CN113777311A

CN113777311A - 一种用于食管鳞癌辅助诊断的elisa试剂盒

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Publication number: CN113777311A
Application number: CN202111088176.3A
Authority: CN
Inventors: 叶华; 王鹏; 韩卓; 方志豪; 史健翔; 代丽萍; 王科妍
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-09-16
Also published as: CN113777311B

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物。本发明提供的用于食管鳞癌诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体中的至少一种。本发明还提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述生物标志物的试剂，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体的表达水平，可以有效区分食管鳞癌患者和正常人，可用于食管鳞癌的辅助诊断。

Description

一种用于食管鳞癌辅助诊断的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌辅助诊断的ELISA试剂盒。

背景技术

食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都相对较高。2020年发布的癌症统计数据显示，食管癌在全世界的地区分布中亚洲地区发病较高，尤其是东亚地区，且男性高于女性。而身处东亚地区的中国2018年食管癌的新发病例数约为32.4万，约占全世界的50％；死亡数为30.1万，约占全世界的55％，这足以说明我国食管癌的流行已愈演愈烈，对食管癌的防治措施已刻不容缓。根据临床组织病理类型，食管癌主要分为食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，我国主要以食管鳞癌为主。食管鳞癌起病隐匿并且早期无明显临床症状、通常出现吞咽困难等症状确诊时已为中晚期而错过最佳治疗时机，严重影响其治疗效果。目前对食管鳞癌的发病机制尚不清楚，进展期食管鳞癌也缺少有效的治疗措施。因此，发现一种能够早期诊断食管鳞癌的方法对提高患者的生存率是至关重要的。目前临床主要采用临床症状结合细胞学检查、内镜等影像学和“金标准”病理细胞技术诊断食管鳞癌，由于早期确诊率和灵敏度低、检测费用高、有创等缺点均不适合食管鳞癌早期诊断。因此，积极探索食管鳞癌早期诊断的新方法对提高其早期诊断率及改善患者预后具有重要的临床意义。

目前，对无症状人群进行内窥镜的普查，是发现早期食管鳞癌的主要技术手段，尽管内窥镜逐渐普及，但其用于食管鳞癌普查时，需要消耗大量的人力、物力资源，且患者接受度低。因此在早期用非侵入性的方法，对于食管鳞癌的诊断和预后有重要意义。近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如甲胎蛋白(AFP)已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)己作为早期诊断肠道腺癌特异性标志物。然而尚无食管鳞癌特异相关抗原。因此，寻找高效、特异的食管鳞癌分子标志物越来越受到国内外的重视。

自身抗体是由肿瘤生长期间产生的肿瘤相关抗原(TAAs)引发人体免疫系统产生免疫反应而产生的自体抗体，是一类很有前景的肿瘤早期检测标志物。在肿瘤发病早期，机体的免疫系统可识别肿瘤细胞内表达异常的蛋白，免疫应答在癌症早期有很强的生物信号放大作用，在肿瘤表型显现之前就可以检测到血清的抗体水平。与传统的抗原类标志物相比，自身抗体肿瘤标志物有天然的高特异性与免疫生物放大信号系统等独特优势，已经成为肿瘤早期诊断临床应用的技术发展趋势。本研究团队在应用全人类蛋白质组芯片技术筛选出4种TAA，分别为TP53、MAGEA1、VCL和PRKCZ。这些自身抗体对于食管鳞癌患者具有较高的特异度和敏感性，且与单个自身抗体检测方法相比，用多个肿瘤相关抗原来联合检查患者体内自身抗体的表达情况，有利于提高针对某一肿瘤的检出率。因此，本研究提出一种可用于食管鳞癌诊断的ELISA试剂盒，这将会推动我国食管鳞癌的诊治水平，也为将来对食管鳞癌的进一步研究提供思路。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用，本发明的目的之三在于提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体中的至少一种。抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平均明显高于正常人，且差异具有统计学意义。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体均为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原的自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。

根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。

本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。更加优选地，所述试剂为MAGEA1蛋白、VCL蛋白、TP53蛋白、PRKCZ蛋白中的至少一种。

根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

本发明第三方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为MAGEA1蛋白、VCL蛋白、TP53蛋白、PRKCZ蛋白中的至少一种。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

本发明中肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的基本信息为：

MAGEA1(Melanoma-associated antigen 1)是MAGEA基因家族的一个成员。这个家族的成员编码的蛋白质具有50％-80％的相同序列。MAGEA基因的启动子和第一外显子表现出相当大的变异性，表明该基因家族的存在使相同的功能能够在不同的转录控制下表达。目前发现MAGEA1主要在肺腺癌、乳腺癌及卵巢癌等致癌相关机制研究中发挥作用，在NCBI中MAGEA1蛋白的蛋白序列号为NP_004979.3。

VCL(Vinculin)是一种与细胞-细胞和细胞-基质连接相关的细胞骨架蛋白，它被认为是参与将肌动蛋白锚定到膜上的几种相互作用蛋白之一。研究发现VCL缺损是1W型扩张型心肌病的病因。扩张型心肌病是一种以心室扩张和收缩功能受损为特征的疾病，可导致充血性心力衰竭和心律失常。该基因已发现多个可变剪接转录本变异，但一些变异的生物学有效性尚未确定。在NCBI中VCL蛋白的蛋白序列号为NP_003364.1。

PRKCZ(Protein kinase C zeta type)全名为蛋白激酶C，PRKCZ是丝氨酸/苏氨酸激酶PKC家族的成员，参与多种细胞过程，如增殖、分化和分泌。与依赖钙的经典PKC同工酶不同，PRKCZ表现出不依赖钙和二酰基甘油也不依赖磷脂酰丝氨酸的激酶活性且只有一个锌指组件。此外，它对典型的PKC抑制剂不敏感。目前发现PRKCZ主要在2型糖尿病以及肺癌的相关机制研究中发挥作用,在NCBI中PRKCZ蛋白的蛋白序列号为NP_002735.3。

TP53(tumor protein p53)基因编码一个肿瘤抑制蛋白，包含转录激活，DNA结合和寡聚结构域。编码蛋白响应不同的细胞压力来调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢改变。目前研究已发现该基因的突变与多种人类癌症有关，在NCBI中PRKCZ蛋白的蛋白序列号为NP_001119584.1。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次发现抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平明显高于正常人，且具有差异具有统计学意义，通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体的表达水平，可以有效检测食管鳞癌；经验证，本发明单独采用抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体中任意一个标志物进行试管鳞癌诊断时，其ROC曲线的AUC值均在0.65以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于食管鳞癌诊断的标志物可用于食管鳞癌的早期辅助诊断。

(2)本发明将抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体者这四种标志物作为一个组合用于早期食管鳞癌诊断检测时，其ROC曲线的AUC为0.79(95％CI:0.73-0.85)，检测灵敏度高达79.4％(即食管鳞癌患者中应用这四个标志物进行诊断时被正确的诊断为食管鳞癌的比率为79.4％)，特异度达到了71.4％(即健康人中应用这四个标志物进行诊断时确定为健康人的比率为71.4％)，因此，本发明的标志物具有相对较高的灵敏度和特异度，极大地提高了食管鳞癌的检出率，有利于无症状食管鳞癌高危人群进行筛查，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体、抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的表达水平，可以较准确地将食管鳞癌患者和健康对照诊断区分开来，为临床医生对食管鳞癌的诊断提供了新的参考依据。

(4)本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可在早期获得食管鳞癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用人类蛋白质组芯片筛选用于食管鳞癌诊断的标志物的原理示意图；

图2为实施例2中食管鳞癌组和健康对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平分布结果图；

图3为实施例2中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线图；

图4为实施例3中食管鳞癌组和健康对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平分布结果图；

图5为实施例3中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线图。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：采用人类蛋白质组芯片筛选用于食管鳞癌诊断的标志物

1、实验样本：

收集来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库的30例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)和24例正常人血清(正常对照组)；其中，30例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者；24例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内；而且，30例食管鳞癌患者和24例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

将30例食管鳞癌患者血清按每3例血清混合为1例混合食管鳞癌血清样本的方式进行混合，将24例正常人血清中的21例血清按每3例混合为1例混合正常血清样本的方式进行混合，共得到10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、人类蛋白质组芯片检测

使用HuProt^TM人类蛋白质组芯片(购自广州博翀生物科技有限公司)检测10例混合食管鳞癌血清样本，7例混合正常血清样本和3例正常人血清样本中自身抗体的表达水平(检测的原理示意图如1所示)。每张芯片可以同时检测14个血清样本，固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性抗体相互作用以结合。

(1)实验方法：

1)复温：将HuProt^TM人类蛋白质组芯片从-80℃冷冻冰箱中取出，置于4℃冰箱30min，然后置于室温15min。

2)封闭：将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中，并加入10mL封闭液(3ml10％BSA，加入7ml 1×PBS溶液)，放置于侧摆摇床中，50-60rpm，室温封闭1h。

3)血清样本孵育：封闭完成后，弃去封闭液，迅速加入预先稀释好的血清孵育液(用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释，得到稀释后的血清孵育液，稀释液的成分组成为：1g BSA，100ml 1×PBST溶液)，放置于侧摆摇床中，20rpm，4℃过夜孵育。

4)清洗：待孵育完成后，取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min；

5)二抗孵育：待清洗结束后，将芯片转移至孵育盒中，并加入按1：1000比例稀释的二抗孵育液(用稀释液将二抗按1:100的比例进行稀释，得到二抗孵育液，二抗为荧光标记的抗人IgM、IgG抗体，稀释液成分组成为：1g BSA,，100ml 1×PBST溶液)3mL，置于侧摆摇床40rpm，避光，室温孵育1h；

6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于芯片清洗盒，并加入芯片清洗液(1×PBST)，放置水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O重复清洗2次，每次10min；

7)干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；

8)扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系)；

9)数据提取：打开对应的GAL文件，将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后，点击自动对齐按钮，提取每个血清样本的数据并保存为GPR。

(2)数据处理：

F532 Median是指在532nm通道下的信号点前景值的中位数，B532 Median是指在532nm通道下的信号点背景值的中位数。为了消除由于背景值不一带来的样本间的偏差，对于每个血清样本提取的数据，进行背景归一化处理，即定义信噪比(signal-noise ratio，SNR)＝F Median/B Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值。分别对10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值进行z-score标准化处理，使其服从N(0,1)的标准正态分布。对于任意一个自身抗体，计算食管鳞癌组与正常对照组的差异倍数，即差异倍数＝食管鳞癌组z-score标准化后的SNR均值/正常对照组z-score标准化后的SNR均值，用以表示食管鳞癌组高于正常对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>2、灵敏度≥20％、特异度＝100％，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

(3)实验结果：

经过筛选，最终筛选出了4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体，分别为抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体和抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体；其中，抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体的差异倍数为5.075，灵敏度为46.8％，特异度为85.1％；抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体的差异倍数为2.201，灵敏度为42.1％，特异度为88.7％；抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体的差异倍数为8.718，灵敏度为42.9％，特异度为88.7％；抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的差异倍数为3.229，灵敏度为46.8％，特异度为85.1％。而且，抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体和抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌组血清中的表达水平均显著高于正常对照组，且差异具有统计学意义。

实施例2：ELISA检测抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体的血清表达水平，评估四种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于食管鳞癌诊断的价值

采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测实施例1筛选出的4种抗肿瘤相关抗原自身抗体在人体血清中的表达水平，评估四种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于食管鳞癌诊断的价值。

1、实验样本：

本研究纳入的90例食管鳞癌患者(食管鳞癌组)和90例正常对照血清(健康对照组)样本均来源于河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库；其中，90例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者；90例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内；而且，90例食管鳞癌患者和90例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

2、实验材料及试剂：

(1)4种肿瘤相关抗原蛋白：MAGEA1蛋白、VCL蛋白、TP53蛋白、PRKCZ蛋白，购买于武汉云克隆科技服务有限公司；

(2)96孔酶标板(8行×12列)；

(3)包被液：含0.15％碳酸钠(Na₂ CO₃)和0.29％碳酸氢钠(NaHCO₃)的水溶液；

(4)封闭液：含2％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(5)血清样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记的重组蛋白A(以下简称HRP标记重组蛋白A)；

(7)抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(8)洗涤液：含0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(9)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20％四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B为含3.7％Na₂HPO₄·12H₂O、0.92％柠檬酸以及0.75％(V/V)过氧化氢脲素水溶液；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；

(10)终止液：10％的硫酸。

3、实验方法：

(1)制备4种肿瘤相关抗原包被的酶标板：

分别制备肿瘤相关抗原MAGEA1蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原VCL蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原TP53蛋白包被的酶标板和肿瘤相关抗原PRKCZ蛋白包被的酶标板。

以制备肿瘤相关抗原MAGEA1蛋白包被的酶标板为例，其具体操作步骤如下：

1)、制备肿瘤相关抗原MAGEA1蛋白溶液：将MAGEA1蛋白溶解于包被液中，配制成浓度为0.25μg/mL的MAGEA1蛋白溶液。

2)包被酶标板：将步骤1)制备的MAGEA1蛋白溶液加入到96孔酶标板的第1-11列反应孔中，加样量为50μl/孔；在96孔酶标板第12列的每个反应孔中均加入人IgG标准品(第12列不同反应孔中包被系列浓度梯度的人IgG标准品，包被的系列浓度梯度的人IgG标准品即可用于制作标准曲线，同时还能够保证实验操作的稳定性)，加样量为50μl/孔，保鲜膜封闭防止挥发，在4℃下包被过夜，然后弃去反应孔中的包被液。

3)、封闭：向包被后的96孔酶标板的每个反应孔中加入封闭液，加样量为100μl/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤3次并拍干，得到肿瘤相关抗原MAGEA1蛋白包被的酶标板，4℃保存备用。

肿瘤相关抗原VCL蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原TP53蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原PRKCZ蛋白包被的酶标板制备的操作步骤与肿瘤相关抗原MAGEA1蛋白包被的酶标板基本相同，其不同之处在于：步骤1)采用的肿瘤相关抗原不同。其中，肿瘤相关抗原VCL蛋白包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为VCL蛋白；制备肿瘤相关抗原TP53蛋白包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为TP53蛋白；制备肿瘤相关抗原PRKCZ蛋白包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为PRKCZ蛋白。

(2)血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体表达水平的检测：

同一血清样本，分别采用上述制备的4种肿瘤相关抗原包被的酶标板通过间接ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体表达水平。

以检测抗肿瘤相关抗原MAGEA1自身抗体表达水平为例，其具体操作步骤如下：

1)、血清样本孵育：

将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入上述步骤(1)制备的已包被MAGEA1蛋白的96孔酶标板第1～10列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被MAGEA1蛋白的96孔酶标板的第11列的第1-6反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在已包被MAGEA1蛋白的96孔酶标板第11列的第7-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔)，在已包被MAGEA1蛋白的96孔酶标板第12列的每个反应孔中均加入不含血清的抗体稀释液；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。

2)酶标二抗孵育：

将HRP标记的重组蛋白A用抗体稀释液按1:5000(v/v)的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记重组蛋白A加入96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。

3)显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应30min，再向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应；使用酶标仪分别读取其在450nm和620nm波长处的吸光度OD₄₅₀、OD₆₂₀，其中，620nm波长的吸光度OD₆₂₀为背景值，以OD₄₅₀与OD₆₂₀的差值作为检测的吸光度值结果，并用空白对照孔调零。

检测血清样本中抗肿瘤相关抗原VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体表达水平的具体操作步骤与上述检测抗肿瘤相关抗原MAGEA1自身抗体基本相同，其不同之处在于检测时采用的酶标板分别为：肿瘤相关抗原VCL蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原TP53蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原PRKCZ蛋白包被的酶标板。

4、数据处理

对食管鳞癌组和健康对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验，经Kolmogorov-Smirnova检验发现，研究对象血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的表达水平不符合正态分布(P<0.05)，因此采用第25百分位数(P25)、中位数(P50)以及第75百分位数(P75)来描述4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平分布；由于实验数据不符合正态分布，采用非参数检验(Mann-Whitney U)比较食管鳞癌组和健康对照组中自身抗体的滴度水平是否有差异。

进一步根据测得食管鳞癌组和健康对照组中抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平，使用GraphPad Prism 8.0分别绘制4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌的ROC曲线；以特异度大于85％时，约登指数最大的时对应的OD值为截断值，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度，分析4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独用于食管鳞癌诊断的价值。所有统计分析使用SPSS 26.0软件进行，P<0.05为统计判断标准。

5、实验结果

食管鳞癌组和健康对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平分布如图2所示。由图2可知，抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体、抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体和抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌组血清样本中表达水平均明显高于健康对照组，而且具有显著差异(P<0.000)；由此说明，4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

图3为4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线图。由图3可知，采用抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体诊断食管鳞癌时，其AUC为0.67(95％CI:0.59-0.75)；采用抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体诊断食管鳞癌时，其AUC为0.67(95％CI:0.60-0.75)；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断食管鳞癌时，其AUC为0.65(95％CI:0.57-0.73)；采用抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体诊断食管鳞癌时，其AUC为0.65(95％CI:0.57-0.73)。由此说明，抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体均能够用于辅助诊断区分食管鳞癌患者和正常人。

实施例3：在大样本人群血清中采用ELISA检测抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体的血清表达水平，评估4种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于食管鳞癌诊断的价值

采用间接ELISA方法进一步在大样本人群血清中检测4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的表达水平，验证这4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体鉴别区分食管鳞癌患者和健康对照的能力。

1、实验样本：

本研究纳入了126例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)、126例健康对照血清(健康对照组)。其中，126例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)来自2017-2018年郑州大学第一附属医院及河南省肿瘤医院的食管鳞癌患者，所有病例均经过组织病理学确诊，未经过任何手术和放化疗；126例健康对照血清(健康对照组)来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库，健康体检者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，126例食管鳞癌患者和126例健康对照者在性别及年龄之间的差异没有统计学意义，所有研究对单项排除自身免疫性疾病及急慢性感染等影响蛋白表达的疾病。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：血清采集的具体方法与实施例2相同，在此不再赘述。

2、实验材料及试剂：

实验材料和具体试剂与实施例2相同，在此不再赘述。

3、实验方法：

实验方法与实施例2相同，在此不再赘述。

4、数据处理

数据分析方法与实施例2相同，在此不再赘述。

5、实验结果

食管鳞癌组和健康对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体滴度水平如图4所示。由图4可知，食管鳞癌组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的滴度水平显著高于健康对照组(P＜0.000)。由此说明，这4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

图5为4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线图。由图5可知，在大样本人群血清中，采用抗肿瘤相关抗原MAGEA1的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组时，其AUC为0.74(95％CI:0.68-0.80)，且当截断值为0.4476时，其诊断区分食管鳞癌的灵敏度为46.8％，特异度为85.1％；采用抗肿瘤相关抗原VCL的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组时，其AUC为0.67(95％CI:0.61-0.74)，且当截断值为0.2520时，其诊断区分食管鳞癌的灵敏度为42.1％，特异度为88.7％；采用抗肿瘤相关抗原TP53的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组时，其AUC为0.70(95％CI:0.63-0.76)，且当截断值为0.3591时，其诊断区分食管鳞癌的灵敏度为42.9％，特异度为88.7％；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体单独诊断区分食管鳞癌组和健康对照组时，其AUC为0.67(95％CI:0.61-0.74)，且当截断值为0.3474时，其诊断区分食管鳞癌的灵敏度为46.8％，特异度为85.1％。由此说明，这4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体均能够将食管鳞癌组与健康对照组区别开来，这也证明4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体均能够用于食管鳞癌的辅助诊断。

实施例4：4种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合对食管鳞癌的诊断价值

由于单独一种抗肿瘤相关抗原用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，诊断的灵敏度相对偏低，为了提高诊断的灵敏度，本发明将抗MAGEA1自身抗体、抗VCL自身抗体、抗TP53自身抗体和抗PRKCZ自身抗体中的两种、三种或四种抗肿瘤相关抗原自身抗体进行并联组合，对实施例3中纳入的126例食管鳞癌患者血清和126例健康对照血清进行判断，分析不同抗肿瘤相关抗原组合用于食管鳞癌诊断的价值。

不同抗肿瘤相关抗原并联组合用于食管鳞癌诊断的价值分析的方法为：基于实施例3中抗MAGEA1自身抗体、抗VCL自身抗体、抗TP53自身抗体、抗PRKCZ自身抗体单独诊断区分食管鳞癌ROC曲线，以特异度大于85％时，约登指数最大的时对应的OD值为截断值，对实施例3纳入的126例食管鳞癌患者血清和126例健康对照血清进行判断，针对任意一种抗肿瘤相关抗原自身抗体，血清样本检测的吸光度值结果大于等于该抗肿瘤相关抗原自身抗体的截断值时，判断为阳性，反之则判断为阴性；两种、三种或四种抗肿瘤相关抗原自身抗体并联组合用于诊断区分食管鳞癌时，组合中任意一种抗肿瘤相关抗原自身抗体的判断结果为阳性，则该抗肿瘤相关抗原自身抗体组合的诊断结果即为阳性。根据判断结果统计灵敏度和特异度，其结果如表1所示。

表1不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合对食管鳞癌的诊断价值

由表1可知，与单独一种抗肿瘤相关抗原自身抗体相比，多种抗肿瘤相关抗原组合用于食管鳞癌检测的灵敏度明显提高；而且，随着组合中抗肿瘤相关抗原自身抗体数目的增加，食管鳞癌诊断的灵敏度也随之增加，当4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合时，检测灵敏度高达79.4％，也就是说食管鳞癌患者中应用该方法能够正确的诊断为食管鳞癌的比率为79.4％。虽然随着组合中抗肿瘤相关抗原自身抗体数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合时，其检测特异度仍能够达到71.4％，这一结果表明，正常人采用4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合检测时，被正确的诊断为未患食管鳞癌的比率为71.4％。因此，使用抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53和PRKCZ的自身抗体组合进行食管鳞癌诊断时，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原MAGEA1、VCL、TP53、PRKCZ的自身抗体。

3.用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

6.根据权利要求5述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

8.一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为MAGEA1蛋白、VCL蛋白、TP53蛋白、PRKCZ蛋白中的至少一种。