CN107271670B - Ppp1ca作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用 - Google Patents

Ppp1ca作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PPP1CA作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用。分别利用RT‑PCR,Western Blot,免疫组化检测了肝癌患者组织中PPP1CA的表达，与非癌组织相比，PPP1CA基因表达水平及蛋白水平明显升高。而利用ELISA或免疫化学发光法检测血液中PPP1CA的含量，与正常人相比，肝癌患者血清中PPP1CA显著升高。分析显示，组织或血样中PPP1CA表达水平升高与肝癌的发生、发展密切相关；PPP1CA高表达的肝癌患者5年生存期缩短。因此可以通过检测组织样品或血样中PPP1CA含量进行肝癌的诊断和预后判断。为临床上诊断和判断治疗预后提供了一种灵敏度更高、特异性更强的标志物及方法。

Description

PPP1CA作为肝癌诊断和检测预后的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及临床诊断领域，具体地说，涉及诊断肝癌的新的标志物及其在诊断肝癌中的应用
背景技术
由于肝癌发病机理复杂，因此，缺乏高效、特异的生物标志物。因此本发明试图寻找一个比现今常用的临床使用的诊断标志物更高效的、灵敏、特异的肝癌生物标志物及其在诊断肝癌中的应用。
目前临床上应用最为广泛的，用于诊断肝癌的生物标志物是甲胎蛋白(AFP)，但AFP有其明显的应用限制。根据大量临床样本统计分析得出，其诊断特异性为85％-90％，但精确度仅为18％-60％。除了甲胎蛋白(AFP)作为肝癌诊断标志物，之后国际上也有许多生物标志物被用于和AFP共同检测，以增加准确性，如脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、骨桥蛋白(OPN)、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)和高尔基体蛋白-73(GP73)。但这些标志物在特异性和灵敏性方面与AFP相比，并没有优势。因此，AASLD(AmericanAssociation for the Study of Liver Disease,美国肝病研究协会)认为AFP“缺乏充分的敏感性和特异性来监视和诊断HCC”。EASL(European Association for the Study ofthe Liver，欧洲肝脏研究协会)也不推荐使用AFP用于HCC的临床诊断。
另外，由于目前缺乏高效、特异的肝癌诊断标志物，所以赵运胜等在国内利用血清，对低浓度甲胎蛋白(AFP)原发性小肝癌患者血清进行了高尔基体蛋白73(GP73)、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3(GPC-3)和异常凝血酶原(DCP)联合检测。结果显示，四种标志物检测的灵敏度、特异性、准确率和曲线下面积分别为78.0％,94.0％,88.7％和0.867。仍然无法满足临床上对肝癌的高效、简便、特异性检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诊断肝癌的新的标志物、诊断试剂盒及引物和抗体。可作为高特异性、高灵敏性的肝癌早期诊断和判断治疗预后的检测标志物。
为实现上述目的，本发明提供一种PPP1CA基因及蛋白作为诊断肝癌标志物的用途。
进一步，所述的检测是血清检测。
进一步，所述的检测也包括组织样品检测。
本发明还提供一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有PPP1CA基因的检测引物或PPP1CA蛋白的单克隆或多克隆抗体。
进一步，所述PPP1CA基因的检测引物是用于检测SEQ ID NO:1序列的引物。
进一步，所述PPP1CA基因检测引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述PPP1CA蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述PPP1CA单克隆或多克隆抗体是抗如SEQ ID NO:2所示蛋白序列的抗体。
本发明还提供一种用于检测肝癌的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ IDNO:3和4所示。
本发明利用肿瘤组织及血液样品，寻找到以PPP1CA为新的肝癌诊断的生物标志物，可高效、特异、灵敏的进行肝癌的早期及预后诊断。
本发明所述PPP1CA基因的cDNA序列及蛋白序列分别为：SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2
5'-GCGGGGCCGCGGGCCGGGGGCGGACTGGGGCGGGCGGAAGGAGAGCCAGGCCGGAAGGAGGCTGCCGGAGGGCGGGAGGCAGGAGCGGGCCAGGAGCTGCTGGGCTGGAGCGGCGGCGCCGCCATGTCCGACAGCGAGAAGCTCAACCTGGACTCGATCATCGGGCGCCTGCTGGAAGGGTCCAGGGTCCTGACACCCCATTGCGCCCCAGTGCAGGGCTCGCGGCCTGGCAAGAATGTACAGCTGACAGAGAACGAGATCCGCGGTCTGTGCCTGAAATCCCGGGAGATTTTTCTGAGCCAGCCCATTCTTCTGGAGCTGGAGGCACCCCTCAAGATCTGCGGTGACATACACGGCCAGTACTACGACCTTCTGCGACTATTTGAGTATGGCGGTTTCCCTCCCGAGAGCAACTACCTCTTTCTGGGGGACTATGTGGACAGGGGCAAGCAGTCCTTGGAGACCATCTGCCTGCTGCTGGCCTATAAGATCAAGTACCCCGAGAACTTCTTCCTGCTCCGTGGGAACCACGAGTGTGCCAGCATCAACCGCATCTATGGTTTCTACGATGAGTGCAAGAGACGCTACAACATCAAACTGTGGAAAACCTTCACTGACTGCTTCAACTGCCTGCCCATCGCGGCCATAGTGGACGAAAAGATCTTCTGCTGCCACGGAGGCCTGTCCCCGGACCTGCAGTCTATGGAGCAGATTCGGCGGATCATGCGGCCCACAGATGTGCCTGACCAGGGCCTGCTGTGTGACCTGCTGTGGTCTGACCCTGACAAGGACGTGCAGGGCTGGGGCGAGAACGACCGTGGCGTCTCTTTTACCTTTGGAGCCGAGGTGGTGGCCAAGTTCCTCCACAAGCACGACTTGGACCTCATCTGCCGAGCACACCAGGTGGTAGAAGACGGCTACGAGTTCTTTGCCAAGCGGCAGCTGGTGACACTTTTCTCAGCTCCCAACTACTGTGGCGAGTTTGACAATGCTGGCGCCATGATGAGTGTGGACGAGACCCTCATGTGCTCTTTCCAGATCCTCAAGCCCGCCGACAAGAACAAGGGGAAGTACGGGCAGTTCAGTGGCCTGAACCCTGGAGGCCGACCCATCACCCCACCCCGCAATTCCGCCAAAGCCAAGAAATAGCCCCCGCACACCACCCTGTGCCCCAGATGATGGATTGATTGTACAGAAATCATGCTGCCATGCTGGGGGGGGGTCACCCCGACCCCTCAGGCCCACCTGTCACGGGGAACATGGAGCCTTGGTGTATTTTTCTTTTCTTTTTTTAATGAATCAATAGCAGCGTCCAGTCCCCCAGGGCTGCTTCCTGCCTGCACCTGCGGTGACTGTGAGCAGGATCCTGGGGCCGAGGCTGCAGCTCAGGGCAACGGCAGGCCAGGTCGTGGGTCTCCAGCCGTGCTTGGCCTCAGGGCTGGCAGCCGGATCCTGGGGCAACCCATCTGGTCTCTTGAATAAAGGTCAAAGCTGGATTCTCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' SEQ ID NO:1。
相应的蛋白序列为
MSDSEKLNLDSIIGRLLEGSRVLTPHCAPVQGSRPGKNVQLTENEIRGLCLKSREIFLSQPILLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGKQSLETICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKTFTDCFNCLPIAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRIMRPTDVPDQGLLCDLLWSDPDKDVQGWGENDRGVSFTFGAEVVAKFLHKHDLDLICRAHQVVEDGYEFFAKRQLVTLFSAPNYCGEFDNAGAMMSVDETLMCSFQILKPADKNKGKYGQFSGLNPGGRPITPPRNSAKAKK SEQ ID NO:2。
本发明所涉及的检测方案包括三个方面：
1.对患者组织样品中PPP1CA基因表达水平的检测：
多数肝癌患者样品中基因表达水平应高于非癌组织1倍以上(图1)
2.对患者组织样品中PPP1CA蛋白表达水平的蛋白免疫印迹(WB)和免疫组化检测(IHC)：
应该有69％左右的肝癌患者样品中蛋白含量高于非癌组织(图2)
3.血液样品中PPP1CA的检测，作为肝癌早期诊断标志物：
利用PPP1CA为检测指标，检验血液样品中其蛋白含量，如果检测限为695.9ng/mL时，PPP1CA的检出率可高达90.59％。
4.对肝癌患者治疗后进行检测，可作为治疗预后的检测标志物：
根据本发明的检测方法，检测了肝癌患者的血液样品中的PPP1CA含量，对患者血液样品中PPP1CA检测值低于695.9ng/mL的患者进行分析，发现这些患者接受治疗后其血样中PPP1CA检测值降低，提示，PPP1CA可作为患者治疗预后的检测指标。结果见表1。
表1.PPP1CA检测值低于695.9ng/mL的患者治疗情况表
本发明的申请人分别利用RT-PCR,Western Blot,免疫组化检测了肝癌患者组织中PPP1CA的表达，发现与非癌组织相比，PPP1CA基因表达水平及蛋白水平明显升高。而利用ELISA或免疫化学发光法检测血液中PPP1CA的含量，发现与正常人相比，肝癌患者血清中PPP1CA显著升高。上述结果结合临床分析显示，PPP1CA组织或血样中表达水平升高与肝癌的发生、发展密切相关；PPP1CA高表达的肝癌患者5年生存期缩短。因此可以通过检测组织样品或血样中PPP1CA含量进行肝癌的诊断和预后判断。本发明的诊断和预后标志物为临床上诊断和判断治疗预后提供了一种灵敏度更高、特异性更强的手段。
附图说明
图1为PPP1CA mRNA在患者组织中的表达水平图；
图2A为WB检测肝癌或非癌组织裂解液中PPP1CA蛋白水平图；
图2B为WB检测肝癌及非癌组织结果统计分析图。
图2C为免疫组化法检测肝癌或非癌组织中PPP1CA的表达水平图；
图3A为ELISA或免疫化学发光法检测PPP1CA在血清样品的中蛋白含量图；
图3B为Cancer Browser网站的数据库对不同PPP1CA表达水平与肝癌患者生存率相关性分析图；
图3C为免疫化学发光法检测AFP在血清样品的中蛋白含量图；
图3D为免疫化学发光法检测AFP-L3在血清样品的中蛋白含量图；
图4为检测肝癌患者样品中PPP1CA以及AFP的ROC曲线图；
图5A为血清样品中检测PPP1CA作为肝癌检测标志物的检出率图；
图5B为血清样品中检测AFP作为肝癌检测标志物的检出率图；
图5C为血清样品中检测AFP-L3作为肝癌检测标志物的检出率图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：肝癌组织中PPP1CA基因表达水平的检测
1.在肝癌组织中PPP1CA基因表达水平的检测包括利用RT-PCR,RT-qPCR检测具体步骤为：
1)设计GAPDH和PPP1CA的特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。
2)配置1ml 5×mix，避光、-20℃可长期保存：DEPC H2O 372.5μl；10×buffer 500μl；dNTP 125μl；STBR(提前稀释为1000×)2.5μl。
3)从待测组织样本中提取出mRNA并反转录为cDNA作为该实验的模版。按表2配制反应体系。配好后轻轻混匀并点离。
表2 qPCR反应体系表
Reagents Volume
Template 50ng/μl
Primers(10mM) 1.2μl
5×mix 4μl
Enzyme 0.1μl
DEPC H<sub>2</sub>O 13.7μl
total 20μl
4)在Mx 3005P仪器中设置扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；4℃保存。融解曲线：95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。
检测结果：如图1所示，图1为PPP1CA mRNA在患者组织中的表达水平图。从图1中可以看出，PPP1CA在2号和3号病人的癌症组织中的表达明显高于正常组织，在1号病人的正常组织(即Normal)、癌旁组织(即Para-tumor)和肝癌组织(即Cancer)中表达并无差异，HepG2细胞系的PPP1CA水平较每例正常组织均有1.5-2.5倍的高表达。因此，初步确定PPP1CA为候选标志物，进行下步实验。
实施例2：肝癌患者组织样品中PPP1CA蛋白序列的检测
利用PPP1CA蛋白序列(SEQ ID NO:2)制备单克隆或多克隆抗体，利用下述方法对PPP1CA蛋白序列(序列2)进行检测。
1)PPP1CA蛋白免疫印迹检测(WB)实验方法
(1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记
(2)安装洗净的玻璃板(1.5mm或1.0mm)，在两板之间加满蒸馏水检漏。
(3)按表3分别配制浓缩胶和分离胶。
表3聚丙烯酰胺凝胶配方表
试剂名称 分离胶(10％) 浓缩胶(5％)
ddH<sub>2</sub>O 4mL 1.7mL
30％丙烯酰胺 3.3mL 0.5mL
4×lower buffer 2.5mL 无
4×upper buffer 无 0.75mL
10％过硫酸铵 0.1mL 0.03mL
TEMED 0.006mL 0.003mL
(4)在两板间加入新配的10％分离胶约8mL，用2mL无水乙醇压胶。
(5)待分离胶完全凝固后，倒掉上层的无水乙醇，并用吸水纸吸干。加入新配的5％浓缩胶至玻璃板最顶部，迅速插入梳子，应避免产生气泡。待完全凝固后，垂直拔出梳子。
(6)安装跑胶装置，内槽加入1×Running buffer检漏。确定不漏后在内外槽加入1×Running buffer，取3μL蛋白Marker和由组织中提取的蛋白样品各50μg依次上样。用80V电压跑胶。约3h后，溴酚蓝跑出分离胶，停止电泳。
(7)转膜：于甲醇中浸泡PVDF膜15min，在1×Transfer buffer中将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白于4℃冰箱中用80V的电压转至PVDF膜上，90min后停止。
(8)封闭：将膜浸没于封闭液中，室温封闭1h。
(9)一抗孵育：利用PPP1CA的单克隆(购自GeneTex，GTX105255)或多克隆抗体(Enogene,E2A6907)，用5％BSA稀释一抗，具体比例参照说明书，于摇床上4℃过夜孵育。
(10)洗膜：回收一抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。
(11)二抗孵育：用封闭液稀释二抗(Goat Anti-Rabbit IgG HRP，R&D,HAF008，或Goat Anti-Mouse IgG HRP，R&D,HAF007)，具体比例参照说明书，于摇床上室温孵育1h。
(12)洗膜：回收二抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。
(13)显影：预冷显影仪，把膜放入显影仪隔板中，将ECL显影液的A液和B液按等体积混合后均匀滴加于膜上，调节明场亮度和清晰度，调至化学发光，每10s曝光一次。保存并标注不同曝光强度的照片。
(14)采用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/i_i)分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白表达的相对强度。
结果见图2A和图2B。其中图2A为WB检测肝癌或非癌组织裂解液中PPP1CA蛋白水平；图2B为WB检测肝癌及非癌组织结果统计分析。
2)PPP1CA蛋白的免疫组化检测实验方法
石蜡包埋
(1)采取组织后，在60mm2培养皿中以PBS洗涤。
(2)将组织分别置于EP管中，4％多聚甲醛4℃固定过夜。
(3)PBS缓冲液洗三次，每次15min.
(4)脱水：室温于30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇中各40min。
(5)透明：提前70℃水浴锅加热软蜡硬蜡。二甲苯：乙醇(1：1)，30min后弃去。加二甲苯透明，视组织状态决定时间长短，直至组织透明，约5～10min。
(6)浸蜡：二甲苯：硬蜡(1：1)，30min。软蜡(溶点52～54℃)，1.5h，硬蜡(溶点58～60℃)，2.5h，此步时间必须充分，可适当延长。硬蜡在室温下立刻凝固，全程在70℃水浴锅中进行。
(7)包埋：提前2h打开石蜡包埋机，加入硬蜡待其完全融化。切EP管底部组织部分，用干净硬蜡洗金属槽，向槽内灌满硬蜡，冷却至金属槽底部出现一层薄雾，将组织块放置于槽正中心，扣包埋盒，灌满硬蜡。
(8)冷却：20min，至石蜡彻底凝固。于4℃保存。
(9)用石蜡切片机切片，厚度5μm。
(10)展片：50％乙醇展片1min左右，45℃自来水中充分展片。自来水应烧开沸腾至无气泡，再冷却至45℃。镜检，选择视野中组织均在一个平面的片子。
(11)烤片：45℃过夜。于4℃保存。
免疫组化染色
(1)脱蜡：取密封保存于4℃的组织切片，加二甲苯静置10min后弃去，重复3遍。加二甲苯：乙醇(1：1)，15min后弃去。
(2)复水：100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、ddH2O、ddH2O中各5min。
(3)抗原热修复：组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，PBS洗3次，每次2min；配制抗原热修复用柠檬酸缓冲液(0.1M柠檬酸，0.1M柠檬酸钠，pH6.0)。将柠檬酸缓冲液微波炉内高火煮沸2min，然后放入组织切片95～100℃低火持续加热20min，每隔几分钟补液，结束后自然冷却至室温。
(4)PBS洗3次，每次2min。
(5)吸水纸擦干片子，3％H2O2去离子水避光孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
(6)浸入PBS洗3次，每次2min。
(7)吸水纸擦干片子，利用PPP1CA的单克隆或多克隆抗体，用5％BSA配置一抗，滴加一抗，每个组织20μl左右，4℃孵育过夜。
(8)回收抗体，浸入PBS洗3次，每次2min。
(9)吸水纸擦干片子，滴加试剂1，室温孵育10～20分钟，PBS洗3次，每次2min。
(10)吸水纸擦干片子，滴加试剂2，室温孵育10～20分钟，PBS洗3次，每次2min。
(11)按DAB浓缩液：DAB底物液1：20配置DAB工作液，配好后避光保存，6小时内使用，剩余的液体应弃去。
(12)DAB显色20min左右，显微镜观察呈黄色。
(13)自来水充分冲洗。
(14)苏木精复染，室温2.5min，流水冲洗或用烧杯荡洗。
(15)若染色过深，0.1％盐酸乙醇洗脱10s，流水冲洗或用烧杯荡洗。
(16)梯度脱水：若之前浸于PBS中，脱水之前dH2O 1min。之后室温于30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、100％乙醇各1min，100％乙醇5min，100％乙醇5min，1/2乙醇1/2二甲苯15min，最后重复3次二甲苯5min。
(17)中性树胶封片，室温干燥过夜，镜检拍照，4℃保存。
结果见图2C。图2C为免疫组化法检测肝癌或非癌组织中PPP1CA的表达水平图。
PPP1CA在病理样本中利用WB(图2A和图2B)和免疫组化(图2C)检测了蛋白质水平的表达，在23例肝癌病理样本中有16例样本的癌症部位的PPP1CA表达水平明显高于正常部位，仅有3例样本正常部位的CAMSAP2表达水平明显高于癌症部位，另外4例样本的PPP1CA表达水平在正常部位和癌症部位没有明显差异。HepG2细胞系的PPP1CA具有高水平的蛋白表达(图2A和图2B)。
实施例3：对肝癌患者血清或血浆样品中PPP1CA蛋白含量的检测
1、酶联免疫(ELISA)
(1)PPP1CA多克隆抗体(Enogene,E2A6907)包被96孔酶标板，4℃备用。
(2)取出所需板条，室温平衡20min。
(3)用稀释液稀释待测血清样本至50μl，按顺序加入各孔；标准品孔按不同浓度各加标准品50μl，空白孔不加。4℃过夜，洗涤。
(4)加入PPP1CA单克隆抗体(购自GeneTex，GTX105255)，37℃恒温箱中孵育60min，洗涤。
(4)除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，放入37℃恒温箱中孵育60min。
(5)20×洗涤缓冲液：蒸馏水按1：20配制洗涤液。弃去液体并在吸水纸上拍干，每孔加洗涤液200μL，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板五次。
(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
(7)每孔加入终止液50μL，在450nm波长处于15min内测定各孔的OD值。
(8)绘制标准曲线并计算。
2、免疫化学发光检测
(1)吖碇酯标记PPP1CA单克隆抗体；
参照刘农乐1993方法进行。取PPP1CA单克隆抗体(购自GeneTex，GTX105255)200μg加在600μL 0.1mol/L,pH 8.0的PB中,然后加150μL 0.5mmol/L AE(溶于二甲基甲酞胺中),混匀,室温避光反应20min,加赖氨酸溶液(8mg)赖氨酸溶于200μL pH8.0PB)放置15min.然后在10mmol/L pH6.5的PB中透析过夜,次日上葡聚糖凝胶G50柱纯化.柱用含0.1％牛血清白蛋白(BSA)和0.002％人IgG的10mmol/L pH6.5的PB平衡,并用此液洗脱,分部收集,测每管之发光强度,取发光值最高部分在4℃冰箱保存或加甘油低温保存.。
(2)PPP1CA多克隆或单克隆抗体包被96孔酶标板
(3)加入一定稀释度的待测血清，4℃过夜，洗涤。
(4)以一定比例加入吖碇酯标记的PPP1CA单克隆抗体，放入37℃恒温箱中孵育60min。
(5)发光测定，酶标板洗涤后，加100μL稀HCL中,然后加NaOH-H2O2试剂(每100mL中含2mol/L NaOH 2mL,30％H2O220μL),在发光仪上测定并记取30秒的累积发光值(m V).
检测结果：血清学生物标志物检测是目前肿瘤临床早期诊断最常用的手段，我们利用121例血清样本，检测了PPP1CA是否具有诊断肿瘤的临床意义。在121例血清样本中，有85例为肝癌患者，29例无肿瘤发病史的正常病例样本，以及7例患有良性肝病而无肿瘤的病例样本。血清病例样本分布规律如图3所示。图3为ELISA检测PPP1CA在血清样品的中蛋白含量。其中A为ELISA检测血清样品中PPP1CA的含量；B为Cancer Browser网站的数据库对不同PPP1CA表达水平的肝癌患者的生存率的相关分析。C为血清样品中AFP的含量；D为血清样品中AFP-L3的含量；
运用ELISA试剂盒分别检测了121例样本的PPP1CA表达水平，由于肝癌病例的表达量远高于正常及良性病例，上样时将肝癌病例样本的上样量调整为0.7μL，良性样本上样7μL，正常样本上样20μL，检测结果如图3A，图3B,图3C和图3D所示。可见，肝癌样本与正常样本具有极显著差异(P<0.0001)，此外肝癌样本与良性样本也具有显著性差异(P＝0.0083)(图3A)。因此可以认为，与AFP以及AFP-L3(图3C和图3D)类似，PPP1CA的表达水平可以区分肿瘤病人和正常人群，其具备肝癌诊断的重要作用。
此外，申请人还通过Cancer Browser网站的数据库对不同PPP1CA表达水平的肝癌患者的生存率进行了统计。结果如图3B所示，随机选择了PPP1CA的表达水平进行分析，实线代表PPP1CA高表达病例的存活率(0.5045～1.97518，n＝62)，虚线代表PPP1CA低表达病例的存活率(-2.0935～0.4905，n＝273)。横轴代表时间(天)，纵轴代表存活率。可见，2000天之前，PPP1CA高表达的病例的存活率明显低于低表达的病例。因此我们得出结论，蛋白PPP1CA的表达水平与肿瘤患者的存活率相关，表达水平越高，存活率越低。
3、利用ELISA或化学发光法检测血清样品中PPP1CA含量，对结果进行ROC分析，结果如图4所示。
检测肝癌及非肝癌人群样品中PPP1CA及AFP含量，进行ROC曲线分析(图4)，图4为PPP1CA和AFP检测肝癌患者样品ROC曲线图。结果显示，PPP1CA对肝癌的灵敏度和特异性都非常强，更加证明了该基因作用于肝癌诊断标志物的应用潜力。据ROC曲线推算，检测限为695.9ng/mL时，检测的灵敏度为：90.59％，特异性为：88.89％，AUC为：0.9641；而AFP以目前临床使用的7.0ng/mL为检测限时，其灵敏度，特异性和AUC分别为：68.5％，88.9％，0.8447.可见在灵敏度和特异性方面，PPP1CA明显优于目前临床使用的检测标志物AFP。
血液样品中PPP1CA与AFP或AFP-L3检出率对比
利用PPP1CA为检测指标，检验血液样品中其蛋白含量，如果检测限为695.9ng/mL时，与现今临床常用的AFP或AFP-L3检出率对比，结果见图5A，图5B和图5C。其中图5A为以695.9ng/mL为PPP1CA为检测限时，临床样品的检出率。图5B为AFP为诊断标志物时，临床样品的检出率；图5C为AFP-L3为诊断标志物时，临床样品的检出率.
AFP(图5B)和AFP-L3(图5C)所选用的检出标准,分别为目前临床一般使用的7.02ng/mL和1ng/mL。由图5结果可见，PPP1CA的检出率可高达90.59％(图5A)，PPP1CA所选用的检出率明显高于AFP或AFP-L3的检出率,明显高于传统的另外两项检测指标。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> PPP1CA作为肝癌检测和预后的标志物及其应用
<130> XMDX-17004-CNI
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1521
<212> DNA
<213> human
<400> 1
gcggggccgc gggccggggg cggactgggg cgggcggaag gagagccagg ccggaaggag 60
gctgccggag ggcgggaggc aggagcgggc caggagctgc tgggctggag cggcggcgcc 120
gccatgtccg acagcgagaa gctcaacctg gactcgatca tcgggcgcct gctggaaggg 180
tccagggtcc tgacacccca ttgcgcccca gtgcagggct cgcggcctgg caagaatgta 240
cagctgacag agaacgagat ccgcggtctg tgcctgaaat cccgggagat ttttctgagc 300
cagcccattc ttctggagct ggaggcaccc ctcaagatct gcggtgacat acacggccag 360
tactacgacc ttctgcgact atttgagtat ggcggtttcc ctcccgagag caactacctc 420
tttctggggg actatgtgga caggggcaag cagtccttgg agaccatctg cctgctgctg 480
gcctataaga tcaagtaccc cgagaacttc ttcctgctcc gtgggaacca cgagtgtgcc 540
agcatcaacc gcatctatgg tttctacgat gagtgcaaga gacgctacaa catcaaactg 600
tggaaaacct tcactgactg cttcaactgc ctgcccatcg cggccatagt ggacgaaaag 660
atcttctgct gccacggagg cctgtccccg gacctgcagt ctatggagca gattcggcgg 720
atcatgcggc ccacagatgt gcctgaccag ggcctgctgt gtgacctgct gtggtctgac 780
cctgacaagg acgtgcaggg ctggggcgag aacgaccgtg gcgtctcttt tacctttgga 840
gccgaggtgg tggccaagtt cctccacaag cacgacttgg acctcatctg ccgagcacac 900
caggtggtag aagacggcta cgagttcttt gccaagcggc agctggtgac acttttctca 960
gctcccaact actgtggcga gtttgacaat gctggcgcca tgatgagtgt ggacgagacc 1020
ctcatgtgct ctttccagat cctcaagccc gccgacaaga acaaggggaa gtacgggcag 1080
ttcagtggcc tgaaccctgg aggccgaccc atcaccccac cccgcaattc cgccaaagcc 1140
aagaaatagc ccccgcacac caccctgtgc cccagatgat ggattgattg tacagaaatc 1200
atgctgccat gctggggggg ggtcaccccg acccctcagg cccacctgtc acggggaaca 1260
tggagccttg gtgtattttt cttttctttt tttaatgaat caatagcagc gtccagtccc 1320
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gcagctcagg gcaacggcag gccaggtcgt gggtctccag ccgtgcttgg cctcagggct 1440
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cgcaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1521
<210> 2
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<212> PRT
<213> human
<400> 2
Met Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser Ile Ile Gly Arg Leu
Leu Glu Gly Ser Arg Val Leu Thr Pro His Cys Ala Pro Val Gln Gly
Ser Arg Pro Gly Lys Asn Val Gln Leu Thr Glu Asn Glu Ile Arg Gly
Leu Cys Leu Lys Ser Arg Glu Ile Phe Leu Ser Gln Pro Ile Leu Leu
Glu Leu Glu Ala Pro Leu Lys Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr
Tyr Asp Leu Leu Arg Leu Phe Glu Tyr Gly Gly Phe Pro Pro Glu Ser
Asn Tyr Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Lys Gln Ser Leu
Glu Thr Ile Cys Leu Leu Leu Ala Tyr Lys Ile Lys Tyr Pro Glu Asn
Phe Phe Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Ala Ser Ile Asn Arg Ile
Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Lys Arg Arg Tyr Asn Ile Lys Leu Trp
Lys Thr Phe Thr Asp Cys Phe Asn Cys Leu Pro Ile Ala Ala Ile Val
Asp Glu Lys Ile Phe Cys Cys His Gly Gly Leu Ser Pro Asp Leu Gln
Ser Met Glu Gln Ile Arg Arg Ile Met Arg Pro Thr Asp Val Pro Asp
Gln Gly Leu Leu Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Asp Lys Asp Val
Gln Gly Trp Gly Glu Asn Asp Arg Gly Val Ser Phe Thr Phe Gly Ala
Glu Val Val Ala Lys Phe Leu His Lys His Asp Leu Asp Leu Ile Cys
Arg Ala His Gln Val Val Glu Asp Gly Tyr Glu Phe Phe Ala Lys Arg
Gln Leu Val Thr Leu Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Gly Glu Phe Asp
Asn Ala Gly Ala Met Met Ser Val Asp Glu Thr Leu Met Cys Ser Phe
Gln Ile Leu Lys Pro Ala Asp Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Gly Gln Phe
Ser Gly Leu Asn Pro Gly Gly Arg Pro Ile Thr Pro Pro Arg Asn Ser
Ala Lys Ala Lys Lys
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcgactattt gagtatggcg 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
aggggccatc cacagtcttc 20

Claims (4)

1.PPP1CA蛋白的检测试剂用于制备诊断肝癌试剂盒的用途，其中PPP1CA单独诊断肝癌，所述诊断是血清检测。
2.如权利要求1所述PPP1CA蛋白的检测试剂用于制备诊断肝癌试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒内含有PPP1CA蛋白的单克隆或多克隆抗体。
3.如权利要求1所述PPP1CA蛋白的检测试剂用于制备诊断肝癌试剂盒的用途，其特征在于，所述PPP1CA蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求2所述PPP1CA蛋白的检测试剂用于制备诊断肝癌试剂盒的用途，其特征在于，所述PPP1CA单克隆或多克隆抗体是抗如SEQ ID NO:2所示蛋白序列的抗体。
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