JP5140808B2 - 消化管間質腫瘍(gist)を患う患者の予後を予測するために使用する腫瘍マーカー及びキット並びにフェチンの使用方法 - Google Patents
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Description
〔1.サンプル〕
(1−1.手術検体)
手術検体を研究に使用することについて文章による同意を得たGIST患者から得られた手術検体を使用した。GIST症例の手術検体の使用について、本研究は国立がんセンターの遺伝子倫理委員会の審査および承認を受けた。
症例の手術検体から腫瘍組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた腫瘍組織をマルチビーズショッカー(安井機器、大阪)にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出バッファー(6M ウレア、2M チオウレア、3% CHAPS、1% TritonX-100)を加えてタンパク質を抽出した。
(2−1.サンプル調整)
抽出したタンパク質を15000回転で遠心し、上精を回収した。上精に含まれるタンパク質をタンパク質定量キット(DCプロテインアッセイキット、Bio-Rad社、米国)にて定量した。抽出したタンパク質5μgを蛍光色素(サチュレーションダイCy5、GE Healthcare Biosciences社)で標識した。標識は以下のように行った。(1)終濃度30mMとなるようにpH8.0のトリスバッファーを加え、次に(2)1nmolのTECP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド,Sigma社)を加え、(3)37度で60分間処理した。次に、(4)Cy5蛍光色素を4nmol加えて、37度で60分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質サンプルから等量ずつタンパク質サンプルを集めて混合し、内部標準サンプルとした。内部標準サンプルの5μgを蛍光色素(サチュレーションダイCy3、GE Healthcare Biosciences社)で上記と同様に標識した。Cy5で標識した個別のサンプルとCy3で標識した内部標準サンプルを混合し、ウレア可溶化液で最終容量420μlとした。その際、終濃度が65mMとなるようにDTTを、2%となるようにとアンフォライン(GE Healthcare Biosciences社)を加えた。Cy5で標識した個別サンプルとCy3で標識した内部標準サンプルを混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル(24cm、pI4−7、GE Healthcare Biosciences社)と、Multiphor II(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。泳動するタンパク質サンプルでイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は40000Vh行った。二次元目の泳動は9−15%のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、EttanDalt II(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。泳動は泳動装置一台につき18Wで17時間、20度で行った。
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー(Typhoon Trio、GE Healthcare Biosciences社)に載せスキャンした。
読み込んだ画像は画像解析ソフトDeCyder(GE Healthcare Bio-sciences社)で解析した。
(3−1.ゲル内消化法)
全自動スポット回収装置ProHunter(AsOne社)を用いて、ゲルから96穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素(トリプシン)で37度にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、60%アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
ペプチドの質量を測定するためにLTQ(サーモ社)を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotを使用した。
前述の方法により手術検体より抽出したタンパク質10μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。抗フェチン抗体として、非特許文献3(Resendes BL et al.(2004))に記載された抗体を用いた。抗体の希釈濃度は1000倍とし、検出にはECLキット(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。
国立がんセンター中央病院に保存されていたパラフィンブロックを使用した。厚さ6μmの切片を作成し、抗フェチン抗体にて免疫染色を行った。抗フェチン抗体として、非特許文献3(Resendes BL et al.(2004))に記載された抗体を用いた。一次抗体の希釈は500倍とし、検出にはABCキット(DAKO社)を用いた。フェチンの陽性、陰性の判定は、2名の熟練した病理医と1名の臨床医が行った。
(6−1.転移の有無)
外来経過観察中の診察所見および定期的画像検査(CT,MRI,単純X線写真)により、肺、リンパ節、腹腔など全身のいずれの場所にも明らかな病変の出現がない場合に転移なしと判断した。
非特許文献1(Hasegawa H et al.(2002 Jun))に記載の方法に準じて、表1およびこれに関連した上記記載の通りに病理学的悪性度を判断した。腫瘍分化度、腫瘍壊死およびMIB−1のそれぞれについて病理医がスコアを決定した。
消化管間葉系腫瘍の手術検体からタンパク質を抽出し、蛍光二次元電気泳動法と質量分析装置にて転移、予後に関係するタンパク質を解析した。1)術後1年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度(リスク分類)が高度であった8症例、2)術後2年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった9症例の手術検体を用いた。約1600個のタンパク質スポットから、両群の間で濃度が異なるタンパク質スポット43個を選別した(Wilcoxon検定のP値が0.01以下)。
結果を検証する目的で、追加症例として3)術後1年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度(リスク分類)が高度であった2症例、4)術後2年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった2症例を、同様に蛍光二次元電気泳動法とウェスタン・ブロッティングを用いて調べた。この結果、上記と同様にフェチンの発現量に基づいて両群を感度、特異度ともに100%で識別することができた(図2(b)参照)。
フェチンによる予後予測の可能性をさらに検証する目的で、フェチンに対する特異抗体を用いた免疫染色を216症例に対して実施した。免疫染色のインターナル陽性コントロールとして血管内皮細胞を用いた。フェチン陽性または陰性の判定は複数の病理医および研究者により独立して行われた。図3に、陽性と陰性のそれぞれについて、免疫染色の結果の例を示す。216症例中、フェチン陽性症例は159症例、フェチン陰性症例は57症例だった。これらの症例について、術後5年間の転移とフェチンの発現の相関を調べた。術後5年間の転移について臨床情報が得られたのは216症例中152症例であった。152症例中、フェチン陽性症例は106例、陰性症例は46症例だった。術後5年間の転移はフェチン陽性症例においてはほとんど認められなかったのに対し(106症例中6症例、5.66%)、陰性症例では高頻度に認められた(46症例中29症例、63.09%)(表2参照)。
フェチン陽性および陰性の集団について、Logrank検定により再発(転移)率の検定を行った。これは、二つの集団の間での再発(転移)率の時間経過に統計学的有意差があるか否かを追跡調査したものである。図4に、個々の症例につき再発(転移)の時期を調べ、ある特定の時期における非再発症例の割合を累積で示す。還元すると、これは、再発(転移)が起こるまでの時間と割合を現している。この結果からも、フェチンが陽性である症例は再発率が極端に低く、予後が良好であることから、手術後の化学療法は必要がないと見込まれること、陰性である症例については、再発が高率に発生すると予測されるため手術後の化学療法を積極的に行うことを検討した方がよいことが分かる。
Claims (3)
- 消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するために使用する腫瘍マーカーであって、
フェチンからなり、前記患者の腫瘍組織において、前記フェチンの発現が陰性の場合に前記患者の予後が不良であり、前記フェチンの発現が陽性の場合に前記患者の予後が良好である、と予測する腫瘍マーカー。 - 消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、
前記患者の腫瘍組織中のフェチンを検出又は定量するための抗フェチン抗体を含み、前記フェチンの発現が陰性の場合に前記患者の予後が不良であり、前記フェチンの発現が陽性の場合に前記患者の予後が良好である、と予測することを特徴とする消化管間質腫瘍患者の予後予測に用いるキット。 - フェチンを、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測する腫瘍マーカーとして使用する方法であって、
前記患者の腫瘍組織において、前記フェチンの発現が陰性の場合に前記患者の予後が不良であり、前記フェチンの発現が陽性の場合に前記患者の予後が良好である、と予測する方法。
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