CN105699649B - 用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，首次采用逆向血清‑蛋白质组学技术在体研究肝癌MVI的相关抗原、抗体，确定了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，为临床术前早期诊断MVI提供一种有效的检测手段。

Description

用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物

技术领域

本发明涉及一种血清标记物，尤其涉及一种用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物。

背景技术

肝细胞肝癌微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)指显微镜下观察到内皮细胞衬覆的血管腔内可见癌细胞巢团。肝癌细胞侵犯微血管后所产生的隐匿性转移灶是引起肝癌术后复发的重要原因之一，文献证实MVI是肝癌切除术后预测复发、评估预后的一项独立指标。美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)指南已将MVI作为肝癌TMN分期的重要因素之一。目前，针对MVI的诊断是依据术后或活检穿刺标本的病理学检查。在影像学水平，有学者采用Gadoxetata Disodium作为造影剂行磁共振检查，发现其诊断的敏感性仅为38.3％。近年来，越来越多的学者从分子生物学水平研究MVI相关标记物，但是这些标记物的特异性及准确率均不理想，离临床诊断相距甚远。以往肝癌抗原的筛选方法主要是基于双向电泳-质谱分析技术，但这一技术存在一些不足：1.通过正常肝组织与肝癌组织做双向电泳，再经质谱分析鉴定抗原，其特异性不足；2.个体之间差异大，且肝癌具有多个阶段，故结果偏差大；3.对于某些重要蛋白不能有效识别，敏感性差。目前针对肝癌MVI的术前检测仍缺乏一种高效、准确的方式。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物。

本发明用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，包含一种或多种下列蛋白：

α烯醇化酶(Alpha-enolase)、多功能蛋白ADE2(Multifunctional proteinADE2)、谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase)、微管蛋白α-1A链(Tublin alpha-1Achain)、酸醛缩酶A(Fructose-bisphosphate aldolase A)、热休克蛋白70(Heat shockprotein 70)、热休克蛋白90-α(Heat shock protein 90-alpha)、热休克蛋白75(Heatshock protein 75)、γ-烯醇酶(Gamma-enolase)、肌动蛋白、胞质1(Actin,cytoplasmic1)、酸醛缩酶A(Fructose-bisphosphate aldolase A)、3-酮脂酰辅酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)、不均一核糖核蛋白(Heterogeneous nuclearribonucleoprotein)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceradehyde-3-phosphatedehydrogenase)、膜联蛋白A2(Annexin A2)、L-乳酸脱氢酶A链(L-lactate dehydrogenaseAchain)、氨酰tRNA合成酶复合铰链多功能蛋白2(Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein2)、原肌球调节蛋白3(Tropomodulin-3)、SUMO-活化酶亚单位1(SUMO-activating enzyme subnit 1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂B6(Serpin B6)、DDB1-CUL4相关因子7(DDB1-and CUL4-associated factor 7)。

这些蛋白引起机体抗肿瘤免疫反应，血清中抗这些蛋白的抗体滴度增高。通过对抗体的检测，间接检测肝癌微血管侵犯。

本发明的有益效果是：本发明首次采用逆向血清-蛋白质组学技术在体研究肝癌MVI的相关抗原、抗体，确定了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，为临床术前早期诊断MVI提供一种有效的检测手段。

附图说明

图1为逆向血清-蛋白质组学实验流程图；

图2为肝癌血管侵犯的三种情况；

图3为肝癌血清蛋白考马斯亮蓝染色及蛋白印迹曝光图，其中A、B分别为MVI(+)组、MVI(-)组血清蛋白考马斯亮蓝染色图，C、D分别为MVI(-)组、MVI(+)组血清蛋白印迹曝光图；图中，1为Alpha-enolase，2为Glutathione synthetase (GST)，3为Heat shock 70(HSP 70)，4为Heat shock 90(HSP 90)，5为Actin，6为Annexin A2；

图4为MVI(+)与MVI(-)患者血清HSP70和Alpha-enolase的抗体含量。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明血清标记物的筛选及逆向验证过程。

本发明实验收集整理160份肝癌组织标本库，包括患者术前外周血、术后肝癌组织、癌旁正常组织、及相关临床病例资料。参照图1所示流程进行逆向血清-蛋白质组学实验研究。

一.需要收集的样本，每例所含：

1)肿瘤组织石蜡块×1；

2)肿瘤组织新鲜标本×1存于-80℃冰箱；

3)肿瘤旁正常肝组织石蜡块×1；

4)肿瘤旁正常肝组织新鲜标本×1存于-80℃冰箱；

5)两次离心后血浆上清液×1存于-80℃冰箱；

6)离心后沉淀物(正常组织)×1存于-80℃冰箱。

1.血标本采集步骤：

1)采集6ml外周血置入EDTA管(2管，每管3ml)；

2)810g离心10min；

3)吸取离心后血浆到1.5ml离心管，16000g离心10min；

4)吸取上清液到新的离心管，冻存于-80℃冰箱；

5)沉淀物冻存于-80℃冰箱；

2.肿瘤标本采集步骤：

1)切取小块肿瘤组织置于5ml离心管中，加入福尔马林液备做石蜡块；

2)另切取小块肿瘤组织置于冻存管中，液氮处理后存于-80℃冰箱；

3)切取小块距肿瘤1cm正常肝组织置于5ml离心管中，加入福尔马林液备做石蜡块；

4)另切取小块距肿瘤1cm正常肝组织置于冻存管中，液氮处理后存于-80℃冰箱。

3.病理筛选MVI(+)和MVI(-)患者：

所有病理切片均由浙江大学医学院附属第二医院资深病理科医生确认，如有异议，则邀请另一同级别的医生鉴定、讨论。判断肝癌MVI参照2002年Journal ofGastrointestinal Surgery中Esnaola NF等报道的标准，肝癌侵犯血管的三种情况如图2所示，其中图A箭头所指为未被侵犯的微血管，内皮完整；图B箭头所指为微血管内漂浮的癌栓，管壁已被肿瘤破坏，周围包绕有不完整的内皮细胞；图C箭头所指为门静脉分支内肉眼癌栓(HE染色100X)。

本实验将临床资料相似的患者标本分为MVI(+)和MVI(-)两组(即微血管侵犯和无血管侵犯两组)，第一阶段选取10名患者，5名MVI(-)和5名MVI(+)患者，与培养的7703肝癌细胞进行逆向血清-蛋白质组学分析。

二.采用血清-蛋白质组学技术逆向筛选MVI相关抗原，质谱鉴定抗原蛋白。

1.实验细胞株：人肝癌细胞株7703，购自中国科学院上海细胞库。

2.两组患者血清与肝癌总蛋白杂交。

1)肝癌总蛋白提取与胶条的水化：

①准备2大瓶培养细胞，倒掉培养液，用PBS冲洗2遍。

②加入5ml EDTA,37°消化6min后倒入EP管，1000rpm离心5min，去上清取沉淀。

③往细胞沉淀中加入950ul冷冻的裂解液。

④冰上超声碎解细胞，5-10次，每次15秒，间隔20s冰上降温。

⑤检测溶液pH，范围应该在8.4-9.0，必要时用1M三羟甲基氨基甲烷调节。 室温下涡轮震荡孵育10-15min。

⑥往溶解产物里加入5ul纯度为99％的DMA烷化，室温下摇床孵育30min。

⑦加入10μl 2M DTT祛除多余DMA，4℃，16000g离心20分钟，转移上清液至EP管。Quant-iT^TM Protein Assay Kit测蛋白质浓度，浓度～8-10mg/ml。

⑧每条胶条配制140ul水化液，155ul缓冲液，再水化时间可延长至过夜。

⑨取出盒子，加样条向上，每条加样条加入140ul样品。将

Strip拿出，胶面朝上，镊子夹住胶的碱性(-)端，用手轻柔地将酸性(+)端从加样条插到底。排尽大气泡，小气泡不会影响再水化。

⑩用封条封闭所有的加样条，确保封闭完全。室温下静置1小时。

2)等电聚焦：

①从盒子中取下封条和2个样品覆盖器，暴露出粘合面。确保凝胶位置合适，保证盒子正极端和负极端都能外露。

②在盒子上的粘合面放置导电条，每一导电条加600ul双蒸水湿润。组装

IPGRunner，从空隙往外室加600ml双蒸水，不要溅入内室。

③等电聚焦时：

200V for 20minutes

450V for 15minutes

750V for 15minutes

2000V for30minutes

注明：总时间1200-4200Vh，接通电源时不要接触盖子；

④注明：可以将盒子密封-80度保存，备用。用平衡盘进行平衡，不需将胶条从盒子中取出。

3)胶条的烷化、SDS-PAGE：

①用纸擦干盒子上残余的液体，勿将手弄湿。撕下盒子上覆盖膜，勿将夹盒 表面弄湿。取出平衡盘，将内面的粘合条撕下。

②将平衡盘对齐盒子两侧的侧板。使得印有Invitrogen对齐盒子的平端。确保盒子和盘之间密封彻底，不漏液(用笔的钝头压下去)。

③从盘中任一开口加入10ml平衡缓冲液。室温摇床震荡上15min，倒出缓冲液。

④加入10ml烷化剂，室温摇床震荡15分钟。倒尽缓冲液，甩干残留液。

⑤从盒子上取下盘，用镊子从盒子上取下胶条。准备浓度为0.5％的琼脂糖电泳缓冲液，煮沸后55-65℃保存，每块胶用约400μl。

⑥取出

Novex 4-12％Bis-Tris

Gel，撕下背面覆盖在插槽的胶条。根据

Gel上的胶槽大小，切除IPG胶两边塑料，达到相互匹配。勿切到凝胶。

⑦将胶条插入胶槽，其中胶面在胶盒子前面，可以用塑料尺调整。向含有胶条的胶槽加入约400μl浓度为0.5％的琼脂糖电泳液，勿溢到marker孔中。(允许琼脂糖溶液有结晶。)

⑧往下室中加入600ml电泳液，往上室中加入200ml电泳液和0.5ml

氧化剂。往marker孔加入标准蛋白。

⑨SDS-PAGE：200V 40-50minutes

4)考马斯亮蓝染色、转膜与曝光：

①用电转膜仪将SDS-Page上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，取分离胶部分安装孔板。

②PVDF膜(孔径大小0.45μm)用甲醇预处理10秒，1×转膜液浸泡15min。

③板(黑色)---纤维棉---滤纸---胶---膜---滤纸---纤维棉---板(红色)的循序安装，转移槽置于冰水浴中。

④330mA，60min；

⑤浓度为3％BSA溶液15ml+人血清150μl(1:100稀释)，4℃冰箱摇床过夜。

⑥1×TPBS漂洗3次，每次5min。

⑦加入相应辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗(1:5000)，室温孵育1h。

⑧1×TPBS漂洗3次每次5min。

⑨采用ECL法检测印迹膜，A液和B液以体积比1:1混合，滴于干净玻璃纸上，将膜用吸水纸吸干，正面向着AB混合液，孵育1min。

⑩曝光。

3.MS鉴定抗原蛋白

1)SDS-PAGE后将胶进行考马斯亮蓝染色，结果如图3中A、B所示，从中筛选出5个潜在的MVI相抗原点，进行质谱分析。

2)查询网络蛋白质信息库，获取抗原蛋白信息，如表格1所示。

3)质谱结果：表1所示MVI(+)血清中筛查出5个蛋白，MVI(-)血清中筛查出21个蛋白，质谱结果显示以下蛋白的特异性较高，故进一步分析后在MVI(+)血清中选取Alpha-enolase。在MVI(-)血清中选取Heat shock protein HSP 90-alpha、Heat shock 70kDaprotein 4和Annexin A2进行下一步逆行验证研究。

表1.MVI相关抗原蛋白质谱分析信息表格

三.逆向认证MVI抗原。

1：ELISA法测定人血清中MVI抗体含量

实验蛋白：HSP70，HSP90，Annexin A2，Alpha-enolase。

1)标准曲线的制作：

①对已有的10份正常血清进行每个蛋白包被下的测试，排除差异较大的血清。

②排除完差异较大的血清后，剩余血清混合，设置稀释比1:100、1:200、1:400、1:800，制作标准曲线，可适当去除无线性规律的稀释比。

③设置每个蛋白一条标准曲线，每块酶标板一条标准曲线。

2)检测血清抗体：

①将用蒸馏水稀释至1μg/ml的蛋白包被在酶标板上，每孔100μl。②TBST洗3次，每次10min。

③加入封闭液，每孔180μl，4摄氏度过夜。

④加入稀释比例为1:800和1:1600的人血清，每孔100μl，室温放置2h。

⑤TBST洗3次，每次10min。

⑥加入1:30000稀释的HRP(抗人)，每孔100μl，室温放置1h。

⑦TBST洗5次，每次10min。

⑧加入TMB(1:19稀释)，每孔100μl，避光放置20～30min。

⑨加入终止液，每孔50μl。450nm吸光度下测OD值。

3)计算肝癌MVI(+)与MVI(-)病人体内相对于正常人体内抗体的含量，如图4所示，为MVI(+)与MVI(-)患者血清HSP70和Alpha-enolase的抗体含量。可以看出，MVI(-)病人中HSP70抗体含量较MVI(+)病人高(p<0.0001),而MVI(+)病人中Alpha-enolase抗体含量较MVI(—)病人高(p＝0.0322)。说明Alpha-enolase与MVI阳性成正相关，HSP70与MVI阴性成正相关。

Claims (1)

1.检测血清中α烯醇化酶抗体的试剂在制备术前检测肝癌微血管侵犯的试剂中的用途。

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