CN103204921A

CN103204921A - 具有趋化活性的分泌蛋白及其编码序列和用途

Info

Publication number: CN103204921A
Application number: CN2012100150781A
Authority: CN
Inventors: 王应; 马大龙; 孙倩影; 裴晓磊; 张焱; 郭嫦媛; 张扬; 綦辉; 徐恩泉; 张颖妹; 莫晓宁; 王平章; 郭帅; 石太平
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明提供了具有白细胞趋化功能的SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的MSMP分泌蛋白，编码该蛋白的多核苷酸，以及含有多核苷酸的基因工程载体。还涉及药物组合物，含有所述蛋白或多核苷酸、基因工程载体和/或宿主细胞，及药物可接受的盐、载体或赋形剂。还涉及体外检测所述蛋白或多核苷酸表达水平变化的方法。还有，所述蛋白或多核苷酸能用于预防和/或治疗病毒感染、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化等心血管病，以及用于商品化试剂研究上述病状。还涉及以所述蛋白或多核苷酸作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂。

Description

具有趋化活性的分泌蛋白及其编码序列和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及具有多种功能的蛋白及编码其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物，本发明还涉及所述蛋白和多核苷酸及其药物组合物的应用。

背景技术

细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。趋化因子是一类具有趋化作用的细胞因子，在机体的病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病等过程中发挥重要作用。目前，趋化因子已经成为国内外研究的热点之一。

人类基因组框架图完成10周年，目前的任务是阐明数以万计的基因及其产物的功能，深入认识疾病发生发展的相关基因和分子机理，发现疾病易感基因、抗病基因、药物敏感基因，发现新的药物作用靶点和新的生物技术药物。这些工作将花费远比基因序列分析更多的时间、更大的投入和更繁重的工作量，也更加具有挑战性。

趋化因子超家族成员具有一定的同源结构，根据一级结构中保守的4、6个Cys的前2个Cys的排列方式，可将趋化因子超家族分为CXC、CC、C和CX3C四个亚家族，它们的功能除趋化活性外，还具有细胞活化等多种生物学效应。这些趋化因子与七次跨膜的G蛋白偶联受体特异结合，通过G蛋白转导信号至细胞内，发挥其生物学活性。迄今为止，大约50种趋化因子和20种趋化因子受体被发现，其中多种趋化因子可以通过同一趋化因子受体发挥趋化作用，同一趋化因子还可通过作用于几种趋化因子受体发挥趋化作用。

近年来，免疫疗法发生了变化，从基础向临床的转化到药物开发成为更为重要的途径。通过描述免疫系统相关趋化因子及其配体如何组织在生理和病理活动中发挥作用，暗示趋化因子有强大的临床应用前景，可以用作免疫疗法的治疗靶或辅助治疗剂或主要疗法。

本发明人利用人类功能基因组学数据库，生物信息学分析，分子生物学、细胞生物学及免疫学技术，从人类基因数据库中发掘具有重要生理、病理意义的新基因，为阐明疾病的发病机制、发现疾病标志物、基因组药物靶标(开发化合物、抗体、多肽药物)或基因工程药物提供基础。

基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测方法包括反转录-聚合酶链式反应、蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学等检测方法。可以应用于实验研究以及临床生理和病理疾病(病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病)中细胞和组织的基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测。

具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质，可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究，疾病标志物的研究和临床检测，及研究和临床的药物的治疗。

发明内容

利用生物信息学技术，本发明从新基因中首次成功地筛选出了新的具有趋化活性的细胞因子，即MSMP(Microseminoprotein，prostate associated)，其核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NP_001037729.1。NM_001044264.2编码103个氨基酸，在体外具有趋化活性。本发明经蛋白表达、纯化、N端测序和趋化功能检测的实验证明MSMP具有趋化活性的分泌蛋白为其C端103个氨基酸序列。本发明还包括在MSMP的基础上陆续得到的其它一些新的蛋白。

本发明在一方面提供了一种具有趋化活性的蛋白。

本发明在另一方面提供了一种编码本发明的蛋白的多核苷酸。

本发明在另一方面提供了一种含有本发明的多核苷酸的基因工程载体。

本发明在另一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的蛋白、多核苷酸和/或基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白或多核苷酸在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

本发明在另一方面提供了检测待测样品中本发明的蛋白或多核苷酸的表达水平是否变化的方法。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白或多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

本发明在另一方面提供了以本发明的蛋白或多核苷酸或本发明蛋白的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供一种蛋白，该蛋白包含：

(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

其中，如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的蛋白，为MSMP蛋白的C末端103个氨基酸序列(MSMP蛋白的核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001044264.2)；在本发明中称为MSMP分泌蛋白。

本发明蛋白还包括具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO：1所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

在本发明的一些优选实施方式中，本发明的蛋白包含：

(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白至少90％同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

再者，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)具有与(1)所述多核苷酸至少80％同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为MSMP分泌蛋白103个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码MSMP分泌蛋白，也可以在上述蛋白的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

在本发明的一些实施方式中，本发明还包括具有与编码MSMP分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70％、优选至少80％、更为优选至少85％，更进一步优选至少90％、特别优选至少95％，更为特别优选至少98％同源性的多核苷酸序列。优选地，本发明的多核苷酸为与编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

还有，根据本发明的一些实施方式，本发明还涉及一种基因工程载体，该基因工程载体含有编码本发明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供所述MSMP分泌蛋白在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

本发明通过实验证明，本发明的MSMP分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性，而其又来源于人类本身，所以MSMP分泌蛋白在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供所述MSMP分泌蛋白在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中，所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录-聚合酶链式反应、蛋白质印迹或ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

附图说明

图1显示根据本发明的实时方式利用Western Blotting检测MSMP分泌蛋白的表达结果。加入Anti-c-myc抗体作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG二抗反应，经Odyssey Imaging System扫描。图中为MSMP(NM_001044264.2)-myc-his过表达的上清，在26kD稍下方有一条清晰条带。

图2显示MSMP分泌蛋白上清液的趋化作用。其中pcDB表达上清为对照，可见MSMP具有明显的趋化作用。

图3显示纯化后的MSMP真核蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中，箭头所指为MSMP-his6真核蛋白。第1泳道为分子量标准；第2泳道为MSMP上样10μl；第3泳道为BSA 0.2μg；第4泳道为BSA0.5μg；第5泳道为BSA 1μg。

图4A和4B显示MSMP-myc-his6真核蛋白N端测序结果。其中，图4A显示用于测序的MSMP-myc-his6真核蛋白转至PVDF膜上，经考马斯亮蓝染色的结果，箭头所指为MSMP-myc-his6真核蛋白；图4B具体地显示MSMP(NM_001044264.2)-myc-his在26kD稍下方处一条清晰条带的N端测序的10个氨基酸的结果。

图5A和5B显示MSMP-myc-his6真核蛋白质对单核细胞和PBL均具有趋化作用。图5A显示MSMP-myc-his6真核蛋白质对单核细胞的趋化作用，其中CXCL12为阳性对照，可见MSMP1000ng/ml对单核细胞的趋化指数大于2。图5B显示MSMP-myc-his6真核蛋白质对PBL的趋化作用，其中CXCL12为阳性对照，可见MSMP1ng/ml、10ng/ml和1000ng/ml对PBL的趋化指数均大于2。

图6A和4B显示MSMP在人类各组织的表达谱。图中，第1、10泳道为分子量标准；第2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18泳道分别是人的心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血淋巴细胞的cDNA文库。其中，图6A显示以一扩产物稀释50倍为模板，以MSMP(F2，R2)为引物二扩28轮的电泳结果，在323bp处可见一条清晰带；图6B显示以GAPDH(F3，R3)为引物扩增25轮的电泳结果，在496bp处可见一条清晰带，为内部标准。结果显示：MSMP除在肝组织中无表达外，余组织中均见表达，其中胸腺和睾丸中表达较高。

图7显示纯化后的MSMP包涵体蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中，箭头所指为MSMP-his6包涵体蛋白。第1泳道为分子量标准；第2泳道为MSMP上样2μl；第3泳道为BSA 1μg；第4泳道为BSA2μg；第5泳道为BSA 3μg。

图8显示纯化前的兔血清识别HEK293T细胞裂解液中超标达的MSMP-Myc-His6的情况。其中，第2、7泳道为分子量标准，第1、3、6、8泳道均为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞裂解液，第4、9泳道为过表达pcDNA3.1空载体对照，第5、10泳道为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞培养上清，其中，第1、6泳道一抗是1#、2#兔免疫前血清，第3至5、8至10泳道一抗是1#、2#兔免疫后血清。可见，纯化前的兔血清可以在HEK293T细胞裂解液中识别出超标达的MSMP-Myc-His6条带，免疫前兔血清对照则无特异性条带。

图9显示Anti-myc标签抗体识别HEK293T细胞裂解液中超标达的MSMP-Myc-His6的情况。其中，第1泳道为分子量标准，第2、3、4泳道分别为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞裂解液，过表达pcDNA3.1空载体的细胞裂解液对照以及过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞培养上清，经Anti-myc标签抗体做免疫印迹实验证实过表达真实有效。

图10显示纯化后兔血清识别HEK293T细胞裂解液中超标达的MSMP-Myc-His6的情况。其上样顺序同图8，可见纯化后兔血清识别条带更特异。

图11显示纯化后1#抗体对内源性表达MSMP的PC-3细胞进行免疫荧光染色的结果。其中，A、B、C为1#抗体染色结果，D、E、F为相同浓度的同型兔IgG染色结果。B、E为细胞核DAPI染色，C、F为共聚焦叠加图像。可见，MSMP表达于PC-3细胞的胞质中。

图12显示纯化后1#抗体对内源性表达MSMP的PC-3细胞进行免疫细胞化学染色的结果。其中，A、B为1#抗体染色结果，C、D为相同浓度的同型兔IgG染色结果。A、C为放大200倍观察结果，B、D为放大400倍观察结果。可见，MSMP表达于PC-3细胞的胞质中。

图13显示人前列腺癌组织芯片中MSMP的免疫组织化学表达情况。其中，A、B为前列腺癌中低分化染色结果，C、D为该前列腺癌组织周围的结节性增生染色结果。A、C为放大100倍观察结果，B、D为放大400倍观察结果。在前列腺癌中低分化的组织中MSMP的染色评分为+，在前列腺结节性增生中MSMP的表达评分为+++，可见，MSMP在前列腺癌中的表达大于在癌旁的表达。

图14A至图14C显示MSMP真核蛋白对HEK293_CCR2b细胞的趋化作用。其中，图14A显示MSMP真核蛋白对HEK293_CCR2b细胞具有趋化作用。图14B显示同等条件下MSMP真核蛋白对HEK293_CCR5不具有明显趋化作用。图14C显示MSMP真核蛋白与HEK293_CCR2b细胞预孵育后脱敏掉MCP-2对HEK293_CCR2b细胞的趋化作用，MCP-2与HEK293_CCR2b细胞预孵育后脱敏掉MSMP真核蛋白对HEK293_CCR2b细胞的趋化作用，可见，MSMP真核蛋白对于HEK293_CCR2b细胞的趋化作用是特异的。

图15显示MSMP真核蛋白诱导CCR2b-EGFP受体内化的情况。其中A为PBS对照组，A显示EGFP受体融合表达质粒pcDB-CCR2b-EGFP转染进入HEK293细胞后，CCR2b-EGFP融合蛋白表达定位于细胞膜，B显示MCP-2(5μg/ml)可以明显诱导CCR2b-EGFP受体内化，C显示MSMP真核蛋白(5μg/ml)也可诱导CCR2b-EGFP受体内化。D显示BSA(5g/ml)无关蛋白对照未诱导CCR2b-EGFP受体内化。可见，MSMP真核蛋白可特异性诱导CCR2b-EGFP受体内化。

具体实施方式

以下针对前述的发明主题就一些实施方式并结合附图进行较为详细的说明和描述。然而应该理解，这些说明和描述以及后面所列的具体实施例不是用来限制本发明权利要求的范围。

本发明构建了MSMP真核表达质粒pCDNA3.1-MSMP(NM_001044264.2)-MYC-HIS6以及293T真核表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的MSMP重组蛋白。分泌表达的MSMP上清对人外周血单核细胞和人外周血淋巴细胞具有趋化作用。进一步通过SDS-PAGE分离获得MSMP蛋白条带，进行N端测序，得到一种MSMP分泌蛋白，为本发明的实验中在国际上首次发现的MSMP分泌蛋白的成熟形式。同时，本发明进行真核表达得到MSMP真核蛋白。

在本发明所提供的蛋白中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白，为MSMP蛋白的C末端103个氨基酸序列(MSMP蛋白的核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001044264.2)；在本发明中称为MSMP分泌蛋白。本发明蛋白还包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更为特别优选超过99％的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO：1所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明MSMP分泌蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明MSMP分泌蛋白可按照Steward和Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪按固相化学技术合成。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的蛋白。通过简单修改此标准程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。在本发明的一个优选实施方式中，使用自动合成仪制备本发明的蛋白。其中使用α氨基被酸或碱敏感性基团保护的氨基酸。这种保护基应该在肽键形成条件下稳定，又容易除去而不破坏成长的肽链、不会引起其中的任何手性中心外消旋。适当的保护基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本发明肽特别优选的。也可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生本发明的蛋白(具体参见实施例1-4)。在实施例1-4中，将MSMP编码序列插入表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的MSMP重组蛋白，进一步通过SDS-PAGE分离获得MSMP蛋白条带，进行N端测序，得到本发明的蛋白。本领域技术人员能够知道，可以直接使用编码本发明的蛋白的多核苷酸序列产生本发明的MSMP分泌蛋白，例如将编码本发明的蛋白的多核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示的序列或其片段)直接插入表达系统，经表达、纯化，获得本发明的蛋白。或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白。

本领域普通技术人员能够知道，本发明所述的蛋白或其片段可以同其它的蛋白或其片段形成融合蛋白。其它蛋白或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。

本发明还包括具有与编码MSMP分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70％、优选至少80％、更为优选至少85％，更进一步优选至少90％、特别优选至少95％，更为特别优选至少98％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与MSMP分泌蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备MSMP的95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括MSMP分泌蛋白的多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括MSMP分泌蛋白多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的蛋白可以在功能上与本发明的MSMP分泌蛋白相同、相似、或不同，但最好是编码与MSMP分泌蛋白的生物学活性基本相同的蛋白。因此，优选地，本发明的多核苷酸为具有与编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

本发明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明MSMP分泌蛋白的表达。本发明的MSMP分泌蛋白的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列为一种编码本发明蛋白的多核苷酸，其来自人类。所以，优选本发明的多核苷酸包含如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其互补序列。

本发明所涉及的基因工程载体含有编码本发明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。其中普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，它们通常含有两个或两个以上的标记基因，其中一个基因用于选择转化体(transformant)，另一基因则是用于检查载体中是否有外源DNA插入。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立。这类载体除具有普通型载体的特征外，还应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在蛋白编码序列上游可加入适当的前导序列。

合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员所知。本领域普通技术人员应该知道用于构建含有本发明的多核苷酸以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等，高技术通讯11：26-29(1991))、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的实施例1中MSMP编码序列插入pCDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pCDNA3.1-MSMP-myc-his6表达质粒。

本发明所提供的药物组合物，可以包含本发明的蛋白、编码本发明蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的基因工程载体和/或宿主细胞，另外，除了上述活性成分之外，还可以包含一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂的选用取决于，例如药物的施用途径。

本发明通过实验证明，本发明的MSMP分泌蛋白能够用于制备预防和/或治疗病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病的药物。

早期研究发现，趋化因子和趋化因子受体在介导急慢性验证过程中起重要作用。近期研究表明趋化因子和趋化因子受体在生长发育；稳态的维持；骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病；病毒感染；免疫应答；骨髓主细胞的迁移以及自身免疫病等病理生理过程中发生重要的作用。晚近的研究也表明，趋化因子和趋化因子受体在肿瘤发生、发展以及转移的过程中扮演重要的角色。

病毒感染、过敏性疾病、炎症、移植排斥、自身免疫病或肿瘤转移、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等疾病与趋化因子及其受体密切相关，激动剂的脱敏作用，中和抗体等是针对药物靶标的主要治疗手段。本发明通过实验证明，本发明的MSMP分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性，而其又来源于人类本身，所以MSMP分泌蛋白在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

本发明还提供本发明的MSMP分泌蛋白在制备商品化试剂研究病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病的应用。

本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录-聚合酶链式反应、蛋白质印迹或ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

可以采用本领域已知的任何方法检测本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平。优选利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平，例如或蛋白质印迹(Western blotting)或ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。所述待测样品可以从来自受试者的各种细胞或体液获得。PT-PCR主要包括以下步骤：提取总RNA，加入一个与mRNA 3’端互补的引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；以及以cDNA为模板，再加入与cDNA互补的另一引物(两引物位于不同的外显子上，以避免基因组DNA污染)进行PCR扩增。蛋白质印迹主要分三阶段：第一阶段为抗原等蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段为电转移：将在凝胶中已分离的条带转移到硝酸纤维素膜上；第三阶段为显色检测：硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)，依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成显色物的酶反应底物，使条带染色。标记二抗的酶包括辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本发明的一个具体实施方式中，采用辣根过氧化物酶作为标记二抗的酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于临苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。常用的酶标第二抗体已有市售。

本发明还提供本发明的MSMP分泌蛋白在或多核苷酸或MSMP的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

实施例

实施例1、构建pcDNA3.1-MSMP-myc-his6融合蛋白表达质粒

构建pcDNA3.1-MSMP-myc-his6质粒，用于表达MSMP-myc-his6融合蛋白。

一、方法：

将MSMP编码序列(SEQ ID NO：2)插入pcDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pcDNA3.1-MSMP-myc-his6表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用Axygen公司质粒大提试剂盒提取质粒，用于细胞转染。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例2、质粒转染细胞获得MSMP表达上清

一、方法：

HEK 293T细胞调成6×10⁵细胞/2ml浓度在6孔板中37℃5％CO₂培养24小时进行转染，pcDNA3.1-MSMP(NM_001044264.2)-myc-his6 DNA 3μg，vigofect(威格拉斯生物技术有限公司)2μl，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pcDNA3.1-myc-his6空载体转染细胞对照，6小时后换无血清培养基HEKG，37℃培养48小时，收获转染后的上清。

利用Western Blotting检查目的蛋白的表达：

经12.5％SDS-PAGE电泳，用Tris-甘氨酸电转液将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，加入Anti-c-myc抗体(MBL公司)作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG(LICOR Bioscience)，采用Odyssey Imaging System检测系统直接检测。

二、结果：

利用Western Blot检查目的蛋白的表达：

结果请参见图1所示。加入Anti-c-myc抗体作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG二抗反应，经Odyssey Imaging System扫描，在26kD稍下方处有清晰的条带(图1)。

实施例3、人外周血单个核细胞的分离

一、方法：

浓缩白细胞由北京市血液中心提供，采用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)获得人外周血单个核细胞。用含10％热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640(Life Technologies，Inc.)培养。

二、结果：

获得人外周血单个核细胞，进行体外培养备用。

实施例4、MSMP上清的趋化功能

一、方法：

MSMP上清的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neuroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的上清加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBMC细胞使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO₂，孵育3h。趋化结束时PBMC吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo(Promega)测量其化学发光值反应细胞计数值。转染pcDNA3.1空载体转染上清作为阴性对照。

趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。所有实验至少重复3次。CI＞2有显著性意义。

二、结果：

如图2所示，MSMP培养上清对PBMC(图2)具有趋化作用。

实施例5、MSMP-myc-his6蛋白质的纯化

一、方法：

将HEK 293T细胞消化离心后调整成1.5×10⁷/ml细胞密度接种在直径为150mm平皿中，同时进行转染。pcDNA3.1-MSMP-myc-his6 DNA 12.5μg，PEI(威格拉斯生物技术有限公司)50μg，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pcDNA3.1-myc-his6空载体转染细胞对照，16小时后换无血清培养基HEKG，37℃，5％CO₂培养48小时，收获转染后的上清。2000rpm/min离心10分钟，0.22μm滤膜过滤。取Ni Sepharose 6 Fast Flow(GE healthcare)柱料，20倍体积的5mM咪唑200mM NaCl平衡液平衡，上清过柱后先用杂蛋白洗液洗柱，再用含1M咪唑的蛋白洗液洗脱。经过纯化，洗脱后样品经超滤管(milipore 3000D)超滤后浓缩。BCA定量后一部分蛋白用于N端测序，一部分蛋白冻存于-80℃用于后续功能实验。

二、结果：

如图3所示，纯化后的蛋白质样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中在26kD稍下方为MSMP-myc-his6蛋白的目的条带。

BCA定量结果示纯化后的MSMP-his6浓度为300ng/μl。

实施例6、MSMP-myc-his6蛋白质的N端测序

一、方法：

纯化得到的MSMP-myc-his6蛋白，经12.5％SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用考马斯亮兰染色，甲醇/冰乙酸脱色后裁下与Western blot检测阳性位置相同的带进行蛋白质的N端测序(委托上海基康生物技术有限公司测序)。

二、结果：

如图4A和图4B所示，纯化后的蛋白质样品经12.5％SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜(图4A)后做N端测序。MSMP(NM_001044264.2)-myc-his在26kd稍下方处有一条清晰条带。送至上海基康生物技术有限公司进行N端测序。蛋白质的N端测序结果为K-C-Y-F-Q-A-Q-A-P-C(图4B)。

实施例7、MSMP-myc-his6蛋白质的趋化功能

一、方法：

人外周血单个核细胞(PBMC)的分离和培养同实施例3，细胞贴壁过夜后，人外周血淋巴细胞(PBL)和单核细胞(Monocyte)得以分离，PBL悬浮生长，吸出培养基离心后继续趋化实验；加入新鲜培养基，单核细胞贴壁生长，用细胞刮刮下离心后继续趋化实验。

MSMP-myc-his6蛋白质的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neutroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的上清加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBL细胞和单核细胞均使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO₂，分别孵育3.5h和5h。趋化结束时PBMC吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo(Promega)测量其化学发光值反应细胞计数值。转染pcDNA3.1空载体转染上清作为阴性对照。

二、结果：

如图5A和5B所示，MSMP-myc-his6真核蛋白质对PBL(图5A)和单核细胞(图5B)均具有趋化作用。

实施例8、MSMP在人类各组织的表达谱

一、方法：

人类各组织cDNA文库购自Clontech公司。以MSMP上游F1(5’CCAGGA GTC TAC AGC AAG TGC TAC 3’(SEQ ID NO：4))，下游R1(5’AGC AGC AGT GAG CAG TCA GCA 3’(SEQ ID NO：5))为引物，扩增26轮，以扩增产物稀释20倍为模板，以MSMP上游F2(5’GCT ACTTCC AAG CTC AAG CCC 3’(SEQ ID NO：6))，下游R2(5’GAT GATCAG TTG AGT TTA GCT GGA GT 3’(SEQ ID NO：7))为引物，扩增28轮。PCR产物进行1％的琼脂糖胶电泳后EB染色通过UV拍摄。

二、结果：

如图6A和6B所示：第1、10泳道为分子量标准；第2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18泳道分别是人的心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血淋巴细胞的cDNA文库，分别是以(图6A)MSMP(F1，R1)，MSMP(F2，R2)；(图6B)GAPDH的F3(5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’(SEQ ID NO：8))，R3(5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’(SEQ IDNO：9))为引物进行的RT-PCR。

结果显示：MSMP除在肝组织中无表达外，余组织中均见表达，其中胸腺和睾丸中表达较高。

实施例9、构建pET32a-MSMP-his6融合蛋白原核表达质粒

构建pET32a-MSMP-his6融合蛋白原核表达质粒，用于表达MSMP-his6原核蛋白。

一、方法：

将MSMP编码序列(SEQ ID NO：3)插入pET32a(Novagen公司)表达载体，构建pET32a-MSMP-his6原核表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用维格拉斯小提试剂盒提取质粒，用于后续原核表达宿主菌转化。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例10、MSMP-his6原核蛋白表达以及包涵体的纯化

一、方法：

将pET32a-MSMP-his6原核表达质粒转染入BL21宿主菌后，280rpm/min37℃LA培养基中培养，待菌生长至OD 0.6时，加入IPTG终浓度为0.2mM250rpm/min 26℃诱导过夜后，离心后弃去培养基，PBS 7.4重悬，超声破碎菌体。收获破碎菌体后上清液和沉淀，经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色，可见上清中分泌的MSMP-his6蛋白较少，绝大部分蛋白在包涵体中，故选择纯化包涵体用于免疫兔子制备多抗。收集超声破碎菌体后的沉淀，经12.5％SDS-PAGE电泳，一小部分考马斯亮蓝染色，通过染色确定MSMP-his6包涵体蛋白的位置，把未染色的部分对应的条带切下，碾碎，溶于PBS 7.4中备用。

二、结果：

如图7所示，纯化后的包涵体蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中用箭头指示的MSMP-his6为目的蛋白条带。

BCA定量结果示纯化后的MSMP-his6浓度为3μg/μl。

实施例11、兔抗人MSMP-his6多克隆抗体的制备、鉴定和纯化

一、方法：

用纯化的MSMP-his6原核蛋白免疫2只家兔制备多克隆抗体。将家兔编号为1#和2#，三次免疫后，ELISA检测显示兔血清效价均升至1∶10000以上。采集兔血清，1∶2000稀释后进行免疫印迹检测，初步结果证实1#和2#两组抗血清可以在过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞裂解液中识别出特异性条带，免疫前兔血清对照则无特异性条带。将家兔处死，心脏取血，获取大量血清。血清用耦联MSMP-his6包涵体蛋白的CNBr活化的Sepharose 4B亲和柱进行纯化，获得的1#和2#抗MSMP兔多克隆抗体经过western验证，识别条带更特异。

二、结果：

如图8所示，第2、7泳道为分子量标准，第1、3、6、8泳道均为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞裂解液，第4、9泳道为过表达pcDNA3.1空载体对照，第5、10泳道为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞培养上清，其中，第1、6泳道一抗是1#、2#兔免疫前血清，第3至5、8至10泳道一抗是1#、2#兔免疫后血清。纯化前的兔血清可以在HEK293T细胞裂解液中识别出超标达的MSMP-Myc-His6条带，免疫前兔血清对照则无特异性条带。

如图9所示，第1泳道为分子量标准，第2、3、4泳道分别为过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞裂解液，过表达pcDNA3.1空载体的细胞裂解液对照以及过表达MSMP-Myc-His6的HEK293T细胞培养上清，经Anti-myc标签抗体做免疫印迹实验证实过表达真实有效。

如图10所示，上样顺序同图8，可见纯化后兔血清识别条带更特异。

实施例12、兔抗人MSMP-his6多克隆抗体检测内源性MSMP

一、方法：

免疫荧光法：实验组前列腺癌PC3细胞在24孔板内接种于L-多聚赖氨酸包被玻璃爬片，包被浓度5ug/ml。48h后收取细胞爬片，4％多聚甲醛室温固定15min，冰冷PBS清洗2次；用含0.1％TritonX-100室温通透10min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用含2％FBS的PBS溶液4℃封闭30min；用前述封闭液稀释的一抗室温结合1小时或在保湿盒内4℃过夜，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用前述封闭液稀释的TRITC标记二抗避光室温结合45-60min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；0.2ug/ml Hochest 33342避光染色5-10min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用DAKO公司抗淬灭封片液封片。由Leica SP5激光共聚焦显微镜观察、摄像。

免疫细胞化学法：实验组前列腺癌PC3细胞在24孔板内接种于L-多聚赖氨酸包被玻璃爬片，包被浓度5ug/ml。48h后收取细胞爬片，4％多聚甲醛室温固定15min，冰冷PBS清洗2次；用含0.1％TritonX-100室温通透10min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；新鲜配置3％H2O2，滴片覆盖，室温避光孵育10分钟，PBS清洗5min，重复3次；用5％正常山羊血清，室温封闭20分钟；洗净山羊血清，滴加用PBS稀释的一抗在保湿盒内4℃过夜，PBS清洗5min，重复3次；用DAKO公司DAB显色液进行显色，苏木素染核，分色、返蓝、脱水，中性树脂封片。光学显微镜下观察、摄像。

二、结果：

如图11所示为免疫荧光结果，A、B、C为1#抗体染色结果，D、E、F为相同浓度的同型兔IgG染色结果。其中，B、E为细胞核DAPI染色，C、F为共聚焦叠加图像。

如图12所示为免疫细胞化学结果，A、B为1#抗体染色结果，C、D为相同浓度的同型兔IgG染色结果。其中，A、C为放大200倍观察结果，B、D为放大400倍观察结果。

可见，MSMP表达于PC-3细胞的胞质中。

实施例13、MSMP在人前列腺癌组织中的差异表达

一、方法：

在超英生物购得29例配对前列腺癌和癌旁芯片用于后续免疫组织化学实验。

免疫组织化学染色方法如下：梯度酒精下行水化，高压法进行抗原修复，3％过氧化氢溶液去除内源性过氧化氢酶，封闭(5％山羊血清)。用纯化的兔抗人MSMP-his6多克隆抗体作为一抗，DAKO显色试剂盒显色。苏木精复染细胞核后中性树胶封片。显微镜下观察拍照。

二、结果：

如图13所示，为其中一例前列腺癌中低分化和其周围的结节性增生的组织化学染色结果。其中，A、B为前列腺癌中低分化染色结果，C、D为该前列腺癌组织周围的结节性增生染色结果。A、C为放大100倍观察结果，B、D为放大400倍观察结果。在前列腺癌中低分化的组织中MSMP的染色评分为+，在前列腺结节性增生中MSMP的表达评分为+++，可见，MSMP在前列腺癌中的表达大于在癌旁的表达。

表1为MSMP在人前列腺癌和癌旁组织化学染色的结果统计表。如表所示，染色评分癌＜癌旁的有17例，癌＝癌旁的有8例，癌＞癌旁的有4例，可见MSMP在癌旁的表达大于在癌的表达，提示MSMP与前列腺癌的发生相关。

表1人前列腺癌组织芯片组织化学染色统计表

癌＜癌旁	17例
		癌＝癌旁	8例

癌＞癌旁	4例
		总计	29例

注：染色评分癌＜癌旁的有17例，癌＝癌旁的有8例，癌＞癌旁的有4例

实施例14、MSMP-myc-his6真核蛋白对CCR2b的趋化和脱敏作用

一、方法：

HEK-293细胞超表达pcDNA3.1-CCR2b和pcDNA3.1-CCR5受体，48h后用细胞刮刮下离心后用于趋化实验。

趋化实验在48孔的趋化小室(Neuroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的蛋白经Hepes RPMI 1640加0.1％BSA稀释至1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml加到小室的下孔里(27μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640加或不加0.1％BSA稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，在check board实验中，细胞预先分别与MSMP真核蛋白50ng/ml、500ng/ml，MCP-2阳性配体5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml孵育后再加入到趋化小室的上孔中。上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBL和单核细胞使用滤膜孔径为8μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO₂，孵育8h。趋化结束时从小室上移去滤膜，用3步染色试剂盒洗涤，固定，染色。每孔迁移的细胞随机选取5个高倍镜视野计数。Hepes RPMI 1640加0.1％BSA作为对照。

二、结果：

如图14A至14C所示，图14A显示MSMP真核蛋白对HEK293_CCR2b细胞具有趋化作用，图14B显示同等条件下MSMP真核蛋白对HEK293_CCR5不具有明显趋化作用。图14C显示MSMP真核蛋白与HEK293_CCR2b细胞预孵育后脱敏掉MCP-2对HEK293_CCR2b细胞的趋化作用，MCP-2与HEK293_CCR2b细胞预孵育后脱敏掉MSMP真核蛋白对HEK293_CCR2b细胞的趋化作用，说明MSMP真核蛋白对于HEK293_CCR2b细胞的趋化作用是特异的。

实施例15、MSMP-myc-his6真核蛋白可诱导CCR2b受体内化

一、方法：

转染细胞继续培养48小时用于受体内化实验。已知的趋化因子作为阳性对照。应用激光扫描共聚焦显微镜检测法进行受体内化实验。

HEK293细胞用电穿孔法转染趋化因子受体CCR2b与EGFP融合表达质粒，以8×10³个细胞铺到共聚焦专用的玻璃底的微孔皿37℃孵育约4～6小时后补加1ml新鲜完全培养基。转染细胞培养24小时。加入已知趋化因子MCP-2、MSMP真核蛋白或相同浓度的BSA对照蛋白，37℃孵育1小时，细胞用冷PBS冲洗，2％多聚甲醛固定，用TCS-SP激光扫描共聚焦显微镜，63×油镜，激发波长488nm，发射波长530nm，观察并拍照趋化因子受体与EGFP融合分子的细胞定位。

二、结果：

如图15所示，其中A为PBS对照组，A显示EGFP受体融合表达质粒pcDB-CCR2b-EGFP转染进入HEK293细胞后，CCR2b-EGFP融合蛋白表达定位于细胞膜，B显示MCP-2(5μg/ml)可以明显诱导CCR2b-EGFP受体内化，C显示MSMP真核蛋白(5μg/ml)也可诱导CCR2b-EGFP受体内化。D显示BSA(5μg/ml)无关蛋白对照未诱导CCR2b-EGFP受体内化。可见，MSMP真核蛋白可特异性诱导CCR2b-EGFP受体内化。

本文通过一些实施方式和具体的实施例对本发明进行了说明，而且为了描述的目的还针对许多细节进行了描述。对于本领域技术人员而言，本发明可以通过采用一些其它的具体实施方式来实现，也可以在不偏离本发明主旨的情况下针对所披露的内容进行调整和变化。本发明的内容应当包括针对本文所披露内容的调整或变化，或者说应当包括由所附权利要求书所定义的以及与之等同的范围。

Claims

1.一种具有白细胞趋化功能的蛋白，其包含：

(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白；或

2.根据权利要求1所述的蛋白，其包含：

(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白有至少90％同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

3.一种多核苷酸，其包含：

(1)编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)具有与(1)所述多核苷酸有至少80％同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列。

5.一种基因工程载体，其含有根据权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，其含有权利要求1或2所述的蛋白、编码所述蛋白的多核苷酸和/或含有所述多核苷酸的基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

7.一种使用如权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用，所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、肿瘤转移、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

8.一种体外检测来自待测者的样品中权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸表达水平的方法。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法为反转录-聚合酶链式反应或蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

10.一种根据权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述疾病包括病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、肿瘤发生、肿瘤转移、免疫调节和干细胞增殖分化、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病。

11.一种根据权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白及其相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。