KR20180099722A - 예측 방법 및 상기 방법에 유용한 키트 - Google Patents

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에두아르도 페레즈 고메즈
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젤다 테라퓨틱스 오퍼레이션즈 피티와이 엘티디
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Abstract

발명은 일반적으로 유방암에 대한 진단, 예측 및 모니터링 방법 및 검정 및 그러한 방법에 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 발명은 유방암에 걸린 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암에 걸린 환자의 예측 방법에 관한 것이다.

Description

예측 방법 및 상기 방법에 유용한 키트
본 발명은 일반적으로 유방암에 대한 진단, 예측 및 모니터링 방법 및 검정 및 그런 방법에 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 출원은 국소성 질환-유리(local disease-free) 생존의 기간의 가능성을 예측하기 위한 HER2/CB2 헤테로머(heteromer) 발현의 사용에 관련된다. 유방암 환자의 전이 가능성, 전체 생존 기간 및 유방암 치료법의 결과의 평가 또한 가능하다. 발명은 추가로 개선된 약물 표적에 관련된다.
유방암은 전세계적으로 가장 빈번한 악성 종양이고 중요한 공중 보건 문제를 대표한다. 질환을 이해함에 있어 진행중인 개선점들에도 불구하고, 유방암은 의학적 중재시술에 대해 대단히 내성인채로 남아 있다. 대부분의 임상 계획은 조기 진단에 집중되고, 이어서 종래 형태의 중재시술, 특히 수술, 방사선, 호르몬 억제, 및 화학요법이 이어진다. 그러한 중재시술은, 특히 종양이 전이가 진행된 환자에서는 성공이 제한된다. 그러므로, 가능한 최소한의 침습성 방식으로 성공적인 치료를 허용할 보다 정확하고 보다 효과적인 정보를 제공하기 위한 진단 도구 및 방법이라는 무기를 개선할 절실한 필요가 있다. 또한 약물 치료를 위한 추가의 및 더 나은 표적을 확인할 것이 지속적으로 요구된다.
과거에, 유방암은 분자 파라미터에 따라 상이한 하위유형들로 분류되었다. 한 가지 하위유형은 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 과잉발현이 특징이고, 모든 유방 암종의 20% 내지 25%를 차지한다. 별도로, HER2+ 유방암에서 CB2가 과잉발현되고, CB2가 HER2 선-종양성 신호전달을 c-SRC 키나아제를 통해 활성화함으로써 종양 생성 및 진행을 촉진한다는 것이 증명되었다. 또한 CB2는 인간 유방암 샘플에서 HER2와 헤테로머를 형성하는 것으로 밝혀졌다.
유방암, 특히 HER2+ 유방암을 진단, 예측 및 모니터링하기 위한 더 나은 도구를 개발하고자 하는 요구가 지속적으로 있다. 또한 새로운 치료 표적을 확인하는 것도 중요하다.
발명자들에 의해 유방암에 걸린 환자에서 HER2/CB2 발현이 국소성 질환-유리 생존과 상관이 있는 것이 발견되었다. 또한 최근에 HER2/CB2가 유방암 세포에서 헤테로머로서 존재하는 것이 발견되었다. 발명자들은 또한 HER2/CB2 헤테로머의 발현이 빈약한 환자 예측과 상관이 있는 것을 밝혔다. 또한 HER2/CB2 헤테로머가 암세포가 △9-테트라하이드로칸나비놀(THC)로 처리될 때 분해되는 것을 밝혔다.
따라서, 제 1 측면으로, 본 발명은 유방암에 걸린 환자의 예측 방법을 제공하며, 방법은 상기 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
제 2 측면으로, 본 발명은 유방암을 가진 환자의 전체 생존 기간을 예측하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 수준을 건강한 개체를 나타내는 또는 더 높거나 더 낮은 전체 생존을 나타내는 표준과 비교하는 단계; 및 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 수준과 관련된 전체 생존 기간을 예측하는 단계를 포함한다.
제 3 측면으로, 본 발명은 유방암 환자의 질환-유리 생존의 기간을 예측하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 수준을 건강한 개체를 나타내는 또는 더 높거나 더 낮은 전체 생존을 나타내는 표준과 비교하는 단계; 및 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 수준과 관련된 질환-유리 생존 기간을 예측하는 단계를 포함한다.
제 4 측면으로, 본 발명은 피험자에서 유방암의 진단 또는 예측 방법을 제공하며, 방법은 피험자의 조직을 제공하는 단계; 조직에서의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 및 발현 수준이 표준보다 높을 때 유방암을 진단 또는 예측하는 단계를 포함한다.
제 1 측면 내지 제 4 측면에서 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 측정하는 단계는 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의할 수 있다. 그러나, 일부 구체예에서, ER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 측정하는 방법은 공동-국지화(co-localization) 프로토콜, 공동-면역침전 검정, 공명 에너지 전달 기법, 근접 결찰 검정이거나, 또는 헤테로머를 검출하기 위해 고안된 특이적 프로브의 사용에 의한 것이다.
제 5 측면으로, 본 발명은 HER2/CB2 헤테로머를 붕괴시킬 수 있는 제약학적 작용제를 투여함으로써 상기 HER+ 유방암을 치료하는 단계를 포함하는, HER+ 유방암의 치료 방법을 제공한다.
제 6 측면으로, 본 발명은 HER2/CB2 헤테로머을 검출할 수 있는 작용제 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 HER2+ 유방 종양(양성 대조군, 상부 패널) 및 HER2- 유방 종양(음성 대조군, 하부 패널)에서 HER2, CB2 및 HER2-CB2 헤테로머 발현을 보여주는 대표적인 영상이다. HER2 및 CB2 염색은 갈색으로 나타나고, 헤테로머 염색은 핑크색으로 나타난다. 세포 핵은 DAPI(청색)로 염색되었다.
도 2는 국소 재발-유리 생존에 대한 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 샘플들은 HER2-CB2 헤테로머 발현에 의해 등급이 매겨졌고 최상의 컷오프를 수동으로 선택함으로써 두 그룹(낮거나 높은 발현)으로 분배되었다.
도 3은 표시된 세포주에서 HER2 및 CB2의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 세포들은 CB2-HA 암호화 플라스미드로 트랜스펙션되었고 4시간 동안 THC로 처리되었다. 그런 다음 HER2는 항-HER2 항체로 면역침전되었고, 블롯은 항-HA 항체로 발생되었다.
도 4는 HCC1954 세포에서 HER2-CB2 헤테로머 발현을 도시한다. 표시된 치료에 대한 반응으로, PLA 실험의 대표적인 영상.
도 5는 HCC1954 세포에서 단백질 발현을 도시한다. THC에 대한 반응으로 총 및 인산화된(즉 활성화된) HER2의 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현 분석.
도 6은 HCC1954 세포에서 HER2-HER2 헤테로머 발현을 도시한다. 표시된 치료에 대한 반응으로, PLA 실험의 대표적인 영상.
본 발명의 방법 및 키트를 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는데, 그것들이 달라질 수 있기 때문인 것이 인지된다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위해서이고, 첨부된 청구범위에 의해 기술될 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아닌 것이 인지되어야 한다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단일한 것을 나타내는 용어들은 맥락이 분명하게 다른 것을 가리키지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것이 주지되어야 한다. 그러므로, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 그러한 세포를 포함하고, "항체"에 대한 언급은 하나 이상의 항체 및 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 그것의 동등물을 포함하는 식이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 인지되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있지만, 방법, 장치 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련되어 사용될 간행물에서 보고된 항체, 단백질, 핵산 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 참조로 본원에 포함된다. 본원에는 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시를 앞서기 위해 자격을 부여받지 않았음을 시인하는 것으로서 해석될 만한 것이 없다.
만약 선행 기술 간행물이 본원에서 언급된다면, 그러한 언급은 간행물이 오스트레일리아 또는 임의의 다른 나라에서, 기술분야의 통상적인 일반 지식의 부분을 형성하는 것이라는 시인을 구성하지 않는 것이 인지되어야 한다.
이어지는 청구범위에서 및 발명의 선행 설명에서, 표현하는 언어 또는 필요한 함축으로 인하여 맥락이 다른 것을 필요로 하는 것을 제외하고, 단어 "(다수가) 포함하다" 또는 "(단수가) 포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로, 즉 명시된 특징의 존재를 명시하지만, 발명의 다양한 구체예에서 추가의 특징의 존재 또는 첨가를 배제하지 않기 위해 사용된다.
본 발명에 따라, 유방암, 특히 HER2+ 유방암에 걸린 환자의 예측을 위한 방법이 제공되는데, 방법은 상기 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 상기 생물학적 샘플을 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 방법은 상기 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 표준과 비교하고, 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 측정된 수준과 관련된 예측을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준은 국소성 질환-유리 생존의 감소된 기간을 가지는 환자와 관련된 것으로 나타났다.
발명의 한 구체예에서, HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준은 진행-유리 생존의 감소된 기간을 가지는 환자와 관련된 것으로 발견되었다.
다른 구체예에서, HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준은 사건-유리 생존의 감소된 기간을 가지는 환자와 관련된 것으로 나타났다.
HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준은 질환 상태를 평가하는 데 단독 인자로서, 또는 림프절 상태, 에스트로겐 수용체 상태, 등을 포함하여 추가의 인자들과 함께 사용될 수 있다.
용어 "진단"은 본원에서 유방암, 특히 HER2+ 유방암에 걸린 환자의 확인을 나타내기 위해 사용된다.
본 출원에서 사용된 "예측"은 한정하는 것은 아니지만, 전체 생존의 기간, 유방암-유리 생존의 기간, 진행-유리 생존, 사건-유리 생존, 환자의 유방암 재발 가능성 및 유방암 전이 가능성을 예측하는 것을 포함하여, 유방암으로부터의 회복 가능성 또는 유방암의 개연성 있는 발생 또는 결과의 예측을 의미한다.
구절 "전체 생존"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 환자의 사망 원인이 직접적으로는 암의 영향으로 인한 것이 아닐 가능성에도 불구하고, 진단 후 환자의 운명을 나타낸다. 구절 "질환-유리 생존"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 모니터링되는 질환이 없는 생활을 의미한다. 예를 들어, 만약 HER2/CB2 헤테로머 발현이 유방암을 진단하거나 모니터링하기 위해 사용된다면, 질환-유리 생존은 검출 가능한 유방암이 없는 것을 의미하게 될 것이다. 구절 "회복 가능성"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 암 진단에 이어서 환자의 회복을 초래하는 종양 소멸 또는 종양 재발의 결핍의 가능성을 나타내며, 여기서 가능성은 발명의 방법에 따라 측정된다. 구절 "재발 가능성"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 암 진단에 이어서 환자에서 종양 재발 또는 전이의 가능성을 나타내며, 여기서 가능성은 발명의 방법에 따라 측정된다. 구절 "사건-유리 생존"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 특정 작용(예컨대 치료) 후 특정 그룹의 규정된 사건(예를 들어 암의 진행)의 발생이 없는 생활을 의미한다. 구절 "진행-유리 생존"은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 환자가 더 나빠지지 않는 질환을 가진 채로 살아가는, 치료 중 및 치료 후 시간의 기간을 나타내며, 치료가 얼마나 잘 작용하고 있는지를 알아내는 것을 돕기 위한 임상 연구 또는 시험에 사용될 수 있다. 용어 "전이"는 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 원래의 암성 종양의 기관과 직접적으로 관련되지 않은 기관 또는 신체 부분에서의 암성 종양의 성장을 나타낸다. 전이는 원래의 암성 종양의 기관과 직접적으로 관련되지 않은 기관 또는 신체 부분에서의 검출할 수 없는 양의 암성 세포의 존재인 미세전이를 포함하는 것으로 인지될 것이다. 그러므로, 본 발명은 유방과 직접적으로 관련되지 않은 기관 또는 신체 부분에서의 하나 이상의 암성 종양의 추가의 성장 위험을 측정하는 방법을 고려한다.
본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 피험자로부터 얻어지고 발명의 과정에 유용한 다양한 샘플 유형을 포함한다. 생물학적 샘플은, 한정하는 것은 아니지만, 고체 조직 샘플, 액체 조직 샘플, 생물학적 유체, 흡인물, 세포 및 세포 단편들을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 구체적 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 수술적 제거에 의해 얻어진 고체 조직 샘플, 병리 표본, 보관된 샘플, 또는 생검 표본, 조직 배양물 또는 그것으로부터 유래된 세포 및 그것들의 자손, 및 이 공급원들 중 임의의 것으로부터 제조된 부분 또는 얼룩을 포함한다. 비-제한적 예는 유방 조직, 림프절, 및 유방 종양으로부터 얻어진 샘플이다. 생물학적 샘플의 전부 또는 일부는 하나 이상의 질환 상태(들)의 특징적인 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "표준"은 다른 데이터의 비교를 위한 토대로서 작용하는 기준이다. 표준은 생물학적 샘플, 생물학적 샘플의 사진 또는 현미경 사진, 또는 생물학적 샘플의 분석으로부터 유래된 정상 범위(예를 들어, 건강한 개체의 범위 내에 있는)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표준은 정상 및/또는 암 조직, 암-유리 조직 또는 양성 대조군으로서 사용하기 위한 다양한 수준의 HER2/CB2 헤테로머 단백질 발현을 함유하는 보관된 병리 샘플, 및 종양 조직 또는 음성 대조군 샘플로서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 보이지 않는 다른 조직, 사진 또는 현미경사진, 또는 상기 샘플로부터 유래된 정상 범위를 포함할 수 있다. 그러한 표준은, 한정하는 것은 아니지만, 질환-유리 및 전체 생존 기간을 예측하는 방법, 진행-유리 생존을 예측하는 방법, 감소된 질환-유리 또는 전체 생존의 위험을 예측하는 방법, 암에 걸린 환자의 회복 가능성을 예측하는 방법, 암 종양을 가진 개체에서 암의 재발 및/또는 전이의 가능성을 예측하는 방법, 암의 재발 위험을 예측하는 방법, 종양 전이의 위험을 측정하기 위해 암에 걸린 환자를 스크리닝하는 방법, 암에 걸린 환자에 대한 치료의 적절한 과정을 측정하는 방법 및 암에 걸린 환자에 대한 치료 과정의 유효성을 모니터링하는 방법을 포함하는 방법들에 사용될 수 있다.
"HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물"은, 한정하는 것은 아니지만, 리간드, 항-HER2/CB2 헤테로머 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하여, HER2/CB2 헤테로머에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 작용제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "HER2/CB2 헤테로머에 결합하는(결합할 수 있는) 작용제"는, 한정하는 것이 아니라, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하여, HER2/CB2 헤테로머 또는 그것의 폴리펩타이드 단편에 특이적으로 결합하고, 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준을 검출하는 임의의 분자를 나타낸다. 그러한 작용제는 바람직하게는 기술분야에 숙련된 자들에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 검출에 대해 표지된다. 표지의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 방사성 표지, 발색단, 형광단, 효소, 결합 모이어티(예컨대 비오틴) 등을 포함한다.
"HER2", "ErbB2", "c-Erb-B2"는 상호교환적으로 사용된다. 다르게 표시되지 않는 한, 용어 "ErbB2", "c-Erb-B2" 및 "HER2"는 본원에서 사용될 때 인간 단백질을 나타낸다. 인간 ErbB2 유전자 및 ErbB2 단백질은, 예를 들어 Semba et al., PNAS(USA) 82:6497-650(1985) 및 Yamamoto et al. Nature 319:230-234(1986)(Genbank 승인 번호 X03363)에서 기술된다. HER2에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 미국 특허 번호 5,677,171; 5,772,997; Fendly et al., Cancer Res., 50: 1550-1558(1990)에서 개시되고; 하이브리도마 세포주(ATCC CRL 10463)에 의해 생성된 HER2 단클론성 항체 4D5, 하이브리도마 세포주(ATCC 번호 PTA-5262)에 의해 생성된 HER2 단클론성 항체 6B3, 하이브리도마 세포주 HB-11601 및 HB-11602에 의해 생성된 ErbB2 단클론성 항체; 등이 있다.
단클론성 및 다클론성 둘 다인, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 HER2/CB2 헤테로머 단백질 또는 그것의 폴리펩타이드 단편에 결합하는 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물로서 사용될 수 있다. 또한 본원에서 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물로서 고려되는 것은 HER2/CB2 헤테로머에 특이적으로 결합하는 단백질의 첨가(예컨대 GST 도메인 또는 GFP 도메인의 첨가), 또는 서열 변형(예컨대 부위-특이적 돌연변이생성), 등에 의한 임의의 돌연변이이다.
용어 항체는 본원에서 한정하는 것은 아니지만 인간 및 비-인간 다클론성 항체, 인간 및 비-인간 단클론성 항체(mAb), 키메라 항체, 항-이디오타입 항체(항-IdAb) 및 인간화된 항체를 포함한다.
용어 항체는 또한 무상 분자뿐 아니라 그것의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab).sub.2, Fab', F(ab').sub.2, Fd, Fd', Fv 및 scFv, 항원에 결합할 수 있는 단일 사슬 항체(천연 또는 재조합)를 포함하는 것을 의미한다. 항체 또는 항원 결합 성분은 용액으로 있거나 지지체(플레이트, 비드, 자기 비드, 등)에 부착될 수 있다.
항체 또는 항체의 단편은 형광 현미경 검출, 유동 세포분석 검출 또는 형광 검출이 있는, 형광 표지된 항체를 사용하는 유용한 면역형광 기법일 수 있다. 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 반응은 기술분야에 잘 알려져 있는 면역검정 방법에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 항체는 조직 샘플 또는 생검에서 HER2/CB2 헤테로머 단백질의 인시튜 검출을 위해 광 현미경, 영상, 면역형광 또는 면역전자 현미경에서와 같이 조직학적으로 사용될 수 있다. 인시튜 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 제거하고 본 발명의 적절하게 표지된 항체를 적용함으로써 이루어질 수 있다.
생물학적 샘플은 니트로셀룰로오스 또는 세포 또는 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고체 지지체와 같은 고체상 지지체 또는 담체로 처리될 수 있다. 지지체는 다음에 세척되고 이어서 검출 가능하게 표지된 항-HER2/CB2 헤테로머 항체로 처리될 수 있다. 이어서 지지체가 세척되어 미결합 항체가 제거된다. 상기 지지체에 결합된 표지의 양은 다음에 종래 수단에 의해 검출될 수 있다. 고체상 지지체는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체, 예컨대 한정하는 것은 아니지만 유리, 폴리스티렌 폴리프로필렌, 나일론, 변형 셀룰로오스, 또는 폴리아크릴아미드인 것으로 의도된다. 다르게는, 항원은 용액으로 있을 수 있고 항체는 지지체(플레이트, 비드, 자기 비드, 등)에 부착된다.
주어진 로트의 항체의 HER2/CB2 헤테로머 단백질에의 결합 활성은 잘 알려져 있는 방법에 따라 측정될 수 있다. 기술분야의 숙련자들은 기본적인 실험을 사용함으로써 각 측정을 위한 작동 가능하고 최적의 검정 조건을 결정할 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 발명은 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 검출함으로써 HER2+ 유방암을 예측하기 위한 방법을 제공한다.
발명의 바람직한 구체예는 HER2+ 유방암에 걸린 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하고, 상기 수준을 건강한 개체를 나타내는 또는 HER2+ 유방암-유리 생존의 더 높거나 더 낮은 기간을 나타내는 표준과 비교하며, 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 수준과 관련된 HER2+ 유방암-유리 생존의 기간을 예측함으로써, HER2+ 유방암에 걸린 환자의 HER2+ 유방암-유리 생존 기간을 예측하는 방법을 제공하며, 여기서 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준은 유방암-유리 생존의 감소된 길이와 관련된다.
발명의 또 다른 구체예에서, 종양 발생의 조기 단계에서 HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준을 측정하는 방법이 제공된다. 종양 발생의 다양한 단계들은 예를 들어 Markman,(1997), Basic Cancer Medicine에서 예시되는 것과 같이 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.
HER2/CB 2 헤테로머 발현의 수준 측정
HER2/CB2 헤테로머 발현의 측정은 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, HER2/CB2 헤테로머 발현 수준은 공동-국지화 프로토콜, 공동-면역침전 검정, 공명 에너지 전달 기법, 근접 결찰 검정을 사용하여, 또는 헤테로머를 검출하기 위해 고안된 특이적 프로브의 사용에 의해 측정될 수 있다.
근접 검정은 분자 복합체의 생물학적 역할의 이해와, 뿐만 아니라 생체마커의 연구에서 점점 더 유용해진다. 예를 들어, HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물은 HER2/CB2 헤테로머의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 상이한 많은 검출 시스템과 연결될 수 있는 HER2/CB2 헤테로머에 특이적으로 결합하는 조성물이다. HER2/CB2 헤테로머의 양을 측정하기에 유용한, 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 임의의 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그러한 방법은, 한정하는 것은 아니지만, Foerster 공명 에너지 전달(FRET), 생물발광 공명 에너지 전달(BRET), 생체분자 형광 상보, 근접 결찰 검정(PLA) 및 신틸레이션 근접 검정(SPA)을 포함한다.
HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준은 또한 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물을 사용하여 HER2/CB2 헤테로머 단백질의 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다. HER2/CB2 헤테로머 단백질 수준의 검출은, 한정하는 것은 아니지만, 화학발광 방법, 조직화학적 염색 또는 생화학적 검출(즉, 면역-조직화학적 검정), 웨스턴 블롯 분석, 유동 세포분석, 면역-침전(또는 비-항체 작용제에 대한 그것의 동등물), 플라즈몬 공명 흡광도 측정, 등을 포함하여, 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, HER2/CB2 헤테로머 단백질 수준의 검출 방법은 적어도 하나의 항체의 사용을 포함하는 면역검정(예컨대 ELISA)이다. 발명의 또 다른 구체예에서, 조직 샘플에서, 예를 들어 포르말린-고정된, 파라핀-삽입된 조직 부분의 HER2/CB2 헤테로머 염색이 항-HER2/CB2 헤테로머 항체를 사용하는 면역-조직화학에 의해 수행되고, HER2/CB2 헤테로머의 발현이 측정된다.
환자의 분류
본원에서 사용되는 용어 "유방암"은 관상피내암(관내 암종), 소엽성 상피내암, 침습성(또는 침윤성) 관 암종, 침습성(또는 침윤성) 소엽 암종, 염증성 유방암, 삼중 음성 유방암, 유두의 파제트병, 엽상 종양, 혈관육종 또는 침습성 유방 암종을 포함한다. 일부 구체예에서, 침습성 유방 암종은 추가로 하위유형으로 분류된다. 일부 구체예에서, 하위유형은 선양 낭성(또는 샘낭성) 암종, 저급 선편평세포 암종, 수질 암종, 점액(또는 콜로이드질) 암종, 유두 암종, 세관 암종, 화생성 암종, 미세유두 암종 또는 혼합 암종을 포함한다. 바람직하게 본원에서 사용되는 용어는 HER2+ 유방암을 나타낸다.
용어 "유방암에 걸린 환자"는 인간 피험자가 본원에서 정의된 유방암을 가지는 것으로서 진단된 것을 의미한다.
환자는 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 표준에 대해 비교함으로써 분류될 수 있다. 예를 들어, 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정한 후에, 측정된 수준이 표준에 비교된다. 이 표준은 환자의 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 평가하기 위해 사용된 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 환자 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준이 표준의 그것보다 더 높을 때, 환자 샘플은 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준을 가지는 것으로 여겨질 것이다. 반대로, 다른 구체예에서, 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준이 표준의 그것보다 더 낮을 때, 샘플은 HER2/CB2 헤테로머 발현의 낮은 수준을 가지는 것으로 여겨질 것이다.
다른 구체예에서, 환자는 주어진 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현과 관련된 "점수"가 배정될 수 있다. 샘플은 유방암의 진단 또는 모니터링 중에 "점수"를 받을 수 있다. 점수 배정은 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준에 의해 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준은, 상대적으로 더 낮은 점수가 주어지는 ER2/CB2 헤테로머 발현의 낮은 수준과 비교하여 더 높은 점수가 주어진다. 점수 배정은 또한 면역조직화학에 의해 샘플을 육안으로 검사함으로써 결정될 수 있다. 다른 구체예에서, 더 정량적인 점수 배정은 둘 이상의 파라미터, 예를 들어 (i) 염색의 세기 및 (ii) 샘플링되는 염색된("양성") 세포의 비율을 측정하는 것을 포함한다. 이런 다중 파라미터를 기반으로, 양성 염색의 증가하는 수준을 반영하는 점수가 배정될 수 있다.
그러므로, 한 구체예에서, 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준과 관련된 점수가, 표준 또는 대조군으로서 사용된 없거나, 낮은 또는 상승된 수준의 HER2/CB2 헤테로머 발현을 가지는 세포 중의 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준과 관련된 점수에 비교될 수 있다. 그러한 비교는 환자의 더 나은 예측에 대한 기초를 제공할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 발명의 방법은 0 내지 3+의 규모를 사용함으로써 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준에 점수를 매길 수 있는데, 여기서 0은 음성이고(검출 가능한 HER2/CB2 헤테로머 발현이 없음), 1+ 및 2+는 각각 약한 및 약한 내지 중간 염색과 관련되며, 3+는 종양 세포의 10% 이상에서 높은 세기 염색과 관련되고; 더 낮은 점수는 환자의 더 나은 예후를 나타낸다.
다양한 수준의 HER2/CB2 헤테로머를 발현하는 환자의 예측은 단일 변량 또는 다중-변량 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 이 방법들은 하나 이상의 변량과 주어진 결과 사이의 상관 가능성을 측정한다. 한 구체예에서, 방법은 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준(또는 다른 변수와 연결된 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준)과 유방암 환자의 질환-유리 또는 전체 생존 사이의 상관 가능성을 측정할 것이다. 이 분석들을 수행하기 위해 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 다수의 방법들 중 임의의 한 방법이 사용될 수 있다. 단일 변량 분석의 예는 카플란-마이어 방법 또는 로그-순위 테스트이다. 다중-변량 분석의 예는 콕스 비례-위험 회귀 모델이다. 발명의 방법은 추가의 유방암 마커와 함께 HER2/CB2 헤테로머 발현 의 수준을 분석하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 콕스 비례 비율은 다양한 수준의 HER2/CB2 헤테로머 발현을 가진 환자에 대한 질환-유리 및 전체 생존에 대한 위험 비율 또는 위험을 제공한다.
카플란 및 마이어의 방법을 사용하는 생존 분석은 암 시험에 사용하기 위한 권장된 통계적 기법이다. 그것은 연구에 대한 모집 후에 환자 생존 시간의 분포를 분석함으로써 적용된다. 분석은 이것들을 모집 후 최대 주어진 시간 동안 여전히 살아있는 환자의 비율 면에서 표현한다. 그래프 상에서 보면, 시간에 따른 생존하는 환자의 비율의 도표는 특징적인 감소(종종 기하급수적임)를 나타내며, 곡선의 가파른 정도는 연구되는 치료의 효율을 가리킨다. 생존 곡선이 더 얕을수록, 치료는 더 효과적이다. 카플란-마이어 분석은 두 상이한 치료와 관련된 생존 곡선들 사이의 차이의 통계학적 유의미성을 테스트하기 위해 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 환자로부터 얻어진 샘플 중의 HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준이 측정되고 표준과 비교된 후에, 환자는 다음에 질환-유리 또는 전체 생존의 특정 가능성을 가지는 그룹으로 분류된다. 그런 다음 환자에 대한 질환-유리 또는 전체 생존의 가능성이 그 그룹의 환자에 대한 질환-유리 또는 전체 생존의 가능성을 기준으로 평가된다. 예를 들어, 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플은 표준에 비해 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준을 가지는 것으로 측정될 수 있다. 이 환자는 다음에 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상승된 수준을 가지는 환자 그룹으로 분류될 수 있을 것이다. 본 발명에 따르면, HER2/CB2 헤테로머의 상승된 수준을 발현하는 환자 그룹에 대해 질환-유리 또는 전체 생존 기간이 감소되는 것으로 발견되었기 때문에, 암에 걸린 특정 환자는 감소된 기간의 질환-유리 또는 전체 생존을 가지는 것으로 여겨질 수 있을 것이다.
키트
본 검출 방법은 바람직하게 임의의 종래의 테스트 키트 포맷으로 수행된다. 예를 들어, 면역검정은 고체 포획, 경쟁, 또는 샌드위치 면역검정일 수 있다.
고체상 포획 면역검정 테스트 키트는 HER2/CB2 헤테로머에 결합할 수 있고 검출을 허용하기 위한 표지를 가지는 항체, 및 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 테스트 키트의 일부로서 고체이거나 또는 그것과 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 검출 방법에 이용될 때, 항체는 테스트 샘플과 접촉된다. 그 결과의 혼합물은 복합체가 지지체에 결합되도록 고체 지지체와 접촉된다. 그런 다음 미결합 물질의 제거 후에 항체가 검출될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 형태에서, HER2/CB2 헤테로머 항체와 테스트 샘플의 혼합물은 복합체가 친화성 매트릭스에 결합하도록 친화성 매트릭스와 접촉될 수 있다. 미결합 물질의 제거 후에, 복합체는 친화성 매트릭스로부터 용출되고, 고체 지지체와 접촉되고 거기에 흡착되는 것이 허용된다. 친화성 매트릭스는 또한 복합체에 결합하고, 그로써 샌드위치 및 경쟁 포맷의 테스트 샘플-HER2/CB2 헤테로머 항체 혼합물의 나머지로부터 복합체를 분리시키는 데 사용될 수 있다. 각각에서, 복합체는 계속해서 친화성 매트릭스로부터 용출되고 고체 지지체와 흡수성 접촉될 수 있다.
면역검정 테스트 키트 포맷들 중 임의의 포맷으로 사용된 고체 지지체는 그러한 키트에서 종래적으로 이용된 임의의 수불용성, 물 현탁성 고체 물질일 수 있다. 적합한 예는 폴리머 막, 플라스틱 또는 유리 비드, 시험관, 또는 미세역가 플레이트이다. 복합체의 결합 물질은 공유 결합 또는 흡착에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 시험관 또는 미세역가 플레이트가 이용될 때, 그러한 결합은 이 캐리어들의 내벽에서 일어난다.
경쟁 및 샌드위치 면역검정 테스트 키트에서, 고체 지지체에 이미 결합된 결합 물질을 가진 키트가 판매될 수 있다. 고체 지지체 표면에 대한 그러한 적용은 고체 지지체와 결합 물질을 접촉시키고 그러한 접촉을 결합 물질의 제 1 영역이 고체 지지체에 결합하는 것을 허용할 충분한 시간 동안 유지함으로써 이루어진다. 전형적으로, 그러한 접촉은 1 내지 18시간, 바람직하게는 4시간이 걸린다. 그런 다음 부착되지 않은 결합 물질은 불용화된 결합 물질(즉, 고체 지지체에 결합된 물질)로부터 분리되고 그런 다음 고체 지지체는 세척된다.
세 가지 면역검정 테스트 키트 포맷 모두에서, 테스트 샘플 및 HER2/CB2 헤테로머 항체는 서로 접촉하도록 놓이며 결합을 허용하는 충분한 시간 동안 인큐베이션되는 것이 허용되다. 전형적으로, 그러한 결합은 2시간이 걸린다. 그러한 접촉은 바람직하게 테스트 샘플 및 HER2/CB2 헤테로머 항체 혼합물과 고체 지지체와의 접촉으로 이어진다. 고체상 포획 검정을 위해, 복합체는 고체 지지치에 직접 결합하는 한편, 경쟁 검정 또는 샌드위치 면역검정에서는 복합체는 고체 지지체에 간접적으로(즉, 결합 물질을 통해) 결합한다. 본 발명의 세 가지 면역검정 테스트 키트 포맷 모두에 대해, 인큐베이션되는 충분한 시간이 허용된 후에, 잔류하는 테스트 샘플 및 HER2/CB2 헤테로머 항체 혼합물은 고체 지지체에 결합된 불용화 물질로부터 분리된다. 불용성 물질이 다음에 세척된다.
특정 문제 또는 환경에 대한 본 발명의 교시의 적용은 본원에 함유된 교시의 관점에서 기술분야의 숙련자의 역량 내에 있을 것임이 인지되어야 한다. 본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의하여 더 충분하게 예시된다.
실시예 1: HER2+ 유방암에서 예측 도구로서의 HER2/CB 2 헤테로머 발현
HER2-CB2 헤테로머의 발현을 1999년과 2013년 사이에 12 de Octubre 병원(스페인 마드리드)에서 수술한 사례들에 상응하는 57개의 HER2+ 유방암 샘플을 함유하는 조직 마이크로어레이(TMA)에서 분석하였다. 발현 분석을 근접 결찰 검정에 의해, Duolink II 인시튜 PLA 검출 키트(Olink, Bioscience, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 공초점 현미경 하에서 관찰하였고, 적색 형광 신호(헤테로머에 상응함)를 ImageJ 소프트웨어로 처리하였다. 샘플을 HER2-CB2 헤테로머 발현에 의해 순위를 매겼고, 최상의 컷오프를 수동으로 선택하였다.
먼저, 본 발명자들은 HER2, CB2 및 HER2-CB2 헤테로머에 대한 대조군 염색을 수행하였다(도 1 참조). 두 번째로, 본 발명자들은 PLA 신호(핑크색 점/PLA-양성 세포의 수)에 의해 샘플의 순위를 매겼고, 환자 예측과 관련된 임상 파라미터와의 잠재적 관련성을 분석하였다. 도 2에서 나타낸 것과 같이, 본 발명자들은 높은 헤테로머 발현과 더 낮은 국소 재발-유리 생존 사이의 유의미한 상관관계를 발견하였다.
실시예 2: THC의 작용 메커니즘
본 발명자들은 앞서 THC가, 항-종양 반응을 나타내는 농도에서 사용될 때, BT474 세포에서 HER2-CB2 헤테로머를 붕괴시키는 것을 보고하였다. 실시예 1에서 논의한 것과 같이, 본 발명자들은 근접 결찰 검정(PLA) 및 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 검정을 사용하여 이 효과들을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 동일한 세포주에서 HER2의 부수적인 분해를 관찰하였는데, 그것은 THC가 HER2-CB2 헤테로머를 붕괴하고 HER2를 탈안정화시킴으로써 항증식 효과를 유도한다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 두 상이한 HER2+ 유방암 세포주(BT474 및 HCC1954)에서, THC가 상이한 기법(공동-면역침전, 공동-IP)에 의해 HER2-CB2 헤테로머를 붕괴하는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
본 발명자들은 또한 SR2(선택적 CB2 길항제)가 THC-유도된 헤테로머 붕괴를 차단하는 것을 보이는 HCC1954 세포에서 PLA를 수행하였다. 이 관찰들은 THC가 CB2에 대한 작용에 의해 헤테로머를 파괴하는 것을 확인해준다(도 4).
본 발명자들은 앞서 BT747 세포에서 THC 치료시에 HER2의 분해를 관찰한 바 있다. 본 발명자들은 이제 HCC1954 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 이런 관찰을 확인하였다(도 5).
본 발명자들은 THC가 HER2-CB2 뿐만 아니라 HER2-HER2 다이머(HER2+ 유방암에서 종양 진행을 유발하는 매우 잘 알려져 있는 신호전달 복합체)를 붕괴시키는 것을 보이는 PLA를 수행하였다. 이 데이터는 도 6에 나타낸다.
방법 및 물질
세포, 세포 배양물, 및 트랜스펙션
BT474 및 HCC1954 인간 유방 선암종 세포를 10% FBS, 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 유지시켰다.
인시튜 근접 결찰 검정(PLA)
세포를 유리 커버슬립에서 성장시키고 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 후, 20 mm 글리신을 함유하는 PBS로 세척하고, 0.05% 트리톤 X-100을 함유하는 동일 완충액으로 투과성이 되게 한 후, 계속해서 PBS로 세척하였다. HER2-CB2R 헤테로머를 Duolink 인시튜 Probemarker 키트(Olink, Bioscience, Uppsala, Sweden)를 사용하여 검출하였다. 37℃에서 1시간 동안 차단 용액과 함께 예열된 항온 항습기에서 인큐베이션한 후에, 세포를 밤새 항체 희석 배지에서 동등한 양의, 플러스 PLA 프로브에 직접 결합된 토끼 항-CB2 항체(1:50, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 및 마이너스 PLA 프로브에 직접 결합된 토끼 항-HER2항체(1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US)의 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척 완충액 A로 실온에서 세척하고 예열된 항온 항습기에서 30분 동안 37℃에서 결찰 용액(Duolink II 결찰 스톡, 1:5, 및 Duolink II 결찰효소, 1:40)과 함께 인큐베이션하여 두 DNA 프로브의 어닐링 및 결찰을 유도하였다. 증폭을 형광 뉴클레오타이드를 함유한 Duolink II 검출 시약 적색 키트로 수행하였다. 실온에서 세척 완충액 B로 철저하게 세척한 후, 세포를 DAPI를 포함한 마운팅(mounting) 배지를 사용하여 마운팅하였다. 샘플을 Leica SP2 공초점 현미경(Leica Microsystems, Mannheim, Germany) 하에서 관찰하였다. 적색 형광 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 처리하였다. PLA는 두 수용체가 두 상이한 항체-DNA 프로브가 결찰되는 것을 허용할 수 있도록 충분히 가깝게(<17 nm) 있을 것을 필요로 한다(Soerberg et al.,(2008), Methods., 45: 227-232; Trifilieff et al.,(2011), BioTechniques, 51: 111-118). 만약 수용체들이 충분히 근접해 있으면, 점모양의 형광 신호가 공초점 현미경에 의해 검출될 수 있다.
웨스턴 블롯팅
HCC1954 세포를 프로테아제 억제제(펩스타틴, 류펩틴, 아프로티닌, 퀴모스타틴, 안티페인 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드)와 포스파타제 억제제(Na3VO4 및 NaF; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)의 칵테일을 함유하는, RIPA 완충액(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트)로 처리하였다. 소듐 도데실 설페이트-10% 폴리아크릴아미드 환원 겔에 의해 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)에 옮겼다. 그것을 5% 탈지유 및 1% 소혈청 알부민으로 차단한 후, 막을 1:500으로 희석한 항-ErbB2 항 혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)과 함께 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체는 염소 항-토끼 면역글로불린 G(IgG) 과산화효소-표지된 항체(Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif.)로 드러냈다. 화학발광 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J)을 사용하여 과산화효소를 드러냈다. 대조군을 1:5,000으로 희석된 항-액틴 단클론성 항체(MAb; Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)와 이어서 1:4,000으로 희석된 항-마우스 IgG 과산화효소-표지된 항체(Zymed)로 수행하였다.
공동-면역침전 검정
HCC1954 및 BT474 세포를 pcDNA3-HA-hCB2 또는 상응하는 빈 벡터(pcDNA3)로, 융합 HD 트랜스펙션 시약(Promega, Madison, WI)을 사용하여 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 48시간 후에, 세포를 3 μM THC 또는 상응하는 비히클(DMSO)로 4시간 동안 처리하고, 공동-면역침전을 위한 특이적 완충액(40 mM Hepes pH 7.5, 120 mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM 소듐 피로포스페이트, 10 mM 소듐 글리세로포스페이트, 50 mM 소듐 플루오라이드, 0.5 mM 소듐 오르토바나데이트, 0.3% CHAPS 및 새롭게 1 mM 벤즈아미딘 및 0.1 mM PMSF로 보충됨)을 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물(1 mg)을 5 μL의 단백질 G-세파로오스에 공유 연결된 5 μg의 항-ErbB2 항체(Neu C-18, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US)를 사용하여 면역침전시켰다. 면역침전 후, 단백질을 SDS-10% 폴리아크릴아미드 환원 겔에 의해 분리하고 PVDF 막에 옮겼다. 그것을 TBST 중의 5% 중량/부피 탈지 분유로 차단한 후, 막을 항-ErbB2 항체(1:1000) 및 항-HA 항체(1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 당나귀 항-토끼 면역글로불린 G(IgG) 과산화효소-표지된 항체(GE Healthcare, UK)로 검출하였다. 화학발광 검출 시스템((Bio-Rad, California, EEUU)을 사용하여 과산화효소 활성을 검출하였다.

Claims (15)

  1. 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암에 걸린 환자의 예측 방법.
  2. 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 수준을 건강한 개체를 나타내는 또는 더 높거나 더 낮은 전체 생존을 나타내는 표준과 비교하는 단계; 및 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 수준과 관련된 전체 생존 기간을 예측하는 단계를 포함하는, 유방암을 가진 환자의 전체 생존 기간을 예측하는 방법.
  3. 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 수준을 건강한 개체를 나타내는 또는 더 높거나 더 낮은 전체 생존을 나타내는 표준과 비교하는 단계; 및 그로써 HER2/CB2 헤테로머 발현의 상기 수준과 관련된 국소성 질환-유리 생존 기간을 예측하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 국소성 질환-유리 생존의 기간을 예측하는 방법.
  4. 피험자로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 생물학적 샘플에서 HER2/CB2 헤테로머 발현 수준을 측정하는 단계; 및 발현 수준이 표준보다 높을 때 유방암을 진단 또는 예측하는 단계를 포함하는, 피험자에서 유방암의 진단 또는 예측 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 측정하는 단계는 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 측정하는 단계는 공동-국지화 프로토콜, 공동-면역침전 검정, 공명 에너지 전달 기법, 근접 결찰 검정 및 헤테로머를 검출하기 위해 고안된 특이적 프로브의 사용으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HER2/CB2 헤테로머의 발현 수준을 측정하는 단계는 근접 결찰 검정(PLA) 또는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 검정인 것인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물은 HER2/CB2 헤테로머에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 것인, 방법.
  9. HER2/CB2 헤테로머를 검출할 수 있는 작용제 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한, HER2/CB2 헤테로머를 검출할 수 있는 작용제 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 작용제는 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물인 것인, 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 HER2/CB2 헤테로머 결합 조성물은 HER2/CB2 헤테로머에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 것인, 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체는 다클론성 항체인 것인, 키트.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인 것인, 키트.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 HER2/CB2 헤테로머를 검출하기 위해 고안된 특이적 프라이머 또는 프로브인 것인, 키트.
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