CN102181400A - 杂交瘤细胞株及抗hcclm-6细胞分泌蛋白单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株QGA062，CGMCC No.4172及其产生的抗HCCLM-6细胞分泌蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体所识别的FN分子的抗原表位位于16个氨基酸(YTVSLVAIKGNQESPK)以内的范围。该单克隆抗体可应用于检测肝癌的肿瘤标志物。同时该单克隆抗体是一种免疫球蛋白，它特异性的结合于肝癌细胞分泌蛋白，同选自下组的偶联部分可构成一种药物组合物或一种检测肝癌的试剂盒。本发明利用抗体技术和分泌蛋白的特性研制肝癌新的肿瘤标志物，使肝癌的早期诊断和早期根治性手术治疗成为可能。

Description

杂交瘤细胞株及抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体。

背景技术

肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞和体液中，反映肿瘤存在与生长的一类物质，能够通过化学、免疫学和分子生物学等方法进行定量检测。肿瘤标志物的血清水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退和复发具有良好的相关性。因此通常通过肿瘤标志物的血清水平测定，可以获得有关恶性肿瘤辅助诊断、疗效观察、预后评判及复发预报等方面的信息。

自1978年在美国国立癌症研究所召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断”会议上首次提出肿瘤标志物这一新概念后，许多与肿瘤相关的生化、免疫学指标不断被发现，目前已发现的肿瘤标志物有100多种，临床常用的肿瘤标志物有20多种。肿瘤标志物的发现使肿瘤的早期检测成为可能，但是在迄今为止发现的肿瘤标志物中，绝大多数不仅存在于恶性肿瘤，而且也存在于良性肿瘤、胚胎组织甚至正常组织中。这类肿瘤标志物并不是恶性肿瘤的特异性产物，而只是在恶性肿瘤中表达水平增高。那么，进一步找寻具有恶性肿瘤特异性的标记物质，对于恶性肿瘤的早期诊断和早期治疗具有至关重要的作用和意义。随着肿瘤分子生物学、免疫学以及人类基因组计划的快速发展，该领域已经成为肿瘤基础和临床研究的热点之一。

目前发现的原发性肝癌的肿瘤标志物主要有以下几种：

1.甲胎蛋白(AFP)

AFP是一种单链糖蛋白，在肝癌、肝硬化和慢性肝炎中均有表达。对慢性肝病、肝硬化病人定期随访发现单独检测AFP区别肝癌有一定困难，因为在部分良 性肝病、生殖系统和胃肠道的一些恶性肿瘤中AFP也会升高。目前对AFP的看法是：在细胞分化过程中，所有肝细胞均能合成AFP，以后减少至只有少数细胞保持有此功能。肝癌细胞能合成AFP，且AFP的分泌与肝癌细胞的分化程度有关。

2.异常凝血酶原(PIV KA-II)

凝血酶原是由肝细胞合成的，所谓异常凝血酶原与凝血酶原的差别仅在于其氨基端特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化，即去羧基凝血酶原(DCP)。Liebman等人用RIA法首先发现肝癌患者中的PIV KA-II升高，认为P1V KA-II是维生素K依赖性羧化作用的肿瘤缺陷特征，可作为HCC的肿瘤标志物。

3.γ-谷氨酰转移酶(GGT)

GGT是细胞分泌的一种结合酶，催化谷胱甘肽中的γ-谷氨酰残基向氨基酸肽链或水转移，分为溶解型和不溶解型两种，血清中只能检测到溶解型。血清中GGT主要来自肝脏，位于肝细胞滑面内质网和胆小管上皮细胞。GGT具有癌胚蛋白性质，胎儿GGT活性高于成年人约30倍，随着年龄的增长该酶活性逐渐下降。但是当发生肝癌和肿瘤转移时，癌细胞会逆向分化，GGT合成增多，又因癌细胞本身因素和周围炎症刺激使肝细胞膜通透性增加，导致血清中GGT活性明显升高。但是GGT对肝癌的诊断特异性较差，一些使GGT排泄受阻、合成及释放增加的疾病如阻塞性黄疸、肝细胞破坏、炎症刺激等均会引起GGT水平升高。

4.转化生长因子β1(TGF-β1)

TGF-β为一组生长调节蛋白，是多肽生长因子中的一个成员。它是一种分泌蛋白质，在一些肿瘤病人的血液、尿液、脑脊液和培养细胞的培养液中均能检测到。TGF-β具有强大而可逆的生长抑制活性和免疫抑制作用，与HCC的细胞免疫抑制作用密切相关。在肝细胞再生过程中亦发挥着重要的作用。TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们分别由不同的基因编码：内皮细胞及结缔组织表达TGF-β1，上皮细胞及神经元细胞表达TCF-β2，间质性细胞表达TGF-β3。在肝癌发生早期TGF-β1呈过度表达状态，能够抑制免疫系统并促进癌细胞生长、浸润及远处转移。TGF-β1是一个多功能的细胞因子，参与正常和 转化细胞的生长与分化，已有报道TGF-β1mRNA及其蛋白在HCC特别在小HCC和分化良好的HCC中过度表达，对AFP检测阳性或AFP检测浓度较低的PHC均具有较高的诊断价值。

5.α-L-岩藻糖苷酶(AFU)

AFU是一种能分解糖蛋白糖链中岩藻糖苷键的溶酶体水解酶，广泛分布于人体各种细胞和体液中。AFU在PHC患者血清中的活性较肝硬变、慢性肝炎等良性肝病以及正常对照为强。1984年Deugnier首次报道肝癌患者AFU活性升高，对肝癌具有一定的诊断价值。此后国内外学者进行的研究也表明，肝癌患者AFU的血清浓度明显高于其它肝病患者，提示AFU的活性可作为PHC的又一诊断指标。AFU的升高可能与肝癌细胞酶蛋白合成增加而降解减少有关，其详细机制有待进一步探索。

6.甘胆酸(glycocholic acid，GA)

甘胆酸是人体血清中的主要结合胆酸，是近年来发现诊断肝细胞损伤、肝硬化及肝癌新的血清标志物。其升高的机制可能与肝癌患者肝细胞损伤引起胆汁淤积有关。研究表明，AFP与GA联合检测可使灵敏度提高到94.44％，且GA在AFP阴性的PHC患者中阳性率可达80％以上。因此可以认为甘胆酸是诊断肝癌特别是AFP阴性者的又一项有意义的指标。

7.组织多肽特异性抗原(tissue polypeptide specific antigen，TPSA)

TPSA是从组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen，TPA)纯化而来，其实质是细胞角蛋白(cytokeratin)18片段上的M3决定簇，在细胞周期的S晚期和G2期，伴随着DNA、蛋白质的合成，TPSA被合成并于细胞分裂后不久释放入血或体液中，因此血清的TPSA水平常可以反映肿瘤细胞的分裂增殖活性。上皮类恶性肿瘤在细胞增殖活跃期TPSA表达水平增高并大量释放入血。研究表明TPSA对PHC具有较高的诊断灵敏度，诊断敏感性为73.1％、特异性为71.2％、有效性为72.1％，但它与肝癌的关系尚未完全明确。

8.端粒酶

端粒酶是一种特殊的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成。它的激活可以使端粒进行复制并加到染色体末端，从而使细胞逃避M2期获得无限增殖能力，成为永生化细胞，这是细胞恶变的关键步骤。应用高敏感性的PCR技术可以检测穿刺活检的少量组织甚至脱落的个别细胞的端粒酶活性，能够有效地诊断小肝癌，其阳性率超过了AFP和DCP，并且可以对PHC术后的早期复发进行监测。KoMyashi等对37名肝癌患者术后标本进行端粒重复扩增，发现端粒酶在肝癌患者的检出率为62.2％；平均追踪36个月，24名患者出现肿瘤复发，而且端粒酶活性越高，手术至复发的时间间隔越短。

9.热休克蛋白70(HSP70)

HSP70是存在于细胞内的一种主要分子伴侣(molecular chaperons)，在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面有重要作用，对细胞抵御外界损伤具有保护作用，在生理和应激条件下均能表达。另外，HSP的表达与肿瘤细胞的分化、凋亡有关。研究显示HSP70在早期肝癌中过度表达，是一种肝癌早期鉴别诊断的灵敏标志物。

综上所述，肿瘤标志物的研究对提高HCC以及HCC复发转移的早期诊断均具有极其重要的意义。目前临床上HCC诊断的标志物仍以AFP为主，但其敏感性和特异性难以满足临床的需要；其他分子在特异性和敏感性方面往往不够稳定，需要与AFP进行联合检测，其在肝癌发生发展中的作用还有待进一步的研究和验证。因此，发现肝癌及其转移相关的抗原，为肝癌复发转移的机制研究提供新的依据，为研究肝癌复发转移的早期诊断提供新的标志物，为肝癌治疗提供新的靶标，具有重要的科学意义和实用价值。

由于基因组和蛋白质组技术的发展，近十年来，比较基因组学与比较蛋白质组学成为发现疾病相关基因和相关蛋白的高通量筛选方法。比较基因组学主要是采用消减杂交和荧光原位杂交的结合，实质是双色荧光原位杂交：采用两种不同颜色的荧光素分别标记待测基因组的DNA和正常对照组的DNA成为探针，两者1∶1混合后与正常人中期染色体进行原位抑制杂交，根据两种探针的颜色 强度比进行定量分析，从而一次了解被检DNA拷贝数的变化情况。比较蛋白质组学法，主要采用双向电泳(2-dimensional electrophoresis，2-D PAGE)和液相色谱(liquid chromatography，LC)技术对蛋白进行分离比较，然后通过质谱(mass spectrometry，MS)对差异蛋白进行鉴定。随着技术的改进，ICAT(isotope coded affinity tag)-MS、表面增强激光解吸(surface enhanced laser desorption ionization，SELDI)-TOF-MS及蛋白质芯片(protein array)等技术的使用提高了差异蛋白鉴定的速度和敏感度。但这些全景式差异蛋白分析工作量大，费用高，重复性也较差。

分泌蛋白在细胞器官中起着决定、调控生物学进程的作用：在细胞水平上参与细胞生长、分化及细胞程序化死亡；在器官水平上参与免疫防御、促进凝血及致瘤发生。分泌蛋白存在于体液或血清中，作为检测样本容易获取且创伤性小，使之作为癌症诊断和愈后的指标具有不可取代的优势。因此，通过鉴定癌细胞或癌组织分泌的蛋白，寻找癌特异性蛋白做为肿瘤标志物的研究备受关注。但是癌特异性分泌蛋白量较少，容易被血清中无组织与疾病特异性的高丰度蛋白覆盖，不易分离与检测。

在免疫学的不断发展中，流行病多价疫苗的使用证明机体免疫系统可针对多种混合抗原产生保护性抗体。随着蛋白质组计划的实施，对作为蛋白质功能研究工具的抗体的需求量也逐渐增大，于是建立了混合抗原免疫的单抗制备新策略，以节省多次免疫和融合过程中人力和物力的投入。实验证明混合抗原免疫后一次融合可获得一百多株单抗，使用高通量的抗原鉴定技术(IP+MASS鉴定技术、蛋白芯片筛选鉴定技术、cDNA表达文库筛选鉴定技术、SELDI鉴定技术)鉴定其抗原有10种以上。

发明内容

本发明的目的是提供一株可产生抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所提供的可产生抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为QGA062，该细胞株已于2010年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4172。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的另一个目的是提供检测原发性肝癌的肿瘤标志物和试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合。

在本发明第一个方面，提供了一种杂交瘤细胞，它是杂交瘤细胞系QGA062，CGMCC No.4172。

在本发明的第二个方面，提供一种免疫球蛋白，它是抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白，并识别人HCCLM-6细胞分泌蛋白。

在本发明的一个实例中，所述的抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白抗体是单克隆抗体。

在本发明的另一个实例中，所述的抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞系QGA062，CGMCC No.4172所产生。

更佳地，上述的抗HCCLM-6细胞分泌蛋白所识别的FN分子中的抗原表位位置为1062～1078aa，其氨基酸序列为(YTVSLVAIKGNQESPK)，在上述16个氨基酸范围之内。

在本发明的第三个方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有上述免疫球蛋白单克隆抗体和选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

在本发明的第四个方面，上述的抗HCCLM-6细胞分泌蛋白抗体用于制备的检测肝癌的肿瘤标志物，它含有它含上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，或其活性片段

较佳地，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白单克隆抗体或免疫偶联物。

在本发明第五个方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

附图说明

图1.单克隆抗体制备流程图

图2.HCCLM-6细胞总蛋白和细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析

图3.ELISA法鉴定单克隆抗体的肝癌特异性

图4.QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307的免疫组化鉴定(400×)

图5.QAG013的抗原在不同组织标本中的细胞定位不同

图6.纤维连接蛋白分子结构示意图

图7.质谱鉴定在转移性F9肝肿瘤中具有肿瘤特异性的FN肽段

具体实施方式

原发性肝癌(primary carcinoma of liver，PCL)是全球第6位，中国第3位最常见的恶性肿瘤，包括原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和原发性肝胆管癌两种主要类型，其中前者的发病率占PCL总发病率的90％以上。根据国际癌症研究中心估计，2000年全球肝癌发病总数为56.4万人，其中半数以上(约55％)发生在中国，即中国肝癌发病人数为30.6万人，而肝癌死亡人数则高达30.0万，而且在近些年原发性肝癌的发病率和死亡率仍有上升的趋势。目前肝癌的治疗仍以手术切除为首选，早期切除是提高患者生存率的关键；肿瘤越小，五年生存率越高。但是原发性肝癌起病常较隐匿，早期肝癌很难发现，一旦出现症状，大多数已到了中晚期。由于肝癌标志物AFP的使用，使肝癌的早期诊断和早期根治性手术治疗成为可能，但其敏感性难以满足临床需要，更为理想的肿瘤标志物还有待进一步的研究和探索。本发明的目的就是利用抗体技术和分泌蛋白的特性探索原发性肝癌新的肿瘤标志物。

本发明尝试利用免疫特异性，使用高转移性肝癌细胞系HCCLM-6细胞总蛋白免疫BALB/c小鼠后，取小鼠脾细胞与SP2/0融合建立杂交瘤细胞系，通过ELISA筛选在肝癌细胞及其分泌蛋白中特异的抗体，用免疫组化筛查对肝癌组织特异性高的抗体，并用免疫荧光方法鉴定其在不同转移性肝癌细胞系以及正常肝上皮细胞中的分布情况，筛选肝癌及其转移相关抗原的抗体；通过筛选 Uni-ZAP XR成人肝脏cDNA表达文库初步鉴定单抗识别的抗原，获得更为理想和有效的检测性肝癌的标志物质。

本发明利用高转移性肝癌细胞系HCCLM-6细胞总蛋白免疫BALB/c小鼠后，取小鼠脾细胞与SP2/0融合建立杂交瘤细胞系，以HCCLM-6的细胞无血清培养上清和细胞总蛋白作为联合筛选抗原，通过ELISA法筛选细胞分泌蛋白以及肝癌细胞内的抗体。用免疫组化筛查对肝癌组织特异性高的抗体，并通过间接免疫荧光的方法鉴定其在不同转移性肝癌细胞系(高转移性细胞系HCCLM-6、低转移性细胞系HCC97-L、无转移性细胞系HepG2)、正常肝细胞系L-02和高转移性肺巨细胞癌细胞系95D中的分布情况；通过筛选Uni-ZAP XR成人肝脏cDNA表达文库对挑选出的具有肝癌特异性的单克隆抗体所识别的抗原进行鉴定，获得更为理想和有效的原发性肝癌的诊断标志物。

通过细胞融合实验建立小鼠抗人HCCLM-6的杂交瘤细胞株28株。通过间接酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫组织化学染色和间接免疫荧光等方法对所获得的28株单克隆抗体的肝癌特异性进行鉴定。ELISA检测的结果提示QGA062、QEC104、QAG013、QAC081、QFH307和QAG063这6株单克隆抗体在肝癌细胞系HCCLM-6总蛋白及HCCLM-6细胞无血清培养上清中的蛋白量均明显高于正常肝细胞系L-02及鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。免疫组化和间接免疫荧光的鉴定结果提示有5株单克隆抗体即QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307能够比较特异地识别肝癌组织和不同肝癌细胞系中的蛋白，而在正常肝组织和正常肝细胞系L-02中则没有明显表达。

结合间接酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色和间接免疫荧光的鉴定结果，挑选单克隆抗体QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307进行成人肝脏cDNA表达文库筛选，初步鉴定QAG013、QGA062、QAC081和QFH307这4株单克隆抗体所识别的抗原是纤维连接蛋白(fibronectin，FN)。以QAG013、QGA062、QAC081和QFH307阳性克隆剪切后质粒的诱导表达产物作为抗原，分别对这4株单克隆抗体进行Western blot鉴定，结合测序结果即阳性克隆插入片段的长度和插入位 置对单克隆抗体所识别的抗原位置进行分析，结果提示4株单克隆抗体分别识别FN分子中3个不同的抗原表位，尤其是QGA062所识别的抗原表位仅在16个氨基酸(YTVSLVAIKGNQESPK)范围以内。对该段氨基酸序列进行人鼠同源性比较后发现二者仅在第4、8和13位氨基酸上存在差异，该肽段抗原表位分析的结果显示分析分值较高的区域位于该肽段的羧基端，提示第13位氨基酸很有可能在QGA062抗原表位的构成中发挥关键性作用，该肽段的发现为进一步研究FN与细胞粘附、新生血管形成和肿瘤之间的关系以及FN的新肿瘤相关位点奠定了基础。

本发明的QGA062单抗或其片段可用于肝癌的放射性定位的诊断成像，还可用于免疫治疗，例如通过直接或间接地将QGA062单抗或其片段与化学治疗剂、或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。

本发明包括：具有QGA062单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有QGA062单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其它蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(Cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与QGA062单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与QGA062单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(Cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与QGA062单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如I-QGA062，MTX-QGA062偶联物等。

对于本发明QGA062单抗重链和轻链的序列，可以用常规方法测定。QGA062单抗V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些 具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与QGA062单抗具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明还提供了编码肝癌标志性抗原的cDNA。本发明的QGA062单抗的抗原的核苷酸全长序列或其片段通常可用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据肝癌标志性序列的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确的次序拼接在一起。

本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子，这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系QGA062，CGMCC No.4172获得，此外，还可以将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增值后的宿主细胞中分离得到有关序列

此外，还可以用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中，此外，还可以通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，代表性例子有：链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；动物细胞如CHO、COS7、293、或Bower黑素瘤细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，但宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获。用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂，如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法，磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适方法(如温度转化或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的，化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：离心、渗透破菌、超声处理、超离心、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、常规的复性处理、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外，本发明还提供一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的，惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常是5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化，配制好的药物组合可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合可直接用于肝癌的治疗，此外，还可以同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TFN-α等。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述免疫球蛋白或上述免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组和可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造，活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1毫克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可以与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效剂量的QGA062免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人建康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按制造厂商所建议的条件。

实施例1

制备抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体，其流程图见图1。

具体方式包括：

1、细胞培养、细胞总蛋白和细胞无血清培养上清的收集；

2、动物免疫：培养高转移性肝癌细胞系HCCLM-6，用0.25％胰蛋白酶消化后进行细胞计数，取5×10⁶个细胞重悬于0.25mL生理盐水内，加入等体积弗氏 完全佐剂进行充分乳化，于BALB/c小鼠背部进行多点皮下注射。4周和8周后分别取与首免等量的细胞与弗氏不完全佐剂进行充分乳化并进行二次和三次免疫。三免后15天检测免疫效价，然后进行加强免疫，4天后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术制备mAbs。免疫过程详见表1。

表1.HCCLM-6抗原的动物免疫时间表

抗原	动物数	首免时间	二免时间	三免时间	加免时间
						HCCLM-6	2只	2006-05-10	2006-06-09	2006-07-06	2006-07-20

3、ELISA法检测抗血清效价并筛选阳性克隆

4、细胞融合：包括脾细胞制备，骨髓瘤细胞制备，细胞混合，细胞融合，细胞培养，细胞培养和换液。

单克隆抗体杂交瘤的制备过程是将生化缺陷型骨髓瘤细胞与经抗原免疫的同种系B细胞进行融合，从中筛选出既保持骨髓瘤细胞无限增殖特性、又保持B细胞分泌抗体特性的杂交融合细胞，融合及融合后筛选是该过程的两个基本环节。

实施例2

HCCLM-6细胞总蛋白和细胞无血清培养上清的分析。

使用BCA蛋白定量试剂盒测定所收集的HCCLM-6细胞总蛋白浓度为2.85mg/mL。对HCCLM-6细胞总蛋白和无血清培养上清进行SDS-PAGE分析(图2)。从SDS-PAGE的分析结果来看，HCCLM-6细胞无血清培养上清与细胞总蛋白的蛋白分布不同，说明制备的HCCLM-6细胞无血清培养上清可以用于融合实验筛选，联合HCCLM-6细胞总蛋白同时进行筛选可使实验结果更加完善。细胞无血清培养上清泳道66kDa处有一条较浓的蛋白条带，考虑为在更换无血清培养基前残留的血清白蛋白。

实施例3

融合鼠血清效价检测及杂交瘤细胞株的建立

三次免疫后通过尾静脉取血，对免疫小鼠的血清效价进行检测，使用 HCCLM-6细胞总蛋白检测头标记和未标记小鼠的血清效价分别为1∶128,000和1∶64,000，其中头标记小鼠的血清效价较高，可于加强免疫后进行细胞融合实验；使用HCCLM-6细胞无血清培养上清检测的头标记和未标记小鼠血清效价均为1∶64,000，提示使用细胞无血清培养上清包板可用于阳性克隆的筛选。加强免疫后4天进行细胞融合，取高转移性肝癌细胞系HCCLM-6免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5∶1的比例进行细胞融合，96孔板铺板10块，融合后5天观测融合率为70％。分三批对456个融合孔进行挑孔检测，其中44孔检测呈阳性，转24孔培养后有12孔转阴，对余32个检测阳性孔进行亚克隆，最终建立杂交瘤细胞株28株，具体信息详见表2。

通过ELISA检测法，分别使用肝癌细胞系HCCLM-6、正常肝细胞L-02和SP2/0的细胞总蛋白和培养上清包板，对这28株杂交瘤细胞株的肝癌特异性进行筛选；其中6株抗体(QGA062、QEC104、QAG013、QAC081、QFH307和QAG063)在肝癌细胞系HCCLM-6总蛋白及细胞培养上清中的蛋白量均明显高于正常肝细胞系L-02及鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。ELISA法对单克隆抗体特异性的鉴定结果见图3。

表2.小鼠抗人HCCLM-6单克隆抗体建株情况统计表

分别使用肝癌细胞系HCCLM-6、正常肝细胞L-02和SP2/0的细胞总蛋白(10μg/L)和细胞培养上清及空白培养基(以20×包被液进行稀释)包板，对建立的28株杂交瘤细胞株的肝癌特异性进行筛选；ELISA检测的结果提示QGA062、QEC104、QAG013、QAC081、QFH307和QAG063这6株单克隆抗体在肝癌细胞系HCCLM-6总蛋白及细胞培养上清中的蛋白量均明显高于正常肝细胞系L-02及鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。

分泌蛋白在细胞器官中起着决定、调控生物学进程的作用：在细胞水平上参与细胞生长、分化及细胞程序化死亡；在器官水平上参与免疫防御、促进凝血及致瘤发生。此外，分泌蛋白存在于体液或血清中，作为检测样本容易获取且创伤性小，使之作为癌症诊断和愈后的指标具有不可替代的优势。因此，通过鉴定癌细胞或癌组织分泌的蛋白，寻找癌特异性蛋白作为肿瘤标志物的研究已越来越受到人们的关注。

本发明使用高转移性肝癌细胞系HCCLM-6的细胞总蛋白进行动物免疫，利用杂交瘤技术制备小鼠抗人HCCLM-6的单克隆抗体；在建株的过程中以HCCLM-6细胞无血清培养上清作为检测抗原(HCCLM-6细胞总蛋白为辅助性检测抗原)、应用间接酶联免疫吸附法对获得的细胞株进行筛选，最终获得了28株杂交瘤细胞株，为后续单克隆抗体的鉴定、高亲和力和高肿瘤特异性单抗的筛选奠定了基础。

通过间接酶联免疫吸附实验对所获得28株单克隆抗体的肝癌特异性进行了初步鉴定，结果提示有6株单克隆抗体在肝癌细胞系HCCLM-6总蛋白及细胞培养上清中的蛋白量均明显高于正常肝细胞系L-02及鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。对于这些单克隆抗体的肿瘤特异性及其所识别的抗原还需要通过后续的实验进行进一步的鉴定和验证。

实施例4

抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的鉴定，具体方式包括：

1.鼠抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的免疫组化筛选

使用免疫组织化学的方法对单克隆抗体在肝癌组织中的特异性进行鉴定，结果显示有5个杂交瘤细胞株即QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307能够与鉴定的人肝细胞肝癌组织产生特异性阳性反应(如图4所示)，其阳性反应例数分别为10、8、6、3和2例(肝细胞肝癌的总样本例数为13例)。

表3对QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307五株单克隆抗体的免疫组化鉴定结果进行了概括总结。其中抗体QAG013的特异性较高，在13例肝细胞肝癌组织中有10例呈现阳性反应，并且在不同肝细胞肝癌组织标本中存在不同的细胞定位(如图5所示)，在3例癌旁非癌组织的切片中，只有1例呈弱阳性反应，在2例正常肝组织中有1例弱阳性，故分析QAG013这株抗体具有较高的肝癌组织特异性。

表3.QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307免疫组化鉴定总结表

表中符号：+，阳性；-，阴性；NEG：阴性对照；(C)/(N)：样本的癌变区/非癌变区；P：细胞浆；M：细胞膜；N：细胞核；E：内皮组织；ECM：细胞外基质。

2.鼠抗HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

使用间接免疫荧光方法对QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307的抗原在不同细胞系中的分布情况进行检测。

检测结果表明，QAG013mAb所识别的抗原在高转移性肝癌细胞系HCCLM-6中主要分布于细胞浆，还有部分可以在细胞外形成纤丝样结构；在低转移性肝癌细胞系HCC97-L中抗原呈弥漫性分布于细胞浆；在无转移性肝癌细胞系HepG2中抗原主要分布在细胞膜上；在正常人肝细胞系L-02中，抗原呈点状聚集分布在细胞核周围，且荧光强度较弱；在高转移性肺巨细胞癌细胞系95D中未检测到抗原的存在。

QGA062 mAb在高转移性肝癌细胞系HCCLM-6和低转移性肝癌细胞系HCC97-L中的间接免疫荧光反应与QAG013相似，所识别的抗原呈弥漫型分布于细胞浆；在正常人肝细胞系L-02中，抗原呈点状聚集分布在细胞核周围，且荧光强度较弱。该单克隆抗体不能识别HepG2和95D细胞系中的抗原。

QAC081 mAb能够识别高转移性肝癌细胞系HCCLM-6、低转移性肝癌细胞系HCC97-L和无转移性肝癌细胞系HepG2中的抗原。抗原在前两种细胞系中弥散分布于细胞浆；而在HepG2中则集中分布于细胞膜，但荧光强度较弱。QAC081 mAb不能识别L-02和95D细胞系中的抗原。

QAE018 mAb在高转移性肝癌细胞系HCCLM-6、低转移性肝癌细胞系HCC97-L和无转移性肝癌细胞系HepG2中的间接免疫荧光鉴定结果与QAG013相似，在L-02和95D细胞系中未检测到抗原存在。

QFH307 mAb在这五种细胞系中的间接免疫荧光反应基本与QAG013相似。

实施例5

筛选Uni-ZAP XR成人肝脏cDNA表达文库鉴定特异性抗体的抗原并通过Western blot鉴定和序列比对确定抗原表位。

1.鼠抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白单克隆抗体的cDNA表达文库鉴定结果

用QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307的细胞培养上清对成人肝脏cDNA表达文库进行初次筛选，除QAE018以外，其他四株单克隆抗体初筛均为阳性，分别获得了8～20个阳性克隆。取阳性噬菌斑进行第2轮筛选以对初始分离克隆的真实性作进一步验证，并获取单个阳性克隆。每株单克隆抗体均选取3个复检阳性克隆进行剪切和测序，并对测序结果进行B1ast比对。测序结果表明，QAG013、QGA062、QAC081和QFH307识别的抗原均为纤维连接蛋白(fibronectin 1，FN1)，所选取的3个克隆测序结果一致。为了确定特异性抗体识别的抗原表位，选择各株单克隆抗体插入片段最短的克隆测通插入序列全长(图7～10D)；为了进一步证明cDAN表达文库筛选的可靠性，对分离到的阳性克隆剪切获得的质粒进行诱导表达，并以单克隆抗体QAG013、QGA062、QAC081和QFH307作为一抗对重组表达蛋白进行了Western blot鉴定。

2.通过Western blot对四株单克隆抗体所识别的抗原表位进行分析

由于QAG013、QGA062、QAC081和QFH307四株单克隆抗体筛选阳性克隆插入片段的长度和插入位置不尽相同，为了对这四株单克隆抗体所识别的抗原表位进行进一步分析，以QAG013、QGA062、QAC081和QFH307复检阳性克隆剪切后质粒的诱导表达产物作为抗原、以无关蛋白血清白蛋白(HSA)的诱导表达产物和SOLR空菌作为对照，分别对这四株单克隆抗体进行Western blot鉴定，并结合测序结果即阳性克隆插入片段的位置对单克隆抗体所识别的抗原表位进行分析。

通过分析可以初步确定4株单克隆抗体识别3个不同的抗原表位，QAG013 mAb所识别的抗原表位不同于与其他三株单抗，位置应该在1674～2240位氨基酸之间；QGA062 mAb所识别的抗原表位在1062～1078位氨基酸之间；QAC081和QFH307 mAb所识别的抗原表位在1078～1673位氨基酸之间。表4对QAG013、QGA062、QAC081和QFH307四株单克隆抗体抗原表位的鉴定结果进行了概括总结。

表4.QAG013、QGA062、QAC081和QFH307单克隆抗体抗原表位的鉴定结果

本发明使用高转移性肝癌细胞系HCCLM-6细胞总蛋白进行动物免疫，利用杂交瘤技术制备小鼠抗人高转移性肝癌细胞系HCCLM-6的单克隆抗体，通过ELISA筛选在细胞分泌蛋白和肝癌细胞内的特异性抗体，最终获得杂交瘤细胞株28株。选择免疫组织化学染色和间接免疫荧光鉴定具有较高肝癌特异的5株单克隆抗体进行Uni-ZAP XR成人肝脏cDNA表达文库筛选，确定其中4株单克隆抗体所识别的抗原为纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)，并且分别识别FN分子III型重复序列中的3个不同抗原表位，提示FN很可能在肝癌的发生发展和转移过程中发挥着重要的作用。

FN是一种细胞外非胶原糖蛋白，广泛存在于细胞外基质(ECM)、血浆及其他体液内，由上皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞及部分癌细胞等分泌，在胚胎发育、刨伤愈合、肿瘤转移等过程中具有重要作用。FN的基因位于人类2号染色体，由I型、II型和III型3种重复序列组成(图6)。FN由同一基因编码形成共同的pre-mRNA，然后在3个位点上发生可变剪接，形成不同的成熟mRNA。这3个位点均位于III型重复序列中，分别为特殊结构域EDA、EDB和III型连接片段(IIICS又称V区)。完整的IIICS结构域含有120个氨基酸残基，分为3个亚片段，从N端到C端依次为CS1(25aa)、中间区(64aa)和CS5(31aa)，CS1和CS5可被剪去，从而形成IIICS-0、IIIICS-120、IIICS-95、IIICS-89和IIICS-64五种变异体； 额外区域A(extra domain A，EDA)和额外区域B(extra domain B，EDB)分别由单个外显子编码，其序列在哺乳动物中具有高度保守性，在剪接过程中只

有剪去和未剪去两种情况；EDA片段位于EDB下游，III11与III12之间，属III型同源序列。它们的剪接配合后可翻译出20余种异构体。

FN可以通过分子内的3个结构域与细胞发生相互作用：中心的细胞结合区域(CCBD)、COOH-末端的肝素结合区域(Hep2)和包含CS1亚片段的III型连接片断(IIICS)^[22]。CCBD是FN分子参与细胞粘附的主要结构域，能够通过Arg-Gly-Asp(RGD)基序与作为细胞粘附受体的整合素家族成员包括α5β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αIIbβ3和α8β1等结合，介导细胞与细胞、细胞与基质的粘附，在肿瘤血管生成和转移过程中起到重要的作用。α5β1是多种细胞类型中FN分子的主要受体，与CCBD结合后通过信号转导作用调节细胞的增殖、分化、迁移与凋亡^[23]。作为一种非常重要的ECM蛋白，FN还可以与除整合素以外的其他ECM蛋白和细胞配体如氨基葡聚糖、肝素、胶原和纤维素等结合。由于FN在细胞粘附与迁移过程中发挥着重要的作用，因而与胚胎发生、恶性肿瘤、止血、伤口愈合、宿主防御以及组织完整性的维持等多种基础生命活动密切相关；虽然早在上个世纪80年代已有人揭示了FN的一级结构和交替拼接形式，但是由于FN异构体形式较多，各种异构体的确切功能和作用尚未明确，因而有关FN的研究日益受到人们的重视。

FN主要有两种存在形式，即血浆型(pFN)和细胞型(cFN)。pFN由成人肝细胞合成并分泌入血，在体内为可溶性二聚体形式，而cFN则由特定培养条件下的成纤维细胞分泌，主要以二聚体或者交联的多聚体形式存在；二者在结构上的主要区别是前者不含有EDA和EDB结构域。研究表明胚胎和肿瘤组织含有EDA和EDB结构域的FN分子表达量要高于正常组织；在创伤愈合过程中含有EDA和EDB结构域的FN分子表达量也增高。目前针对EDA和EDB结构域的研究非常广泛，但是有关EDA、EDB以及CSIII结构域在细胞粘附、胚胎发育、创伤愈合以及肿瘤发生中的具体功能目前尚未明确。有研究显示，EDA⁺FN与整合素α5β1的亲和力 是EDA-FN的2～2.5倍，提示EDA在调节FN分子与整合素α5β1结合的亲和力以及细胞粘附和迁移方面发挥着重要的作用；而日本的研究人员则发现在FN分子羧基端有两段FN III型重复片段FNIII14(氨基酸序列为YTIYVIAL)和FNIII10，能够通过与膜蛋白p50结合抑制FN与β1整合素结合，从而阻断细胞的粘附作用，因此就目前的研究结果来看，FN分子及其主要结构域在细胞粘附中的作用还有待进一步的深入研究和探索。与此不同的是，EDA和EDB结构域作为新生血管标志物的结论已经得到了广泛的证实。通过抗EDA和EDB的单克隆抗体，研究人员发现EDA和EDB在肝癌转移灶和原发性肿瘤病灶的新生血管中有大量表达，由于蛋白质组学研究的结果提示EDA和EDB在肿瘤和肝癌样本中存在显著性差异，另外血浆和大多数正常组织中通常无EDA和EDB存在，因此考虑EDA和EDB是良好的原发性肿瘤及其转移病灶的血管标记物，在肿瘤新生血管形成方面发挥着重要的作用。L19是一种特异性针对EDB的人单链Fv抗体，目前使用该抗体与反射性元素和细胞因子融合表达产物进行肿瘤治疗已在动物实验取得良好的结果。

本发明共获得4株抗FN的单克隆抗体，测序结果表明这4株单克隆抗体所识别的抗原序列中并不包含与肿瘤发生相关的EDB和EDA区域，但是间接酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色和间接免疫荧光等的鉴定结果均提示这4株单抗在肝癌组织和肝癌细胞中具有特异性表达。通过Western blot鉴定和测序结果比对发现这4株单克隆抗体分别识别FN分子中3个不同的抗原表位。QAG013 mAb所识别的抗原表位在1674～2240位氨基酸之间，QAC081和QFH307mAb所识别的抗原表位在1078～1673位氨基酸之间，QGA062 mAb所识别的抗原表位在1062～1078位氨基酸之间；其中特别值得一提的是QGA062 mAb所识别的抗原表位仅在16个氨基酸(YTVSLVAIKGNQESPK)范围以内，该片段位于FN分子III型重复序列中的第5个重复片段，属于细胞粘附和肝素结合的主要作用位点。研究人员在对小鼠正常肝组织和转移性F9肝肿瘤组织的血管蛋白进行对比分析中发现，该肽段在肿瘤组织中具有较高的特异性(图7)，提示其很可能与肿瘤的发生和转移存在密切的联系，有关该片段在细胞粘附、肿瘤发生和 转移中的具体作用值得进一步深入研究和探索。灰色方块为从正常肝组织鉴定的肽段位置；黑色方块为从转移性F9肝肿瘤组织鉴定出的肽段位置。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，它是QGA062，CGMCC No.4172。

2.一种免疫球蛋白，其特征在于，它是抗人HCCLM-6细胞分泌蛋白。

3.权利要求2所述的免疫球蛋白，其特征在于，其抗体是单克隆抗体。

4.权利要求2所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是由杂交瘤细胞株QGA062，CGMCC No.4172所产生。

5.权利要求2所述的免疫球蛋白，其特征在于，它特异性的结合于人肝癌细胞分泌蛋白。

6.权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，它所识别的FN分子中的抗原表位抗原表位位置为1062～1078aa，其氨基酸序列为(YTVSLVAIKGNQESPK)，在上述16个氨基酸范围之内。

7.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有权利要求3所述免疫球蛋白单克隆抗体和选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求2所述的免疫球蛋白或权利要求7所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

9.一种用于检测肝癌的肿瘤标志物，其特征在于，它含有权利要求2所述的免疫球蛋白或权利要求7所述的免疫偶联物，或其活性片段。

10.一种检测原发性肝癌的试剂盒，它含有权利要求3所述的单克隆抗体和权利要求7所述的免疫偶联物。 

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