CN104531843A - 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途 - Google Patents

肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104531843A
CN104531843A CN201410728835.9A CN201410728835A CN104531843A CN 104531843 A CN104531843 A CN 104531843A CN 201410728835 A CN201410728835 A CN 201410728835A CN 104531843 A CN104531843 A CN 104531843A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mcam
liver cancer
cell
antibody
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410728835.9A
Other languages
English (en)
Inventor
孙韶周
何博汇
孙晋华
周旭一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
The Sheng Tai biotechnology Limited by Share Ltd
Original Assignee
HANGZHOU JOIN GENOME BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU JOIN GENOME BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical HANGZHOU JOIN GENOME BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201410728835.9A priority Critical patent/CN104531843A/zh
Priority to PCT/CN2015/075833 priority patent/WO2016086560A1/zh
Publication of CN104531843A publication Critical patent/CN104531843A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种诊断肝癌的标志物及其用途。具体地，申请人将黑素瘤细胞黏附分子(MCAM)鉴定为YAP依赖性肝癌的新型血清肿瘤标志物。本申请人的实验结果同时证明，MCAM活性对于肝癌细胞存活和转化是至关重要的，表明其可作为潜在的直接抗癌药靶加以应用。本发明提供了一种黑素瘤细胞黏附分子(MCAM)的基因、mRNA或cDNA的用途，用作检测肝癌的标志物；或用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。研究表明，肝癌患者血清中MCAM的量显著高于正常人、其他肝脏疾病和非肝癌血清样品中的量。数据分析显示，MCAM蛋白是定量的灵敏的肝癌特异性血清标志物。

Description

肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种诊断肝癌的标志物及其用途。
背景技术
肝癌是中国常见的恶性肿瘤，位居肿瘤发生率的第三位，死亡率的第二位。原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型。
中国的肝癌患者占全世界发病率的54％，男性较女性更易发病。目前肝癌患者的5年生存率不到5％。全世界每年大约有549000名患者死于此，且其发病率有逐年上升的趋势(来自WHO死亡率数据库)。因此，加大对肝癌的防治力度对降低死亡率具有重要意义。
目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查以及实验室检查。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限性。肝硬化基础上肝内再生结节和发育不良的结节等良性病变较为常见，与肝癌的影像学特征有一定的重叠，放射学检查对肝内小的良恶性病变鉴别仍很困难。与肝脏病理对比，CT诊断肝癌的敏感度较低。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的主要方法，即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。因此，临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异性标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。
肝癌的早期诊断是提高患者生存率的一项最重要因素。目前在临床使用的肝癌血清诊断标志物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)。虽然甲胎蛋白在肝癌的诊断中起了积极的作用，但其敏感性和特异性还不令人满意，而且在新发病例中AFP阴性比例在不断增加。
因此，寻找新的具有诊断或联合诊断价值的肝癌血清标志物是当务之急，也是HCC早发现早治疗的关键。因此，提供在肝癌组织和血清中特异高表达的基因或蛋白质具有重要的诊断和治疗意义，本领域迫切需要开发用于检测或判断肝癌的血清特异标志物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于检测或判断肝癌的血清特异标志物及其用途。
YAP(Yes-Associated Protein)已被发现可促进细胞增殖及转化[1]。YAP在肝细胞肝癌(HCC)中的过表达与较低程度的肿瘤分化具有显著的相关性[2]。近来的研究表明，核YAP的表达和活性的提高与胆酸诱导的HCC有着密切的联系[3]。在小鼠实验中，YAP过表达使肝尺寸不可逆地增大4倍以上[4]。相反，敲除肝中的YAP不仅导致肝细胞存活中的缺陷，还会导致胆管上皮细胞发育的重大缺陷[5]。这些结果表明，YAP活化在肝癌发展中有着重要的作用。
YAP作为辅助因子能够提高几种转录因子的转录活性，这些转录因子包括TEAD、ErbB4和Runx2[6]。尽管已经鉴定了包括存活蛋白(Survivin)、CTGF和周期蛋白D1(Cyclin D1)等数个影响HCC细胞去分化、抗细胞凋亡抗性和体内细胞生长的YAP靶基因[7-8]，但还有哪些能够反映YAP功能似乎很有可能仍然不清楚，特别是那些可在血清中检测到并可用作非侵入诊断肿瘤标志物的分子。膜蛋白很有希望用作候选分子，它们来自肿瘤损伤并易于释放入血流中。但是，迄今仍没有肝癌特异性的YAP依赖性膜蛋白的详细报道。最近的研究表明，Hippo信号传导可导致YAP功能失活[9-10]。除Hippo信号传导外，YAP在肝癌中的致瘤性的保持依赖于多种癌蛋白的配合作用，这些癌蛋白包括TRIB2、c-Myc、CREB、MEK1和SRSF1[11-15]。虽然逐渐鉴定了许多调节YAP功能的核和细胞质蛋白，但是可调控YAP活性并可用作直接治疗靶的膜蛋白仍是未知的。
在本发明中，申请人将黑素瘤细胞黏附分子(MCAM)鉴定为YAP依赖性肝癌的新型血清肿瘤标志物。本申请人的实验结果同时证明，MCAM活性对于肝癌细胞存活和转化是至关重要的，表明其可作为潜在的直接抗癌药靶加以应用。
本发明的第一方面，提供了一种黑素瘤细胞黏附分子(MCAM)的基因、mRNA或cDNA的用途，用作检测肝癌的标志物；或用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。更优选，所述检测是血清检测。
在另一个优选实施方案中，所述试剂包括抗体、引物、探针、核酸微阵列(例如DNA微阵列)或蛋白质微阵列。
在本发明的第二方面，提供了MCAM或其特异性抗体的用途，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。更优选，所述检测是血清检测。
在本发明的第三方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)抗MCAM抗体；和/或
(b)特异性扩增MCAM的mRNA或MCAM的cDNA引物或引物对。
在另一优选实施方案中，所述试剂盒还包含标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌。
在另一优选实施方案中，所述抗MCAM抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明的第四方面，提供了检测肝癌的方法，其中所述方法包括：
(a)制备受试者测试样品；
(b)检测测试样品中MCAM的表达水平，并将检测到的表达水平与参比值相比较，其中MCAM表达水平高于参比值表明受试者患有肝癌，或患肝癌的几率高于正常人群。
在另一优选实施方案中，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。
在另一优选实施方案中，所述参比值为非肝癌样品中的MCAM表达水平。
在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括检测MCAM mRNA的量，或MCAM cDNA的量；和/或检测MCAM的量。
在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。
在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括使用抗MCAM蛋白抗体进行检测。
在另一优选实施方案中，所述检测步骤b通过酶联免疫反应法(ELISA)实现。
在另一优选实施方案中，所述抗MCAM抗体是单克隆抗体或多克隆抗体(如抗血清)。
在另一优选实施方案中，所述方法还包括评估测试样品中其它肝癌标志物的表达水平。
在另一优选实施方案中，所述其它肝癌标志物包括：甲胎蛋白AFP、AFP异构体AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移酶II(GGT II)、GP73、骨桥蛋白OPN、TGF-β、DKK1、SCCA或其组合。
在另一优选实施方案中，所述方法还包括评估测试样品中甲胎蛋白的表达水平。
在本发明的第五方面，提供了MCAM或其特异性抗体的用途，用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。
在另一优选实施方案中，MCAM或其特异性抗体偶联或带有可检测标记。
在另一优选实施方案中，所述可检测标记选自：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选实施方案中，所述诊断试剂是单克隆抗体。
在另一优选实施方案中，所述试剂是蛋白微阵列。
在另一优选实施方案中，所述核酸微阵列包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与MCAM多核苷酸(mRNA或DNA)特异性结合的探针。
在另一优选实施方案中，所述蛋白质微阵列包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗MCAM的特异性抗体。
在另一优选实施方案中，所述特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选实施方案中，所述血清检测是ELISA或双抗体夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)。
在本发明的第六方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有容器，所述容器中含有MCAM蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于血清检测或诊断肝癌。
在另一优选实施方案中，所述标签或说明书中注明以下内容：如果检测对象的血清MCAM的浓度>100ng/ml(优选>500ng/ml，更优选>1,000ng/ml，甚至更优选>2,000ng/ml甚至更优选>2,200ng/ml甚至更优选>2,400ng/ml甚至更优选>2,600ng/ml，最优选>20,000ng/ml)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。ELISA数据表明，肝癌患者中血清MCAM的浓度显著升高(n＝84,20742.48±19215.08ng/ml)。
在另一优选实施方案中，MCAM或其特异性抗体偶联或带有可检测标记。
在另一优选实施方案中，所述肝癌包括肝细胞癌，尤其是原发性肝细胞癌。
在另一优选实施方案中，所述可检测标记选自：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选实施方案中，所述诊断试剂是单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明的第七方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有容器，所述容器中含有特异性扩增MCAM mRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于定量检测MCAM的表达水平来判断患肝癌的几率。
在另一优选实施方案中，所述的标签或说明书中注明以下内容：如果检测对象的MACM mRNA的量与一般人群中MACM mRNA的量之比>1.5(优选>2.0，更优选>2.5，甚至更优选>5.0最优选>10.0)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。
在本发明的第八方面，提供了MCAM的用途，用作血清检测肝癌的标志物。
在本发明的第九方面，提供了MCAM的拮抗剂的用途，用于制备抑制肝癌细胞生长的药物。
在另一优选的实施方案中，所述拮抗剂包括靶向MCAM的siRNA、反义RNA、抗体，或其组合。
在本发明的第十方面，提供了体外检测肝组织中MCAM mRNA的表达是否异常的方法，包括以下步骤：
A，用特异性MCAM的引物，做定量PCR检测，测定待测肝组织中MACM mRNA的数值；
B，将步骤A测得的MCAM的数值与正常肝组织中的MCAM的数值进行比较，如测得的数值高于正常值，则表示被检测肝组织中MCAM的表达异常。
在本发明的第十一方面，提供了体外检测肝组织中MCAM蛋白的表达是否异常的方法，包括以下步骤：
A，用特异性抗MCAM的抗体检测待测肝组织中MACM蛋白的数量；
B，将步骤A测得的MCAM的数量与正常肝组织中的MCAM的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测肝组织中MCAM的表达异常。
在本发明的第十二方面，提供了体外检测血清中MCAM蛋白的含量是否异常的方法，包括以下步骤：
A，用特异性抗MCAM的抗体检测血清中MACM蛋白的数量；
B，将步骤A测得的MCAM的数量与正常人血清中的MCAM的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测血清中MCAM的表达异常。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各种技术特征和在下文(实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1，MCAM受YAP的调节。
(A)筛选可能的YAP靶膜蛋白。如所示在用shRNA转染的Bel-7402或SMMC-7721细胞中对所示膜蛋白进行蛋白质印迹实验。(B)通过免疫荧光法确定Bel-7402、SMMC-7721和Huh7细胞中MCAM的定位。标尺，10μM。(C)YAP不影响MCAM稳定性。
将转染有空或YAP-FLAG表达质粒的Bel-7402细胞用CHX(50μg/ml)处理0或24小时，然后收获用来进行蛋白质印迹实验。MCAM的蛋白表达水平表示为MCAM与GAPDH之间的比率，将0时任意设定为为100％。(D)如所示从用shRNA转染的Bel-7402或SMMC-7721细胞中提取RNA并进行qPCR实验。如所示收获转染有不同表达质粒的Bel-7402细胞用来进行qPCR实验。数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。*,p<0,05,和**,p<0,01，用t检验。(E)来自TMA的MCAM和YAP的代表性IHC染色图像。数据用卡方检验(Chi-square test)进行分析。
图2，CREB是调节MCAM的YAP依赖性转录伙伴。
(A)MCAM基因的启动子分析。如所示，将含截断型MCAM启动子的pGL4.21质粒与pRL-TK质粒共同稳定转染入Bel-7402或SMMC-7721细胞中，并将萤火虫萤光素酶活性归一化至海肾萤光素酶活性。在nt-33～-25之内的可能CRE显示于下。(B)MCAM受PKA控制。用DMSO、H89(5-20μM)，或毛喉素(10-50μM)处理Bel-7402细胞24小时，检测细胞中的MCAM mRNA。将稳定转染有-33-Luc质粒的Bel-7402细胞或SMMC-7721细胞用20μM H89处理24小时，然后分析细胞中的启动子活性。(C)将转染有空或YAP表达质粒的Bel-7402细胞用带有CRE的-33-Luc(野生型)或不带有CRE的-33-Luc稳定转染。CRE用灰色矩形表示。(D)YAP提高CREB诱导的MCAM的上调。如所示将转染有不同质粒的细胞的蛋白质和RNA样品分别进行蛋白质印迹和qPCR分析。(E)用于CRE扩增的特异性引物用箭头表示。如所示，在没有抗体或有对照IgG、抗CREB或抗YAP抗体存在下，进行ChIP-qPCR实验。用抗CREB抗体然后用抗YAP抗体进行连续ChIP实验(Re-ChIP)，也进行了相反顺序的实验。(F)YAP结合是CREB依赖性的。如所示用转染有shRNA的Bel-7402细胞中的抗CREB或抗YAP抗体进行ChIP-qPCR实验。图A-F，数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。*,p<0,05,和**,p<0,01，用t检验。
图3，MCAM是新的肝癌肿瘤标志物。
(A)通过抗MCAM抗体染色的TMA的IHC图像(分别为肝癌和正常肝组织)。(B)来自正常人和原发性肝癌患者的血清MCAM和YAP的蛋白质印迹实验。每个肝癌组和正常组代表10人份的等量血清样品混合物。(C)正常人、肝硬化、乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌患者、结肠癌患者和乳腺癌患者中血清MCAM的ELISA分析。箱图中的水平线代表中值，箱代表四分位范围，触须代表第2.5和97.5百分位。(D)如ELISA所测，血清MCAM和血清AFP在84例肝癌血清样品中呈正相关。血清MCAM和血清AFP的值进行Spearman相关性分析。(E)血清MCAM和血清AFP水平的ROC曲线来检测肝癌。AUC，ROC曲线下面积。(F)小鼠血清及细胞培养基中的MCAM。如所示带有人肝癌异种移植的小鼠被处死并取血。血清用ELISA分析。**,p<0,01，用t检验。如所示1×107个细胞铺在35mm培养皿上，再培养24小时。离心，收集培养基上清，并进行ELISA分析。如所示，通过使用抗YAP抗体的蛋白质印迹实验检测不同细胞系的内源YAP表达水平。(G)人结肠癌组织和正常结肠组织中MCAM表达的免疫组织化学分析。(H)人乳腺癌组织和正常乳腺组织中MCAM表达的免疫组织化学分析。(I)经历肝癌切除手术的40名患者在手术前后的血液样品中MCAM的成对t检验。
图4，MCAM是细胞存活和转化所需要的。
(A-B)如基于MTT的增殖分析(A)和胱天蛋白酶3/7活性(B)所检测，MCAM敲减阻断增殖并诱导Bel-7402细胞中的细胞凋亡，但是不诱导HL-7702中的细胞凋亡。(C)在不存在或存在MCAM表达质粒的情况下，MCAM或YAP敲减的Bel-7402细胞中无贴壁依赖的软琼脂集落形成。(D)使用或不使用多柔比星(Doxo,0.5μg/ml)处理的情况下，表达YAP或针对MCAM的shRNA的Bel-7402细胞中胱天蛋白酶3/7活性。(E)沉默Bel-7402细胞中MCAM或YAP表达抑制体内肿瘤生长。注射后36天测定肿瘤体积(n＝每组5只小鼠)。*,p<0,05,和**,p<0,01，用t检验。(F)注射了MCAM敲减的Bel-7402细胞的无胸腺裸鼠的存活显著高于注射了对照细胞(用GFP-shRNA转染)的小鼠。n＝20每组。
图5，c-Jun/c-Fos用作MCAM下游效应器。
(A)如所示，测试转染了GFP-或MCAM-shRNA的Bel-7402细胞中来自信号传导报道基因的萤光素酶活性(左图)。如所示，测试转染了MCAM shRNA或转染了1-3μg MCAM表达质粒的Bel-7402或SMMC-7721细胞中来自c-Jun/c-Fos报道基因的萤光素酶活性(右图)。将萤火虫萤光素酶活性归一化至海肾萤光素酶活性。(B)在Bel-7402细胞中通过qPCR检测，MCAM的敲减下调了c-Jun/c-Fos靶基因的mRNA表达。(C)Bel-7402细胞中c-Jun/c-Fos细胞内定位。箭头，表示用MCAM-HA转染的细胞；*，表示没有成功转染的细胞。标尺，10μM。(D)如蛋白质印迹所测，MCAM控制c-Jun/c-Fos蛋白质表达。(E)用抗MCAM、抗c-Jun和抗c-Fos抗体染色的，来自图4E的对照细胞(用GFP-shRNA转染)和MCAM敲减的异种移植组织的代表性IHC图像。标尺，200μM。(F)YAP调节的c-Jun/c-Fos表达是MCAM依赖性的。在存在或不存在MCAM-HA表达质粒的情况下，在YAP敲减的细胞中通过蛋白质印迹实验检测c-Jun/c-Fos蛋白。
图6，AKT是MCAM和c-Jun/c-Fos之间的递质。
(A)MCAM对AKT有积极作用。如所示，在转染有GFP或MCAM-shRNA的Bel-7402细胞中不同蛋白的蛋白质印迹实验。(B)MCAM影响AKT定位。通过显微分析，检测瞬时转染有MCAM-HA表达质粒的Bel-7402细胞中AKT定位。箭头，表示转染有MCAM-HA的细胞；*，表示没有成功转染的细胞。标有破折号矩形的区域在下左图被放大。标尺，10μM。(C)AKT结合于MCAM。如所示，MCAM-HA与AKT-Myc共同转染进入Bel-7402细胞。如所示，通过往复免疫共沉淀检测MCAM和AKT结合。(D)如所示，通过在不同细胞系中进行蛋白质印迹实验检测蛋白质表达模式。(E)AKT影响c-Jun/c-Fos表达。在AKT敲减或过表达的细胞中对所示蛋白质进行蛋白质印迹实验。(F)阻断PI3K/AKT降低c-Jun/c-Fos表达和活性。用DMSO、渥曼青霉素(50μM)或LY294002(20μM)处理细胞24小时，进行蛋白质印迹实验和qPCR实验检测所示基因表达。S，表示较短暴露；L，表示较长暴露。数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。*,p<0,05,和**,p<0,01，用t检验。
图7，MCAM-AKT轴影响c-Jun/c-Fos的蛋白质合成。
(A)MCAM和AKT不影响c-Jun/c-Fos的蛋白质稳定性。在存在或不存在MCAM-HA或AKT-Myc表达质粒的情况下，将Bel-7402细胞用CHX(50μg/ml)处理0或24小时，然后收获进行蛋白质印迹实验。(B)MCAM诱导eIF4E结合于c-Jun/c-Fos mRNA。如所示，经不同处理的Bel-7402细胞提取物用抗eIF4E抗体和对照非特异性IgG抗体进行RNA-IP实验。对照IgG和eIF4E IPs中c-Jun/c-Fos RNA水平用RT-qPCR检测。还进行无RT的qPCR实验以排除DNA污染。用特异性抗体免疫沉淀的相对RNA富集被计算为RT-qPCR和无RT的qPCR的数据间的比例，并表示为相对于输入RNA的百分比。(C)如所示，再不同时间点用DMSO、渥曼青霉素(50μM)或LY294002(20μM)处理Bel-7402细胞提取物，用抗eIF4E抗体进行RNA-IP。将“0时”点数据任意设为100％。
图8，MCAM对YAP到c-Jun/c-Fos具有正反馈作用。
(A)如通过pUAS-LUC/TEAD-Gal4系统在Bel-7402细胞中所检测，c-Jun/c-Fos对YAP介导的转录作用的活性提高。(B)c-Jun/c-Fos诱导的YAP蛋白和mRNA水平。通过免疫荧光分析来检测分别转染有c-Jun-FLAG和c-Fos-FLAG表达质粒的Huh7细胞中YAP的定位和细胞内表达。箭头，表示转染有c-Jun/c-Fos-FLAG的细胞；*，表示没有成功转染的细胞。标尺，20μM。(C)如蛋白质印迹实验所检测，c-Jun/c-Fos诱导CREB的活化。(D)c-Jun/c-Fos诱导HULC和YAP启动子活性。如所示，在不同处理条件下，将含YAP(-608～+144)或HULC核心启动子区的报道基因与pRL-TK质粒一道共转染到Bel-7402细胞中。将萤火虫萤光素酶活性归一化至海肾萤光素酶活性。(E)如蛋白质印迹实验在Bel-7402细胞中所检测，MCAM对YAP表达有正向影响。(F)在肝癌细胞中YAP与MCAM之间的正反馈作用的可能机制。数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。*,p<0,05,和**,p<0,01，用t检验。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现，MCAM在肝癌组织高表达且在正常肝组织中低表达，因此可用作肝癌标志物。此外，肝癌细胞中还产生分泌性MCAM进入血液，因此血清中MCAM浓度与检测对象患肝癌的几率呈正相关。因此，血清MCAM可以作为检测肝癌的标志物。在此基础上完成了本发明。
样品
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其他材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定于受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息。
表达
如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如蛋白质免疫印迹上最轻微密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
参比值
如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比MCAM蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其他因素特别相关的情况和结果来确定。
非肝癌样品
如本文所用，术语“非肝癌样品”包括但不限于未患有肝癌的人群，肝癌患者的非肝癌组织。
MCAM蛋白和基因
在本发明中，术语“本发明蛋白”“MCAM”、“MCAM多肽”或“黑素瘤细胞黏附分子”可互换使用，都指具有黑素瘤细胞黏附分子的氨基酸序列(NCBI蛋白序列登录号：NP_006491.2，如SEQ ID NO：2所示)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含有起始甲硫氨酸的MCAM的蛋白。此外，该术语还包括全长的MCAM及其片段。本发明所指的MCAM蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
在本发明中，术语“MCAM基因”、“MCAM多核苷酸”或“黑素瘤细胞黏附分子基因”可互换使用，都指具有人MCAM核苷酸序列的核酸序列。全长MCAM基因是(NCBI GenBank GENE ID.4162)，其转录产物全长mRNA序列(NCBI序列登录号：NM_006500.2，如SEQ ID NO：1所示)也包括在内。应理解，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。还应理解，当核苷酸取代取代产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了MCAM的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的MCAM核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的MCAM多肽。一般来说有以下步骤：
(1)，用本发明的编码人MCAM多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)，在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)，从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，MCAM多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含MCAM编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数升长期后收获，用氯化钙法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用氯化镁。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包囊等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
特异性抗体
在本发明中，术语“本发明的抗体”和“特异性抗MCAM抗体”可互换使用。
本发明还包括对人MCAM多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MCAM基因产物或片段。优选地，指那些能与人MCAM基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MCAM蛋白的分子，也包括那些并不影响人MCAM蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能够与修饰或未经修饰形式的人MCAM基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员一直的各种技术进行制备。例如，纯化的人MCAM基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MCAM蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等，Nature 256；495,1975；Kohler,等,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler,等,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人MCAM蛋白功能的抗体以及不影响人MCAM蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MCAM基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MCAM基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如，大肠杆菌)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与反以后修饰形式结合的抗体(如糖基化火磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人MCAM蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人MCAM蛋白。
检测方法
利用MCAM存在于血清中，且与肝癌密切相关这一特点，本发明还提供了检测或判断肝癌的方法，尤其是血清学检测方法。
在本发明的一个优选实施例中，本发明提供一种检测血清MCAM的ELISA方法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。
检测试剂盒
基于MCAM与肝癌的相关性，即MCAM在肝癌组织中高表达并且在肝癌病人血清中含量高，因此MCAM可以作为肝癌的一种血清诊断标志物。
本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有本发明的抗MCAM的免疫球蛋白阔免疫偶联物，或其活性片段；或者含有特异性扩增MCAM的mRNA或cDNA的引物。
在另一优选实施例中，本发明还提供了MCAM的诊断试剂盒，包括MCAM诊断试剂盒或MCAM酶联免疫检测试剂盒。
用本发明的人肝癌的血清诊断试剂盒检测为阳性的对象，其患肝癌的几率明显高于正常人群或一般肝癌患者。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的MCAM的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于抑制肝癌细胞的生长。
在本发明中，所述的拮抗剂包括针对MCAM的siRNA、反义RNA、抗体，或其组合。此外，所述的拮抗剂还包括可以降低MCAM表达或活性的小分子化合物。
通常，可将MCAM拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，优选为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合可以通过常规途径进行给药，其中包括(但不限于)：腹膜内、静脉内，或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的MCAM拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇，及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如，每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其它治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的MCAM拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，优选该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围内的。
本发明的主要优点包括：
(1)肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，早发现早治疗是提高病人存活率的最有效手段。由于目前肝癌早期诊断的血清标志物较少，发现癌变病人大多为晚期，MCAM是本发明人首次发现的一个肝癌血清标志物，可应用于肝癌的早期诊断。
(2)提供了一种新的通过血清标志物检测和判断肝癌的方法，有助于早期检测或辅助检测肝癌，从而有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。
(3)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。
(4)本发明还提供了MCAM应用于肝癌诊断的检测方法和试剂盒，为MCAM的具体实施提供了可靠保证。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
材料和方法
血清样品
血清样品收集自中国上海瑞金医院中接受肝癌、结肠癌和乳腺癌切除手术的患者。此项研究方案经上海交通大学医学院临床研究与伦理委员会批准。
细胞培养、载体和引物
将HEK-293T、HepG2、Huh7、Bel-7402、SMMC-7721、DLD-1、LS174T和HL-7702细胞在DMEM中培养。将细胞用环己酰胺(CHX,50ug/ml,Sigma,St.Louis,MO,USA)、多柔比星(0.5μg/ml,Sigma)、渥曼青霉素(50uM,Cayman,Ann Arbor,MI,USA)、LY294002(20uM,Cell signaling technology(CST),Boston,MA,USA)或雷帕霉素(50nM,CST)处理0-24小时，然后收获。
针对MCAM、c-Fos和c-Jun的ShRNAs购自Genechem公司(中国上海)。针对AKT和YAP的ShRNAs克隆到pLKO.1慢病毒载体中。编码人MCAM-HA的cDNA片段购自Origene公司(中国北京)并亚克隆入pcDNA3.1(+)载体中。c-Fos和c-Jun表达载体购自Origene公司。Wnt-报道基因(pTOP-FLASH)、HULC启动子-报道基因和YAP表达质粒如参考文献所述构建[14-15]。截断的MCAM启动子区进行PCR扩增，用Bel-7402细胞的gDNA为模板，并克隆入pGL4.21质粒中(Promega,Madison,WI,USA)。用重叠PCR构建突变启动子报道基因。NF-κB、c-Myc、Rb、STAT3和c-Jun/c-Fos报道基因购自Beyotime公司(中国海门)。所用引物全部列于附表S1，如SEQ ID NO：3-46所示。
免疫组织化学(IHC)、免疫荧光分析(IF)和蛋白质印迹实验(WB)
对于IHC，组织微阵列分析(TMA)载玻片购自美国Biomax公司(Rockville,MD,USA)。IHC的详细操作方案见参考文献[16]。所用的第一抗体为：抗-MCAM(Epitomics,Burlingame,CA,USA,2505)、抗-YAP(Epitomics,2060)、抗-c-Fos(CST,2250)和抗-c-Jun(CST,9165)抗体。
对于IF，详细的操作方案见参考文献[16]。所用的抗体为：抗-YAP(CST,4912,或Santa curz Biotechnology,Santa cruz,CA,USA,sc-101199)、抗-AKT(CST,4691)、抗-MCAM(Epitomics,2505)、抗-FLAG(CST,8146或2368)、抗-HA(CST,2367抗3724)、抗-c-Fos(CST,2250)或抗-c-Jun(CST,9165)抗体。
对于WB，将蛋白用SDS-PAGE凝胶分离，然后进行标准WB实验。所用一抗为：抗-MCAM(Epitomics,2505)、抗-FLAG(Sigma,F3165或CST,2368)、抗-HA(CST,3724或2367)、抗-Myc(CST,2278或2276)、抗-YAP(Epitomics,2060)、抗-CREB(CST,9197)、抗-p-CREB(CST,9198)、抗-AKT(CST,4691)、抗-p-AKT(CST,4060)、抗-p-AKT substrate(CST,9614)、抗-GAPDH(CST,5174)、抗-p-mTOR(CST,5536)、抗-mTOR(CST,2983)、抗-p-p70S6K(CST,9234)、抗p70S6K(CST,1175)、抗-c-Jun(Epitomics,1254)、抗-c-Fos(CST,2250)、抗-4EBP1(CST,9644)、抗-p-4EBP1(SantaCruz,sc-12884-R)和抗-eIF4E(abcam,中国香港,ab33766)抗体。
细胞增殖、胱天蛋白酶3/7活性、软琼脂分析、萤光素酶报道基因分析、免疫沉淀(IP)和定量RT-PCR(qPCR)。
如所述，通过基于MTT的增殖分析测定细胞增殖[15]。用Caspase-Glo 3/7分析系统(Promega)测定胱天蛋白酶3/7活性。无贴壁依赖的软琼脂生长分析、萤光素酶报道基因分析、IP和qPCR如参考文献[15]所述进行。
RNA-免疫沉淀分析(RNA-IP)
如参考文献[11]所述进行RNA-IP，免疫沉淀用对照IgG(Santa Cruz,sc-2345)或抗-eIF4E抗体(Abcam,ab33766)(2μg每次反应)。
染色质免疫沉淀(ChIP)和Re-ChIP
如参考文献[14]所述对1×107Bel-7402细胞进行ChIP分析。将蛋白质-DNA复合体用3μg抗-YAP(Epitomics,2060)、抗-CREB(CST,9197)，或偶联有蛋白质A/G珠的非特异性IgG(Santa cruz,sc-2345)抗体孵育过夜，然后洗脱。如参考文献[14]所述进行Re-ChIP分析。DNA用酚/氯仿提取并用乙醇沉淀来纯化，进行qPCR。
ELISA
包被96孔Elisa板。将50μl山羊抗人MCAM多克隆抗体(R&D systems,Inc.,CatAF932,100ng/μl)溶于4,950μl PBS溶液中。96孔板的每个孔中加入50μl上述稀释液并于4℃过夜。各孔用0.05％PBST溶液200μl清洗3次，每次3分钟。各孔加入含有4％BSA(Sigma,Cat A3059-50G)的100μl PBS，室温封闭2小时，然后用0.05％PBST溶液200μl清洗3次，每次3分钟。将10μl血清加入到添加有0.1％Tween和1％BSA的40μl PBS中(按1:5稀释于样品稀释液中)。每个样本重复加样两次，将每孔50μl重组人MCAM蛋白标准(Lichen Biotech,10ng/μl)加入到添加有0.1％BSA的400μl PBS中，然后倍比稀释。设置7个稀释程度，每个标准重复加样两次，每孔加入50μl。将板室温孵育2小时，然后用0.05％PBS溶液200μl清洗3次，每次3分钟。将20μl生物素标记的山羊抗人MCAM抗体(R&D systems,Inc.,Cat.BAF932,50ng/μl)稀释于4,980μl 0.1％BSA的TBS溶液中，每孔加入100μl上述稀释液。将板于37℃放置1小时，然后用0.05％PBS溶液200μl清洗5次，每次5分钟。将0.5μl缀合有链霉亲和素的辣根过氧化物酶(Vector laboratories,Inc.,Cat.SA-5704)稀释于5ml缓冲液中(10mM磷酸盐,0.15M NaCl,0.1％Tween 20,pH 7.8)，并将50μl上述稀释液加入各孔中，37℃避光孵育15分钟。各孔用0.05％PBST溶液200μl清洗3次，每次3分钟。将50μl OPD底物溶液[8mg OPD(DakoCytomation,Cat.S2045)溶于12ml水和5μl H2O2中]加入到各孔中显色，37℃孵育15分钟。将50μl 0.5M H2SO.4终止缓冲液加入到各孔中，并将没有加标准的用作空白对照。用微滴定板于450nm测定各孔的OD值。
小鼠模型
对于异种移植实验，如所示将表达shRNA的5×106Bel-7402细胞皮下注射入8-周龄无胸腺裸鼠(Bikai,中国上海)。每6天用游标卡尺检测肿瘤大小，肿瘤体积按0.5×L×W2公式计算，L表示长度，W表示宽度。心脏穿刺收集血样(100μl)并用于测定人MCAM。
对于存活实验，将1×106Bel-7402细胞通过尾经脉注射入8-周龄雌性无胸腺裸鼠。每天检测小鼠，用存活时间作为标准来测定肿瘤恶性程度。所有有关动物以及照料的程序都遵照研究指导，并且合乎法律和政策。
实施例1
用组织微阵列(TMA)分析检测人肝癌和正常肝组织中MCAM的表达
通过组织微阵列(TMA)对418例肝癌组织样品和24例正常肝组织样品进行染色和分析。如图3A所示，418例肝癌组织中有304例免疫组化膜染色阳性，比例为约72.7％。而正常肝组织24例中无一例染色阳性。
数据分析显示，MCAM蛋白表达在肝癌组织中膜染色显著强于正常肝组织。
实施例2
用免疫组织化学分析人结肠癌和乳腺癌组织中MCAM的表达
对5例正常以及24例结肠癌组织样品进行IHC染色和分析，并对其相应组织细胞染色情况进行统计。如图3G所示，发现正常组织与肠癌组织样品无统计学差异(p<0.01)。此外，可见MCAM仅较多位于腺泡或血管表面，在结肠组织细胞表面极少见到。
类似的，对5例正常以及24例乳腺癌组织样品进行IHC染色和分析，并对其相应组织细胞染色情况进行统计。如图3H所示，发现正常组织与乳腺癌组织样品无统计学差异(p<0.01)。此外，可见MCAM仅较多位于腺泡或血管表面，在乳腺组织细胞表面极少见到。
数据分析显示，MCAM蛋白表达在肝癌组织中的特异性强于结肠癌及乳腺癌。
实施例3
选取一组肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、Huh7经免疫荧光观察MCAM的膜定位。如图1B所示，可见MCAM明显位于细胞膜上。
数据分析显示，MCAM蛋白是位于细胞膜上的肝癌特异性标志物。
实施例4
用蛋白质印迹检测人肝癌和正常组织血清样品中的MCAM
进行蛋白质印迹实验来检测8组人肝癌患者血清样品(每组为10人份肝癌病人血清等量混合)和一组正常人血清样品(每组为10人份正常人血清等量混合)中的血清MCAM。如图3B所示，人肝癌患者血清样品中MCAM的浓度明显高于正常人血清样品中的浓度。
数据分析显示，MCAM蛋白是灵敏的肝癌特异性血清标志物。
实施例5
用ELISA检测肝癌、肝炎、肝硬化、结肠癌和乳腺癌患者血清中的MCAM量
使用上述ELISA系统，对总计504例不同组人血清样品中的MCAM进行检测，其中包括85例正常人、27例肝硬化、97例乙型肝炎、81例丙型肝炎、84例肝癌、89例肠癌和41例乳腺癌患者。
如图3C所示，各组人血清样品中的MCAM的量都以中值数表示。血清样品中MCAM的量为：正常人组(n＝85,2761.99±6232.38ng/ml)、肝硬化组(n＝27,2056.75±2050.07ng/ml),乙肝组(n＝97,1812.94±2164.97ng/ml)、丙肝组(n＝81,2322.26±3718.36ng/ml)、肝癌组(n＝84,20742.48±19215.08ng/ml)、结肠癌组(n＝89,1618.67±1445.47ng/ml)和乳腺癌组(n＝41,2156.63±2675.25ng/ml)。可见，肝癌患者血清中MCAM的量显著高于正常人、其他肝脏疾病和非肝癌血清样品中的量。
数据分析显示，MCAM蛋白是定量的灵敏的肝癌特异性血清标志物。
实施例6
检测40例肝癌患者肝癌切除术前后血清中MCAM浓度。如图3I所示，术后MCAM浓度(3980.83±4733.48ng/ml)比术前(20168.59±17536.69ng/ml)下降明显。
数据分析显示，MCAM蛋白作为肝癌特异性血清标志物可用于预测肝癌切除手术患者的临床结果。
实施例7
作为经典的肿瘤标志物，血清MCAM与AFP呈显著正相关，具有统计学意义
分析了甲胎蛋白(AFP)和MCAM在肝癌诊断中的相关性。用Spearman相关性分析法分析血清MCAM和血清AFP的值。如图3D所示，R＝0.0858(P<0.0001)，表明血清MCAM和血清AFP具有正相关性，具有统计学意义。
数据分析显示，MCAM蛋白作为特异性血清标志物可在临床诊断中用作另选的可靠的预测肝癌的血清标志物。
实施例8
MCAM和AFP作为肝癌诊断试剂的对比
进一步分析了MCAM用于肝癌诊断的灵敏度和特异性等指标，并与现有的肝癌诊断标志物AFP进行了比较。通过ROC曲线分析它们在区分肝癌患者和正常人群时的灵敏度和特异性是相当的。结果如图3E所示AFP的AUC是0.9315，而MCAM的AUC是0.9471。在区分肝癌患者和正常人时，以2000ng/ml为临界值，对应的灵敏度和特异性分别可达到94.05％和88.24％；以2200ng/ml为临界值，对应的灵敏度和特异性分别可达到92.86％和90.59％；以2400ng/ml为临界值，对应的灵敏度和特异性分别可达到90.48％和95.29％；以2600ng/ml为临界值，对应的灵敏度和特异性分别可达到82.14％和95.29。
数据分析显示，MCAM蛋白作为特异性血清标志物可在临床诊断中与AFP一起用作可靠的预测肝癌的组合型血清标志物。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇被单独引用作为参考。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
附表S1
表.S1-1.用于制粒构建的引物.
表.S1-2.用于qPCR的引物
表.S1-3.用于RNA-IP的引物
表.S1-4.用于ChIP的引物
表.S1-5.用于shRNAs的引物
参考文献
1.Overholtzer M,Zhang J,Smolen GA,et al.Transforming properties of YAP,acandidate oncogene on the chromosome 11q22amplicon.Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103:2405-10.
2.Xu MZ,Yao TJ,Lee NP,et al.Yes-associated protein is an independent prognosticmarker in hepatocellular carcinoma.Cancer.2009；115:4576-85.
3.Anakk S,Bhosale M,Schmidt VA,et al.Bile acids activate YAP to promote livercarcinogenesis.Cell Rep 2013；5:1060-69.
4.Camargo FD,Gokhale S,Johnnidis JB,et al.YAP1increases organ size andexpands undifferentiated progenitor cells.Curr Biol 2007；17:2054-60.
5.Zhang N,Bai H,David KK,et al.The Merlin/NF2tumor suppressor functionsthrough the YAP oncoprotein to regulate tissue homeostasis in mammals.Dev Cell2010；19:27-38.
6.Zhao B,Ye X,Yu J,et al.TEAD mediates YAP-dependent gene induction andgrowth control.Genes Dev 2008；22:1962-71.
7.Urtasun R,Latasa MU,Demartis MI,et al.Connective tissue growth factorautocriny in human hepatocellular carcinoma:oncogenic role and regulation by epidermalgrowth factor receptor/yes-associated protein-mediated activation.Hepatology.2011；54:2149-58.
8.Li H,Wolfe A,Septer S,et al.Deregulation of Hippo kinase signalling in humanhepatic malignancies.Liver Int 2012；32:38-47.
9.Zhao B,Li L,Tumaneng K,et al.A coordinated phosphorylation by Lats and CK1regulates YAP stability through SCF(beta-TRCP).Genes Dev 2010；24:72-85.
10.Pan D.The hippo signaling pathway in development and cancer.Dev Cell2010；19:491-505.
11.Wang J,Wang H,Zhang Y,et al.Mutual inhibition between YAP and SRSF1maintains long non-coding RNA,Malat1-induced tumourigenesis in liver cancer.Cell Signal2014；26:1048-59.
12.Li L,Wang J,Zhang Y,et al.MEK1promotes YAP and their interaction is criticalfor tumorigenesis in liver cancer.FEBS Lett 2013；587:3921-27.
13.Xiao W,Wang J,Ou C,et al.Mutual interaction between YAP and c-Myc iscritical for carcinogenesis in liver cancer.Biochem Biophys Res Commun 2013；439:167-72.
14.Wang J,Park JS,Wei Y,et al.TRIB2acts downstream of Wnt/TCF in liver cancercells to regulate YAP and C/EBPαfunction.Mol Cell 2013；51:211-25.
15.Wang J,Ma L,Weng W,et al.Mutual interaction between YAP and CREBpromotes tumorigenesis in liver cancer.Hepatology.2013；58:1011-20.
16.Ma L,Wang J,Lin J,et al.Cluster of Differentiation 166(CD166)regulated byPhosphatidylinositide 3-Kinases(PI3K)/AKT signaling to exert its anti-apoptotic role viaYes associated protein(YAP)in liver cancer.J Biol Chem 2014；289:6921-33.
17.Lehmann JM,Holzmann B,Breitbart EW,et al.Discrimination between benignand malignant cells of melanocytic lineage by two novel antigens,a glycoprotein with amolecular weight of 113,000and a protein with a molecular weight of 76,000.Cancer Res1987；47:841-45.
18.Wang Z,Yan X.CD146,a multi-functional molecule beyond adhesion.CancerLett 2013；330:150-62.
19.Yamaguchi K,Lantowski A,Dannenberg AJ,et al.Histone deacetylase inhibitorssuppress the induction of c-Jun and its target genes including COX-2.J Biol Chem2005；280:32569-77.
20.Bakiri L,Matsuo K,Wisniewska M,et al.Promoter specificity and biologicalactivity of tethered AP-1dimers.Mol Cell Biol 2002；22:4952-64.
21.Quan T,Qin Z,Xu Y,et al.Ultraviolet irradiation induces CYR61/CCN1,amediator of collagen homeostasis,through activation of transcription factor AP-1in humanskin fibroblasts.J Invest Dermatol 2010；130:1697-1706.
22.Li G,Kalabis J,Xu X,et al.Reciprocal regulation of MelCAM and AKT inhuman melanoma.Oncogene.2003；22:6891-99.
23.He L,Simmen FA,Mehendale HM,et al.Chronic ethanol intake impairs insulinsignaling in rats by disrupting Akt association with the cell membrane.Role of TRB3ininhibition of Akt/protein kinase B activation.J Biol Chem 2006；281:11126-34.
24.Scheper GC,Proud CG.Does phosphorylation of the cap-binding protein eIF4Eplay a role in translation initiation？Eur J Biochem 2002；269:5350-59.
25.Sonenberg N,Hinnebusch AG.Regulation of translation initiation in eukaryotes:mechanisms and biological targets.Cell 2009；136:731-45.
26.Sonenberg N,Gingras AC.The mRNA 5'cap-binding protein eIF4E and controlof cell growth.Curr Opin Cell Biol 1998；10:268-75.
27.Fingar DC,Salama S,Tsou C,et al.Mammalian cell size is controlled by mTORand its downstream targets S6K1and 4EBP1/eIF4E.Genes Dev 2002；16:1472-87.
28.Xie S,Price JE,Luca M,et al.Dominant-negative CREB inhibits tumor growthand metastasis of human melanoma cells.Oncogene.1997；15:2069-75.
29.Melnikova VO,Balasubramanian K,Villares GJ,et al.Crosstalk betweenprotease-activated receptor 1and platelet-activating factor receptor regulates melanoma celladhesion molecule(MCAM/MUC18)expression and melanoma metastasis.J Biol Chem2009；284:28845-55.
30.Tschaharganeh DF,Chen X,Latzko P,et al.Yes-associated protein up-regulatesJagged-1and activates the Notch pathway in human hepatocellular carcinoma.Gastroenterology.2013；144:1530-42.
31.Mills L,Tellez C,Huang S,et al.Fully human antibodies to MCAM/MUC18inhibit tumor growth and metastasis of human melanoma.Cancer Res 2002；62:5106-14.
32.Fan R,Kim NG,Gumbiner BM.Regulation of Hippo pathway by mitogenicgrowth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1.ProcNatl Acad Sci U S A.2013；110:2569-74.
33.Zhang H,Wu S,Xing D.Inhibition of Aβ(25-35)-induced cell apoptosis bylow-power-laser-irradiation(LPLI)through promoting Akt-dependent YAP cytoplasmictranslocation.Cell Signal 2012；24:224-32.
34.Lee YC,Lin HH,Hsu CH,et al.Inhibitory effects of andrographolide onmigration and invasion in human non-small cell lung cancer A549cells via down-regulationof PI3K/Akt signaling pathway.Eur J Pharmacol 2010；632:23-32.

Claims (10)

1.一种诊断肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
抗黑素瘤细胞黏附分子(MCAM)抗体；和/或
特异性扩增MCAM mRNA或MCAM cDNA的引物或引物对。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌。
3.权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒用于血清检测或血清诊断肝癌。
4.权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述抗体偶联有或带有可检测标记。
5.权利要求4的诊断试剂盒，其中所述可检测标记选自：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
6.一种用于抑制肝癌细胞生长的组合物，包含MCAM拮抗剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述拮抗剂包含MCAM靶向siRNA、反义RNA、MCAM抗体、小分子化合物，或其组合。
8.MCAM、MCAM抗体、MCAM mRNA或MCAM cDNA在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述治疗选自诊断、治疗和预后。
10.权利要求8或9的用途，其中所述MCAM、MCAM抗体、MCAM mRNA或MCAM cDNA是全长分子、其片段或其变异体。
CN201410728835.9A 2014-12-04 2014-12-04 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途 Pending CN104531843A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410728835.9A CN104531843A (zh) 2014-12-04 2014-12-04 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途
PCT/CN2015/075833 WO2016086560A1 (zh) 2014-12-04 2015-04-03 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410728835.9A CN104531843A (zh) 2014-12-04 2014-12-04 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104531843A true CN104531843A (zh) 2015-04-22

Family

ID=52847462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410728835.9A Pending CN104531843A (zh) 2014-12-04 2014-12-04 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN104531843A (zh)
WO (1) WO2016086560A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107271670A (zh) * 2017-05-04 2017-10-20 厦门大学 Ppp1ca作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用
CN107345967A (zh) * 2016-05-05 2017-11-14 中国医学科学院基础医学研究所 Gp73蛋白作为血清标记物在诊断癌症中的用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111624078A (zh) * 2019-09-16 2020-09-04 湖北第二师范学院 点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及染色方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003139A1 (en) * 1990-08-14 1992-03-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
CN102181400A (zh) * 2010-10-15 2011-09-14 北京蛋白质组研究中心 杂交瘤细胞株及抗hcclm-6细胞分泌蛋白单克隆抗体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102936283B (zh) * 2008-01-31 2014-11-05 中国科学院生物物理研究所 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法
CN106913870A (zh) * 2014-06-27 2017-07-04 中国科学院生物物理研究所 用于阻断Netrin‑1与CD146之间的相互作用的试剂及其肿瘤治疗用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003139A1 (en) * 1990-08-14 1992-03-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
CN102181400A (zh) * 2010-10-15 2011-09-14 北京蛋白质组研究中心 杂交瘤细胞株及抗hcclm-6细胞分泌蛋白单克隆抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴飞翔等: "肝癌组织中CD146、微血管密度与临床病理关系的研究", 《广西医科大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345967A (zh) * 2016-05-05 2017-11-14 中国医学科学院基础医学研究所 Gp73蛋白作为血清标记物在诊断癌症中的用途
CN107271670A (zh) * 2017-05-04 2017-10-20 厦门大学 Ppp1ca作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用
CN107271670B (zh) * 2017-05-04 2019-10-11 厦门大学 Ppp1ca作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016086560A1 (zh) 2016-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Zinc-dependent regulation of ZEB1 and YAP1 coactivation promotes epithelial-mesenchymal transition plasticity and metastasis in pancreatic cancer
Myojin et al. Hepatic stellate cells in hepatocellular carcinoma promote tumor growth via growth differentiation factor 15 production
Kashima et al. Cancer‐associated fibroblasts (CAFs) promote the lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma
Zhu et al. HBx drives alpha fetoprotein expression to promote initiation of liver cancer stem cells through activating PI3K/AKT signal pathway
Li et al. ENO1 promotes lung cancer metastasis via HGFR and WNT signaling–driven epithelial-to-mesenchymal transition
Zhao et al. PI3K positively regulates YAP and TAZ in mammary tumorigenesis through multiple signaling pathways
Fan et al. Long noncoding RNA MALAT1 contributes to sorafenib resistance by targeting miR-140-5p/Aurora-A signaling in hepatocellular carcinoma
Song et al. Flotillin-1 promotes tumor necrosis factor-α receptor signaling and activation of NF-κB in esophageal squamous cell carcinoma cells
CN105349618B (zh) 三阴性乳腺癌标记物及其在诊断和治疗中的应用
Bahnassy et al. Aberrant expression of cancer stem cell markers (CD44, CD90, and CD133) contributes to disease progression and reduced survival in hepatoblastoma patients: 4-year survival data
D’Arcy et al. Oncogenic functions of the cancer-testis antigen SSX on the proliferation, survival, and signaling pathways of cancer cells
Xiao et al. S100A11 promotes human pancreatic cancer PANC‑1 cell proliferation and is involved in the PI3K/AKT signaling pathway
Rau et al. Neovascularization evaluated by CD105 correlates well with prognostic factors in breast cancers
Moore et al. Antibody-guided in vivo imaging for early detection of mammary gland tumors
Liu et al. A low level of GPR37 is associated with human hepatocellular carcinoma progression and poor patient survival
Yong et al. Overexpression of Semaphorin-3E enhances pancreatic cancer cell growth and associates with poor patient survival
Song et al. Hypermethylation of GNA14 and its tumor-suppressive role in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma
Liu et al. PSCA regulates IL‐6 expression through p38/NF‐κB signaling in prostate cancer
Liu et al. Carboxyl-terminal modulator protein positively regulates Akt phosphorylation and acts as an oncogenic driver in breast cancer
Xu et al. The roles of REIC gene and its encoding product in gastric carcinoma
Yao et al. MTA1 promotes proliferation and invasion in human gastric cancer cells
Peng et al. CIP2A overexpression induces autoimmune response and enhances JNK signaling pathway in human lung cancer
Cai et al. Downregulation of PTPN 18 can inhibit proliferation and metastasis and promote apoptosis of endometrial cancer
Li et al. RIPK4 suppresses the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by inhibiting the phosphorylation of STAT3
CN104531843A (zh) 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170110

Address after: 311188 Zhejiang economic and Technological Development Zone, Yuhang, Xingguo Road, No. 519, building, floor, floor, No. 10, No.

Applicant after: The Sheng Tai biotechnology Limited by Share Ltd

Address before: Hangzhou City, Zhejiang province 311188 Xingguo Qianjiang Road Economic Development Zone No. 519

Applicant before: HANGZHOU JOIN GENOME BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150422