US20220106405A1 (en) * | 2019-02-10 | 2022-04-07 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Anti-matrix metalloproteinase 7 (mmp-7) inhibitory antibody and uses thereof |
CN116063527A (zh) * | 2021-09-30 | 2023-05-05 | 南京北恒生物科技有限公司 | 靶向间皮素的抗体及其用途 |
KR20230115661A (ko) * | 2022-01-27 | 2023-08-03 | 에피노젠 주식회사 | 기질 메탈로프로테아제-7의 프로-도메인에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그 용도 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
VISHNU MOHAN等: ""Conformation-Specific Inhibitory Anti-MMP-7 MonoclonalAntibody Sensitizes Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells toChemotherapeutic Cell Kill"", 《CANCER》, vol. 13, no. 1679, 2 April 2021 (2021-04-02), pages 1 - 21 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2765306C2 (ru) | Антитело против в7-н3, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение | |
CN111196850B (zh) | 人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体及其应用 | |
EA023406B1 (ru) | Антитела к гепцидину и варианты их применения | |
CN112585165A (zh) | 优化的抗tl1a抗体 | |
CN111615519B (zh) | 结合人il-5的单克隆抗体、其制备方法和用途 | |
EP4089111A1 (en) | New polypeptide complex | |
CN113164593A (zh) | 兽用抗il4受体抗体 | |
US20160159922A1 (en) | Novel Antibodies for the Diagnosis and Treatment of Rheumatoid Arthritis | |
WO2016104439A1 (ja) | 抗活性型gip抗体 | |
CN114667297B (zh) | 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用 | |
CN114773473A (zh) | 抗cd39抗体及其制备方法和用途 | |
CN113227148B (zh) | 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
CN111051343A (zh) | Il-6r抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
CN115515635A (zh) | 兽用抗il4受体抗体 | |
EP3878867A1 (en) | Antibody binding to human il-1 ?, preparation method therefor and use thereof | |
CN117964771B (zh) | 一种特异性结合mmp7的抗体、mmp7检测试剂及其应用 | |
EP4201960A1 (en) | Single variable domain and antigen binding molecule binding bcma | |
WO2023019174A2 (en) | Antibodies to sars-cov-2 | |
CN117964771A (zh) | 一种特异性结合mmp7的抗体及其应用 | |
CN115298216A (zh) | 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途 | |
CN106749661B (zh) | 抗psmp的单克隆抗体及其用途 | |
CN110596369A (zh) | 一种用于检测人tim-3表达水平的试剂盒 | |
WO2022127842A1 (zh) | 靶向il-17a和il-36r的双特异性抗体及其应用 | |
WO2024012434A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
US20230086530A1 (en) | Human cd47-targeting single-domain antibody and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |