CN110546510A - 预后方法和在所述方法中有用的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及针对乳腺癌的诊断、预后和监测方法和测定以及可以用于这些方法的试剂盒。更具体地，本发明涉及患有乳腺癌的患者的预后方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体表达的水平。

Description

预后方法和在所述方法中有用的试剂盒
领域
本发明总体上涉及针对乳腺癌的诊断、预后和监测方法和测定以及可以用于这些方法的试剂盒。
更具体地，本申请涉及HER2/CB2异聚体表达用于预测局部无病生存(localdisease-free survival)长度的可能性的用途。对乳腺癌患者的转移可能性、总生存(overall survival)长度和乳腺癌治疗结果的评估也是可能的。本申请还涉及改进的药物靶。
背景
乳腺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，并代表了重要的公共卫生问题。尽管对这种疾病的认识不断提高，乳腺癌在很大程度上仍然耐受医疗干预。大多数临床举措侧重于早期诊断，然后是常规形式的干预，特别是手术、放射、激素抑制和化学治疗。此类干预成功率有限，尤其是在肿瘤已经历转移的患者中。因此，对改进诊断工具的库和方法以提供更精确和更有效的信息存在迫切需要，该信息将允许以可能的最低侵入性方式进行的成功治疗。还对鉴定用于药物治疗的另外的和更好的靶存在持续需要。
在过去的数年里，根据分子参数，乳腺癌已经被分类为不同的亚型。一种亚型的特征是人类表皮生长因子受体2(HER2)的过表达，并且代表所有乳腺癌的20％至25％。另外，已经证明CB2在HER2+乳腺癌中过表达，并且CB2通过c-SRC激酶活化HER2原癌基因信号传导来促进肿瘤产生和进展。还已经表明，在人类乳腺癌样品中，CB2与HER2形成异聚体(heteromer)。
对开发用于进行乳腺癌并尤其是HER2+乳腺癌的诊断、预后和监测的更好的工具存在持续需要。鉴定新的治疗靶也是重要的。
概述
发明人已经发现，HER2/CB2表达与患有乳腺癌的患者的局部无病生存相关。近期还描述了HER2/CB2在乳腺癌细胞中作为异聚体存在。发明人也已经示出，HER2/CB2异聚体的表达与不良患者预后相关。并且，当用Δ9-四氢大麻酚(THC)处理癌细胞时，HER2/CB2异聚体解离。
因此，在第一方面，本发明提供了一种患有乳腺癌的患者的预后方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平。
在第二方面，本发明提供了一种预测患有乳腺癌的患者的总生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的总生存长度。
在第三方面，本发明提供了一种预测乳腺癌患者的无病生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的无病生存长度。
在第四方面，本发明提供了一种受试者中乳腺癌的诊断或预后方法，该方法包括：提供受试者的组织；确定组织中HER2/CB2异聚体的表达水平；和当表达水平高于标准时进行乳腺癌的诊断或预后。
第一至第四方面中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤可以通过本领域已知的任何方法进行。然而，在一些实施方案中，确定HER2/CB2异聚体表达水平的方法是共定位方案、免疫共沉淀测定、共振能量转移技术、邻位连接测定，或者通过使用被设计用于检测异聚体的特异性探针。
在第五方面，本发明提供了一种治疗HER+乳腺癌的方法，所述方法包括施用能够破坏HER2/CB2异聚体的药剂(pharmaceutical agent)的步骤，从而治疗所述HER+乳腺癌。
在第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括能够检测HER2/CB2异聚体的剂和使用说明。
附图简述
图1.显示在HER2+乳腺肿瘤(阳性对照，上图)和HER2-乳腺肿瘤(阴性对照，下图)中HER2、CB2和HER2-CB2异聚体表达的代表性图像。HER2和CB2染色以棕色呈现，并且异聚体染色呈粉红色。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图2.局部无复发生存(relapse-free survival)的Kaplan-Meier曲线。将样品按照HER2-CB2异聚体表达进行排序，并通过手动选择最佳截止值分配为两组(低表达和高表达)。
图3.所示的细胞系中HER2和CB2的蛋白质印迹分析。用CB2-HA编码质粒转染细胞，并用THC处理持续4h。然后用抗HER2抗体免疫沉淀HER2，并用抗HA抗体显现印迹。
图4.HCC1954细胞中的HER2-CB2异聚体表达。响应于所示的处理，PLA实验的代表性图像。
图5.HCC1954细胞中的蛋白质表达。通过蛋白质印迹对响应于THC的总HER2和磷酸化的(即活化的)HER2的蛋白质表达进行分析。
图6.HCC1954细胞中的HER2-HER2二聚体表达。响应于所示的处理，PLA实验的代表性图像。
本发明优选实施方案的详细描述
在描述本申请的方法和试剂盒之前，应理解本发明不局限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将通过所附的权利要求描述。
必须注意，如本文以及在所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如，提及“细胞”包括多于一个此类细胞，提及“抗体”包括一种或更多种抗体和本领域技术人员已知的其等价物，等等。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料，现在描述方法、设备和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，用于描述和公开在出版物中报道的可以与本发明关联使用的抗体、蛋白质、核酸和方法的目的。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借之前的发明而早于此公开内容。
应当理解，如果本文提及任何现有技术出版物，则此提及并不构成承认该出版物在澳大利亚或任何其他国家构成了本领域中普通常识的一部分。
在所附的权利要求中和在本发明的前面描述中，除其中上下文由于明确的语言或必要的暗示而另有要求的情形之外，词语“包括/包含/含有(comprise)”或诸如“包括/包含/含有(comprises)”或“包括/包含/含有(comprising)”的变化形式以包括性的意义被使用，即指定所陈述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加另外的特征。
根据本发明，提供了用于患有乳腺癌，尤其是HER2+乳腺癌的患者的预后方法，所述方法包括确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平。
在一个实施方案中，该方法可以包括将所述生物样品与HER2/CB2异聚体结合组合物接触。
在另一个实施方案中，该方法还可以包括将所述生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平与标准进行比较，和从而提供与所述的经确定的HER2/CB2异聚体的表达水平相关的预后。
在另一个实施方案中，已经发现HER2/CB2异聚体表达水平的升高与患者具有减少的局部无病生存长度相关。
在本发明的一个实施方案中，已经发现HER2/CB2异聚体表达水平的升高与患者具有减少的无进展生存(progression-free survival)长度相关。
在另一个实施方案中，已经发现HER2/CB2异聚体表达水平的升高与患者具有减少的无事件生存(event-free survival)长度相关。
HER2/CB2异聚体的表达水平可以被作为评估疾病状态的唯一因素，或与其他因素(包括淋巴结状态、雌激素受体状态等)一起使用。
术语“诊断”在本文中用于指鉴定患有乳腺癌，尤其是HER2+乳腺癌的患者。
如本申请中使用的，“预后”是指从乳腺癌恢复的可能性或乳腺癌可能的发展或结果的预测，包括但不限于预测总生存长度、无乳腺癌生存长度、无进展生存、无事件生存、患者中乳腺癌再现的可能性和乳腺癌转移的可能性。
短语“总生存(overall survival)”是本领域技术人员熟知的，并且指的是在诊断后患者的命运，尽管患者的死亡原因可能不是直接由于癌症的影响。短语“无病生存”是本领域技术人员熟知的，并且意指不存在被监测的疾病的生存。例如，如果HER2/CB2异聚体表达被用于诊断或监测乳腺癌，则无病生存将意指不存在可检测的乳腺癌。短语“恢复的可能性”是本领域技术人员熟知的，并且指的是导致患者在癌症诊断后恢复的肿瘤消失或无肿瘤再现的可能性，其中根据本发明的方法确定该可能性。短语“再现的可能性”是本领域技术人员熟知的，并且指的是在癌症诊断后患者中肿瘤再现或转移的可能性，其中根据本发明的方法确定该可能性。短语“无事件生存”是本领域技术人员熟知的，并且意指在特定的活动(例如治疗)之后，没有特定组的所定义的事件(例如癌症的进展)的发生的生存。短语“无进展生存”是本领域技术人员熟知的，并且指的是治疗期间和之后患者在疾病没有恶化的情况下生存的时间长度，并且可以被用于临床研究或试验以帮助发现治疗效果如何。术语“转移”是本领域技术人员熟知的，并且指的是与原始癌性肿瘤的器官不直接相连的器官或身体部分中癌性肿瘤的生长。转移将被理解为包括微转移(micrometastasis)，微转移是在与原始癌性肿瘤的器官不直接相连的器官或身体部分中存在不可检测量的癌细胞。因此，本发明构思了一种确定与乳腺不直接相连的器官或身体部分中一个或更多个癌性肿瘤的进一步生长的风险的方法。
如本文所用的，短语“生物样品”包括从受试者获得的并在本发明的程序中有用的多种样品类型。生物样品可以包括但不限于固体组织样品、液体组织样品、生物流体、抽取物、细胞和细胞碎片。生物样品的具体实例包括但不限于通过手术切除获得的固体组织样品、病理标本、归档的样品或活组织检查标本，组织培养物或源自其的细胞及其后代，以及从这些来源的任一个制备的切片或涂片。非限制性实例是从乳腺组织、淋巴结和乳腺肿瘤获得的样品。生物样品的全部或部分可以具有一种或更多种疾病状态特征性的HER2/CB2异聚体表达水平。
如本文所使用的，“标准”是用作用于其他数据的比较的基础的参考。标准可以包括生物样品、生物样品的照片或显微照片，或者来源于生物样品的分析的正常范围(例如，在健康个体的范围内)。例如，标准可以包括正常和/或癌症组织、无癌症组织或归档的病理学样品，其含有不同水平的HER2/CB2异聚体蛋白质表达，用作阳性对照，以及显示没有HER2/CB2异聚体表达水平的肿瘤组织或其他组织，作为阴性对照样品，照片或显微照片，或来源于所述样品的正常范围。此类标准可以被用于包括但不限于以下的方法中：用于预测无病生存和总生存的长度的方法、用于预测无进展生存的方法、用于预测无病生存或总生存减少的风险的方法、用于预测患有癌症的患者恢复的可能性的方法、用于预测患有癌症肿瘤的个体中癌症再现和/或转移的可能性的方法、用于预测癌症再现的风险的方法、用于筛选患有癌症的患者以确定肿瘤转移风险的方法、用于确定用于患有癌症的患者的适当疗程的方法以及用于监测用于患有癌症的患者的疗程的有效性的方法。
“HER2/CB2异聚体结合组合物”可以包括能够特异性结合HER2/CB2异聚体的任何剂，包括但不限于配体、抗HER2/CB2异聚体抗体或其抗原结合片段。如本文所用的，术语“结合(或能够结合)HER2/CB2异聚体的剂”是指特异性结合HER2/CB2异聚体或其多肽片段的任何分子，包括但不限于抗体或其抗原结合片段，并从而检测HER2/CB2异聚体的表达水平。此类剂优选使用本领域技术人员熟知的方法被标记以用于检测。标记物的实例包括但不限于放射性标记物、生色团、荧光团、酶、结合部分(例如生物素)等。
可互换使用“HER2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”。除非另有指明，当在本文使用时，术语“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“HER2”是指人类的蛋白质。人类ErbB2基因和ErbB2蛋白质在例如Semba等人,PNAS(USA)82:6497-650(1985)和Yamamoto等人,Nature 319:230-234(1986)中描述(Genbank登录号X03363)。特异性结合HER2的抗体的实例是在美国专利第5,677,171号；第5,772,997号；Fendly等人，Cancer Res.,50:1550-1558(1990)中公开的；杂交瘤细胞系(ATCC CRL 10463)产生的HER2单克隆抗体4D5、杂交瘤细胞系(ATCC编号PTA-5262)产生的HER2单克隆抗体6B3、杂交瘤细胞系HB-11601和HB-11602产生的ErbB2单克隆抗体；等等。
抗体(单克隆和多克隆)或其抗原结合片段可以被用作结合HER2/CB2异聚体蛋白质或其多肽片段的HER2/CB2异聚体结合组合物。本文还构思了特异性结合HER2/CB2异聚体的任何蛋白质突变体(无论是通过添加(例如，添加GST结构域或GFP结构域)或序列修饰(例如，位点特异性诱变)等)作为HER2/CB2异聚体结合组合物。
本文中的术语抗体包括但不限于人类和非人类多克隆抗体、人类和非人类单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗独特型抗体(抗IdAb)和人源化抗体。
术语抗体也意指包括能够结合抗原的完整分子及其片段二者，诸如例如Fab、F(ab)2(F(ab).sub.2)、Fab’、F(ab’)2(F(ab’).sub.2)、Fd、Fd’、Fv和scFv、单链抗体(天然或重组的)。抗体或抗原结合组分可以在溶液中或附着于支持物(板、珠、磁珠等)。
抗体或抗体片段在免疫荧光技术中可以是有用的，所述免疫荧光技术采用荧光标记的抗体，使用荧光显微术检测、流式细胞术检测或荧光检测。本发明的抗体和多肽的反应可以通过本领域已知的免疫测定方法来检测。本发明的抗体可以在组织学上被采用，如在光学显微术、成像、免疫荧光或免疫电子显微术中被采用，用于组织样品或活组织检查中HER2/CB2异聚体蛋白质的原位检测。可以通过从患者中取出组织标本并施加本发明的被适当标记的抗体来实现原位检测。
生物样品可以用固相支持物或载体处理，所述固相支持物或载体诸如硝化纤维素或其他能够固定细胞或细胞颗粒或可溶性蛋白质的固体支持物。支持物然后可以被洗涤，然后用被可检测地标记的抗HER2/CB2异聚体抗体进行处理。这之后，洗涤支持物以移除未结合的抗体。然后可以通过常规手段检测所述支持物上结合的标记物的量。固相支持物意指能够结合抗原或抗体的任何支持物，诸如但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙、改性纤维素或聚丙烯酰胺。可选地，抗原可以在溶液中，并且抗体附着至支持物(板、珠、磁珠等)。
可以根据熟知的方法来确定给定批次的抗体对HER2/CB2异聚体蛋白质的结合活性。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每次确定的运转(operative)和最佳测定条件。
在一个实施方案中，本发明提供了通过检测HER2/CB2异聚体的表达水平的HER2+乳腺癌的预后方法。
本发明的优选实施方案提供了用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的无HER2+乳腺癌生存长度的方法，该方法通过以下进行：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的无HER2+乳腺癌生存长度的标准进行比较，和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的无HER2+乳腺癌生存的长度，其中HER2/CB2异聚体的表达水平的升高与无乳腺癌生存的长度的减少相关。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了用于在肿瘤发展的早期阶段确定HER2/CB2异聚体表达水平的方法。本领域技术人员熟知肿瘤发展的不同阶段，例如，如在Markman,(1997)，Basic Cancer Medicine中示例的。
确定HER2/CB2异聚体表达水平
HER2/CB2异聚体表达的确定可以通过本领域普通技术人员已知的一种或更多种方法进行。例如，HER2/CB2异聚体表达水平可以使用共定位方案、免疫共沉淀测定、共振能量转移技术、邻位连接测定(proximity ligation assay)或通过使用被设计用于检测异聚体的特异性探针来确定。
邻位连接测定对于理解分子复合物的生物学作用以及在生物标志物的研究方面越来越有用。例如，HER2/CB2异聚体结合组合物，即特异性结合HER2/CB2异聚体的组合物可以与许多不同的检测系统偶联，以测量HER2/CB2异聚体的存在和/或量。本领域技术人员已知的可用于确定HER2/CB2异聚体的量的任何方法可以根据本发明被使用。此类方法包括但不限于，福斯特共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、双分子荧光互补、邻位连接测定(PLA)和闪烁邻近测定(scintillation proximity assay；SPA)。
也可以通过使用HER2/CB2异聚体结合组合物测量HER2/CB2异聚体蛋白质水平来检测HER2/CB2异聚体表达水平。HER2/CB2异聚体蛋白质水平的检测可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行，包括但不限于化学发光方法、组织化学染色或生物化学检测(即免疫组织化学测定)、蛋白质印迹分析、流式细胞术、免疫沉淀(或对于非抗体剂的其等价方法)、等离子体共振吸收测量等。在本发明的一个实施方案中，检测HER2/CB2异聚体蛋白质水平的方法是免疫测定(诸如ELISA)，其包括使用至少一种抗体。在本发明的又另一个实施方案中，组织样品例如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片中的HER2/CB2异聚体染色，可以通过使用抗HER2/CB2异聚体抗体的免疫组织化学进行，并确定HER2/CB2异聚体的表达。
患者的分类
如本文使用的，术语“乳腺癌”包括导管原位癌(导管内癌)、小叶原位癌、侵袭性(invasive)(或浸润性(infiltrating))导管癌、侵袭性(或浸润性)小叶癌、炎性乳腺癌、三阴性乳腺癌、乳头佩吉特病、叶状肿瘤、血管肉瘤或侵袭性乳腺癌。在一些实施方案中，侵袭性乳腺癌被进一步分类为亚型。在一些实施方案中，亚型包括腺样囊性(adenoid cystic)(或腺样囊性(adenocystic))癌、低级别腺鳞癌(low-grade adenosquamous carcinoma)、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌(tubular carcinoma)、化生性癌、微乳头状癌或混合癌。优选地，如本文使用的，该术语指HER2+乳腺癌。
术语“患有乳腺癌的患者”是指已经诊断出患有如本文定义的乳腺癌的人类受试者。
通过将从患者获得的生物样品中的HER2/CB2异聚体表达水平与标准进行比较，可以对患者进行分类。例如，在测量样品中HER2/CB2异聚体表达水平后，将所测量的水平与标准进行比较。该标准是用于评估患者的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平的HER2/CB2异聚体的表达水平。例如，在一个实施方案中，当患者样品中的HER2/CB2异聚体表达水平高于标准的HER2/CB2异聚体表达水平时，患者样品将被认为具有升高的HER2/CB2异聚体表达水平。相反，在另一个实施方案中，当样品中的HER2/CB2异聚体表达水平低于标准时，样品将被认为具有低的HER2/CB2异聚体表达水平。
在另一个实施方案中，可以给患者分配与给定生物样品中HER2/CB2异聚体表达相关的“评分”。在乳腺癌的诊断或监测期间，可以对样品进行“评分”。可以根据生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平确定评分。在一个实施方案中，与低的HER2/CB2异聚体表达水平(其被给予相对较低的评分)相比，生物样品中升高的HER2/CB2异聚体表达水平被给予更高的评分。也可以通过免疫组织化学通过对样品进行目视检查来确定评分。在另一个实施方案中，更多定量的评分涉及确定两个或更多个参数，例如(i)染色强度和(ii)所取样的被染色(“阳性”)细胞的比例。基于这些多个参数，可以分配反映阳性染色水平增加的评分。
因此，在一个实施方案中，可以将与从患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体表达水平相关的评分与以下进行比较：与标准HER2/CB2异聚体表达水平相关的评分、或用作对照的不具有HER2/CB2异聚体表达、具有低或升高的HER2/CB2异聚体表达水平的细胞。这样的比较可以为患者更好的预后提供基础。例如，在一个实施方案中，本发明的方法可以通过使用0至3+的尺度来对HER2/CB2异聚体表达的水平进行评分，其中0为阴性(没有可检测的HER2/CB2异聚体表达)，1+和2+分别与弱染色和弱至中等染色相关，并且3+是与高强度染色相关(在多于10％的肿瘤细胞中)；并且其中较低的评分指示患者的预后较好。
表达不同水平HER2/CB2异聚体的患者的预后可以使用单变量或多变量分析进行。这些方法确定了一个或更多个变量与给定结果之间相关性的可能性。在一个实施方案中，方法将确定HER2/CB2异聚体表达水平(或与另一个变量偶联的HER2/CB2异聚体表达水平)和乳腺癌患者的无病生存或总生存之间相关性的可能性。可以使用本领域普通技术人员熟知的用于进行这些分析的多于一种方法中的任何一种。单变量分析的一个实例是Kaplan-Meier方法或对数秩检验。多变量分析的一个实例是Cox比例风险回归模型。本发明的方法还可以包括分析HER2/CB2异聚体的表达水平连同另外的乳腺癌标志物的水平。Cox比例比提供了具有不同HER2/CB2异聚体表达水平的患者的无病生存和总生存的风险比或风险。
使用Kaplan和Meier方法的生存分析是推荐的用于癌症试验的统计技术。其通过在将患者招募到研究后分析他们的生存时间的分布被应用。该分析将患者生存时间按照从招募后直至给定时间仍然存活的患者比例进行表示。从图形的角度，患者生存比例对时间的图具有一个特征性的下降(通常是指数的)，曲线的斜度指示正在研究的治疗的效力。生存曲线越浅，治疗越有效。Kaplan-Meier分析可以被用于测试与两种不同治疗相关的生存曲线之间差异的统计显著性。
在一个实施方案中，在从患者获得的样品中HER2/CB2异聚体的表达水平已经被确定并与标准进行比较后，患者然后被分类为具有特定的无病生存或总生存的可能性的组。然后，基于在该组中患者的无病生存或总生存的可能性来评估患者的无病生存或总生存的可能性。例如，可以确定从患者获得的生物样品相对于标准具有升高的HER2/CB2异聚体表达水平。然后将这一患者归类到具有升高的HER2/CB2异聚体表达水平的患者组中。由于根据本发明，已经发现对于表达升高水平的HER2/CB2异聚体的患者组，存在无病生存或总生存长度的减少，因此患有癌症的特定患者将被认为具有减少的无病生存或总生存长度。
试剂盒
本申请的检测方法合意地以任何常规测试试剂盒的形式进行。例如，免疫测定可以是固体捕获、竞争性或夹心免疫测定。
固相捕获免疫测定测试试剂盒包括能够结合HER2/CB2异聚体并具有允许检测的标记物的抗体，以及固体支持物。固体支持物可以作为测试试剂盒的一部分或与它分离出售。当用于本发明的检测方法时，使抗体与测试样品接触。使所得混合物与固体支持物接触，使得复合物结合至支持物。在移除未结合的物质后，抗体然后可以被检测。
在本发明的一个特别优选的形式中，HER2/CB2异聚体抗体和测试样品的混合物可以与亲和基质接触，使得复合物结合至亲和基质。在移除未结合的物质后，将复合物从亲和基质洗脱出来，并允许接触和吸附到固体支持物。在夹心和竞争性形式中，亲和基质也可用于结合复合物，并从而将复合物与测试样品-HER2/CB2异聚体抗体混合物的剩余部分分离。在每种情况下，可以将复合物随后从亲和基质中洗脱出来并与固体支持物吸收性接触。
任何免疫测定测试试剂盒形式中使用的固体支持物可以是此类试剂盒中常规使用的任何水不溶性、水可悬浮的固体材料。合适的实例是聚合物膜、塑料或玻璃珠、试管或微量滴定板。复合物中的结合物质可以通过共价结合或吸附结合至固体载体。当使用试管或微量滴定板时，此结合发生在这些载体的内壁处。
在竞争性和夹心免疫测定测试试剂盒中，试剂盒可以与已经结合至固体支持物的结合物质一起销售。固体支持物表面的此应用通过以下实现：使结合物质与固体支持物接触并保持此接触持续足够的时间以允许结合物质的第一区域结合至固体支持物。通常，此接触需要一至十八个小时，优选四个小时。然后将未粘附的结合物质与不溶的结合物质(即，结合至固体支持物的结合物质)分离，并随后洗涤固体支持物。
在所有三种免疫测定测试试剂盒形式中，放置测试样品和HER2/CB2异聚体抗体以进行相互接触，并允许孵育持续足够的时间以允许结合。通常，此结合需要两个小时。合意地，在此接触之后，使测试样品和HER2/CB2异聚体抗体混合物与固体支持物接触。对于固相捕获测定，复合物直接结合至固体支持物，而在竞争性测定或夹心免疫测定中，复合物间接结合至(即通过结合物质)固体支持物。对于本发明的所有三种免疫测定测试试剂盒形式，在允许用于孵育的足够的时间后，将残留的测试样品和HER2/CB2异聚体抗体混合物与结合至固体支持物的不溶物质分离。然后洗涤不溶性物质。
应当理解，根据本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境将在具有本领域普通技术的技术人员的能力范围内。通过以下非限制性实施例来更全面地说明本发明。
实施例1：HER2/CB2异聚体表达作为HER2+乳腺癌的预后工具
在含有57个HER2+乳腺癌样品的组织微阵列(TMA)中分析HER2-CB2异聚体的表达，所述57个HER2+乳腺癌样品对应于1999年和2013年之间在12 de Octubre Hospital(Madrid,Spain)手术的病例。使用Duolink II in situ PLA检测试剂盒(Olink，Bioscience，Uppsala，Sweden)，通过邻位连接测定进行表达分析。在共焦显微镜下观察样品，并且用ImageJ软件处理红色荧光信号(对应于异聚物)。按照HER2-CB2异聚体表达对样品进行排序，并手动选择最佳截止值。
首先，我们进行了针对HER2、CB2和HER2-CB2异聚体的染色对照(见图1)。其次，我们按照PLA信号(粉红色点/PLA-阳性细胞的数量)对样品进行排序，并分析与有关于患者预后的临床参数的潜在相关性。如图2所示，我们发现高异聚体表达和较低的局部无复发生存之间存在显著相关性。
实施例2：THC的作用机理
我们先前报道了当以产生抗肿瘤反应的浓度使用时，THC会破坏BT474细胞中的HER2-CB2异聚体。如实施例1中所讨论的，我们使用邻位连接测定(PLA)和生物发光共振能量转移(BRET)测定观察到这些效应。我们还观察到在同一细胞系中HER2的伴随降解，这表明THC通过破坏HER2-CB2异聚体并使HER2不稳定来诱导其抗增殖作用。
我们通过一种不同的技术(免疫共沉淀，co-IP)已经证实了在两种不同的HER2+乳腺癌细胞系(BT474和HCC1954)中，THC破坏HER2-CB2异聚体。结果示于图3中。
我们还在HCC1954细胞中进行了PLA，表明SR2(一种选择性CB2拮抗剂)阻断了THC诱导的异聚体破坏。这些观察结果证实了THC通过作用于CB2而破坏异聚体(图4)。
我们先前在BT474细胞中在THC处理后观察到HER2的降解。我们现在通过HCC1954细胞中的蛋白质印迹已经证实了这一观察结果(图5)。
我们已经进行了PLA，表明THC不仅破坏HER2-CB2，还破坏HER2-HER2二聚体(其是非常熟知的信号传导复合物，驱动HER2+乳腺癌中的肿瘤进展)。这些数据示于图6中。
方法和材料
细胞、细胞培养和转染
将BT474和HCC1954人类乳腺腺癌细胞维持在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI培养基中。
原位邻位连接测定(PLA)
将细胞在玻璃盖玻片上生长，并在4％多聚甲醛中固定，用含有20mM甘氨酸的PBS洗涤，用含有0.05％Triton X-100的相同缓冲液透化，并用PBS连续洗涤。使用Duolink insitu Probemarker试剂盒(Olink，Bioscience，Uppsala，Sweden)检测HER2-CB2异聚体。在预热的湿度室中在37℃用封闭溶液孵育1小时后，使细胞在抗体稀释介质中孵育过夜，该抗体稀释介质具有等量的直接连接到正PLA探针(plus PLA probe)的兔抗CB2抗体(1:50，Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)和直接连接到负PLA探针(minus PLA probe)的兔抗HER2抗体(1:50，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，US)的混合物。在室温用洗涤缓冲液A洗涤细胞，并在预热的湿度室中用连接溶液(Duolink II连接原液，1:5，和Duolink II连接酶，1:40)在37℃孵育持续30分钟，以诱导两种DNA探针的退火和连接。用含有荧光核苷酸的Duolink II检测试剂红色试剂盒进行扩增。在室温用洗涤缓冲液B彻底洗涤后，用具有DAPI的封固介质对细胞进行封固。在Leica SP2共焦显微镜(Leica Microsystems,Mannheim,Germany)下观察样品。用ImageJ软件处理红色荧光图像。PLA要求两种受体足够接近，以允许两种不同的抗体-DNA探针能够连接(<17nm)(等人，(2008),Methods.,45:227–232；Trifilieff等人，(2011),BioTechniques,51:111–118)。如果受体在足够近的距离内，可以通过共焦显微术检测到点状荧光信号。
蛋白质印迹
将HCC1954细胞用RIPA缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠)处理，所述RIPA缓冲液含有蛋白酶抑制剂(胃酶抑素、亮抑酶肽、抑肽酶、quimostatin、抗蛋白酶和苯甲基磺酰氟)和磷酸酶抑制剂(Na3VO4和NaF；SigmaChemical Co.,St.Louis，Mo.)的混合物。将通过十二烷基硫酸钠-10％聚丙烯酰胺还原凝胶分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。用5％脱脂牛奶和1％牛血清白蛋白封闭后，将膜与1:500稀释的抗ErbB2抗血清(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,California)在室温孵育持续3个小时。用山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)过氧化物酶标记的抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif.)显示结合的抗体。使用化学发光检测系统(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)显示过氧化物酶。用1:5,000稀释的抗肌动蛋白单克隆抗体(MAb；Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.)，然后用1:4,000稀释的抗小鼠IgG过氧化物酶标记的抗体(Zymed)进行对照。
免疫共沉淀测定
使用Fugene HD Transfection Reagent(Promega，Madison，WI)，用pcDNA3-HA-hCB2或相应的空载体(pcDNA3)瞬时转染HCC1954和BT474细胞。转染后48小时，将细胞用3μMTHC或相应的媒介物(DMSO)处理持续4小时，并使用用于免疫共沉淀的特定缓冲液(40mMHepes pH 7.5、120mM NaCl、1mM EDTA、10mM焦磷酸钠、10mM甘油磷酸钠、50mM氟化钠、0.5mM原钒酸钠、0.3％CHAPS，并补充有新鲜的1mM苄脒和0.1mM PMSF)裂解。使用共价偶联到5μL蛋白G琼脂糖凝胶的5μg抗ErbB2抗体(Neu C-18,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,US)免疫沉淀细胞裂解物(1mg)。免疫沉淀后，通过SDS–10％聚丙烯酰胺还原凝胶分离蛋白质，并转移到PVDF膜。在用TBST中5％w/v的脱脂奶粉封闭后，将膜与抗ErbB2抗体(1:1000)和抗HA抗体(1:1000,Cell Signaling Technology,Danvers,MA)在4℃孵育过夜。用驴抗兔免疫球蛋白G(IgG)过氧化物酶标记的抗体(GE Healthcare,UK)检测结合的抗体。使用化学发光检测系统(Bio-Rad,California,EEUU)检测过氧化物酶活性。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种患有乳腺癌的患者的预后方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平。
2.一种预测患有乳腺癌的患者的总生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的总生存长度。
3.一种预测乳腺癌患者的局部无病生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的局部无病生存长度。
4.一种受试者中乳腺癌的诊断或预后方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的生物样品；确定所述生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；和当所述表达水平高于标准时进行乳腺癌的诊断或预后。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤包括接触HER2/CB2异聚体结合组合物的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤选自由以下组成的组：共定位方案、免疫共沉淀测定、共振能量转移技术、邻位连接测定和被设计用于检测所述异聚体的特异性探针的使用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤是邻位连接测定(PLA)或生物发光共振能量转移(BRET)测定。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述HER2/CB2异聚体结合组合物包括能够特异性结合HER2/CB2异聚体的抗体。
9.一种试剂盒，所述试剂盒当在根据权利要求1至8中任一项所述的方法中使用时，包括能够检测HER2/CB2异聚体的剂和使用说明。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述剂是HER2/CB2异聚体结合组合物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述HER2/CB2结合组合物包括能够特异性结合HER2/CB2异聚体的抗体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述抗体是多克隆抗体。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。

Claims (15)

1.一种患有乳腺癌的患者的预后方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平。
2.一种预测患有乳腺癌的患者的总生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的总生存长度。
3.一种预测乳腺癌患者的局部无病生存长度的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低总生存的标准进行比较；和从而预测与所述HER2/CB2异聚体的表达水平相关的局部无病生存长度。
4.一种受试者中乳腺癌的诊断或预后方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的生物样品；确定所述生物样品中HER2/CB2异聚体的表达水平；和当所述表达水平高于标准时进行乳腺癌的诊断或预后。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤包括接触HER2/CB2异聚体结合组合物的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤选自由以下组成的组：共定位方案、免疫共沉淀测定、共振能量转移技术、邻位连接测定和被设计用于检测所述异聚体的特异性探针的使用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定HER2/CB2异聚体表达水平的步骤是邻位连接测定(PLA)或生物发光共振能量转移(BRET)测定。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述HER2/CB2异聚体结合组合物包括能够特异性结合HER2/CB2异聚体的抗体。
9.一种试剂盒，所述试剂盒包括能够检测HER2/CB2异聚体的剂和使用说明。
10.一种试剂盒，所述试剂盒用于在根据权利要求1至8中任一项所述的方法中使用，所述试剂盒包括能够检测HER2/CB2异聚体的剂和使用说明。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的试剂盒，其中所述剂是HER2/CB2异聚体结合组合物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述HER2/CB2结合组合物包括能够特异性结合HER2/CB2异聚体的抗体。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述抗体是多克隆抗体。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的试剂盒，其中所述剂是被设计用于检测HER2/CB2异聚体的特异性引物或探针。
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