JP5574522B2 - 癌マーカー及び癌細胞の検査方法 - Google Patents
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1.生体から生体検体を分離し、当該生体検体中のRB1CC1(retinoblastoma 1 (RB1)-inducible coiled-coil 1)を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする癌細胞の検査方法。
2.癌細胞が乳癌細胞である、前項1に記載の癌細胞の検査方法。
3.生体検体が、RB1陽性と評価されたものである、前項1又は2に記載の検査方法。
4.さらに、上記生体検体中のp53を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする前項1〜3のいずれか1に記載の癌細胞の検査方法。
5.RB1CC1が陰性の場合に、予後が不良と判断する前項1〜4のいずれか1に記載の癌細胞の検査方法。
6.さらに、p53が陽性の場合に、予後が不良と判断する前項4又は5に記載の癌細胞の検査方法。
7.RB1CC1及び/又はp53、RB1の検出を、免疫学的手法により行う前項1〜6のいずれか1に記載の検査方法。
8.免疫学的手法が、免疫組織染色である前項7に記載の検査方法。
9.生体検体中のRB1CC1を検出するための抗RB1CC1抗体を含む前項1〜8のいずれか1に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
10.前項9に記載の抗RB1CC1抗体と、生体検体中のp53を検出するための抗p53抗体及び/又は生体検体中のRB1を検出するための抗RB1抗体とを含む、前項3〜8のいずれか1に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。
また、RB1CC1+/p53wtでは、術後5年再発率が5.88%、術後5年以降再発率が6.47%であるものの、術後生存率は96.47%であり、成績良好であった。一方、RB1CC1+/p53wt以外の症例では、術後5年以内再発率が27.74%と高く、術後生存率も78.1%と低かった。RB1CC1+/p53wt以外の症例では、RB1CC1+/p53wtの症例に比べ、術後5年以内の早期再発、早期死亡症例が多く、有意に予後不良であった。
これにより、術後生存、術後再発ともにRB1CC1は乳癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。さらに、RB1CC1と並行してp53及び/又はRB1について検出することで、乳癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。乳癌と診断された患者について、生検などで乳房組織を採取した際や手術で切除された乳房組織の乳癌検体に、本発明の検査方法を用いて検査することで予後を判断することができ、適切な治療方法を選択することができる。
RB1遺伝子は癌抑制遺伝子であり、RB1CC1タンパク質は、RB1遺伝子の発現に重要であることは上記特許文献1にて報告したとおりである。p53タンパク質は、細胞周期制御遺伝子(Cdk inhibitor)の一種であるp21に作用し、RB1CC1タンパク質とともにRB1の機能増強に重要な役割を有する(図1参照)。p53タンパク質はまた腫瘍細胞死、いわゆるアポトーシスにも関与し、腫瘍進展に重要な役割を果たすことが知られている。しかしながら、これらタンパク質の発現を複合的に評価し、指標とする病理診断が、乳癌の予後を予測しうることは本発明者らが初めて見出した。
ここにおいて、p53陽性とはp53変異を示唆するp53mutの場合をいい、p53陰性とはp53正常を示唆するp53wtの場合をいう。p53mutの場合は、変異無機能型のタンパク質が分解されず、細胞内に蓄積し続けるからである。
例えば、RB1CC1発現の結果を2種類の段階(陽性及び陰性)に分類する場合は、各段階に対応した2種類のコントロール(RB1CC1陽性コントロール及びRB1CC1陰性コントロール)を用いることが好ましい。また、陽性コントロールの1つとして、健常者又は予後良好な乳癌患者に由来するコントロールを用いることが好ましい。
RB1CC1及びp53、RB1の予後予測能を検証する目的で、抗RB1CC1抗体及び抗p53抗体、抗RB1抗体を用いた免疫組織染色を乳癌59症例の検体について行った。
外科的手術により取得した乳癌組織を含む検体(59症例)を、10%ホルマリンを含む緩衝液に加え、一晩固定した。固定検体を、70%エタノール中で数回洗浄し、パラフィンに包埋し、5μmの連続切片を作製した。脱パラフィンした切片試料を、0.3%のH202に浸し、120℃で1分間オートクレーブにより、滅菌及び免疫賦活化処理した。次に、抗RB1CC1抗体(自家製)及び抗p53抗体(Novocastra社製PAb1801、もしくはSanta Cruz社製FL393)、抗RB1抗体(Pharmingen社製G3-245)を加え、4℃に1×Tris緩衝液(TBS)で一晩置いた。各切片を1×TBSで洗浄し、二次抗体(Simple Stain MAX-POTM;ニチレイ社)を加え、室温にて1時間おいた。免疫組織染色のために更にDAB染色 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAKO社)を行い、さらにヘマトキシリン染色を行った。
すべての検体は、患者からの書面によるインフォームド・コンセントを得たものであり、施設の倫理委員会により使用を承認されたものである。
免疫組織染色を行った59症例のうち、4例はRB1−(陰性:異常)で予後不良(5年生存率50%)であった。RB1+(陽性:正常)の55例のうち、RB1CC1+(陽性)症例は42症例、RB1CC1−(陰性)症例は13例であった。また、p53陰性症例(野生型(p53wt))は41症例、強陽性症例(変異型(p53mut))は14例であった。予後との関連を検討した結果、術後5年生存率はRB1CC1を単独マーカーとした場合は、陽性症例では90.5%であったのに対し、陰性症例では53.9%であり、陰性症例は陽性症例よりも有意に予後不良であった(表1、図2:Log-Rank test p=0.0028)。さらに、p53を単独マーカーとした場合は、p53wt症例では85.4%であったのに対し、p53mut症例では71.4%であった。RB1CC1及びp53をマーカーとした場合は、RB1CC1+/p53wtの場合(いずれのマーカーも正常。より正常細胞に近いと示唆される症例の場合。)は、術後5年生存率は93.5%であったのに対し、RB1CC1−/p53mut症例の場合(いずれのマーカーも異常。より癌化が進行したと示唆される症例の場合。)は33.3%であり、RB1CC1−/p53mut症例はRB1CC1+/p53wt症例より有意に予後不良であった(表1、図2:Log-Rank test p=0.0094)。
実施例1と同様の手法により、抗RB1CC1抗体及び抗p53抗体、抗RB1抗体を用いた免疫組織染色を、原発性乳癌323症例の外科的手術により取得した乳癌組織を含む検体について行った。患者の平均追跡期間は79.1ヶ月(3−137ヶ月)であり、平均年齢は53.2歳(26−90歳)である。すべての検体は、患者からの書面によるインフォームド・コンセントを得たものであり、施設の倫理委員会により使用を承認されたものである。検体の病理学的診断は、2人以上の臨床病理医によって行い、WHO(世界保健機構)のガイドラインに従って分類された。
図4に、RB1CC1+/p53wt、RB1CC1−/p53wt、RB1CC1+/p53mutの代表的な症例について、検体の免疫組織染色の写真を示す。これら症例(Case1-3)についてRB1は陽性(正常)である。
323症例のうち、16症例はRB1の発現が認められず、RB1遺伝子が欠失しているものと考えられた。これらRB1陰性(異常)16症例の成績は不良で生存率、無病生存率ともに56.3%であった(図6)。これらのRB1陰性症例は除外し、RB1陽性の307症例について更に解析を行った。なおRB1遺伝子が欠失している16症例の生存曲線は、RB1CC1(−)94症例とほぼ同様であった(図5a、図6)。
Multivariate Cox proportinal hazard解析を行ったところ、RB1CC1−(陰性)症例は死亡の危険度が高く(Hazard ratio=3.075, 95% Confidence Interval=1.544-6.124, p=0.001)(表3)、予後は明らかに不良であった(Log-rank test, Chi-Square value=15.569, p<0.0001)(図5a)。
しかし、RB1CC1とp53の両方についての評価では、RB1CC1が陰性(−)またはp53が陽性(p53mut)である場合は、RB1CC1が陽性(+)かつp53が陰性(p53wt)である場合に比べて臨床的に予後が悪い結果であった(図5c)。
無病生存率に関しても、RB1CC1は、有意な危険度を示し、予後不良であった(表4、図7a)
Claims (2)
- 生体から分離された生体検体においてRB1CC1(retinoblastoma 1 (RB1)-inducible coiled-coil 1)、p53、およびRB1を癌予後予測マーカーとして、免疫組織染色により検出することを含み、各マーカーについて、細胞の核における染色強度を陽性コントロールおよび陰性コントロールと比較することにより、生体検体を陽性と陰性に分類し、RB1が陽性と評価された生体検体において、RB1CC1が陰性、又はp53が陽性の場合に、予後が不良と判断するための、乳癌細胞の検査方法。
- 生体検体中のRB1CC1を検出するための抗RB1CC1抗体と、生体検体中のp53を検出するための抗p53抗体及び生体検体中のRB1を検出するための抗RB1抗体とを含む、請求項1に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。
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