CN106749661B

CN106749661B - 抗psmp的单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN106749661B
Application number: CN201610998193.3A
Authority: CN
Inventors: 王应; 马大龙; 郑丹凤; 裴晓磊; 佘少平; 彭新建; 陈迪新; 郑璨; 梁炜薇; 宋泉声; 张颖妹
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106749661A

Abstract

本发明涉及抗PSMP的单克隆抗体3D5，重链属于IgG1亚型，轻链属于κ链。本发明涉及抗PSMP的单克隆抗体4E7，重链属于IgG2b亚型，轻链属于κ链。3D5重链可变区序列如SEQ ID NO.3和5所示，重链互补决定区如SEQ ID NO.7,8,9和13,14,15所示，轻链可变区如SEQ ID NO.4和6所示，轻链互补决定区如SEQ ID NO.10,11,12和16,17,18所示。4E7重链可变区序列如SEQ ID NO.31和33所示，重链互补决定区如SEQ ID NO.35,36,37和41,42,43所示，轻链可变区如SEQ ID NO.32和34所示，轻链互补决定区如SEQ ID NO.38,39,40和44,45,46所示。所述3D5和4E7抗PSMP的单克隆抗体可用于PSMP相关的多种疾病的治疗。所述3D5和4E7抗PSMP的单克隆抗体还可用于检测样品中的PSMP蛋白的含量。

Description

抗PSMP的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及单克隆抗体技术，尤其涉及抗PSMP的单克隆抗体及编码所述抗体蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的基因工程载体，相应的药物组合物，以及在药物和试剂的制备、疾病的预防和治疗等方面的用途。

背景技术

近年来，免疫疗法发生了变化，从基础向临床的转化到药物开发成为更为重要的途径。通过描述免疫系统相关趋化因子如何组织在生理和病理活动中发挥作用，暗示趋化因子有强大的临床应用前景，可以用作免疫疗法的治疗靶或辅助治疗剂或主要疗法。

抗体，又称免疫球蛋白分子，由B细胞分泌产生。抗体基本结构单元由2对相同的多肽链组成，每一对具有一条轻链(约25kDa)和一条重链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端为恒定区。根据抗体分子重链的性质分为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类别。某些类别也具有子类，例如IgG1、IgG2。轻链可为κ链或λ链。

单克隆抗体：指含有由唯一轻链基因产物和唯一重链基因产物组成的唯一一个物种的抗体群体。在群体的所有分子中单克隆抗体的互补性决定区域(CDR)相同。单克隆抗体抗原结合位点由重链(H)和轻链(L)的N端可变(V)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内3个“高变区”，插入多个称为“骨架区”或“FR”的保守区段之间。FR指免疫球蛋白的高变区之间天然存在且与之相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区相对于彼此呈三维空间布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，每条重链和轻链的3个高变区称为“互补性决定区域”或“CDR”。

单克隆抗体的制备的杂交瘤技术是通过融合经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的杂交瘤细胞克隆。在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。

基因工程抗体(重组抗体)是指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和重新装配，再导入适当的工程细胞所表达的抗体分子。基因工程抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、二硫键稳定的Fv、Fab、单域抗体、多价抗体、多特异抗体、靶向药物抗体、抗原化抗体。

基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测方法包括反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学、流式蛋白定量检测方法。可以应用于实验研究以及临床生理和病理疾病中细胞和组织的基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测。

具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质，可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究，疾病标志物的研究和临床检测，及研究和临床的药物的治疗。

发明内容

本发明提供了两种抗PSMP的单克隆抗体。所述单克隆抗体3D5，属于IgG1亚型，对PSMP具有高亲和力检测和中和活性。所述单克隆抗体4E7，属于IgG2b亚型，对PSMP具有高亲和力检测和中和活性。

本发明还提供了两种分泌所述单抗隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述单克隆抗体包含重链和轻链可变区，包括其多核苷酸及氨基酸序列。

所述单克隆抗体3D5包括SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.7，SEQ IDNO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，以及与上述氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明还提供了一种多核苷酸或其互补序列。所述多核苷酸包含编码SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15所示分别编码SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9的多核苷酸序列，和SEQ ID NO.16，SEQ IDNO.17，SEQ ID NO.18所示分别编码SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12的多核苷酸序列；或(2)具有编码权利要求1，2，5或6所述氨基酸序列的多核苷酸序列，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

所述单克隆抗体4E7包括SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.35，SEQ IDNO.36，SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，以及与上述氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明还提供了一种多核苷酸或其互补序列。所述多核苷酸包含编码SEQ IDNO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.43所示分别编码SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37的多核苷酸序列，和SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.46所示分别编码SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40的多核苷酸序列；或(2)具有编码权利要求1，2，5或6所述氨基酸序列的多核苷酸序列，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

本发明还提供了两种基因工程载体。所述基因工程载体含有编码本发明所述的单克隆抗体的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体。

本发明还提供了一种药物组合物。所述药物组合物含有：本发明所述的蛋白，编码所述蛋白的多核苷酸和/或含有所述多核苷酸的基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

所述药物能够用于预防和/或治疗的疾病包括：自身免疫病、肿瘤转移、免疫调节、炎症反应、肝癌，肺腺癌，胰腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、破骨细胞瘤、动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压疾病、心力衰竭、肥胖和胰岛素抵抗、多发性硬化、肺部炎症、肝部炎症，消化道炎症、关节炎、过敏性疾病、移植排斥。

本发明还提供了试剂制备方法，用于检测待测样品中PSMP蛋白或多核苷酸的表达水平，所述试剂包含本发明所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸。

本发明还提供了以本发明的抗体或多核苷酸或本发明抗体的相互作用分子作为靶点开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

本发明具有如下技术特征：1、PSMP单克隆抗体3D5，包含轻链可变区和重链可变区，重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，重链互补决定区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9所示；轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.4所示，轻链互补决定区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ IDNO.12所示；2、一种多核苷酸，编码所述PSMP单克隆抗体；3、如上所述的多核苷酸分子，编码所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，重链互补决定区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15所示；以及编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，轻链互补决定区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18所示。4、PSMP单克隆抗体4E7，包含轻链可变区和重链可变区，重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.31所示，重链互补决定区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37所示；轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.32所示，轻链互补决定区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40所示；5、一种多核苷酸，编码所述PSMP单克隆抗体；6、如上所述的多核苷酸分子，编码所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.33所示，重链互补决定区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.43所示；以及编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.34所示，轻链互补决定区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.46所示。

本发明人利用人类功能基因组学数据库，生物信息学分析，分子生物学、细胞生物学及免疫学技术，从人类基因数据库中发掘具有重要生理、病理意义的新基因，为阐明疾病的发病机制、发现疾病标志物、基因组药物靶标(开发化合物、抗体、多肽药物)或基因工程药物提供基础。

本发明人从人类基因组编码基因中首次成功地筛选出了新的具有趋化活性的细胞因子PSMP(Microseminoprotein,prostate associated)，其序列在Gen-bankTM的注册登记号为NP_001037729.1、NM_001044264.2。经蛋白表达、纯化、N端测序和趋化功能检测的实验证明PSMP具有趋化活性的分泌蛋白为其C端103个氨基酸序列，PSMP趋化作用受体为CCR2。

CCR2及其配体现已证明与自身免疫病、肿瘤转移、免疫调节、炎症反应、心血管疾病和干细胞增殖分化有密切关系，特别是前列腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、破骨细胞瘤，动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压疾病、心力衰竭、肥胖和胰岛素抵抗、多发性硬化、肺部炎症、肝部炎症，消化道炎症、关节炎、过敏性疾病、移植排斥。

本发明通过单克隆抗体的制备技术，已获得抗PSMP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的抗体，并对抗PSMP单克隆抗体可变区进行测序，得到轻链、重链的可变区核苷酸和氨基酸序列。技术方案如下：1、获取阳性杂交瘤细胞株：将人源PSMP蛋白免疫BALB/C小鼠，从免疫成功小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用HAT筛选，经三次亚克隆后获得一株稳定分泌抗PSMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株；2、采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体与纯化：在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，经体内诱生后收集腹水，将腹水离心去除脂类等杂质，分离获得的单克隆抗体采用Protein G Sepharose纯化；3、鉴定单克隆抗体亚型：采用常规试剂盒鉴定单克隆抗体亚型；4、上述技术方案中获得的单克隆抗体采用间接ELISA方法测定其效价；5、本发明杂交瘤分泌的抗体具有良好的稳定性和特异性，通过体外实验发现，本发明获得单克隆抗体对PSMP具有中和活性；6、克隆上述PSMP单克隆抗体轻、重链可变区基因。重链可变区核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.33所示，轻链可变区核苷酸序列分别如序列表EQ ID NO.6或SEQ ID NO.34所示。获得该单克隆抗体轻链，重链可变区氨基酸序列，重链可变区氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.31所示，轻链可变区的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.32所示；7、利用上述核苷酸序列可构建嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、二硫键稳定的Fv、Fab、单域抗体、多价抗体、多特异抗体、靶向药物抗体、抗原化抗体。

本发明提供PSMP与急性肝损伤，结肠炎，胃炎，肺纤维化，前列腺癌，肺癌，肝癌，肾癌，胃癌，胰腺癌等疾病皆有相关性，生物信息分析PSMP在关节炎病人滑膜高表达，与疾病相关。

本发明提供结果显示PSMP单克隆抗体可用于体内肿瘤和炎症疾病的治疗。

本发明为阐明疾病的发病机制、发现疾病标志物、基因组药物靶标(开发化合物、抗体、多肽药物)或基因工程药物提供基础。

附图说明

图1显示纯化后的PSMP包涵体蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中，箭头所指为PSMP-his6包涵体蛋白。第1泳道为分子量标准；第2泳道为PSMP上样2μl；第3泳道为BSA 1μg；第4泳道为BSA2μg；第5泳道为BSA 3μg。

图2原核表达纯化的PSMP蛋白。

图3Western blot检测显示兔多抗、1B1、2G11、2H11、2H8、2G8、2G9、3D5、3F4、4A8、4C1、4D6、4D9、4E7、4F6均可特异性识别PSMP分泌蛋白以及表达外源性过表达PSMP的293T细胞裂解液里面的PSMP。

图4Western blot检测显示兔多抗、2G11、2H8、3D5、3F4、4C1、4D9、4E7、4F6均可识别PC3细胞内源性PSMP蛋白。

图5免疫细胞化学检测显示3D5、4E7、2G11均可识别PC3细胞内内源性PSMP蛋白。

图6ELISA方法检测显示3D5、4E7、2G11均可识别PSMP真核、原核蛋白，并且对其识别位点进行分析发现4E7可以识别PSMP的多肽60#，而3D5、2G11四条多肽都不识别。

图7所示用鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒(上海博耀生物工程有限公司)鉴定抗体亚型，结果显示PSMP单克隆抗体3D5重链为IgG 1型，轻链为κ；4E7重链为IgG2a型。2G11重链为IgG1型。

图8显示采用PSMP的兔多抗和鼠单抗3D5组合进行双抗体夹心ELISA识别PSMP蛋白的标准曲线，线性拟合度良好，识别灵敏度可达100pg/ml.

图9显示采用PSMP的兔多抗和鼠单抗3D5组合进行流式蛋白定量检测(CBA)，对浓度梯度PSMP蛋白与荧光强度值首先进行对数换算后，再进行线性拟合测得标准曲线。

图10显示Boyden Chamber趋化实验，四组下孔均为7、70、700ng/ml的PSMP真核蛋白，其中有三组加入单抗预孵育，加入的单抗分别为3D5、4E7、2G11，加入的浓度分别为2、2、10μg/ml，室温30分钟后进行趋化，趋化时间4.5小时。

图11显示Boyden Chamber趋化实验，下孔均为200ng/ml的CCL2，其中有两个加入单抗预孵育，加入的单抗为3D5、4E7，加入的单抗浓度为2μg/ml，室温30分钟后趋化，趋化时间为4.5小时。

图12和图13显示DSS诱导的小鼠结肠炎模型，使用3％的DSS诱导七天。PSMP腺病毒注射量为1X10^9/50μl PBS/只，提前24小时注射。3D5的注射量为10mg/kg，隔天注射。

图14和图15显示DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，将结肠进行匀浆，检测其炎症因子的表达量。

图16显示PSMP对于PC3细胞在体内原位成瘤和转移成瘤的影响。其中，A.PC3细胞经过腋窝皮下注射在裸鼠的腋下成瘤后经过瘤旁注射PSMP蛋白和3D5中和抗体治疗最后的瘤体大小；B.对三组成瘤进行称重后的统计结果，PSMP组与3D5组的成瘤重量有显著性的差异；C.在成瘤过程中，不同时间点测量成瘤的体积，箭头表示瘤旁注射；D.对裸鼠进行尾静脉注射PC3细胞，形成转移瘤模型，监测中和抗体治疗组和对照组裸鼠的死亡时间，统计生存期。

图17显示PSMP在小鼠急性肝损伤模型中的表达以及PSMP对急性肝损伤的影响。其中，A.PSMP微球检测系统检测正常小鼠和急性肝损伤小鼠的肝组织匀浆中PSMP的表达水平，0.01<*<0.05；B&D.正常小鼠、CCl4诱导急性肝损伤小鼠、CCl4+AD-PSMP肝损伤小鼠三组的小鼠肝脏称重，统计上调PSMP后肝脏的重量和HE染色下肝脏组织的损伤与对照组相比的统计差异，标尺＝50μm；C.对小鼠的正常肝组织和急性肝损伤肝组织进行免疫组化的染色检测PSMP和CCL2的表达，标尺＝200μm。

图18显示采用CBA方法检测PSMP在小鼠肺纤维化模型中的表达量。

图19显示利用肝癌组织芯片和肝癌病程芯片检测PSMP的表达与肝癌发生之间的关系。其中，A.PSMP的兔多抗对肝细胞肝癌和癌旁组织进行免疫组化染色，检测PSMP在该组织的表达情况，标尺＝100μm；B.对肝细胞肝癌病人的癌组织和癌旁的PSMP表达情况进行评分统计后，比较肝癌与癌旁之间的差异，***<0.005；C.对肝癌发病的不同阶段的病人的肝组织进行免疫组化染色，对PSMP的表达进行评分，统计，0.01<**<0.005；D.对有肝癌病人生存期随访的肝组织芯片进行免疫组化染色后，根据PSMP的表达评分不同统计，不同组之间的生存率的差异；E.PSMP在癌旁的表达水平与肝癌组织表达水平相同的病人中根据PSMP的表达评分不同统计，不同组之间的生存率的差异；F.PSMP在癌旁的表达水平高于肝癌组织表达水平相同的病人中根据PSMP的表达评分不同统计，不同组之间的生存率的差异。

图20显示利用肺癌组织芯片检测PSMP在肺癌组织中的表达与肺癌发生的关系。其中，A.对肺腺癌组织和肺腺癌癌旁组织进行免疫组化染色检测PSMP的表达水平；B.对肺腺癌病人的肺组织芯片进行免疫组化染色检测PSMP的表达水平后，对PSMP的表达进行评分分组后统计表达高中低(3，2，1)三组病人的生存期。

图21显示人来源的多肿瘤疾病芯片的免疫组织化学染色，染色使用的抗体是PSMP单克隆抗体，使用浓度为20μg/mL。图中所列5种器官肿瘤及瘤旁组织的染色结果，图中标尺长度为100μm。

图22显示检测PSMP在结肠多疾病中表达情况。结肠多疾病组织来源于结肠多疾病芯片，PSMP检测抗体为PSMP兔多克隆抗体，使用浓度为5μg/mL。标尺为100μm。

图23显示用5‘race扩增方法得到小鼠来源的单克隆抗体3D5重链和轻链的可变区。

图24显示从单克隆抗体3D5的cDNA文库中扩增出3D5重链和轻链的全长核苷酸序列。

图25显示共转染含有3D5重链和轻链基因的质粒的293T上清中表达了重链和轻链。

图26显示共转染含有3D5重链和轻链基因的质粒的293T上清能识别PSMP蛋白，并且识别具有浓度依赖性。

图27显示用5‘race扩增方法得到小鼠来源的单克隆抗体4E7重链和轻链的可变区。

图28显示从单克隆抗体4E7的cDNA文库中扩增出4E7重链和轻链的全长核苷酸序列。

具体实施方式

以下针对前述的发明内容就不同的实施方式并结合附图进行较为详细的描述。应当理解，这些描述以及后面所列的具体实施例只是用来进一步说明本发明的技术内容，而不是用来限制本发明的保护范围。

实施例1.构建pET32a-PSMP-his6融合蛋白原核表达质粒，用于表达PSMP-his6原核蛋白

一、方法：

将PSMP编码序列(SEQ ID NO.3)插入pET32a(Novagen公司)表达载体，构建pET32a-PSMP-his6原核表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用博迈德小提试剂盒提取质粒，用于后续原核表达宿主菌转化。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例2.PSMP-his6原核蛋白的制备

一、方法：

将pET32a-PSMP-his6原核表达质粒转染入BL21宿主菌后,280rpm/min 37℃LA培养基中培养，待菌生长至OD 0.6时，加入IPTG终浓度为0.2mM 250rpm/min 26℃诱导过夜后，离心后弃去培养基，PBS 7.4重悬，超声破碎菌体。收获破碎菌体后上清液和沉淀，经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色，可见上清中分泌的PSMP-his6蛋白较少，绝大部分蛋白在包涵体中。收集超声破碎菌体后的沉淀，经12.5％SDS-PAGE电泳，一小部分考马斯亮蓝染色，通过染色确定PSMP-his6包涵体蛋白的位置，把未染色的部分对应的条带切下，碾碎，溶于PBS 7.4中备用。

二、结果：

如图1所示，纯化后的包涵体蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中用箭头指示的PSMP-his6为目的蛋白条带。

BCA定量结果示纯化后的PSMP-his6浓度为3μg/μl。

实施例3.PSMP原核蛋白免疫小鼠，筛选得到阳性细胞株

一、方法：

8M尿素溶解包涵体后，蛋白电泳，考马斯亮蓝染色确定PSMP的纯度后，进行透析复性，最终将约3mg的PSMP溶解在PBS里。免疫小鼠及杂交瘤细胞融合是由北京京天成生物科技公司完成。抗体的鉴定包括westernblot识别重组PSMP原核蛋白、重组PSMP真核蛋白、表达PSMP的293T细胞裂解液、内源性PSMP蛋白后筛选出14株克隆，对其中的三株进行进一步进行抗体亚型的鉴定。

进一步采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体与纯化：在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，经体内诱生后收集腹水，将腹水离心去除脂类等杂质，分离获得的单克隆抗体采用Protein G Sepharose纯化；

二、结果：

如图2所示，纯化获得的PSMP原核蛋白存在一定量的高聚体，PAGE结果与Westernblot结果一致。如图3所示，选定的14株单抗克隆的编号分别为1B1、2G11、2H11、2H8、2G8、2G9、3D5、3F4、4A8、4C1、4D6、4D9、4E7、4F6均可识别PSMP原核蛋白。如图4所示，2G11、2H8、3D5、3F4、4C1、4D9、4E7、4F6均可识别内源性PSMP蛋白。如图5所示，3D5、4E7、2G11均可通过免疫细胞化学识别PC3内源性PSMP蛋白。如图6所示4E7可以识别PSMP的多肽60#：DTSQHPIDFPAGCE，而3D5、2G11四段多肽都不识别。多肽59#：CHYEGKYFTLGESWLRKDCF(SEQNO.19)；多肽60#：DTSQHPIDFPAGCE(SEQ NO.20)；多肽61#：SLVQKSDPRLPCKGGGPDPEWGS(SEQ NO.21)；多肽62#：PGAPAPHSS(SEQ NO.22)。如图7所示，结果显示真核表达细胞分泌的抗体3D5重链为IgG 1型，轻链为κ；4E7重链为IgG2a型；2G11重链为IgG1型。

实施例4.流式蛋白定量CBA(Cytometric Bead Array)检测系统的建立

一、方法：

用抗PSMP的兔多抗作为捕获抗原，小鼠来源的单克隆抗体3D5作为检测抗原，组合进行双抗夹心ELISA实验。鉴定合格后，将PSMP的兔多抗包被到0.38μm的eBioscience公司来源的微球上，和鼠单抗3D5以5μg/ml的浓度作为检测抗体，以PE标记的兔抗小鼠的IgG作为二抗，最终流式细胞仪检测不同浓度抗原对应的微球荧光强度，用PSMP的含量的对数和荧光强度值进行线性拟合，得到标准曲线。因此建立了检测PSMP的CBA系统，用于检测待测样本中PSMP的表达量。

二、结果：

如图8所示，3D5与兔抗PSMP多抗组合做ELISA识别真核PSMP所做的标准曲线，双抗夹心的ELISA可以识别100pg级别的PSMP蛋白。如图9所示，3D5与兔多抗组合形成CBA鉴定系统，能识别10pg级别的PSMP蛋白。

实施例5.小鼠来源的抗PSMP的单克隆抗体的中和活性的鉴定

一、方法：

通过将合适比例的PSMP真核蛋白和单克隆抗体混合后，单克隆抗体可以封闭PSMP真核蛋白引起过表达CCR2B的HEK293细胞的趋化作用。

首先如前所述将pcDB-CCR2B质粒电转至HEK293细胞，培养48小时后在BoydenChamber小室中进行趋化实验，PSMP的趋化浓度为7、70、700ng/ml，分为四组，其中三组分别与浓度为10、10、50μg/ml的3D5、4E7、2G11室温30分钟，进行趋化实验。4.5个小时后对趋化进行染色，计数。

二、结果：

如图10所示，PSMP可以引起过表达CCR2B的HEK293细胞的趋化，并且有一定的浓度梯度依赖性。如果加入3D5、4E7到PSMP中预孵育后，可以明显抑制PSMP对HEK293细胞的趋化，而2G11则不能明显抑制PSMP对HEK293细胞的趋化作用。另一方面，如图11所示，CCR2B的已知阳性配体CCL2引起过表达CCR2B的HEK293细胞趋化作用不会被3D5和4E7抑制，说明3D5、4E7对PSMP的趋化抑制具有特异性。

实验例6.抗PSMP的单克隆抗体治疗小鼠溃疡性结肠炎

一、方法：

实验一：第一组小鼠正常饮水，第二组小鼠用3％的DSS饲喂一周。一周后处死取结肠，将小鼠结肠组织提取mRNA，进行实时定量检测PSMP的表达。取远端结肠组织进行包埋，进行组化染色。

实验二：第一组小鼠正常饮水，第二组小鼠饲喂3％DSS前24小时结肠感染1X10^9pfu/只对照腺病毒Ad-Null，诱导一周。第三组小鼠感染同等剂量的PSMP腺病毒Ad-PSMP。一周后处死小鼠，测量其体重和结肠长度的变化。

实验三：用3％的DSS饲养，使其自由饮水一周，制造小鼠的溃疡性结肠炎模型。将6到8周的雄性小鼠随机分成三组，第一组正常饮水，第二组给予3％的DSS自由饮水一周，同时在第0，2，4，6天腹腔注射纯化的小鼠IgG，注射剂量为5mg/kg，第三组与第二组同样处理，在同样天数注射同等剂量的3D5。期间检测三组小鼠体重变化。一周后，处死小鼠，测量结肠长度，将结肠组织研磨，用CBA法检测细胞因子浓度。

二、结果：

如图12所示，DSS组小鼠结肠组织在mRNA水平和蛋白水平都高表达PSMP，经组化染色后DSS组PSMP表达量也明显高于对照组。PSMP腺病毒注射组小鼠的结肠炎症更加严重，结肠长度相比空载组更短。

如图13所示，注射3D5中和抗体的小鼠组与小鼠IgG组相比，体重减轻改善，结肠长度更长，上皮细胞损伤和减轻细胞浸润都减轻。如图14所示，3D5中和抗体干预组炎症细胞因子的分泌减少。说明3D5在体内实验中也对PSMP具有中和作用。

实验例7.抗PSMP的单克隆抗体抑制PC3原位皮下成瘤和PC3肿瘤细胞引起的小鼠死亡

一、方法：

将6到8周的雄性裸鼠的双侧腋下分别注射5X10^6细胞/100μlPBS，3周后测量到腋下成瘤，根据成瘤大小随机分成三组，第一组作为对照，第二组每周在瘤旁注射10μg的PSMP蛋白，第三组每周在瘤旁注射20μg的3D5。在此过程中，实时检测瘤体大小，直至第8周，处死小鼠，取出瘤体。

尾静脉注射PC3细胞到裸鼠体内，同时一组作为对照，另一组对小鼠进行腹腔注射中和抗体。检测裸鼠的生存率。

二、结果：

如图16A，16B，16C所示，3D5中和抗体治疗组的瘤体体积和重量都比对照组小，而PSMP组的瘤体体积和重量比对照组大。PSMP具有促进PC3增殖的作用，而中和抗体能抑制PSMP对肿瘤细胞的增殖。如图16D所示，注射3D5中和抗体的裸鼠死亡率明显低于对照组。

实施例8.PSMP在急性肝损伤中表达升高

一、方法：

将6到8周的雄性小鼠随机分为四组，第一组在腹腔注射腺病毒空载24小时后注射橄榄油作为对照，第二组在第一组在腹腔注射腺病毒PSMP 24小时后注射橄榄油，第三组在腹腔注射腺病毒空载24小时后注射CCl4诱导急性肝损伤，第四组在腹腔注射腺病毒PSMP24小时后注射CCl4诱导急性肝损伤。

二、结果：

如图17A，17C所示，急性肝损伤组PSMP的表达升高。如图17B所示，诱导急性肝损伤前注射PSMP腺病毒组肝重增加。结果显示PSMP的表达与急性肝损伤的严重程度有密切的关系。

实施例9.PSMP在肺纤维化中的表达

一、方法:

使用博莱霉素诱导小鼠的肺纤维化模型，处死当日取小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)。采用CBA检测系统的方法对BALF进行PSMP蛋白水平的检测。

二、结果：

如图18所示，肺纤维化组小鼠的支气管肺泡灌洗液中PSMP的表达水平明显比对照组高。

实施例10.PSMP在肿瘤中的表达水平与生存率关系

一、方法：

对从西安艾丽娜生物技术有限公司购买的人类的多器官肿瘤组织芯片，进行PSMP免疫组化的染色。并结合患者的资料进行生存率与染色程度的统计。

二、结果：

如图19所示，在肝癌中，PSMP在癌旁表达较高，且随着PSMP表达水平的升高，病人的死亡率在下降。并且可见在肝癌进程中的肝炎、肝硬化中PSMP的表达量增高。如图20所示，在肺腺癌中，癌比癌旁表达量高，且随着PSMP的表达升高，患者生存率提高。如图21所示，显示PSMP在多种器官的肿瘤疾病的癌和癌旁的表达差异。如图22所示，PSMP在炎症相关的结肠炎和结肠癌中表达升高。提示PSMP与这些疾病存在相关性，可能作为新的治疗靶点。

实施例11.单克隆抗体3D5轻链和重链可变区基因的测序和克隆

一、方法：

利用5’race技术，根据试剂盒说明进行操作。其中3D5重链恒定区引物H-GSP1：TCCAGGTCACTGTCACTGGC(SEQ ID NO.23)；3D5重链恒定区引物H-GSP2：GTCACCATGGAGTTAGTTTG(SEQ ID NO.24)；轻链恒定区引物K-GSP1：GTATAGCTGTTATGTCGTTC(SEQ ID NO.25)；轻链恒定区引物K-GSP2：CACTGCCATCAATCTTCCAC(SEQ ID NO.26)引物均由擎科公司合成。将扩出的条带跑胶回收，克隆到T载体上进行测序。根据得到的可变区序列，设计引物，利用3D5单克隆细胞cDNA文库扩出小鼠重链和轻链全长，克隆到pcDNA3.1载体上。重链的正向引物：CTAGCTAGCGCCACCATGGGATGGAGCTGGATC(SEQ ID NO.27)；轻链的正向引物：CTAGCTAGCGCCACCATGCATCAGACCAGCATG(SEQ ID NO.28)；其中下划线部分为NheI的酶切位点。重链的反向引物：CCCAAGCTTTCATTTACCAGGAGAGTGGGAG(SEQ ID NO.29)；轻链的反向引物：CCCAAGCTTTCAACACTCATTCCTGTTGAAG(SEQ ID NO.30)；其中下划线部分为HindIII的酶切位点。PCR产物进行1％的琼脂糖胶电泳后通过紫外线照射拍摄。

将获得重链全长基因质粒和轻链全长基因质粒以2：1的比例共转染到293T细胞中，四天后取293T的表达上清做western blotting和ELISA检测，分别确定上清中重链和轻链是否表达，以及表达上清对PSMP识别的特异性。其中以3D5作为阳性对照，以未转染质粒的293T上清作为阴性对照。

二、结果：

如图23所示，重链可变区大小500bp，轻链可变区大小约500bp。经过测序重链可变区多核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；轻链可变区多核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；如图24重链全长基因约1400bp，轻链全长基因约为750bp。经pubmed blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析重链可变区SEQ ID NO.3互补决定区序列为SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQID NO.9所示，轻链可变区SEQ ID NO.4互补决定区序列为SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12所示。

如图25所示共转染含有3D5重链和轻链基因的质粒的293T上清中表达了重链和轻链，其中重链大小约为55kD，与预测大小相符，轻链大小约为40kD，比预测的20kD要大，可能是轻链存在二聚体。如图26所示共转染含有3D5重链和轻链基因的质粒的293T上清能识别PSMP蛋白，并且识别具有浓度依赖性。说明共转染的293T上清中表达了3D5的重链和轻链，并且该表达的抗体能够特异地识别PSMP蛋白。

实施例12.单克隆抗体4E7轻链和重链可变区基因的测序和克隆

一、方法：

利用5’race技术，根据试剂盒说明进行操作。其中4E7重链恒定区引物H2b-GSP1：TCCAAGTCACAGTCACTGAC(SEQ ID NO.47)；4E7重链恒定区引物H2b-GSP2：GTCACAGAGGAACCAGTTGT(SEQ ID NO.48)；轻链恒定区引物K-GSP1：GTATAGCTGTTATGTCGTTC(SEQ ID NO.25)；轻链恒定区引物K-GSP2：CACTGCCATCAATCTTCCAC(SEQ ID NO.26)引物均由擎科公司合成。将扩出的条带跑胶回收，克隆到T载体上进行测序。根据得到的可变区序列，设计引物，利用4E7单克隆细胞cDNA文库扩出小鼠重链和轻链全长，克隆到pcDNA3.1载体上。重链的正向引物：CTAGCTAGCATGATCAGTGTCC

(SEQ ID NO.49)；轻链的正向引物：CTAGCTAGCATGGAATCACAGAC(SEQ ID NO.51)；其中下划线部分为NheI的酶切位点。重链的反向引物：TGCTCTAGATCATTTACCCGG(SEQ IDNO.50)；轻链的反向引物：TGCTCTAGATCAACACTCATTC(SEQ ID NO.52)；其中下划线部分为Xbal的酶切位点。PCR产物进行1％的琼脂糖胶电泳后通过紫外线照射拍摄。

二、结果：

如图27所示，重链可变区大小500bp，轻链可变区大小约500bp。经过测序重链可变区多核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，编码SEQ ID NO.31所示氨基酸序列；轻链可变区多核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，编码SEQ ID NO.32所示氨基酸序列；如图28重链全长基因约1400bp，轻链全长基因约为750bp。经pubmed blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析重链可变区SEQ ID NO.31互补决定区序列为SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37所示，轻链可变区SEQ ID NO.32互补决定区序列为SEQ ID NO.38，SEQ IDNO.39，SEQ ID NO.40所示。

本文通过一些实施方式和具体的实施例对本发明进行了说明，而且还针对许多细节进行了描述。对于本领域技术人员而言，本发明可以通过采用一些其它的具体实施方式来实现，也可以在不偏离本发明主旨的情况下针对所披露的内容进行调整和变化。本发明的内容应当包括针对本文所披露内容的调整或变化，或者说应当包括由所附权利要求书所定义的以及与之等同的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 抗PSMP的单克隆抗体及其用途

<130> P152850CN3

<160> 52

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 人PSMP 分泌蛋白氨基酸序列

<400> 1

Lys Cys Tyr Phe Gln Ala Gln Ala Pro Cys His Tyr Glu Gly Lys Tyr

5 10 15

Phe Thr Leu Gly Glu Ser Trp Leu Arg Lys Asp Cys Phe His Cys Thr

20 25 30

Cys Leu His Pro Val Gly Val Gly Cys Cys Asp Thr Ser Gln His Pro

35 40 45

Ile Asp Phe Pro Ala Gly Cys Glu Val Arg Gln Glu Ala Gly Thr Cys

50 55 60

Gln Phe Ser Leu Val Gln Lys Ser Asp Pro Arg Leu Pro Cys Lys Gly

65 70 75 80

Gly Gly Pro Asp Pro Glu Trp Gly Ser Ala Asn Thr Pro Val Pro Gly

85 90 95

Ala Pro Ala Pro His Ser Ser

100

<210> 2

<211> 420

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 人PSMP分泌蛋白的多核苷酸序列

<400> 2

atggccctaa ggatgctctg ggctggacag gccaagggga tcctaggagg ctgggggatc 60

atctgcttgg tgatgtctct actcctccag cacccaggag tctacagcaa gtgctacttc 120

caagctcaag ccccctgtca ctatgagggg aaatatttta ccctgggtga gtcttggctc 180

cgcaaggact gtttccattg cacctgtctg catcctgttg gcgtgggctg ctgtgacacg 240

tcccagcatc ccatcgactt cccggctggg tgtgaggtac gtcaggaggc aggaacctgc 300

cagttctcct tggtgcaaaa atctgaccct cggctgccct gcaaaggggg agggcctgac 360

ccagaatggg gctcagccaa cacccctgtt cctggggctc ctgctcccca ctccagctaa 420

<210> 3

<211> 138

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5中和抗体重链可变区的氨基酸序列

<400> 3

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 10 15

Val Phe Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Met Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Ala Se rGlu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Ala Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 4

<211> 137

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5中和抗体轻链可变区的氨基酸序列

<400> 4

Met His Gln Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Leu Val

5 10 15

Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val

20 25 30

Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val

35 40 45

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser Trp

50 55 60

Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala

65 70 75 80

Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

85 90 95

Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

100 105 110

Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Thr Phe Gly

115 120 125

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

130 135

<210> 5

<211> 414

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5中和抗体重链可变区的多核苷酸序列

<400> 5

atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt gttctctgag 60

gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggttactc atttactggc tactttatga actgggtgat gcagagccat 180

ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt aatccttaca atggtgatac tttctacaac 240

cagaagttca agggcaaggcc acattgact gtagacaaat cctctagtac agcccacatg 300

gagctccgga gcctggcatct gaggactct gcagtctatt attgtgcaag aggtggggat 360

ggttactacg cgtttgcttac tggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 414

<210> 6

<211> 411

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5中和抗体轻链可变区的多核苷酸序列

<400> 6

atgcatcaga ccagcatggg catcaagatg gaatcacaga ctctggtctt catatccata 60

ctgctctggt tatatggtgc tgatgggaac attgtaatga cccaatctcc caaatccatg 120

tccatgtcag taggagagag ggtcaccttg agctgcaggg ccagtgagaa tgtgggtact 180

tatgtatcct ggtatcaaca gaaaccagag cagtctccta aactgctgat atacggggca 240

tccaaccggt acactggggt ccccgatcgc ttcacaggca gtggatctgc aacagatttc 300

actctgacca tcagcagtgt gcaggctgaa gaccttgcag attatcactg tggacagagt 360

tacagctata tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaacg g 411

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区氨基酸序列CDR1

<400> 7

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe

5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区氨基酸序列CDR2

<400> 8

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr

5

<210> 9

<211> 2

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区氨基酸序列CDR3

<400> 9

Ala Arg

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区氨基酸序列CDR1

<400> 10

Glu Asn Val Gly Thr Tyr

5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区氨基酸序列CDR2

<400> 11

Gly Ala Ser

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区氨基酸序列CDR3

<400> 12

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr

5

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区多核苷酸序列CDR1

<400> 13

ggttactcat ttactggcta cttt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区多核苷酸序CDR2

<400> 14

attaatcctt acaatggtga tact 24

<210> 15

<211> 6

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链的互补决定区多核苷酸序CDR3

<400> 15

gcaaga 6

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR1

<400> 16

gagaatgtgg gtacttat 18

<210> 17

<211> 9

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR2

<400> 17

ggggcatcc 9

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR3

<400> 18

ggacagagtt acagctat 18

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 多肽59#

<400> 19

Cys His Tyr Glu Gly Lys Tyr Phe Thr Leu Gly Glu Ser Trp Leu Arg

5 10 15

Lys Asp Cys Phe

20

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 多肽60#

<400> 20

Asp Thr Ser Gln His Pro Ile Asp Phe Pro Ala Gly Cys Glu

5 10

<210> 21

<211> 23

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 多肽61#

<400> 21

Ser Leu Val Gln Lys Ser Asp Pro Arg Leu Pro Cys Lys Gly Gly Gly

5 10 15

Pro Asp Pro Glu Trp Gly Ser

20

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 多肽62#

<400> 22

Pro Gly Ala Pro Ala Pro His Ser Ser

5

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链恒定区引物H-GSP1

<400> 23

tccaggtcac tgtcactggc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链恒定区引物H-GSP2

<400> 24

gtcaccatgg agttagtttg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 轻链恒定区引物K-GSP1

<400> 25

gtatagctgt tatgtcgttc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 轻链恒定区引物K-GSP2

<400> 26

cactgccatc aatcttccac 20

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链的正向引物

<400> 27

ctagctagcg ccaccatggg atggagctgg atc 33

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的正向引物

<400> 28

ctagctagcg ccaccatgca tcagaccagc atg 33

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5重链的反向引物

<400> 29

cccaagcttt catttaccag gagagtggga g 31

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 3D5轻链的反向引物

<400> 30

cccaagcttt caacactcat tcctgttgaa g 31

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7中和抗体重链可变区的氨基酸序列

<400> 31

Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly

5 10 15

Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Pro

115

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7中和抗体轻链可变区的氨基酸序列

<400> 32

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln Lys Val

5 10 15

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln

20 25 30

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser

85 90 95

Thr Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 33

<211> 417

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7中和抗体重链可变区的多核苷酸序列

<400> 33

atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120

tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 240

gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag atcccct 417

<210> 34

<211> 333

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7中和抗体轻链可变区的多核苷酸序列

<400> 34

atgacacagt ctccatcctc cctggctatg tcagtaggac agaaggtcac tatgagctgc 60

aagtccagtc agagcctttt aaatagtagc aatcaaaaga actatttggc ctggtaccag 120

cagaaaccag gacagtctcc taaacttctg gtatactttg catccactag ggaatctggg 180

gtccctgatc gcttcatagg cagtggatct gggacagatt tcactcttac catcagcagt 240

gtgcaggctg aagacctggc agattacttc tgtcagcaac attatagcac tacgtggacg 300

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgg 333

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区氨基酸序列CDR1

<400> 35

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp

5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区氨基酸序列CDR2

<400> 36

Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr

5

<210> 37

<211> 2

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区氨基酸序列CDR3

<400> 37

Ala Arg

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区氨基酸序列CDR1

<400> 38

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr

5 10

<210> 39

<211> 3

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区氨基酸序列CDR2

<400> 39

Phe Ala Ser

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区氨基酸序列CDR3

<400> 40

Gln Gln His Tyr Ser Thr Thr Trp Thr

5

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区多核苷酸序列CDR1

<400> 41

ggctacgcat tcagtagctc ttgg 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区多核苷酸序列CDR2

<400> 42

atttatcctg gagatggaga tact 24

<210> 43

<211> 6

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链的互补决定区多核苷酸序列CDR3

<400> 43

gcaaga 6

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR1

<400> 44

cagagccttt taaatagtag caatcaaaag aactat 36

<210> 45

<211> 9

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR2

<400> 45

tttgcatcc 9

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的互补决定区多核苷酸序列CDR3

<400> 46

cagcaacatt atagcactac gtggacg 27

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链恒定区引物H2b-GSP1

<400> 47

tccaagtcac agtcactgac 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链恒定区引物H2b-GSP2

<400> 48

gtcacagagg aaccagttgt 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链的正向引物

<400> 49

ctagctagca tgatcagtgt cc 22

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7重链的反向引物

<400> 50

tgctctagat catttacccg g 21

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的正向引物

<400> 51

ctagctagca tggaatcaca gac 23

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 4E7轻链的反向引物

<400> 52

tgctctagat caacactcat tc 22

Claims

1.一种抗PSMP的单克隆抗体，其由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.31和SEQID NO.32所示氨基酸序列组成。

2.一组多核苷酸，其包含：

(1)SEQ ID NO.5所示编码SEQ ID NO.3的多核苷酸序列，和SEQ ID NO.6所示编码SEQID NO.4的多核苷酸序列；或，SEQ ID NO.33所示编码SEQ ID NO.31的多核苷酸序列，和SEQID NO.34所示编码SEQ ID NO.32的多核苷酸序列；或

(2)编码权利要求1所述氨基酸序列的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸或其互补序列，其包含编码权利要求1所述氨基酸序列的多核苷酸序列。

4.一种抗PSMP的单克隆抗体，其中所述抗体的重链的互补决定区氨基酸序列CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，轻链的互补决定区氨基酸序列CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；或，其中所述抗体的重链的互补决定区氨基酸序列CDR1、CDR2、CDR3如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37所示，轻链的互补决定区氨基酸序列CDR1、CDR2、CDR3如SEQ ID NO.38、SEQID NO.39、SEQ ID NO.40所示。

5.一组多核苷酸，其包含：

(1)SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示分别编码SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9的多核苷酸序列，和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示分别编码SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12的多核苷酸序列；或，SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43所示分别编码SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37的多核苷酸序列，和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示分别编码SEQ IDNO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40的多核苷酸序列；或

(2)编码权利要求4所述氨基酸序列的多核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸或其互补序列，所述多核苷酸包含编码权利要求4所述氨基酸序列的多核苷酸序列。

7.一种基因工程载体，其含有权利要求2、3、5或6所述的多核苷酸。

8.一种药物组合物，其含有：权利要求1或4所述的抗体，权利要求2、3、5或6所述的多核苷酸和/或权利要求7所述的基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种使用权利要求1或4所述的抗体或权利要求2、3、5或6所述的多核苷酸和/或权利要求7所述的基因工程载体在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗的疾病为：自身免疫病、肿瘤转移、炎症反应、肝癌，肺腺癌，胰腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、破骨细胞瘤、动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压疾病、心力衰竭、肥胖和胰岛素抵抗、多发性硬化、过敏性疾病、移植排斥。

10.权利要求9所述的应用，其中所述药物用于免疫调节。

11.权利要求9所述的应用，其中所述炎症反应为肺部炎症、肝部炎症，消化道炎症或关节炎。

12.一种制备试剂的方法，所述试剂包含权利要求1或4所述的抗体或权利要求2、3、5或6所述的多核苷酸，用于检测样品中PSMP表达水平。

13.一种制备试剂的方法，所述试剂包含权利要求1或4所述的抗体或权利要求2、3、5或6所述的多核苷酸，作为多肽药物和商品化试剂。