JP2023552755A - 頭部コンピュータ断層撮影スキャンの結果が外傷性脳損傷（ｔｂｉ）に関して陰性の対象においてｔｂｉを判定するための１種以上のバイオマーカーの使用 - Google Patents

頭部コンピュータ断層撮影スキャンの結果が外傷性脳損傷（ｔｂｉ）に関して陰性の対象においてｔｂｉを判定するための１種以上のバイオマーカーの使用 Download PDF

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Abstract

本願では、ヒト対象等の対象から採取した試料中で、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせ等の少なくとも１種のバイオマーカーの値を検出することにより、対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有するか否かの判定を補助する方法が開示され、前記対象は、頭部ＣＴスキャンを受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性である。

Description

本開示は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）等の頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われる対象の診断と評価を補助する方法に関する。前記方法は、対象が頭部の損傷を生じた時点、又は生じた可能性がある時点、又は生じたことが疑われる時点から２４時間以内の１時点以上で前記対象から採取した１種以上の試料中で、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせ等の少なくとも１種のバイオマーカーの値を検出する工程を含み、前記対象は、（臨床的に適切な時間枠内で）それと同時、その前又はその後に頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンも受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性であり、更に前記方法は、前記試料中の１種以上のバイオマーカーの値が参照値よりも高いならば、前記対象がＴＢＩを有する可能性の方が高いと診断する工程を含む。
米国だけでも毎年５００万件を超える軽度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が発生している。現在のところ、患者評定を助長するのに利用可能な簡単・客観的・正確な測定法は存在しない。実際に、ＴＢＩ評価及び診断の多くは主観的データに基づいている。残念ながら、頭部ＣＴやグラスゴーコーマスコア（Ｇｌａｓｃｏｗ Ｃｏｍａ Ｓｃｏｒｅ：ＧＣＳ）等の客観的測定は、軽度ＴＢＩを評価するにはさほど包括的又は高感度ではない。更に、頭部ＣＴは、現時点では大半の場合に軽度ＴＢＩを検出できず、高価であり、患者を不必要な放射線に曝露する。また、頭部ＣＴが陰性でも、患者が脳震盪を起こしている疑いがなくなったという意味ではなく、外科処置等の所定の介入が不可欠ではないという意味に過ぎない。臨床医と患者は、適切なトリアージと回復を促進するようにこの状態を正確に評価するために客観的で信頼できる情報を必要とする。現在までのところ、患者評価及び管理を補助するように急性ケア状況でＵＣＨ－Ｌ１及びＧＦＡＰを使用するために利用可能なデータは限られている。
軽度ＴＢＩ又は脳震盪は、客観的に検出することが非常に難しく、世界中の救急治療室で日々の課題である。脳震盪は、通常では出血等の肉眼所見を生じず、従来の脳のコンピュータ断層撮影スキャンでは異常ないが、急激な神経細胞機能障害を生じ、数日～数週間で自然に解消する。軽度ＴＢＩ患者の約１５％は、持続的な認知機能障害を患う。現場、救急治療室及びクリニック、スポーツ領域、並びに軍事行動（例えば、戦闘）における軽度ＴＢＩ犠牲者にはアンメットニーズがある。
脳損傷の重症度の現在の評定用アルゴリズムとしては、グラスゴーコーマスケールスコア及び他の尺度が挙げられる。これらの尺度は、急性重症度に関しては十分な場合もあるが、微妙な病理には感度が不十分であり、持続的障害に繋がりかねない。ＧＣＳ及び他の尺度は、損傷の種類を識別することもできず、十分であるとは思われない。例えば、臨床試験に参加して同じＧＣＳレベルにグループ分けされた患者でも、損傷の重症度と種類が著しく不均一になる可能性がある。それに伴ってアウトカムも変動するため、不適切な分類は臨床試験の整合性を損なう。損傷の分類が改善されるならば、臨床試験におけるＴＢＩ患者の疾患重症度及び種類をより的確に見分けることができるであろう。
また、現在の脳損傷試験は、拡張版グラスゴーアウトカムスケール（Ｇｌａｓｃｏｗ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃａｌｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ）等のアウトカム尺度に依存しており、包括的現象を捉えるが、アウトカムの微妙な差を評定できない。このため、脳損傷治療の試験に連続して３０回失敗している。
治療及び予防を試験するためには、患者が脳損傷からどの程度回復しているかを判定するための高感度のアウトカム尺度が必要である。
１態様において、本開示は、頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われるヒト対象等の対象の診断と評価を補助する方法の改善に関する。このような改善方法は、（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施される頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを、同時又は逐次実施する工程を含み、前記改善は、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む。
更に別の態様では、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と前記参照値を相関させる。
別の態様において、上記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象をＴＢＩについて経過観察する工程を含む。別の態様において、前記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む。更に別の態様において、前記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施した後、前記対象を経過観察する工程を含む。
上記改善方法の更に別の態様では、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内に、前記試料を採取することができる。例えば、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１２分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約２０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１．５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の２時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の４時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の７時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の８時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の９時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１０時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１１時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１２時間以内に、前記試料を採取することができる。
１実施形態では、上記改善方法を使用し、ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、軽度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、中等度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、中等度～重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。更にまた別の実施形態では、上記改善方法を使用し、ＴＢＩをもたないとして前記対象を評定又は評価する。
上記改善方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定又は評価されたヒト対象等の対象にＴＢＩ治療（例えば、外科処置、治療処置、又はその組み合わせ）を施す工程を含むことができる。当技術分野で公知であり、本願に更に記載する任意のこのような治療を使用することができる。更に、別の実施形態では、ＴＢＩの治療中の任意の対象を任意に治療クール中又は治療クール後に経過観察することもできる。あるいは、前記方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定された対象（例えば、まだ治療を受けていなくてもよい対象）を経過観察する工程を含むことができる。
上記改善方法において、前記試料は、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択することができる。血液試料は、全血試料、血清試料、又は血漿試料を含むことができる。所定の実施形態において、前記試料は、全血試料である。所定の実施形態において、前記試料は、血漿試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、血清試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、唾液試料である。更にまた他の実施形態において、前記試料は、口咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記試料は、鼻咽頭検体である。このような試料は、種々の方法で取得することができる。例えば、前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部損傷を生じた後に、前記試料を取得することができる。あるいは、前記対象が火炎、化学物質、毒素又は化学物質と毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得することができる。化学物質又は毒素の例は、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである。更に、前記試料は、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得することができる。
上記改善方法は、対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩのいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値及び／又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、並びに前記対象が頭部損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、ヒト対象等の任意の対象で実施することができる。
上記改善方法において、前記アッセイは、イムノアッセイである。所定の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。
別の態様において、本開示は、頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われるヒト対象等の対象の診断と評価を補助する方法に関する。前記方法は、
ａ．（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施される頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを、同時又は逐次実施する工程と；
ｂ．前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む。
更に別の態様では、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と前記参照値を相関させる。
別の態様において、上記方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象をＴＢＩについて経過観察する工程を含む。別の態様において、前記方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む。更に別の態様において、前記方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施した後、前記対象を経過観察する工程を含む。
上記方法の更に別の態様では、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内に、前記試料を採取することができる。例えば、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１２分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約２０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１．５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の２時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の４時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の７時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の８時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の９時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１０時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１１時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１２時間以内に、前記試料を採取することができる。
１実施形態では、上記方法を使用し、ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記方法を使用し、軽度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記方法を使用し、中等度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記方法を使用し、重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記方法を使用し、中等度～重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。更にまた別の実施形態では、上記方法を使用し、ＴＢＩをもたないとして前記対象を評定又は評価する。
上記方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定又は評価されたヒト対象等の対象にＴＢＩ治療（例えば、外科処置、治療処置、又はその組み合わせ）を施す工程を含むことができる。当技術分野で公知であり、本願に更に記載する任意のこのような治療を使用することができる。更に、別の実施形態では、ＴＢＩの治療中の任意の対象を任意に治療クール中又は治療クール後に経過観察することもできる。あるいは、前記方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定された対象（例えば、まだ治療を受けていなくてもよい対象）を経過観察する工程を含むことができる。
上記方法において、前記試料は、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択することができる。所定の実施形態において、前記試料は、全血試料である。血液試料は、全血試料、血清試料、又は血漿試料とすることができる。所定の実施形態において、前記試料は、血漿試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、血清試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、唾液試料である。更にまた他の実施形態において、前記試料は、口咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記試料は、鼻咽頭検体である。このような試料は、種々の方法で取得することができる。例えば、前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部損傷を生じた後に、前記試料を取得することができる。あるいは、前記対象が火炎、化学物質、毒素又は化学物質と毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得することができる。化学物質又は毒素の例は、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである。更に、前記試料は、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得することができる。
上記方法は、対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩのいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値及び／又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、並びに前記対象が頭部損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、ヒト対象等の任意の対象で実施することができる。
上記方法において、前記アッセイは、イムノアッセイである。所定の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。
更にまた別の態様において、本開示は、頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のあるヒト対象等の対象の診断と評価を補助する方法の改善に関する。前記改善は、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイを実施する工程を含み、前記改善は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施された頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが、ＴＢＩに関して陰性であるか、又は前記対象に頭部ＣＴスキャンが実施されていないならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む。
更に別の態様では、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と前記参照値を相関させる。
別の態様において、上記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、任意に、頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、その結果がＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象をＴＢＩについて経過観察する工程を含む。別の態様において、前記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、任意に、前記頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、その結果がＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む。更に別の態様において、前記改善方法は更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、任意に、前記頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、その結果がＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施した後、前記対象を経過観察する工程を含む。
上記改善方法の更に別の態様では、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内に、前記試料を採取することができる。例えば、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約１２分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１５分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約２０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６０分以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１．５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の２時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の３時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の４時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の５時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の６時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の７時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の８時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の９時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１０時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１１時間以内に、前記試料を採取することができる。あるいは、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の１２時間以内に、前記試料を採取することができる。
１実施形態では、上記改善方法を使用し、ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、軽度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、中等度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。別の実施形態では、上記改善方法を使用し、中等度～重度ＴＢＩを有するとして前記対象を評定又は評価する。更にまた別の実施形態では、上記改善方法を使用し、ＴＢＩをもたないとして前記対象を評定又は評価する。
上記改善方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定又は評価されたヒト対象等の対象にＴＢＩ治療（例えば、外科処置、治療処置、又はその組み合わせ）を施す工程を含むことができる。当技術分野で公知であり、本願に更に記載する任意のこのような治療を使用することができる。更に、別の実施形態では、ＴＢＩの治療中の任意の対象を任意に治療クール中又は治療クール後に経過観察することもできる。あるいは、前記方法は更に、軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有するとして評定された対象（例えば、まだ治療を受けていなくてもよい対象）を経過観察する工程を含むことができる。
上記改善方法において、前記試料は、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択することができる。血液試料は、全血試料、血清試料、又は血漿試料とすることができる。所定の実施形態において、前記試料は、全血試料である。所定の実施形態において、前記試料は、血漿試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、血清試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、唾液試料である。更にまた他の実施形態において、前記試料は、口咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記試料は、鼻咽頭検体である。このような試料は、種々の方法で取得することができる。例えば、前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部損傷を生じた後に、前記試料を取得することができる。あるいは、前記対象が火炎、化学物質、毒素又は化学物質と毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得することができる。化学物質又は毒素の例は、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである。更に、前記試料は、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得することができる。
上記改善方法は、対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩのいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値及び／又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、並びに前記対象が頭部損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、ヒト対象等の任意の対象で実施することができる。
上記改善方法において、前記アッセイは、イムノアッセイである。所定の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイである。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は全血である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血清である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は血漿である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は唾液である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、ポイントオブケアアッセイであり、前記対象はヒトであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、臨床化学検査であり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。更に他の実施形態において、前記アッセイは、単分子検出アッセイであり、前記試料は、口咽頭検体又は鼻咽頭検体である。
図１Ａ～Ｄは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のグラスゴーコーマスコア（ＧＣＳ）重症度（即ち、ＧＣＳ軽度対中等度／重度）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から１２時間以内（図１Ａ、１Ｃ）又は損傷から２４．１時間以内（図１Ｂ、１Ｄ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図１Ａ及び図１Ｂに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図１Ｃ及び図１Ｄに示す。 図１Ａ～Ｄは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のグラスゴーコーマスコア（ＧＣＳ）重症度（即ち、ＧＣＳ軽度対中等度／重度）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から１２時間以内（図１Ａ、１Ｃ）又は損傷から２４．１時間以内（図１Ｂ、１Ｄ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図１Ａ及び図１Ｂに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図１Ｃ及び図１Ｄに示す。 図１Ａ～Ｄは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のグラスゴーコーマスコア（ＧＣＳ）重症度（即ち、ＧＣＳ軽度対中等度／重度）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から１２時間以内（図１Ａ、１Ｃ）又は損傷から２４．１時間以内（図１Ｂ、１Ｄ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図１Ａ及び図１Ｂに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図１Ｃ及び図１Ｄに示す。 図１Ａ～Ｄは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のグラスゴーコーマスコア（ＧＣＳ）重症度（即ち、ＧＣＳ軽度対中等度／重度）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から１２時間以内（図１Ａ、１Ｃ）又は損傷から２４．１時間以内（図１Ｂ、１Ｄ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図１Ａ及び図１Ｂに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図１Ｃ及び図１Ｄに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失（即ち、有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は２４．１時間以内（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果（即ち、陽性か陰性か）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は２４．１時間以内（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。 図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は２４．１時間以内（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。
詳細な説明
本開示は、（例えば、軽度、中等度、重度又は中等度～重度ＴＢＩ等の）外傷性脳損傷等の頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われるヒト対象が、任意に臨床的に適切な時間枠内で少なくとも１回の頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性である場合に、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせ等のバイオマーカーを使用して前記対象の診断と評価を補助する改善方法に関する。
本願に記載する方法は、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷の約２４時間以内の時点でヒト対象等の対象から採取した１種以上の試料中の１種以上のバイオマーカー値を検出する工程を含む。任意に、頭部ＣＴスキャンを実施する場合には、同時又は任意の順序で逐次実施することができ、対象から採取した１種以上の試料中の１種以上のバイオマーカー値を検出すると同時、その前、又はその後に実施することができる。前記対象が任意に頭部ＣＴスキャンを受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性である場合に、ＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等の１種以上のバイオマーカーの値が参照値よりも高値で検出されると、ヒト対象等の対象がＴＢＩを有する可能性の方が高いと正確に評価又は診断し易くなる。換言するならば、所定の態様において、本願に記載する改善方法は、ＴＢＩを生じているが、１回以上の頭部ＣＴスキャンの結果のみに基づいてＴＢＩを生じていないと誤って診断された可能性のある対象を同定することができる。
本セクションで使用するセクション見出しと、本願の開示内容全体は、単に体系化の目的に過ぎず、限定的なものではない。
１．定義
本願中で他の定義のない限り、本願で使用する科学技術用語は、当技術分野における通常の知識を有する者に広く理解されている意味とする。矛盾する場合には、定義を含めて本願に従う。好ましい方法と材料について以下に記載するが、本発明の実施又は試験には、本願に記載するものと同様又は等価の方法及び材料を使用することができる。本願中に言及する全刊行物、特許出願、特許及び他の参考資料は、その開示内容全体を本願に援用する。本願に開示する材料、方法及び実例は、例証に過ぎず、限定的なものではない。
本願で使用する場合に「含む」、「包含する」、「有している」、「有する」、「できる」、「含有する」なる用語とその変形は、他の行為又は構造の可能性を排除しない拡張可能な暫定的語句、用語又は単語を意味する。文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、単数形の不定冠詞、「及び」及び定冠詞は複数の言及を含む。明確に記載しているか否かに拘わらず、本開示は、本願に示す実施形態又は構成要素「を含む」、「から構成される」及び「から本質的に構成される」他の実施形態も想定する。
本願中で数値範囲を指定する場合には、範囲内の同一精度の各数値が明確に想定される。例えば、６～９の範囲では、６と９に加えて７と８の数値も想定され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数値が明確に想定される。
「親和性成熟抗体」とは、本願では、１個以上のＣＤＲに１箇所以上の改変を含み、その結果、改変箇所のない親抗体に比較して標的抗原に対する抗体の親和性（即ち、ＫＤ、ｋｄ又はｋａ）が改善された抗体を表すために使用される。典型的な親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルレベルの親和性を有するであろう。バイオディスプレイ法を使用して作製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニングをはじめとして、親和性成熟抗体の種々の作製方法が当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟について記載している。Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０－３３１９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）には、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が記載されている。米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号には、選択的突然変異誘発位置及び活性増強アミノ酸残基との接触位置又は超突然変異位置における選択的突然変異が記載されている。
本願で使用する場合に「アナログアッセイ」とは、反応混合物全体（例えば、単一反応容器）において被検体により発生される総シグナル（例えば、蛍光、色等）を測定することにより、被検試料中の被検体の存在及び／又は濃度を測定するアッセイを意味する。アナログアッセイでは、ノイズをシグナルから識別できない。アナログアッセイの１例は、単一反応容器に含まれる複数のビーズ又は微粒子から発生される総シグナルを測定することにより、被検体の存在及び／又は濃度を測定するアッセイである。
本願で使用する場合に「抗体」及び「複数の抗体」とは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分ヒト化抗体）、限定されないが、鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）、サメ、クジラ、及び非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス等）又は非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー等）を含む哺乳動物等の動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、シングルドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合により連結されたＦｖ（「ｓｄＦｖ」）、及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、デュアルドメイン抗体、デュアル可変ドメイン（ＤＶＤ）又はトリプル可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（デュアル可変ドメイン免疫グロブリンとその作製方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２９０－１２９７（２００７）及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２００１／０５８９５６に記載されており、各々その開示内容を本願に援用する）、並びに以上のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片を意味する。抗体としては、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、即ち、被検体結合部位を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスとすることができる。簡略にするために、本願では、被検体に対する抗体を「抗被検体抗体」又は単に「被検体抗体」（例えば、抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又はＵＣＨ－Ｌ１抗体）と呼ぶことが多い。
本願で使用する場合に「抗体断片」とは、抗原結合部位又は可変領域を含む無傷の抗体の一部分を意味する。前記一部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の重鎖定常ドメイン（即ち、抗体イディオタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１個だけ含む一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１個だけ含む一本鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチドが挙げられる。
「曲線下面積」又は「ＡＵＣ」とは、ＲＯＣ曲線の下の面積を意味する。ＲＯＣ曲線の下のＡＵＣは、正確性の尺度である。ＡＵＣが１であるならば、試験は完全であり、ＡＵＣが０．５であるならば、試験は意味がない。好ましいＡＵＣとしては、少なくとも約０．７００、少なくとも約０．７５０、少なくとも約０．８００、少なくとも約０．８５０、少なくとも約０．９００、少なくとも約０．９１０、少なくとも約０．９２０、少なくとも約０．９３０、少なくとも約０．９４０、少なくとも約０．９５０、少なくとも約０．９６０、少なくとも約０．９７０、少なくとも約０．９８０、少なくとも約０．９９０、又は少なくとも約０．９９５が挙げられる。
「ビーズ」と「粒子」は、本願では同義に使用され、実質的に球状の固相担体を意味する。ビーズ又は粒子の１例は、微粒子である。本願で使用することができる微粒子は、当技術分野で公知の任意の種類とすることができる。例えば、前記ビーズ又は粒子は、磁気ビーズ又は磁性粒子とすることができる。磁気ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体とすることができる。典型的な強磁性材料としては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、及びＮｉＯ／Ｆｅが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ・Ｆｅ２Ｏ３）が挙げられる。ビーズは、磁性の固体コア部分を有することができ、その周囲に１層以上の非磁性層が配置されている。あるいは、磁性部分を非磁性コアの周囲の層とすることもできる。微粒子は、本願に記載する方法で機能する任意の寸法とすることができ、例えば、約０．７５～約５ｎｍ、又は約１～約５ｎｍ、又は約１～約３ｎｍとすることができる。
「結合タンパク質」とは、本発明では、例えば、ポリペプチド、抗原、化合物若しくは他の分子、又は任意種類の基質等の結合パートナーと結合して複合体を形成する単量体若しくは多量体タンパク質を表すために使用される。結合タンパク質は、結合パートナーと特異的に結合する。結合タンパク質としては、抗体とその抗原結合断片に加え、当技術分野で公知であり、以下に記載するような他の種々の形態とその誘導体、及び抗原分子若しくは抗原分子上の特定部位（エピトープ）と結合する１個以上の抗原結合ドメインを含む他の分子が挙げられる。したがって、結合タンパク質としては、限定されないが、抗体、四量体免疫グロブリン、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ１分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、及び抗原結合能を維持するいずれかのこのような抗体の断片が挙げられる。
「二重特異性抗体」とは、本願では、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７－５４０（１９８３）参照）、２種の異なるモノクローナル抗体の化学的共役（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４（６０１２）：６２８－６３１（１９８５）参照）、又はＦｃ領域に突然変異を導入するノブ・イントゥ・ホール法（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）若しくは同様のアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４－６４４８（１９９３）参照）により作製され、複数の異なる免疫グロブリン種を生じ、そのうちの１種のみが機能的な二重特異性抗体となるような全長抗体を表すために使用される。二重特異性抗体は、その２本の結合アームの一方においてある抗原（又はエピトープ）と結合し（第１のＨＣ／ＬＣ対）、その第２のアームにおいて別の抗原（又はエピトープ）と結合する（別のＨＣ／ＬＣ対）。この定義によると、二重特異性抗体は、（特異性とＣＤＲ配列の両方において）異なる２本の抗原結合アームを有しており、それらが結合する各抗原に対して一価である。
「ＣＤＲ」とは、本願では、抗体可変配列内の「相補性決定領域」を表すために使用される。重鎖と軽鎖の可変領域の各々に３個のＣＤＲが存在する。可変領域の各々について、これらの領域は、重鎖又は軽鎖のＮ末端から順に「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と呼ばれる。本願で使用する場合に「ＣＤＲセット」なる用語は、抗原と結合する単一の可変領域に存在する３個１組のＣＤＲを意味する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖可変領域の各々からのＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含むことができる。１個のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３）を含むポリペプチドを「分子認識単位」と呼ぶ場合もある。抗原と抗体の複合体の結晶構造解析の結果、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原と広い抗原接触部を形成し、重鎖ＣＤＲ３との抗原接触部が最も広いことが立証された。したがって、分子認識単位が、主に抗原結合部位の特異性を担っていると思われる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に作用するのに直接的且つ最も実質的に関与する。
これらのＣＤＲの厳密な境界は種々のシステムに従って種々に定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１））により記載されているシステムは、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを提供するのみならず、３個のＣＤＲを定義する厳密な残基境界も提供する。これらのＣＤＲを「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ」と呼ぶ場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の所定のサブ部分が、アミノ酸配列レベルでは多様性が大きいにも拘らず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとることを見出した。これらのサブ部分は、「Ｌ１」、「Ｌ２」、及び「Ｌ３」、又は「Ｈ１」、「Ｈ２」、及び「Ｈ３」と呼ばれ、「Ｌ」及び「Ｈ」は、夫々軽鎖領域と重鎖領域を表す。これらの領域を「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」と呼ぶ場合もあり、その境界は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３－１３９（１９９５）と、ＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２（５）：７３２－７４５（１９９６）に記載されている。本願に記載するシステムの１種に厳密に従わないかもしれないが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする更に他のＣＤＲ境界定義もあり、特定の残基若しくは残基群又はＣＤＲ全体でさえも抗原結合に有意に影響を与えないという予想又は実験結果に鑑み、短縮又は延長してもよい。本願で使用する方法は、これらのシステムのいずれに従って定義されたＣＤＲも利用することができるが、所定の実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに定義されるＣＤＲを使用する。
「臨床的に適切な時間枠」とは、慎重且つ賢明な医療従事者（例えば、医師、看護師、パラメディック等）が１種以上のバイオマーカー試験の結果を頭部ＣＴスキャン等の画像法に関連付けられると妥当に判断するのに要する時間枠（例えば、秒、分、又は時間）、又は監督団体（例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）等の標準制定機関、医師審査会、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ等の規制承認当局等）により制定されたガイドラインに従う時間枠を意味する。
「コンポーネント」、「複数のコンポーネント」、又は「少なくとも１種のコンポーネント」とは、一般に、本願に記載する方法及び当技術分野で公知の他の方法に従い、患者尿、全血、血清又は血漿試料等の被検試料のアッセイ用キットに含むことができる捕捉抗体、検出抗体又はコンジュゲート、キャリブレーター、対照、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、（例えば、溶液としての）基質、停止溶液等を意味する。一部のコンポーネントは溶液とすることができ、又はアッセイで使用時に再構成するように凍結乾燥することができる。
本願で使用する場合に「～に相関」とは、～に比較することを意味する。
本願で使用する場合に「ＣＴスキャン」とは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを意味する。ＣＴスキャンは、種々の角度から撮影した一連のＸ線画像を集合し、コンピュータ処理を使用して体内の骨、血管及び軟組織の断面画像又はスライスを作成する。ＣＴスキャンは、Ｘ線ＣＴ、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴスキャン）、又はコンピュータ支援断層撮影を使用することができる。ＣＴスキャンは、コンベンショナルＣＴスキャンでもよいし、スパイラル／ヘリカルＣＴスキャンでもよい。コンベンショナルＣＴスキャンでは、例えば、腹部の最上部から骨盤に向かって、スライス毎にスキャンし、スライス後毎にスキャンが停止し、次のスライスに移動する。コンベンショナルＣＴスキャンでは、移動によるアーチファクトを避けるために患者は息を止める必要がある。スパイラル／ヘリカルＣＴスキャンは螺旋状に撮影される連続スキャンであり、著しく迅速な方法であり、スキャン画像は連続的である。
頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われる対象から撮影された画像に頭蓋内病変が認められないとき、頭部ＣＴスキャンは、ＴＢＩに関して「陰性」である。更に明確に説明すると、病変が検出又は確認されないとき、対象の頭部ＣＴスキャンはＴＢＩに関して「陰性」であるが、頭部ＣＴが陰性でも、対象がまだ（例えば、ＴＢＩの）症状を患っている場合がある。全ての損傷又は病変を頭部ＣＴにより可視化することはできないので、大半の対象は、頭部ＣＴでＴＢＩに関して陰性になるであろう。したがって、本願に記載する方法及びアッセイは、頭部ＣＴが陰性であるが、ＴＢＩを有する可能性がある対象の評定又は判定を提供するために使用することができる。
「アッセイにより測定される」とは、本願では、任意の適切なアッセイによる参照値の測定を表すために使用される。参照値の測定は、所定の実施形態では、対象からの試料に適用しようとするアッセイと同一種のアッセイにより（例えば、イムノアッセイ、臨床化学検査、単分子検出アッセイ、タンパク質免疫沈降法、免疫電気泳動法、化学分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析若しくはタンパク質免疫染色法、電気泳動分析、タンパク質アッセイ、競合結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等のクロマトグラフィー若しくはスペクトロメトリー法により）実施することができる。参照値の測定は、所定の実施形態では、対象からの試料に適用しようとするアッセイと同一種のアッセイにより同一のアッセイ条件下で実施することができる。本願中で言及するように、本開示は、（例えば、種々の時点の参照値を比較することにより計算される）典型的な参照値を提供する。本開示により提供される記載に基づき、他のアッセイのアッセイ特異的参照値を得るように本願の開示を他のアッセイに適応させることは、当技術分野における通常の知識を有する者が十分になし得る範囲内である。例えば、頭部の損傷を生じていることが分かっているヒト対象から取得した試料（より特定的には、（ｉ）軽度ＴＢＩ、及び／又は（ｉｉ）中等度、重度、若しくは中等度～重度ＴＢＩを生じていることが分かっているヒト対象から取得した試料）と、頭部の損傷を生じていないことが分かっているヒト対象から取得した試料を含む１組のトレーニング試料を使用し、アッセイ特異的参照値を得ることができる。当然のことながら、「アッセイにより測定され」、指定レベルの「感度」及び／又は「特異度」を有する参照値とは、本願では、前記参照値を本発明の方法で採用するときに指定感度及び／又は特異度を提供するように決定された参照値を表すために使用される。例えば、複数の異なる可能な参照値を使用してアッセイデータの繰り返し統計分析により、本発明の方法で所定の参照値に関連する感度と特異度を決定することは、当技術分野における通常の知識を有する者が十分になし得る範囲内である。
実際に、外傷性脳損傷を有する対象と外傷性脳損傷をもたない対象、又は軽度外傷性脳損傷を有する対象と中等度、重度、若しくは中等度～重度外傷性脳損傷を有する対象を識別する際に、当業者は、カットオフ値の上昇が感度と特異度に及ぼす影響を比較考量するであろう。カットオフ値の高低は、感度及び特異度と、他の標準統計尺度に明確且つ予想可能な影響を及ぼすであろう。カットオフ値を上げると、特異度は改善されるが、感度（疾患の試験結果が陽性の対象の割合）は低下する可能性があることはよく知られている。他方、カットオフ値を下げると、感度は改善されるが、特異度（疾患の試験結果が陰性の対象の割合）は低下するであろう。それに伴い、外傷性脳損傷の検出結果又は軽度に対する中等度、重度、若しくは中等度～重度外傷性脳損傷の判定結果がどうなるかは、当業者に容易に予想されよう。対象が外傷性脳損傷を有するか否か、又は軽度に対して中等度、重度、若しくは中等度～重度外傷性脳損傷を有するかを識別する際に、カットオフ値が高いほど、外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度～重度外傷性脳損傷を有する対象から真陰性（即ち、外傷性脳損傷をもたない対象、軽度外傷性脳損傷をもたない対象、中等度外傷性脳損傷をもたない対象、重度外傷性脳損傷をもたない対象、又は中等度～重度外傷性脳損傷をもたない対象）が識別されるので、特異度は改善する。しかし、それと同時に、カットオフ値を上げると、陽性として同定される対象の合計数と、真陽性数が減少するので、感度は低下する。逆に、カットオフ値が低いほど、外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度～重度外傷性脳損傷をもたない対象から真陽性（即ち、外傷性脳損傷を有する対象、軽度外傷性脳損傷を有する対象、中等度外傷性脳損傷を有する対象、重度外傷性脳損傷を有する対象又は中等度～重度外傷性脳損傷を有する対象）が識別されるので、感度は改善する。しかし、それと同時に、カットオフ値を下げると、陽性として同定される対象の合計数と、偽陽性数が増加するので、特異度は低下する。
一般に、感度値が高いと、当業者は、疾患又は病態（例えば、外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度～重度外傷性脳損傷）を除外診断し易く、特異度値が高いと、当業者は、疾患又は病態を確定診断し易い。当業者が疾患を除外診断したいか又は確定診断したいかは、エラーの種類毎に患者の帰結がどのようになるかに依存する。したがって、数値がどのように選択されたかという基本的な情報が完全に開示されない限り、試験カットオフ値を誘導するために利用される厳密なバランスを認識又は予想することはできない。感度と特異度及び他の因子のバランスは、ケースバイケースで異なるであろう。このため、場合によっては、医師又は医療従事者が選択できるような代替カットオフ（例えば、参照）値を提供することが好ましい。
本願で使用する抗体の「誘導体」とは、真の抗体又は親抗体に比較してそのアミノ酸配列に１箇所以上の修飾を有しており、改変ドメイン構造を示す抗体を意味することができる。誘導体は、天然抗体に認められる典型的なドメイン構造と、標的（抗原）と特異的に結合することが可能なアミノ酸配列をとることができる。抗体誘導体の典型例は、他のポリペプチドと結合させた抗体、再配置された抗体ドメイン、又は抗体の断片である。誘導体は更に、少なくとも１種の他の化合物、例えば、タンパク質ドメインを含むことができ、前記タンパク質ドメインは、共有又は非共有結合により連結されている。前記連結は、当技術分野で公知の方法に従う遺伝子融合に基づくことができる。抗体を含む融合タンパク質に存在する付加ドメインは、フレキシブルリンカーにより連結することが好ましく、ペプチドリンカーが有利であり、前記ペプチドリンカーは、付加タンパク質ドメインのＣ末端と抗体のＮ末端の間、又は抗体のＣ末端と付加タンパク質ドメインのＮ末端の間の距離に対応するために十分な長さのペプチド結合した複数の親水性アミノ酸を含む。抗体は、生物学的活性や、例えば、固相担体、生体活性物質（例えば、サイトカイン又は成長ホルモン）、化学物質、ペプチド、タンパク質、若しくは薬物との選択的結合に適した構造を有するエフェクター分子と連結することができる。
本願で使用する場合に「デジタルアッセイ」とは、（例えば、試料中の被検体の存在及び／又は濃度を検出するために）被検体を捕捉し、被検体の分子を分離・解析するアッセイを意味する。デジタルアッセイでは、ノイズがシグナルから分離される。デジタルアッセイでは、結果が１又は０の数値に割り当てられる。デジタルアッセイの例としては、（オーバーラップしてもよいが、相互に排他的ではない）以下のアッセイ、即ち、単分子検出アッセイ、ナノウェルアッセイ、単分子酵素免疫測定法、直接捕捉計数アッセイ等の１種以上が挙げられる。
「乱用薬物」とは、本願では、（例えば、気晴らし及び／又は向精神作用等の）医療以外の理由で摂取される１種以上の（薬物等の）付加的物質を表すために使用される。このような乱用薬物の過剰な耽溺、使用又は依存を「物質乱用」と言うことが多い。乱用薬物の例としては、アルコール、バルビツール酸系薬物、ベンゾジアゼピン、大麻、コカイン、幻覚剤（例えば、ケタミン、メスカリン（ペヨーテ）、ＰＣＰ、サイロシビン、ＤＭＴ及び／又はＬＳＤ）、メタカロン、オピオイド、アンフェタミン（メタンフェタミンを含む）、アナボリックステロイド、吸入剤（即ち、例えば、亜硝酸塩、スプレー塗料、クリーニング液、マーカー、接着剤等の向精神性を有する揮発性物質を含有する物質）及びその組み合わせが挙げられる。
「デュアル特異性抗体」とは、本願では、その２本の結合アームの各々において２種の異なる抗原（又はエピトープ）と結合する（１対のＨＣ／ＬＣ）ことが可能な全長抗体を表すために使用される（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０２７７３参照）。したがって、デュアル特異性結合タンパク質は、同一の特異性と同一のＣＤＲ配列をもつ２本の同一の抗原結合アームを有しており、結合する各抗原に対して二価である。
「デュアル可変ドメイン」とは、本願では、二価（２個の抗原結合部位）、四価（４個の抗原結合部位）、又は多価結合タンパク質のいずれでもよい結合タンパク質上の２個以上の抗原結合部位を表すために使用される。ＤＶＤは、単一特異的、即ち、１個の抗原（又は１個のエピトープ）と結合することが可能であってもよいし、多重特異的、即ち、２個以上の抗原（即ち、同一標的抗原分子の２個以上のエピトープ又は異なる標的抗原の２個以上のエピトープ）と結合することが可能であってもよい。好ましいＤＶＤ結合タンパク質は、２本の重鎖ＤＶＤポリペプチドと２本の軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含み、「ＤＶＤ免疫グロブリン」又は「ＤＶＤ－Ｉｇ」と呼ばれる。したがって、このようなＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質は、四量体であり、ＩｇＧ分子と同様であるが、ＩｇＧ分子よりも多くの抗原結合部位を提供する。即ち、四量体ＤＶＤ－Ｉｇ分子の各半分は、ＩｇＧ分子の半分と同様であり、重鎖ＤＶＤポリペプチドと軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むが、ＩｇＧ分子の１対の重鎖及び軽鎖が単一の抗原結合ドメインを提供するのに対して、ＤＶＤ－Ｉｇの１対の重鎖及び軽鎖は、２個以上の抗原結合部位を提供する。
ＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質の各抗原結合部位は、ドナー（「親」）モノクローナル抗体に由来することができ、したがって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、抗原結合部位１個当たり合計６個のＣＤＲが抗原結合に関与する。したがって、２個の異なるエピトープ（即ち、２個の異なる抗原分子の２個の異なるエピトープ又は同一抗原分子の２個の異なるエピトープ）と結合するＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質は、第１の親モノクローナル抗体に由来する抗原結合部位と、第２の親モノクローナル抗体に由来する抗原結合部位を含む。
ＤＶＤ－Ｉｇ結合分子のデザイン、発現及び特性決定については、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号、米国特許第７，６１２，１８１号、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５：１２９０－１２９７（２００７）に記載されている。このようなＤＶＤ－Ｉｇ分子の好ましい１例は、構造式ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－Ｃ－（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであり、但し、ＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１であるが、１が好ましい）を含む重鎖と、構造式ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－Ｃ－（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであり、但し、ＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず、ｎは０又は１であるが、１が好ましい）を含む軽鎖を含む。このようなＤＶＤ－Ｉｇは、２本のこのような重鎖と２本のこのような軽鎖を含むことができ、各鎖は、可変領域間に定常領域を介さずにタンデムに連結された可変ドメインを含み、重鎖と軽鎖は会合してタンデムな機能的抗原結合部位を形成し、１対の重鎖及び軽鎖は、別の対の重鎖及び軽鎖と会合し、４個の機能的抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成することができる。別の例において、ＤＶＤ－Ｉｇ分子は、可変ドメイン間に定常領域を介さずにタンデムに連結された３個の可変ドメイン（ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３）を各々含む重鎖及び軽鎖を含むことができ、１対の重鎖及び軽鎖は会合して３個の抗原結合部位を形成することができ、１対の重鎖及び軽鎖は別の対の重鎖及び軽鎖と会合して６個の抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成することができる。
好ましい１実施形態において、ＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質は、その親モノクローナル抗体の結合相手と同一の標的分子と結合するのみならず、その親モノクローナル抗体の１種以上が有する１種以上の望ましい特性も有する。このような付加特性は、親モノクローナル抗体の１種以上の抗体パラメーターであることが好ましい。その親モノクローナル抗体の１種以上に由来するＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質に付与することができる抗体パラメーターとしては、限定されないが、抗原特異性、抗原親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、タンパク質安定性、タンパク質可溶性、産生効率、免疫原性、薬物動態、生体利用性、組織交差反応性、及びオルソロガスな抗原結合が挙げられる。
ＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＵＣＨ－Ｌ１の少なくとも１個のエピトープと結合する。ＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質の非限定的な例としては、ＵＣＨ－Ｌ１の１個以上のエピトープと結合するＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質、ヒトＵＣＨ－Ｌ１のエピトープと別の生物種（例えば、マウス）のＵＣＨ－Ｌ１のエピトープとに結合するＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質、及びヒトＵＣＨ－Ｌ１のエピトープと別の標的分子のエピトープとに結合するＤＶＤ－Ｉｇ結合タンパク質が挙げられる。
本願で使用する場合に「ダイナミックレンジ」とは、アッセイ読み出し値が被分析試料中の標的分子又は被検体の量に比例する範囲を意味する。
「エピトープ」、又は「複数のエピトープ」、又は「着目エピトープ」とは、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的部位と結合することができる任意の分子上の部位を意味する。分子と特異的結合パートナーは、特異的結合対を形成する。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、（限定されないが、糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖等の）糖鎖抗原、又は多糖上に存在することができる。その特異的結合パートナーは、限定されないが、抗体とすることができる。
本願で使用する場合に「断片抗原結合断片」又は「Ｆａｂ断片」とは、抗原と結合し、１個の抗原結合部位と、１本の完全な軽鎖と、１本の重鎖の一部を含む抗体の断片を意味する。Ｆａｂは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片である。Ｆａｂは、重鎖と軽鎖の各々の１個の定常ドメインと１個の可変ドメインから構成される。可変ドメインは、単量体のアミノ末端に１組の相補性決定領域を含むパラトープ（抗原結合部位）を含む。したがって、Ｙ字の各アームは、抗原上のエピトープと結合する。Ｆａｂ断片は、例えば、免疫グロブリン単量体を切断して２個のＦａｂ断片と１個のＦｃ断片にするために使用することができる酵素パパインを使用して当技術分野で記載されているように作製することもできるし、組換え手段により作製することもできる。
本願で使用する場合に「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、ヒンジ領域の一部を無傷のままにしながらＦｃ領域の大半を除去するように全長ＩｇＧ抗体のペプシン消化により作製された抗体を意味する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合により相互に連結された２個の抗原結合Ｆ（ａｂ）部分を有するため、二価であり、約１１０ｋＤａの分子量を有する。二価抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）は、全長ＩｇＧ分子よりも短く、組織に浸透し易いため、免疫組織化学においてより良好な抗原認識を助長する。Ｆ（ａｂ’）２断片を使用すると、生細胞上のＦｃ受容体又はプロテインＡ／Ｇとの非特異的結合も避けられる。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗原と結合し、浸透することができる。
本願で使用する場合に「フレームワーク」（ＦＲ）又は「フレームワーク配列」とは、可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を意味することができる。ＣＤＲ配列の厳密な定義は種々のシステム（例えば、上記参照）により決定することができるので、フレームワーク配列の意味も、それに応じて種々に解釈される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）は更に、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４個のサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に配置され、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に配置され、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に配置される。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４として指定しない限り、それ以外で言及されるフレームワーク領域は、１本の天然免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲ全体を表す。本願で使用する場合、ＦＲは、４個のサブ領域の１個を表し、ＦＲｓは、フレームワーク領域を構成する４個のサブ領域の２個以上を表す。
当技術分野で公知の技術を使用して非ヒト抗体をヒト化するために重鎖及び軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列（又は単に「アクセプター」配列）として使用することができるヒト重鎖及び軽鎖ＦＲ配列は、当技術分野で公知である。１実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、Ｖ－ｂａｓｅ（ハイパーテキストトランスファープロトコル：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）等の公共データベース又は国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（Ｒ）（ＩＭＧＴ（Ｒ））情報システム（ハイパーテキストトランスファープロトコル：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｓ／ＩＭＧＴレパートリー／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）にリストされているフレームワーク配列から選択される。
本願で使用する場合に「機能的抗原結合部位」とは、標的抗原と結合することが可能な結合タンパク質（例えば、抗体）上の部位を意味することができる。抗原結合部位の抗原結合親和性は、親結合タンパク質（例えば、抗原結合部位が由来する親抗体）ほど強くなくてもよいが、抗原との結合能は、タンパク質（例えば、抗原と結合する抗体）を評価する方法として知られている種々の方法のいずれか１種を使用して測定可能でなければならない。更に、多価タンパク質（例えば、多価抗体）の抗原結合部位の抗原結合親和性は、本願では、定量可能な程度に同一である必要はない。
「ＧＦＡＰ」とは、本願では、グリア線維性酸性タンパク質を表すために使用される。ＧＦＡＰは、ヒトにおいてＧＦＡＰ遺伝子によりコードされ、（例えば、他の生物種で組換え手段により）作製することができるタンパク質である。
「ＧＦＡＰ状態」とは、（ＧＦＡＰの単回測定等による）ある時点におけるＧＦＡＰの値若しくは量、（ＧＦＡＰ量の増減を確認するために対象で実施される反復試験等による）経過観察に関連するＧＦＡＰの値若しくは量、（一次性脳損傷及び／又は二次性脳損傷のいずれかに関係なく）外傷性脳損傷の治療に関連するＧＦＡＰの値若しくは量又はその組み合わせを意味することができる。
本願で使用する場合に「グラスゴーコーマスケール」又は「ＧＣＳ」とは、脳損傷を生じている患者における意識レベルの障害を評定するための実用的方法を提供する（例えば、１９７４年にＧｒａｈａｍ Ｔｅａｓｄａｌｅ ａｎｄ Ｂｒｙａｎ Ｊｅｎｎｅｔｔ，Ｌａｎｃｅｔ １９７４；２：８１－４により記載された）１５点満点のスケールを意味する。この試験は、最良運動反応、言語反応及び開眼反応を以下の点数で測定する。Ｉ．最良運動反応（６点－２部分要求に従う；５点－首への刺激に対して鎖骨の上に手を動かす；４点－急に肘を曲げるが、目立った異常は示さない；３点－肘を曲げ、明白に目立った異常を示す；２点－肘を伸ばす；１点－腕／脚の運動なし、妨害因子なし；ＮＴ－麻痺又は他の制限因子）；ＩＩ．言語反応（５点－名前、場所及び日付を正しく言える；４点－見当識を失っているが、会話は成り立つ；３点－聞き取れるシングルワード；２点－呻き／唸り声のみ；１点－聞こえる反応なし、妨害因子なし；ＮＴ－会話を妨害する因子）；及びＩＩＩ．開眼（４－刺激前に開眼；３点－話しかけ又は大声の呼びかけ後；２点－指先刺激後；１点－全く開眼せず、妨害因子なし；ＮＴ－局所因子による閉眼）。最終的なスコアは、Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの点数を加算することにより決定される。ＧＣＳスコアが１３～１５であるならば、対象は軽度ＴＢＩを有するとみなされる。ＧＣＳスコアが９～１２であるならば、対象は中等度ＴＢＩを有するとみなされる。ＧＣＳスコアが８以下、一般的に３～８であるならば、対象は重度ＴＢＩを有するとみなされる。
本願で使用する場合に「グラスゴーアウトカムスケール」とは、患者状態を死亡、植物状態、重度障害、中等度障害又は回復良好の５つのカテゴリーの１つに等級付けする機能的アウトカムのグローバルスケールを意味する。「拡張版グラスゴーアウトカムスケール」又は「ＧＯＳＥ」は、本願では同義に使用し、表１に示すように重度障害、中等度障害及び回復良好のカテゴリーを下位と上位のカテゴリーに細分することにより８つのカテゴリーのより詳細な分類を提供する。
Figure 2023552755000002
「ヒト化抗体」とは、本願では、非ヒト生物種（例えば、マウス）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、「ヒト様」となるように、即ち、ヒト生殖細胞系列可変配列とより類似するように、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部を改変させた抗体を表すために使用される。「ヒト化抗体」は、着目抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログ、若しくは断片である。ＣＤＲに関して本願で使用する「実質的に」なる用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％一致するアミノ酸配列を有するＣＤＲを意味する。ヒト化抗体は、少なくとも１個、一般的には２個の可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。１実施形態において、ヒト化抗体は更に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインを含む。前記抗体は更に、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及びＣＨ４領域を含むことができる。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含む。
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラスと、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、２種類以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当技術分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化させるように特定の定常ドメインを選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域とＣＤＲは、親配列と厳密に対応する必要はなく、例えば、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれとも対応しないように、少なくとも１アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに突然変異を誘発してもよい。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は、広範囲にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列の残基と対応するであろう。本願で使用する場合に「コンセンサスフレームワーク」なる用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を意味する。本願で使用する場合に「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は、同族免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８７）参照）。したがって、「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、「コンセンサスフレームワーク領域」及び／又は「コンセンサスＣＤＲ」を含むことができる。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、前記ファミリーにおけるその位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占められる。２個のアミノ酸が同等の頻度で存在する場合には、どちらがコンセンサス配列に含まれていてもよい。
２個以上のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列に関して本願で使用する場合に「一致する」又は「一致度」とは、これらの配列が指定領域に渡って同一である残基を指定百分率で有することを意味することができる。前記百分率は、２つの配列を最適に整列させ、２つの配列を指定領域で比較し、同一残基が両方の配列に出現する位置数を調べて一致位置数を求め、一致位置数を指定領域内の合計位置数で除し、結果に１００を乗じて配列一致度百分率を得ることにより計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合、又は整列させたときに一端以上がずれ、比較する指定領域に片方の配列しか含まれない場合には、この片方の配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。
「頭部の損傷」又は「頭部損傷」は、本願では同義に使用し、頭皮、頭蓋又は脳の任意の外傷を意味する。このような損傷は、単に頭蓋の小さなこぶの場合もあるし、重度脳損傷の場合もある。このような損傷としては、脳の一次性損傷及び／又は脳の二次性損傷が挙げられる。一次性脳損傷は、初期受傷時に生じ、脳の物理的構造の変位に起因する。より具体的には、一次性脳損傷は、外傷イベント中に生じて周囲の脳組織の剪断と圧縮をもたらす実質（組織、血管）の物理的損傷である。二次性脳損傷は、一次性損傷後に生じ、一連の細胞プロセスを伴う場合がある。より具体的には、二次性脳損傷とは、一次性脳損傷後一定期間（数時間～数日間まで）をかけて徐々に発現する変化を意味する。これは、脳内の細胞変化、化学的変化、組織変化、又は血管変化のカスケード全体を含み、脳組織の更なる破壊に繋がる。
頭部の損傷は、閉鎖性でも開放性（穿通性）でもよい。閉鎖性頭部損傷とは、頭皮、頭蓋又は脳の外傷であって、打撃物による頭蓋の穿通がない場合を意味する。開放性頭部損傷とは、頭皮、頭蓋又は脳の外傷であって、打撃物による頭蓋の穿通がある場合を意味する。頭部の損傷は、人による身体揺さぶり、閉鎖性又は開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的又は他の力による鈍的衝撃（例えば、自動車、飛行機、列車等による車両事故、野球バットや火器による頭部殴打）、脳血管事故（例えば、卒中）、（例えば、運動又は他の活動における）１回以上の転倒、爆発又は爆破（「爆破損傷」と総称する）及び他の型の鈍力外傷に起因することができる。あるいは、頭部の損傷は、火炎、化学物質、毒素又は化学物質と毒素の組み合わせの吸い込み及び／又は曝露に起因することができる。このような化学物質及び／又は毒素の例としては、カビ、アスベスト、駆除剤及び殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、（一酸化炭素、硫化水素、及びシアン化物等の）ガス、（メチル水銀、四エチル鉛及び有機スズ等の）有機金属並びに／又は１種以上の乱用薬物が挙げられる。あるいは、対象が自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している結果として、頭部の損傷が生じる場合もある。場合によっては、このようなイベント又は損傷が生起又は発生したかどうかが確かでない可能性がある。例えば、患者又は対象の既往歴がない場合や、対象が話せない場合や、対象がどのイベントに曝露されたかを気付いていない場合等が挙げられる。このような状況を本願では、対象が「頭部の損傷を生じている可能性がある」と言う。本願の所定の実施形態において、閉鎖性頭部損傷は、卒中等の脳血管事故を含まず、明確に除外する。
本願で使用する場合に「頭蓋内病変」とは、脳の内側の損傷区域を意味する。頭蓋内病変は、ＣＴスキャン又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）等の脳画像検査で認められる異常とすることができる。ＣＴ又はＭＲＩスキャン上に、脳病変は、正常脳組織と異なる暗スポット又は明スポットとして出現することができる。
本願で使用する場合に「単離ポリヌクレオチド」とは、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源、又はその組み合わせの）ポリヌクレオチドを意味することができ、その起源により、単離ポリヌクレオチドは、前記「単離ポリヌクレオチド」が自然界で結合しているポリヌクレオチドの全部若しくは一部と結合していないか、自然界で連結されていないポリヌクレオチドと機能的に連結されているか、又はより大きな配列の一部として自然界に存在しない。
本願で使用する場合に「ラベル」及び「検出可能なラベル」とは、抗体と被検体の反応を検出可能にするために抗体又は被検体に結合される部分を意味し、こうして標識された抗体又は被検体を「検出可能に標識されている」と言う。ラベルは、目視又は計器手段により検出可能なシグナルを発生することができる。各種ラベルとしては、色素原、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物等のシグナル発生物質が挙げられる。ラベルの代表例としては、光を発生する部分（例えば、アクリジニウム化合物）と、蛍光を発生する部分（例えば、フルオレセイン）が挙げられる。他のラベルも本願中に記載する。この点に関して、前記部分自体は検出可能でなくてもよいが、更に別の部分と反応すると、検出可能になるものもある。「検出可能に標識されている」なる用語の使用は、このような標識も包含するものとする。
当技術分野で公知の任意の適切な検出可能なラベルを使用することができる。例えば、検出可能なラベルは、放射性ラベル（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、及び１５３Ｓｍ）、酵素ラベル（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ等）、化学発光ラベル（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステル、又はスルホンアミド、ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステル等）、蛍光ラベル（例えば、フルオレセイン（例えば、５－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、３’６－カルボキシフルオレセイン、５（６）－カルボキシフルオレセイン、６－ヘキサクロロフルオレセイン、６－テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート等））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ－フィコエリスリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛でキャップしたセレン化カドミウム）、測温ラベル、又はイムノポリメラーゼ連鎖反応ラベルとすることができる。ラベル、標識手順及びラベルの検出の手引きは、Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎにより発行されたハンドブック兼カタログであるＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）を参照されたい。ＦＰＩＡでは蛍光ラベルを使用することができる（例えば、その開示内容全体を本願に援用する米国特許第５，５９３，８９６号、５，５７３，９０４号、５，４９６，９２５号、５，３５９，０９３号及び５，３５２，８０３号参照）。均一系化学発光アッセイでは、アクリジニウム化合物を検出可能なラベルとして使用することができる（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４－１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３－２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７－３９２１（２００４）；及びＡｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９－３７８２（２００３）参照）。
１態様において、前記アクリジニウム化合物は、アクリジニウム－９－カルボキサミドである。アクリジニウム－９－カルボキサミドの製造方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７－１１４（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６－５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５：１０８９９－１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９－７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：７１４－７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．７７－１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９－３７８２（２００３）；並びに米国特許第５，４６８，６４６号、５，５４３，５２４号及び５，７８３，６９９号に記載されている（各々、前記方法に関するその教示内容全体を本願に援用する）。
アクリジニウム化合物の別の例は、アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルの１例は、１０－メチル－９－（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能）である。アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルの製造方法は、ＭｃＣａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１－２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １５：２４５－２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １５：２３９－２４４（２０００）、及び米国特許第５，２４１，０７０号に記載されている（各々、前記方法に関するその教示内容全体を本願に援用する）。このようなアクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルは、シグナルの強度及び／又はシグナルの速さの点において、少なくとも１個のオキシダーゼ分子による被検体の酸化で生成される過酸化水素の効率的な化学発光指示薬である。アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルの化学発光過程は、迅速に（即ち、１秒未満で）完了するが、アクリジニウム－９－カルボキサミド化学発光は、２秒を超える。一方、アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルは、タンパク質の存在下でその化学発光性を失う。したがって、その使用には、シグナル発生・検出中にタンパク質が不在であることが必要である。試料中のタンパク質の分離又は除去方法は、当業者に周知であり、限定されないが、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィー、及び／又は消化が挙げられる（例えば、Ｗｅｌｌｓ，Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）参照）。被検試料から除去又は分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％とすることができる。アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルとその使用に関するその他の詳細は、２００７年４月９日付け米国特許出願第１１／６９７，８３５号に記載されている。アクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステルは、脱気無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やコール酸ナトリウム水溶液等の任意の適切な溶媒に溶解することができる。
「連結配列」又は「連結ペプチド配列」とは、１本以上の着目ポリペプチド配列（例えば、全長、断片等）と連結される天然又は人工ポリペプチド配列を意味する。「連結される」なる用語は、連結配列を着目ポリペプチド配列と結合することを意味する。１個以上のペプチド結合によりこのようなポリペプチド配列を結合することが好ましい。連結配列は、約４～約５０アミノ酸長とすることができる。連結配列の長さは、約６～ 約３０アミノ酸が好ましい。天然連結配列をアミノ酸置換、付加、又は欠失により修飾し、人工連結配列を作製することができる。連結配列は、組換えＦａｂにおける使用をはじめとして、多くの用途に使用することができる。典型的な連結配列としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。（ｉ）ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する６×Ｈｉｓタグ等のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグは、着目ポリペプチド及び抗体の単離と精製を助長するための連結配列として有用である。（ｉｉ）エンテロキナーゼ切断部位は、Ｈｉｓタグと同様に、着目タンパク質及び抗体の単離と精製に使用される。多くの場合、エンテロキナーゼ切断部位は、着目タンパク質及び抗体の単離と精製においてＨｉｓタグと共に使用される。種々のエンテロキナーゼ切断部位が当技術分野で公知である。エンテロキナーゼ切断部位の例としては、限定されないが、ＤＤＤＤＫ（配列番号４）のアミノ酸配列とその誘導体（例えば、ＡＤＤＤＤＫ（配列番号５）等）が挙げられる。（ｉｉｉ）一本鎖可変領域断片の軽鎖及び／又は重鎖可変領域を連結又は結合するためにその他の配列も使用することができる。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）に挙げられている。薬物の結合や固相担体への結合等の付加機能のために、連結配列を修飾することもできる。本開示に関して、モノクローナル抗体は、例えば、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位、又はその両方等の連結配列を含むことができる。
「磁気共鳴画像法」又は「ＭＲＩ」とは、本願では同義に使用され、健康及び疾患の両方において生体の解剖学的構造及び生理プロセスの画像を形成するために放射線医療で使用される医用画像技術を意味する（例えば、本願では、同義に「ＭＲＩ」、「ＭＲＩ法」又は「ＭＲＩスキャン」と呼ぶ）。ＭＲＩは、強磁場におかれたときの高周波ラジオ波に対する生体組織の原子核の応答を測定し、体内臓器の画像を生成する医用画像法である。ＭＲＩスキャナーは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）科学に基づき、強磁場、ラジオ波及び磁場勾配を使用して生体内の画像を生成する。
本願で使用する場合に「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一の抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、前記集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある天然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原に対して高度に特異的である。更に、ポリクローナル抗体製剤は、一般的に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むが、これとは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に特異的である。本願におけるモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定生物種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であり、前記抗体鎖の残余が別の生物種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体と、所望の生物学的活性を示す限りにおいてこのような抗体の断片を含む。
「多価結合タンパク質」とは、本願では、２個以上の抗原結合部位（本願では「抗原結合ドメイン」とも言う）を含む結合タンパク質を表すために使用される。多価結合タンパク質は、３個以上の抗原結合部位を有するように人工的に作製されることが好ましく、一般に、天然に存在する抗体ではない。「多重特異性結合タンパク質」なる用語は、２個以上の関連する標的又は無関係の標的と結合することができる結合タンパク質を意味し、同一標的分子の２個以上の異なるエピトープと結合することが可能な結合タンパク質が挙げられる。
「陰性適中率」又は「ＮＰＶ」とは、本願では同義に使用され、対象の試験結果が陰性である場合に、対象のアウトカムが陰性となる確率を意味する。
本願で使用する場合に「参照値」とは、診断、予後又は治療効果を評定するために使用され、種々の臨床パラメーター（例えば、疾患の存在、疾患のステージ、疾患の重症度、疾患の進行、非進行又は改善等）と従来関係付けられているか又は本願で関連付けられるアッセイカットオフ値を意味する。本願で使用する場合に「絶対量」とは、異なる時点で採取又はサンプリングされた少なくとも２回のアッセイ結果間の変化又は差の絶対値であって、参照値と同様に、種々の臨床パラメーター（例えば、疾患の存在、疾患のステージ、疾患の重症度、疾患の進行、非進行又は改善等）と従来関係付けられているか又は本願で関連付けられる数値を意味する。本願で使用する場合に「絶対値」とは、その符号に関係なく、即ち、正負に関係なく、（例えば、（第１の時点で測定された値と、第２の時点で測定された値等の）２つの比較される値の差等の）実数値を意味する。
本開示は、典型的な参照値と、（例えば、異なる時点の参照値を比較することにより計算された）絶対量を提供する。しかし、参照値と絶対量がイムノアッセイの種類（例えば、利用される抗体、反応条件、試料純度等）に応じて変動する可能性があり、アッセイを比較・標準化できることは周知である。更に、本開示により提供される記載に基づき、他のイムノアッセイのイムノアッセイ特異的参照値及び絶対量を得るように本願の開示を他のイムノアッセイに適応させることは、当技術分野における通常の知識を有する者が十分になし得る範囲内である。参照値と絶対量の厳密な数値は、アッセイ間で変動し得るが、本願に記載する知見は、一般に他のアッセイにも適用可能であり、外挿することができる。
「ポイントオブケアデバイス」とは、患者ケアの現場（例えば、病院、医院、救急若しくは他の医療ケア施設、患者の自宅、介護施設及び／又は長期ケア及び／又はホスピス施設）のポイントオブケア（即ち、実験室の外）又はその付近で医療診断試験を提供するために使用されるデバイスを意味する。ポイントオブケアデバイスの例としては、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）（例えば、ｉ－ＳＴＡＴ及びｉ－ＳＴＡＴ Ａｌｉｎｉｔｙ）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ社（オーストラリア、ロウビル）（ＵＳ２００６／０１３４７１３参照）、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ社（ノルウェー、オスロ）及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（米国、ロサンゼルス）の製品が挙げられる。
「陽性適中率」又は「ＰＰＶ」とは、本願では同義に使用され、対象の試験結果が陽性である場合に、対象のアウトカムが陽性となる確率を意味する。
本願に記載するイムノアッセイ及びキットに関する「品質管理試薬」としては、限定されないが、キャリブレーター、対照及び感度パネルが挙げられる。抗体又は被検体等の被検体の濃度の内挿用の校正（標準）曲線を作成するために、一般的に（例えば、複数等の１以上の）「キャリブレーター」又は「標準」が使用される。あるいは、参照値又は対照値（例えば、「低」値、「中」値、又は「高」値）の付近の単一キャリブレーターを使用することができる。複数のキャリブレーター（即ち、２以上のキャリブレーター又は変動量のキャリブレーター）を組み合わせて使用し、「感度パネル」を構成することができる。
「受信者動作特性」曲線又は「ＲＯＣ」曲線とは、その識別閾値の変動に伴う二項分類器システムの性能を示すグラフプロットを意味する。例えば、ＲＯＣ曲線は、診断試験の種々の可能なカットオフ点の偽陽性率に対する真陽性率のプロットとすることができる。この曲線は、種々の閾値設定で陰性のうちの偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）に対して陽性のうちの真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）をプロットすることにより作成される。ＴＰＲは、感度とも呼ばれ、ＦＰＲは、１－特異度又は真陰性率である。ＲＯＣ曲線は、感度と特異度のトレードオフを示し（感度の上昇は特異度の低下を伴う）、曲線がＲＯＣ空間の左端に近付き、次いで上端に近付くにつれて試験は正確になり、曲線がＲＯＣ空間の４５度の対角線に近付くにつれて試験の正確性は低下し、カットオフ点における接線の傾きは試験のその数値の尤度比（ＬＲ）を表し、曲線下の面積は試験の正確性の尺度となる。
「組換え抗体」及び「複数の組換え抗体」とは、１種以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を組換え技術により適切な発現ベクターにクローニングする工程と、次いで前記抗体を適切な宿主細胞で発現させる工程を含む１工程以上により作製される抗体を意味する。この用語は、限定されないが、組換え生産されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全又は部分ヒト化抗体）、抗体断片から形成される多重特異性又は多価構造、二機能性抗体、ヘテロコンジュゲートＡｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ（Ｒ）、及び本願の（ｉ）に記載した他の抗体を含む（デュアル可変ドメイン免疫グロブリンとその作製方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０－１２９７（２００７）に記載されている）。本願で使用する場合に「二機能性抗体」なる用語は、ある抗原部位に対する特異性を有する第１のアームと、別の抗原部位に対する特異性を有する第２のアームを含む抗体を意味し、即ち、二機能性抗体は、デュアル特異性を有する。
本願で使用する場合に対象（例えば、患者）の「リスク評定」、「リスク分類」、「リスク同定」又は「リスク層別化」とは、より詳しい情報に基づいて対象に関する治療決定を実施できるように、疾患発症又は疾患進行を含む将来のイベントの発生リスクを予測するためのバイオマーカーを含む因子の評価を意味する。
「試料」、「被検試料」、「検体」、「対象からの試料」、「生体試料」、及び「患者試料」とは、本願では同義に使用され、（例えば、毛細管血、静脈血、乾燥血斑等を含む）全血、血清若しくは血漿等の血液、組織、唾液、尿、羊水、口咽頭検体、鼻咽頭検体、限定されないが、痰、気管内吸引物若しくは気管支肺胞洗浄液等の下気道検体、脳脊髄液、胎盤細胞若しくは組織、血管内皮細胞、白血球、又は単球の試料とすることができる。試料は、患者から取得した状態で直接使用することもできるし、本願に記載する何らかの方法又は当技術分野で公知の他の方法で試料の特徴を改変するように、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心、妨害成分の不活性化、試薬の添加等により前処理することもできる。更に、試料は１回以上のスワブを使用して取得した鼻咽頭又は口咽頭試料とすることもでき、試料を取得後、ウイルス輸送媒体（ＶＴＭ）又はユニバーサル輸送媒体（ＵＴＭ）を入れた滅菌チューブに浸して保管するか、又は別の試験用媒体に移す。
試料を取得するには種々の細胞種、組織、又は体液を利用することができる。このような細胞種、組織、及び体液としては、生検及び剖検試料等の組織切片、口咽頭検体、鼻咽頭検体、組織学的検査目的で採取した凍結切片、血液（例えば、全血、乾燥血斑等）、血漿、血清、唾液、赤血球、血小板、間質液、脳脊髄液等が挙げられる。細胞種及び組織としては、吸引により採取したリンパ液、脳脊髄液、又は任意の体液も挙げられる。組織又は細胞種は、ヒト及び非ヒト動物から細胞試料を採取することにより提供することもできるし、予め単離した（例えば、別の人により、別の時点で及び／又は別の目的のために単離した）細胞を使用することにより遂行することもできる。治療又はアウトカム履歴を有するもの等のアーカイブ組織を使用してもよい。タンパク質又はヌクレオチド単離及び／又は精製が不要な場合もある。所定の実施形態において、前記試料は、血液試料（例えば、全血試料、血清試料、又は血漿試料）である。所定の実施形態において、前記試料は、全血試料である。所定の実施形態において、前記試料は、毛細管血試料である。所定の実施形態において、前記試料は、乾燥血斑である。所定の実施形態において、前記試料は、血清試料である。更に他の実施形態において、前記試料は、血漿試料である。所定の実施形態において、前記試料は、口咽頭検体である。他の実施形態において、前記試料は、鼻咽頭検体である。他の実施形態において、前記試料は、痰である。他の実施形態において、前記試料は、気管内吸引物である。更にまた他の実施形態において、前記試料は、気管支肺胞洗浄液である。更にまた他の実施形態において、前記試料は、唾液試料である。
本願で使用する場合にアッセイの「感度」とは、アウトカムが陽性であり、陽性として正しく同定される対象の割合を意味する（例えば、試験の標的である疾患又は病態を有する対象を正しく同定する）。例えば、これは、ＴＢＩをもたない対象から識別してＴＢＩを有する対象を正しく同定すること、軽度ＴＢＩを有する対象から識別して中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有する対象を正しく同定すること、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有する対象から識別して軽度ＴＢＩを有する対象を正しく同定すること、ＴＢＩをもたない対象から識別して中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有する対象を正しく同定すること、あるいはＴＢＩをもたない対象から識別して軽度ＴＢＩを有する対象を正しく同定すること等が挙げられる。
本願で使用する場合にアッセイの「特異度」とは、アウトカムが陰性であり、陰性として正しく同定される対象の割合を意味する（例えば、試験の標的である疾患又は病態をもたない対象を正しく同定する）。例えば、これは、ＴＢＩを有する対象から識別してＴＢＩをもたない対象を正しく同定すること、軽度ＴＢＩを有する対象から識別して中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩをもたない対象を正しく同定すること、中等度、重度、又は中等度～重度ＴＢＩを有する対象から識別して軽度ＴＢＩをもたない対象を正しく同定すること等が挙げられる。
「校正組成物系列」とは、既知濃度のＵＣＨ－Ｌ１を含有する複数の組成物を意味し、組成物は各々、ＵＣＨ－Ｌ１の濃度が系列中の他の組成物と相違する。
「固相」又は「固相担体」とは、本願では同義に使用され、（１）１種以上の捕捉剤若しくは捕捉用特異的結合パートナー、又は（２）１種以上の検出剤若しくは検出用特異的結合パートナーを結合及び／又は吸引して固相化するために使用することができる任意の材料を意味する。固相は、捕捉剤を吸引・固相化するその固有の能力により選択することができる。あるいは、固相は、（１）捕捉剤若しくは捕捉用特異的結合パートナー、又は（２）検出剤若しくは検出用特異的結合パートナーを吸引・固相化する能力を有する連結剤を結合することができる。例えば、連結剤は、捕捉剤（例えば、捕捉用特異的結合パートナー）若しくは検出剤（例えば、検出用特異的結合パートナー）自体に対して、あるいは（１）捕捉剤若しくは捕捉用特異的結合パートナー、又は（２）検出剤若しくは検出用特異的結合パートナーと結合された荷電物質に対して逆電荷の荷電物質を含むことができる。一般に、連結剤は、固相に固相化（結合）され、結合反応により、（１）捕捉剤若しくは捕捉用特異的結合パートナー、又は（２）検出剤若しくは検出用特異的結合パートナーを固相化することが可能な（好ましくは特異的な）任意の結合パートナーとすることができる。連結剤により、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に捕捉剤を固相材料に間接的に結合することが可能になる。例えば、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性若しくは非磁性金属、ガラス又はシリコン製とすることができ、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当技術分野における通常の知識を有する者に公知の他の構造が挙げられる。
本願で使用する場合に「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、抗体、タンパク質又はペプチドと第２の化学種の相互作用を意味することができ、前記相互作用は、化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存し、例えば、抗体は、タンパク質全般ではなく、特定のタンパク質構造を認識してこれと結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であるならば、標識された「Ａ」と前記抗体を含む反応にエピトープＡ（遊離未標識Ａ）を含む分子を介在させると、標識されたＡが前記抗体と結合する量は減るであろう。
「特異的結合パートナー」とは、特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的又は物理的手段により相互に特異的に結合する２個の異なる分子を含む。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原と抗体の特異的結合対以外に、他の特異的結合対としては、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）、糖鎖とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素と酵素阻害剤等を挙げることができる。更に、特異的結合対としては、元の特異的結合メンバーのアナログであるメンバー（例えば、被検体アナログ）を挙げることができる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、単離されたものであるか又は組換え生産されたものであるかに関係なく、抗原、抗原断片、及びモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を含む抗体に加え、複合体とその断片が挙げられる。
本願で使用する場合に「統計的に有意」とは、２個以上の変数間の関係が偶然以外の原因に起因する確率を意味する。データセットの結果が統計的に有意であるか否かを判定するには、統計的仮説検定を使用する。統計的仮説検定では、検定統計量の観測ｐ値が検定の設定された有意水準よりも小さければ、統計的に有意な結果が得られる。ｐ値は、帰無仮説が真であると仮定したときに、少なくとも観測結果と同程度に仮説から外れた結果を得る確率である。統計的仮説解析の例としては、ウィルコクソンの符号順位検定、ｔ検定、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定が挙げられる。本願で使用する場合に「有意」とは、統計的に有意であると判定されていない変化を意味する（例えば、統計的仮説検定を実施していなくてもよい）。
「対象」及び「患者」とは、本願では同義に使用され、任意の脊椎動物を意味し、限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルやアカゲザル等のサル、チンパンジー等）及びヒト）が挙げられる。所定の実施形態において、前記対象はヒトでも非ヒトでもよい。所定の実施形態において、前記対象はヒトである。前記対象又は患者は、他の型の治療を受療中でもよい。
「治療する」、「治療用」又は「治療」とは、本願では各々同義に使用され、このような用語が適用される疾患及び／若しくは損傷、又はこのような疾患の１種以上の症状の進行を逆行、緩和又は抑制することを表す。対象の状態に応じて、この用語は疾患を予防することも意味し、疾患の発症を予防すること、又は疾患に伴う症状を予防することを含む。治療は急性的に実施してもよいし、慢性的に実施してもよい。この用語は更に、疾患に罹患する前に前記疾患又はこのような疾患に伴う症状の重症度を低下させることも意味する。罹患前の疾患のこのような予防又はその重症度の低下とは、投与時に前記疾患に罹患していない対象に医薬組成物を投与することを意味する。「予防する」とは、疾患又はこのような疾患に伴う１種以上の症状の再発を防止することも意味する。「治療」及び「治療的」とは、治療行為を意味し、「治療する」とは、上記に定義した通りである。
「外傷性脳損傷」又は「ＴＢＩ」とは、本願では同義に使用され、広範な症状と障害を伴う複合損傷を意味する。ＴＢＩは、他の損傷と同様に急性イベントであることが最も多い。ＴＢＩは、「軽度」、「中等度」、又は「重度」に分類することができる。ＴＢＩの原因は多様であり、例えば、人による身体揺さぶり、自動車事故、火器による損傷、脳血管事故（例えば、卒中）、転倒、爆発又は爆破及び他の型の鈍力外傷が挙げられる。ＴＢＩの他の原因としては、１種以上の火炎、化学物質若しくは毒素（例えば、カビ、アスベスト、駆除剤及び殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス（例えば、一酸化炭素、硫化水素、及びシアン化物）、有機金属（例えば、メチル水銀、四エチル鉛及び有機スズ）、１種以上の乱用薬物又はそれらの組み合わせ）の吸い込み及び／又は曝露が挙げられる。あるいは、ＴＢＩは、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、髄膜炎等）、真菌感染症（例えば、髄膜炎）、細菌感染症（例えば、髄膜炎）、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象で生じる可能性がある。ＴＢＩの危険が最も高い年齢群は、若年成人と高齢者である。本願の所定の実施形態において、外傷性脳損傷又はＴＢＩは、卒中等の脳血管事故を含まず、明確に除外する。
本願で使用する場合に「軽度ＴＢＩ」とは、対象が意識消失していてもよいし、していなくてもよい頭部損傷を意味する。意識消失している対象でも、一般的に短時間であり、通常では僅か数秒間又は数分間である。軽度ＴＢＩは、脳震盪、軽微な頭部外傷、軽微なＴＢＩ、軽微な脳損傷、及び軽微な頭部損傷とも呼ばれる。ＭＲＩとＣＴスキャンは正常であることが多いが、軽度ＴＢＩを有する個体は、頭痛、思考障害、記憶障害、気分変動及び苛立ち等の認知障害を有する場合がある。
軽度ＴＢＩは最も一般的なＴＢＩであり、初期損傷時に見落とされることが多い。一般的に、対象はグラスゴーコーマスケール点数が１３～１５点（例えば、１３～１５点又は１４～１５点）である。軽度ＴＢＩを有する人の１５％は、症状が３カ月以上続く。軽度ＴＢＩの一般的な症状としては、疲労感、頭痛、視覚障害、記憶消失、注意力／集中力低下、睡眠障害、眩暈／平衡感覚低下、短気－情緒障害、抑うつ感情、及び発作が挙げられる。軽度ＴＢＩに伴う他の症状としては、悪心、味覚低下、光と音に対する感受性、気分変調、迷子若しくは混乱及び／又は思考遅延が挙げられる。
本願で使用する場合に「中等度ＴＢＩ」とは、意識消失及び／又は錯乱と失見当識が１～２４時間であり、対象のグラスゴーコーマスケール点数が９～１３点（例えば、９～１２点又は９～１３点）である脳損傷を意味する。中等度ＴＢＩを有する個体は、脳画像結果が異常になる可能性がある。本願で使用する場合に「重度ＴＢＩ」とは、意識消失が２４時間超であり、損傷又は穿通性頭蓋損傷後の記憶消失が２４時間超であり、対象のグラスゴーコーマスケール点数が３～８点である脳損傷を意味する。障害は、高次認知機能障害から昏睡状態までの範囲に渡る。回復しても、腕又は脚の機能低下、発語又は言語異常、思考能力低下又は情緒障害が残る場合がある。重度損傷を有する個体は、長期間無反応状態のままになる可能性がある。重度ＴＢＩを有する多くの人々では、機能と自立を最大にするために長期リハビリテーションが必要になることが多い。
本願で使用する場合に「中等度～重度」ＴＢＩとは、経時的な中等度から重度ＴＢＩへの変化を含み、したがって、（例えば、一時的な）中等度ＴＢＩ単独、重度ＴＢＩ単独、及び中等度～重度ＴＢＩ複合を包含する範囲の脳損傷を意味する。例えば、臨床状況によっては、対象は当初は中等度ＴＢＩを有すると診断されるが、時間（分、時間又は日数レベル）の経過に伴い、（例えば、脳出血がある状況のように）重度ＴＢＩに進行する場合がある。あるいは、臨床状況によっては、対象は当初は重度ＴＢＩを有すると診断されるが、時間（分、時間又は日数レベル）の経過に伴い、中等度ＴＢＩに移行する場合がある。このような対象は、「中等度～重度」に分類することができる患者の例である。中等度～重度ＴＢＩの一般的な症状としては、注意力、集中力、被転導性、記憶、処理速度、錯乱、保続、衝動性、言語処理、及び／若しくは「遂行機能」の障害、他者の言うことを理解できない（受容性失語）、発語が困難で他者に理解されない（表出性失語）、不明瞭発語、話し方が非常に速い若しくは非常に遅い、読字障害、書字障害、触覚、温度、運動、四肢位置及び微細な識別の解釈困難、感覚印象の心理学的に有意義なデータへの統合若しくはパターン化、完全若しくは部分的な視力喪失、眼筋力低下と二重視（複視）、霧視、距離判断障害、無意識的眼球運動（眼球振盪）、光不耐性（羞明）、聴力低下若しくは喪失等の聴覚障害、耳鳴り（響鳴）、音に対する感受性増加、嗅覚消失若しくは低下（無嗅覚症）、味覚消失若しくは低下、数種類に分類することができ、意識、感覚認知若しくは運動の混乱を伴う場合がある癲癇に付随する痙攣、排便・排尿コントロール障害、睡眠障害、持久力低下、食欲変化、体温調節障害、月経困難、依存的行動、感情能力若しくは安定性の障害、モチベーションの欠如、被刺激性、攻撃性、抑うつ、脱抑制、又は自覚の拒否／欠如を含む認知障害が挙げられる。中等度～重度ＴＢＩを有する対象は、グラスゴーコーマスケール点数が３～１２点とすることができる（中等度ＴＢＩの９～１２点と、重度ＴＢＩの３～８点を含む）。
「ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１」又は「ＵＣＨ－Ｌ１」とは、本願では同義に使用され、ヒトにおいてＵＣＨ－Ｌ１遺伝子によりコードされる脱ユビキチン化酵素を意味する。ＵＣＨ－Ｌ１は、ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１及びユビキチンチオールエステラーゼとも呼ばれ、その産物がユビキチンの低分子Ｃ末端付加物を加水分解してユビキチン単量体を生じる遺伝子ファミリーのメンバーである。
「ＵＣＨ－Ｌ１状態」とは、（ＵＣＨ－Ｌ１の単回測定等による）ある時点におけるＵＣＨ－Ｌ１の値若しくは量、（ＵＣＨ－Ｌ１量の増減を確認するために対象で実施される反復試験等による）経過観察に関連するＵＣＨ－Ｌ１の値若しくは量、（一次性脳損傷及び／又は二次性脳損傷のいずれかに関係なく）外傷性脳損傷の治療に関連するＵＣＨ－Ｌ１の値若しくは量又はその組み合わせを意味することができる。
「変異体」とは、本願では、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によりアミノ酸配列が相違するが、少なくとも１種の生物学的活性を維持するペプチド又はポリペプチドを表すために使用される。「生物学的活性」の代表例としては、特異的抗体と結合する能力又は免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体とは、本願では、少なくとも１種の生物学的活性を維持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に一致するアミノ酸配列を有するタンパク質を表すためにも使用される。アミノ酸の保存的置換、即ち、アミノ酸を類似の性質（例えば、親水性、程度、及び荷電領域の分布）の別のアミノ酸で置換することは、当技術分野において一般的に軽微な変化を伴うとして認識されている。これらの軽微な変化は、一面において、当技術分野で理解されているようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することにより、同定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）参照。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷を考慮することに基づく。疎水性親水性指標が類似するアミノ酸を置換してもタンパク質機能を維持できることは当技術分野で知られている。１態様では、疎水性親水性指標が±２のアミノ酸を置換する。生物学的機能を維持するタンパク質が得られるような置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性を使用することもできる。最大局所平均親水性は、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な手段であるが、ペプチドに関してアミノ酸の親水性を考慮すると、このペプチドの最大局所平均親水性を計算することができる。全文を本願に援用する米国特許第４，５５４，１０１号参照。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、生物学的活性（例えば、免疫原性）を維持するペプチドが得られる。親水性値が相互に±２以内のアミノ酸で置換を行うことができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値はどちらもそのアミノ酸の特定の側鎖により影響される。この所見に一致し、生物学的機能に適合可能なアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、寸法及び他の性質により明らかなように、アミノ酸、特にこれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存すると考えられる。「変異体」とは、抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体の対応する断片とアミノ酸配列が相違するが、依然として抗原反応性であり、ＵＣＨ－Ｌ１との結合について抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体の対応する断片と競合することができる抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体の抗原反応性断片を表すために使用することもできる。「変異体」とは、タンパク質分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾等により差次的にプロセシングされているが、その抗原反応性を維持するポリペプチド又はその断片を表すために使用することもできる。
「ベクター」とは、本願では、これが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を表すために使用される。ベクターの１例は、付加ＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、付加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターや、エピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、ノンエピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノムに組込むことができるので、宿主ゲノムと共に複製される。更に、所定のベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを本願では「組換え発現ベクター」（又は、単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、最も広く使用されている形態のベクターであるので、「プラスミド」と「ベクター」は同義に使用することができる。しかし、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等の他の形態の発現ベクターも使用することができる。この点については、（ＲＮＡウイルスベクターを含む）ＲＮＡベクターも本開示に関して適用できる。
本願中で他の定義のない限り、本開示に関連して使用する科学技術用語は、当技術分野における通常の知識を有する者に広く理解されている意味とする。例えば、本願に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関して使用される全ての命名法とこれらの技術は、当技術分野で周知であり、広く使用されている。用語の意味と範囲は明白でなければならないが、潜在的に曖昧な場合には、辞書又は外部の定義よりも本願に記載する定義を優先する。更に、文脈から必然的にそうでない場合を除き、単数形の用語は複数形も含み、複数形の用語は単数形も含む。
２．頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンの結果が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に関して陰性の対象においてＴＢＩの判定を補助する方法
本開示は特に、頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われるヒト対象等の対象が、頭部ＣＴスキャンを１回以上受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性である場合に、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を生じている可能性の方が高いか否かを判定するのを補助する方法に関する。具体的に、このような方法は、（ａ）（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するための少なくとも１種のアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施される少なくとも１回の頭部ＣＴスキャンを、同時又は（任意の順序で）逐次実施する工程と；（ｂ）前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象がＴＢＩを有する可能性の方が高いと診断する工程を含むことができる。前記試料は、生体試料とすることができる。
更に別の態様において、本開示は、頭部の損傷を生じているか、又は生じている可能性があるか、又は生じていることが疑われるヒト対象等の対象が、ＴＢＩを生じている可能性が高いか否かを判定するのを補助する方法に関する。具体的に、前記方法は、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイを実施する工程を含み、前記方法は、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施された頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが、ＴＢＩに関して陰性であるか、又は前記対象で頭部ＣＴスキャンが実施されていないならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む。前記試料は、生体試料とすることができる。所定の態様では、前記対象で頭部ＣＴスキャンを実施する。他の態様では、前記対象で頭部ＣＴスキャンを実施しない。
本願に記載するように、前記少なくとも１種のアッセイと、任意に、少なくとも１回の頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、前記頭部ＣＴスキャンは、同時又は任意の順序で逐次実施することができる。逐次実施する場合には、前記アッセイと前記頭部ＣＴスキャンを臨床的に適切な時間枠内で実施することができ、例えば、相互に約１分以内、相互に約２分以内、相互に約３分以内、相互に約４分以内、相互に約５分以内、相互に約１０分以内、相互に約１５分以内、相互に２０分以内、相互に約２５分以内、相互に約３０分以内、相互に約４５分以内、相互に約５０分以内、相互に約６０分以内、相互に約１時間以内、相互に約１．５時間以内、相互に約２時間以内、相互に約３時間以内、相互に約４時間以内、相互に約５時間以内、相互に約６時間以内、相互に約７時間以内、相互に約８時間以内、相互に約９時間以内、相互に約１０時間以内、相互に約１１時間以内、又は相互に約１２時間以内に実施することができる。
所定の態様において、本願に記載する方法は、頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象が、頭部ＣＴスキャンを受けており、その結果がＴＢＩに関して陰性である場合に、１種以上のバイオマーカー値に基づいてＴＢＩを有するとして同定することができる。本願に記載する方法は、ＴＢＩを生じているが、１回以上の頭部ＣＴスキャンの結果のみに基づいてＴＢＩをもたないとして誤って診断された可能性のある対象を同定することができる。
所定の実施形態において、前記方法は、前記対象の疑われる損傷から約２４時間以内に試料を取得する工程と、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせ等のＴＢＩのバイオマーカーの抗体と前記試料を接触させ、前記抗体と前記バイオマーカーの複合体を形成する工程を含むことができる。前記方法は更に、得られた抗体とバイオマーカーの複合体を検出する工程を含む。
所定の実施形態では、頭部の損傷（例えば、実際の損傷）又は疑われる損傷から約２４時間以内、例えば約０～約６時間以内、約０～約８時間以内、約０～約１０時間以内、約０～約１２時間以内、約０～約１８時間以内、約６時間～約１２時間以内、約６時間～約１８時間、又は約１２時間～約１８時間以内に、前記試料をヒト対象等の対象から採取する。例えば、頭部の損傷又は疑われる損傷から約０分以内、約３０分以内、約６０分以内、約９０分以内、約１２０分以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約１３時間以内、約１４時間以内、約１５時間以内、約１６時間以内、約１７時間以内、約１８時間以内、約１９時間以内、約２０時間以内、約２１時間以内、約２２時間以内、約２３時間以内、又は約２４時間以内に、前記試料をヒト対象等の対象から採取することができる。所定の実施形態において、ＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等のバイオマーカーの存在の徴候は、頭部の損傷又は疑われる損傷後、約０分以内、約３０分以内、約６０分以内、約９０分以内、約１２０分以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約１３時間以内、約１４時間以内、約１５時間以内、約１６時間以内、約１７時間以内、約１８時間以内、約１９時間以内、約２０時間以内、約２１時間以内、約２２時間以内、約２３時間以内、又は約２４時間以内に現れる。
一般に、被検試料をＵＣＨ－Ｌ１についてアッセイして得られた結果を比較評定するためのベンチマークとして、ＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等のバイオマーカーの参照値を利用することができる。一般に、このような比較を行う際に、ＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等のバイオマーカーの参照値は、被検体の存在、量又は濃度と、ＴＢＩの特定のステージ若しくはエンドポイント又は特定の指標とを関係又は関連付けられるように、特定のアッセイを適切な条件下で十分な回数実施することにより得られる。一般的に、ＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等のバイオマーカーの参照値は、参照対象（又は対象集団）のアッセイで得られる。測定されるＵＣＨ－Ｌ１、ＧＦＡＰ、又はその組み合わせ等のバイオマーカーは、その断片、その分解物、及び／又はその酵素分解物を含むことができる。
所定の実施形態において、前記方法は更に、後述するように、ヒト対象等の対象に外傷性脳損傷治療を施す工程及び／又は前記対象を経過観察する工程を含む。
本願に記載する方法で利用されるアッセイの種類は重要ではなく、試験は、当技術分野で公知の任意のアッセイとすることができ、例えば、イムノアッセイ、タンパク質免疫沈降法、免疫電気泳動法、化学分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析若しくはタンパク質免疫染色法、電気泳動分析、タンパク質アッセイ、競合結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等のクロマトグラフィー若しくはスペクトロメトリー法が挙げられる。また、当技術分野における通常の知識を有する者に知られているような臨床化学フォーマットで前記アッセイを利用することもできる。このようなアッセイについては、本願のセクション４～８で詳述する。（例えば、血清を利用するイムノアッセイ又は全血を利用するポイントオブケアデバイス等の）特定の試料種を利用するアッセイで使用される数値（例えば、キャリブレーター及び／又は対照の参照値、カットオフ値、閾値、特異度、感度、濃度等）を、アッセイ標準化等の当技術分野における公知技術により他のアッセイフォーマットに外挿できることは、当技術分野で公知である。例えば、アッセイ標準化を実施することができる１つの方法は、試料濃度読み値を上下させてコンパレータ方法と整合する傾きを得るように、アッセイで利用されるキャリブレーターに係数を適用することにより実施することができる。あるアッセイで得られた結果を別のアッセイに標準化する他の方法も周知であり、文献に記載されている（例えば、その開示内容を本願に援用するＤａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第４版、３．５章、３１５～３２２頁参照）。
３．頭部の損傷を生じている対象の治療及び経過観察
上記方法で同定された対象を治療又は経過観察することができる。所定の実施形態において、前記方法は更に、ヒト対象等の対象に、当技術分野で公知の任意の治療等の外傷性脳損傷治療を施す工程を含む。例えば、外傷性脳損傷の治療は、頭部の損傷の重症度に応じて種々の形態をとることができる。例えば、軽度ＴＢＩの対象では、前記治療は、安静にする、運動等の身体活動を控える、明るい場所への外出時には光を避けるか又はサングラスをかける、頭痛又は片頭痛の軽減薬の服用、制吐薬の服用等の１種以上を含むことができる。中等度、重度又は中等度～重度ＴＢＩ患者の治療としては、（例えば、利尿剤、抗痙攣薬、個体を鎮静させ、薬物誘導昏睡状態にする薬剤、又は（ＴＢＩの治療用に知られているか又は将来開発される）他の医薬品若しくはバイオ医薬品等の）１種以上の適切な薬剤の投与、（例えば、血腫の除去、頭蓋骨折の修復、減圧開頭術等の）１種以上の外科処置、気道の保護、及び（例えば、１種以上のリハビリテーション、認知行動療法、アンガーマネジメント、カウンセリング心理学等の）１種以上の療法が挙げられる。所定の実施形態において、前記方法は更に、ヒト対象等の対象を経過観察する工程を含む。所定の実施形態では、ＣＴスキャン又はＭＲＩ法で対象を経過観察することができる。
４．ＵＣＨ－Ｌ１値の測定方法
上記方法では、任意の手段によりＵＣＨ－Ｌ１値を測定することができ、イムノアッセイ、タンパク質免疫沈降法、免疫電気泳動法、化学分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析、タンパク質免疫染色法、電気泳動分析、タンパク質アッセイ、競合結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ等の抗体依存方法や、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等のクロマトグラフィー又はスペクトロメトリー法が挙げられる。また、当業者に公知のように、臨床化学フォーマットで前記アッセイを利用することもできる。
所定の実施形態において、ＵＣＨ－Ｌ１値の測定は、前記試料を第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーと接触させる工程を含む。所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、捕捉抗体であり、前記第２の特異的結合メンバーは、検出抗体である。所定の実施形態において、ＵＣＨ－Ｌ１値の測定は、捕捉抗体とＵＣＨ－Ｌ１抗原と検出抗体の複合体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１捕捉抗体とＵＣＨ－Ｌ１抗原とＵＣＨ－Ｌ１検出抗体の複合体）が形成されるように、前記試料を、（１）ＵＣＨ－Ｌ１又はＵＣＨ－Ｌ１断片上のエピトープと結合して捕捉抗体とＵＣＨとＬ１抗原の複合体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１捕捉抗体とＵＣＨ－Ｌ１抗原の複合体）を形成する捕捉抗体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１捕捉抗体）と、（２）検出可能なラベルを含み、捕捉抗体と結合していないＵＣＨ－Ｌ１上のエピトープと結合してＵＣＨ－Ｌ１抗原と検出抗体の複合体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１抗原とＵＣＨ－Ｌ１検出抗体の複合体）を形成する検出抗体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１検出抗体）とに、同時又は任意の順序で逐次接触させる工程と、前記捕捉抗体とＵＣＨ－Ｌ１抗原と検出抗体の複合体中の検出可能なラベルにより発生されるシグナルに基づいて前記試料中のＵＣＨ－Ｌ１の量又は濃度を測定する工程を含む。
所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、固相担体に固相化されている。所定の実施形態において、前記第２の特異的結合メンバーは、固相担体に固相化されている。所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、以下に記載するようなＵＣＨ－Ｌ１抗体である。
所定の実施形態において、前記試料は、希釈されているか、又は希釈されていない。前記試料は、約１～約２５マイクロリットル、約１～約２４マイクロリットル、約１～約２３マイクロリットル、約１～約２２マイクロリットル、約１～約２１マイクロリットル、約１～約２０マイクロリットル、約１～約１８マイクロリットル、約１～約１７マイクロリットル、約１～約１６マイクロリットル、約１５マイクロリットル又は約１マイクロリットル、約２マイクロリットル、約３マイクロリットル、約４マイクロリットル、約５マイクロリットル、約６マイクロリットル、約７マイクロリットル、約８マイクロリットル、約９マイクロリットル、約１０マイクロリットル、約１１マイクロリットル、約１２マイクロリットル、約１３マイクロリットル、約１４マイクロリットル、約１５マイクロリットル、約１６マイクロリットル、約１７マイクロリットル、約１８マイクロリットル、約１９マイクロリットル、約２０マイクロリットル、約２１マイクロリットル、約２２マイクロリットル、約２３マイクロリットル、約２４マイクロリットル又は約２５マイクロリットルとすることができる。所定の実施形態において、前記試料は、約１～約１５０マイクロリットル以下又は約１～約２５マイクロリットル以下である。
ポイントオブケアデバイス以外の（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製機器ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）や、他のコアラボラトリー機器等の）所定の機器は、試料中の２５，０００ｐｇ／ｍＬ超のＵＣＨ－Ｌ１値を測定することが可能であると思われる。
他の検出方法としては、ナノポアデバイス又はナノウェルデバイスの使用が挙げられ、あるいはこれらのデバイスで使用するように適応させることができる。ナノポアデバイスの例は、その開示内容全体を本願に援用する国際特許公開第ＷＯ２０１６／１６１４０２号に記載されている。ナノウェルデバイスの例は、その開示内容全体を本願に援用する国際特許公開第ＷＯ２０１６／１６１４００号に記載されている。
５．ＵＣＨ－Ｌ１抗体
本願に記載する方法は、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（「ＵＣＨ－Ｌ１」）（又はその断片）と特異的に結合する単離抗体（「ＵＣＨ－Ｌ１抗体」と言う）を使用することができる。ＵＣＨ－Ｌ１抗体は、外傷性脳損傷の尺度としてのＵＣＨ－Ｌ１状態を評定するため、試料中のＵＣＨ－Ｌ１の存在を検出するため、試料中に存在するＵＣＨ－Ｌ１の量を定量するため、又は試料中のＵＣＨ－Ｌ１の存在を検出し、定量するために使用することができる。
ａ．ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）
ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（「ＵＣＨ－Ｌ１」）は、「ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ」とも呼ばれ、脱ユビキチン化酵素である。ＵＣＨ－Ｌ１は、その産物がユビキチンの低分子Ｃ末端付加物を加水分解してユビキチン単量体を生じる遺伝子ファミリーのメンバーである。ＵＣＨ－Ｌ１の発現はニューロンと、びまん性内分泌系の細胞及びその腫瘍に高度に特異的である。全ニューロンに多量に存在し（総脳タンパク質の１～２％に相当）、ニューロンと精巣／卵巣で特異的に発現される。ＵＣＨ－Ｌ１の触媒三残基は、９０位のシステインと、１７６位のアスパラギン酸と、１６１位のヒスチジンを含み、そのヒドロラーゼ活性を担う。
ヒトＵＣＨ－Ｌ１は、以下のアミノ酸配列を有することができる。
Figure 2023552755000003
ヒトＵＣＨ－Ｌ１は、配列番号１の断片又は変異体でもよい。ＵＣＨ－Ｌ１の断片は、５～２２５アミノ酸長、１０～２２５アミノ酸長、５０～２２５アミノ酸長、６０～２２５アミノ酸長、６５～２２５アミノ酸長、１００～２２５アミノ酸長、１５０～２２５アミノ酸長、１００～１７５アミノ酸長、又は１７５～２２５アミノ酸長とすることができる。前記断片は、配列番号１に由来する連続数のアミノ酸を含むことができる。
ｂ．ＵＣＨ－Ｌ１認識抗体
本抗体は、ＵＣＨ－Ｌ１、その断片、ＵＣＨ－Ｌ１のエピトープ、又はその変異体と結合する抗体である。前記抗体は、抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体の断片又はその変異体若しくは誘導体でもよい。前記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。前記抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、若しくはＦａｂ断片等の抗体断片、又はその混合物とすることができる。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖ断片を含むことができる。抗体誘導体は、ペプチドミメティクスにより作製することができる。更に、一本鎖抗体の作製について記載されている技術を応用して一本鎖抗体を作製することもできる。
前記抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体は、キメラ抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又はヒト化抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体とすることができる。１実施形態において、前記ヒト化抗体及びキメラ抗体はいずれも一価である。１実施形態において、前記ヒト化抗体及びキメラ抗体は、いずれもＦｃ領域と連結された１個のＦａｂ領域を含む。
ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから得ることができる。ヒト抗体は、ヒトインビボ免疫応答の結果として作製・単離することができる。例えば、Ｆｕｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８（８）：８５参照。したがって、前記抗体は、ヒト及び非動物レパートリーの産物とすることができる。ヒト由来であるため、自己抗原に対する反応性の危険を最小限にすることができる。あるいは、標準酵母ディスプレイライブラリー及びディスプレイ技術を使用してヒト抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を選択・単離することもできる。例えば、ナイーブヒト一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）のライブラリーを使用してヒト抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を選択することができる。トランスジェニック動物を使用してヒト抗体を発現させることができる。
ヒト化抗体は、所望の抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子であって、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有するものとすることができる。
前記抗体は、当技術分野で公知のものとは異なる生物学的機能を有するという点で公知抗体と区別することができる。
（１）エピトープ
前記抗体は、ＵＣＨ－Ｌ１（配列番号１）、その断片、又はその変異体と免疫特異的に結合することができる。前記抗体は、エピトープ領域内の少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸を免疫特異的に認識し、これらと結合することができる。前記抗体は、エピトープ領域の少なくとも３連続アミノ酸、少なくとも４連続アミノ酸、少なくとも５連続アミノ酸、少なくとも６連続アミノ酸、少なくとも７連続アミノ酸、少なくとも８連続アミノ酸、少なくとも９連続アミノ酸、又は少なくとも１０連続アミノ酸を免疫特異的に認識し、これらと結合することができる。
ｃ．抗体作製／生産
抗体は、当業者に周知の技術を含む種々の技術のいずれかにより作製することができる。一般に、抗体は、細胞培養技術により作製することができ、従来技術により、あるいは抗体遺伝子、重鎖及び／又は軽鎖を適切な細菌又は哺乳動物細胞宿主にトランスフェクションして抗体を産生させることにより、モノクローナル抗体を作製する方法が挙げられ、前記抗体は組換え体でもよい。「トランスフェクション」なる用語の各種変形は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものとし、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体をアセンブル・分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させるほうが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。
組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入すると、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間をかけて宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。
Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子等の機能的抗体断片を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形を実施してもよい。例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましいと思われる。着目抗原との結合に不要な軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も、前記抗体に含まれる。更に、標準化学的架橋方法により第１の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が第１の抗体であり（即ち、ヒトＵＣＨ－Ｌ１と結合する）、他方の重鎖と軽鎖がヒトＵＣＨ－Ｌ１以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することもできる。
抗体又はその抗原結合部分の好ましい組換え発現システムでは、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションにより、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの内側で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結し、前記遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も組込んでいるので、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択することができる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、培養培地から無傷の抗体を回収する。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するには、標準分子生物学技術を使用する。更に、組換え抗体が合成されるまで宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより、組換え抗体を合成する方法を実施してもよい。前記方法は更に、組換え抗体を培養培地から単離する工程を含むことができる。
モノクローナル抗体の作製方法は、所望の特異性を有する抗体を産生することが可能な不死細胞株の作製を含む。このような細胞株は、免疫動物から取得した脾細胞から作製することができる。動物にＵＣＨ－Ｌ１又はその断片及び／若しくは変異体を免疫することができる。動物に免疫するために使用されるペプチドは、ヒトＦｃ（例えば、ヒト抗体の断片結晶化可能領域又はテール領域）をコードするアミノ酸を含むことができる。次に、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーと融合することにより、脾細胞を不死化させることができる。種々の融合技術を利用することができる。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞を非イオン性界面活性剤で数分間結合させた後、ハイブリッド細胞の増殖を助長するが、骨髄腫細胞の増殖は助長しない選択培地に低密度で撒くことができる。このような技術の１例は、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択を使用する。別の技術は、電気融合法を含む。十分な時間、通常では約１～２週間後に、ハイブリッドのコロニーが認められる。シングルコロニーを選択し、ポリペプチドに対する結合活性についてその培養上清を試験する。高い反応性と特異性を有するハイブリドーマを使用することができる。
増殖中のハイブリドーマコロニーの上清からモノクローナル抗体を単離することができる。更に、収率を上げるために種々の技術を利用することができ、ハイブリドーマ細胞株をマウス等の適切な脊椎動物宿主の腹腔に注入する方法が挙げられる。その後、腹水又は血液からモノクローナル抗体を回収することができる。クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、及び抽出等の従来技術により、汚染物質を抗体から除去することができる。抗体を精製するための工程で使用することができる方法の１例はアフィニティークロマトグラフィーである。
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して数個の断片とし、そのうちの２個（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々無傷の抗原結合部位を含む共有結合的ヘテロダイマーを構成する。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断し、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含む数個の断片にすることができる。
Ｆｖ断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子と、ごく稀であるが、ＩｇＧ又はＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断により作製することができる。Ｆｖ断片は、組換え技術を使用して得ることもできる。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識・結合能の多くを維持する抗原結合部位を含む非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含む。
前記抗体、抗体断片、又は誘導体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットと、夫々ＣＤＲを挟むように配置され、ＣＤＲを支えると共に、ＣＤＲの相互間の空間関係を規定する重鎖及び軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットは、重鎖又は軽鎖Ｖ領域の３個の超可変領域を含むことができる。
必要な特異性の抗体を作製又は単離する他の適切な方法も使用することができ、限定されないが、当技術分野で公知の方法を使用し、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（英国、ケンブリッジシャー）、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ社（英国、スコットランド、アバディーン）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社（スウェーデン、ルンド）等の種々の販売業者から入手可能なペプチド又はタンパク質ライブラリー（例えば、非限定的な例として、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、酵母等のディスプレイライブラリー）から組換え抗体を選択する方法が挙げられる。米国特許第４，７０４，６９２号、５，７２３，３２３号、５，７６３，１９２号、５，８１４，４７６号、５，８１７，４８３号、５，８２４，５１４号、５，９７６，８６２号参照。代替方法は、当技術分野で公知のように、及び／又は本願に記載するように、ヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１－９０７；Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５－１１８；Ｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４－１６１）の免疫に依存する。このような技術としては、限定されないが、リボソームディスプレイ法（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７－４９４２；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０－１４１３５）；シングルセル抗体作製技術（例えば、リンパ球選択抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７－８９２；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３－７８４８））；ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３－３３７；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）．；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５－１６３；Ｋｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７－７９０）；Ｂ細胞選択法（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５－１３４（１９９４））が挙げられる。
当技術分野で公知の多数の手順のいずれか１種により親和性成熟抗体を作製することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟について記載している。Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０－３３１９（１９９５）；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）には、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が記載されている。米国特許第６，９１４，１２８ Ｂ１号には、選択的突然変異誘発位置及び活性増強アミノ酸残基との接触又は超突然変異位置における選択的突然変異が記載されている。
その乳汁中にこのような抗体を産生するトランスジェニック動物又はヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳動物を提供するように、抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に送達することにより、抗体変異体を作製することもできる。これらの方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、５，８４９，９９２号、４，８７３，３１６号、５，８４９，９９２号、５，９９４，６１６号、５，５６５，３６２号、及び５，３０４，４８９号に記載されている。
このような抗体を産生するトランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば、非限定的な例として、タバコ、トウモロコシ、及びアオウキクサ）、特定の部分、又は前記植物部分若しくは前記部分から培養された細胞における変異体を提供するように、ポリヌクレオチドを送達することにより、抗体変異体を作製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５－１１８とその引用文献は、例えば、誘導プロモーターを使用して多量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の生産について記載している。他の組換えシステムで産生されるか又は天然源から精製される哺乳動物タンパク質と同等の生物学的活性を有する哺乳動物タンパク質を商業生産レベルで発現させるために、トランスジェニックトウモロコシが使用されている。例えば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）４６４：１２７－１４７とその引用文献参照。タバコ種子とジャガイモ塊茎をはじめとして、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗体断片を含むトランスジェニック植物種子からも抗体変異体が大量に生産されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１－１０９とその引用文献参照。したがって、公知方法に従い、トランスジェニック植物を使用して抗体を作製することもできる。
例えば、免疫原性を変更するように、又は結合親和性、会合速度、解離速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは他の任意の適切な特性を低下、増強若しくは変更するように、外来配列を付加することにより、抗体誘導体を作製することができる。一般に、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全部を維持し、可変領域と定常領域の非ヒト配列をヒト又は他のアミノ酸で置換する。
低分子抗体断片は、２個の抗原結合部位を有するダイアボディとすることができ、同一ポリペプチド鎖で重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した断片（ＶＨ－ＶＬ）である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８参照。同一の抗体鎖上のこれらの２個のドメインを対合させるには短か過ぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインを別の抗体鎖の相補的ドメインと対合させ、２個の抗原結合部位を形成する。Ｃｈｅｎら名義の米国特許第６，６３２，９２６号は、親抗体の超可変領域に１アミノ酸以上を挿入し、標的抗原に対する結合親和性を前記抗原に対する親抗体の結合親和性の少なくとも約２倍とした抗体変異体を開示しており、その開示内容全体を本願に援用する。
前記抗体は、線状抗体とすることができる。線状抗体の作製手順は、当技術分野で公知であり、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２に記載されている。要約すると、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性とすることができる。
前記抗体は、公知方法により組換え細胞培養から回収・精製することができ、このような方法としては、限定されないが、プロテインＡ精製、硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用できる。
前記抗体を検出可能に標識すると有用であると思われる。抗体をこれらの物質に共役させる方法は当技術分野で公知である。単に例証の目的に過ぎないが、放射性原子、発色団、フルオロフォア等の検出可能な部分で抗体を標識することができる。このような標識抗体をインビボで又は単離した被検試料で診断技術に使用することができる。抗体をサイトカイン、リガンド、別の抗体と連結することができる。抗腫瘍作用を奏するように抗体とカップリングするのに適した物質としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン；アルミニウム（ＩＩＩ）フタロシアニンテトラスルホン酸、ヘマトポルフィリン、及びフタロシアニンを含む光線力学的療法用光増感剤；ヨウ素－１３１（１３１Ｉ）、イットリウム－９０（９０Ｙ）、ビスマス－２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（２１３Ｂｉ）、テクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）、レニウム－１８６（１８６Ｒｅ）、及びレニウム－１８８（１８８Ｒｅ）等の放射性核種；ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、ダウノマイシン、ネオカルジノスタチン、及びカルボプラチン等の抗生物質；ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリンＡ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡ及び天然リシンＡ）、ＴＧＦ－α毒素、タイワンコブラ（ｎａｊａ ａｔｒａ）に由来する細胞毒、及びゲロニン（植物毒素）等の細菌、植物、及び他の毒素；レストリクトシン（アスペルギルス・レストリクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）により産生されるリボソーム不活性化タンパク質）、サポリン（サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）に由来するリボソーム不活性化タンパク質）、及びＲＮａｓｅ等の植物、細菌及び真菌に由来するリボソーム不活性化タンパク質；チロシンキナーゼ阻害剤；ｌｙ２０７７０２（ジフルオロ化プリンヌクレオチド）；抗嚢胞剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサート等）を内包するリポソーム；並びに他の抗体又はＦ（ａｂ）等の抗体断片が挙げられる。
ハイブリドーマ技術、リンパ球選択抗体法（ＳＬＡＭ）、トランスジェニック動物、及び組換え抗体ライブラリーの使用による抗体作製について、以下に詳述する。
（１）ハイブリドーマ技術を使用した抗ＵＣＨ－Ｌ１モノクローナル抗体
ハイブリドーマ技術、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はその組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多様な技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。なお、本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、ハイブリドーマ技術により作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる用語は、任意の真核、原核、又はファージクローンを含むシングルクローンに由来する抗体を意味し、その作製方法を意味するものではない。
モノクローナル抗体の作製方法と、このような方法により作製された抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を含むことができ、前記ハイブリドーマは、ＵＣＨ－Ｌ１を免疫した動物（例えば、ラット又はマウス）から単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合した後、融合から得られたハイブリドーマをスクリーニングし、本発明のポリペプチドと結合することが可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することにより作製することが好ましい。要約すると、ラットにＵＣＨ－Ｌ１抗原を免疫することができる。好ましい１実施形態では、ＵＣＨ－Ｌ１抗原をアジュバントと共に投与し、免疫応答を刺激する。このようなアジュバントとしては、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局所貯留場所に隔離することにより急速に分散しないように保護することができ、又はマクロファージ及び免疫系の他の成分に対して走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有することができる。ポリペプチドを投与する場合には、数週間かけてポリペプチドを２回以上投与する免疫スケジュールが好ましいが、ポリペプチドの単回投与を使用してもよい。
動物にＵＣＨ－Ｌ１抗原を免疫後、動物から抗体及び／又は抗体産生細胞を取得することができる。動物の採血又は屠殺により抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を含有する血清を動物から取得する。血清を動物から取得したまま使用してもよいし、血清から免疫グロブリン画分を取得してもよいし、血清から抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を精製してもよい。こうして取得された血清又は免疫グロブリンは、ポリクローナルであるため、一連の不均一な性質を有する。
免疫応答が検出されたら（例えば、抗原ＵＣＨ－Ｌ１に特異的な抗体がラット血清中で検出されたら）、ラット脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知技術により任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，ＵＳ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０に由来する細胞）と融合する。ハイブリドーマを限界希釈法により選択・クローニングする。次に、ＵＣＨ－Ｌ１と結合することが可能な抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性のハイブリドーマクローンをラットに免疫することにより、一般に高値の抗体を含有する腹水を生成することができる。
別の実施形態では、免疫した動物から抗体を産生する不死化ハイブリドーマを作製することができる。免疫後、動物を屠殺し、当技術分野で周知のように、脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞と融合する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前出参照。好ましい１実施形態において、前記骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌型細胞株）。融合と抗生物質選択後、ＵＣＨ－Ｌ１若しくはその一部、又はＵＣＨ－Ｌ１を発現する細胞を使用してハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい１実施形態では、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して初期スクリーニングを実施する。ＥＬＩＳＡスクリーニングの１例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／３７５０４号に記載されている。
抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングし、堅牢なハイブリドーマ増殖、高収率の抗体産生、及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性について更にスクリーニングする。同系動物、免疫系を欠損する動物（例えば、ヌードマウス）でインビボにて又は細胞培養でインビトロにてハイブリドーマを培養・増殖させることができる。ハイブリドーマの選択、クローニング及び増殖方法は当技術分野における通常の知識を有する者に周知である。
好ましい１実施形態において、ハイブリドーマは、ラットハイブリドーマである。別の実施形態では、マウス、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマ等の非ヒト非ラット生物種でハイブリドーマを産生させる。更に別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を発現するヒト細胞とヒト非分泌型骨髄腫を融合させたヒトハイブリドーマである。
公知技術により、非特異的エピトープを認識する抗体断片を作製することができる。例えば、（２個の同一のＦａｂ断片を作製するために）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するために）ペプシン等の酵素を使用して免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。ＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）２断片は、より大きい（「親」）ＩｇＧ分子の２個の抗原結合部位を維持し、親ＩｇＧ分子の（軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を含む）両方の軽鎖と、重鎖のＣＨ１ドメインと、ジスルフィド形成ヒンジ領域を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は依然として親ＩｇＧ分子と同様に抗原分子と架橋することが可能である。
（２）ＳＬＡＭを使用した抗ＵＣＨ－Ｌ１モノクローナル抗体
本発明の別の態様では、当技術分野でリンパ球選択抗体法（ＳＬＡＭ）と呼ばれ、米国特許第５，６２７，０５２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２５５１号；及びＢａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７８４３－７８４８（１９９６）に記載されているような手順を使用し、単離されたシングルリンパ球から組換え抗体を作製する。この方法では、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用して着目抗体を分泌するシングルセル（例えば、免疫した動物のいずれか１個体に由来するリンパ球）をスクリーニングし、ビオチン等のリンカーを使用して抗原ＵＣＨ－Ｌ１、ＵＣＨ－Ｌ１のサブユニット、又はその断片をヒツジ赤血球とカップリングし、ＵＣＨ－Ｌ１に対して特異性を有する抗体を分泌するシングルセルを同定するために使用する。着目抗体を分泌する細胞を同定後、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞からレスキューした後、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物宿主細胞で適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）のコンテキストにおいてこれらの可変領域を発現させることができる。インビボで選択したリンパ球に由来する免疫グロブリン配列を増幅して宿主細胞にトランスフェクトした後、例えば、トランスフェクトした細胞をパニングすることにより、インビトロで更に分析・選択し、ＵＣＨ－Ｌ１に対する抗体を発現する細胞を単離することができる。増幅した免疫グロブリン配列をインビトロ親和性成熟法等により、インビトロで更に操作することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／５６７７２号参照。
（３）トランスジェニック動物を使用した抗ＵＣＨ－Ｌ１モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物にＵＣＨ－Ｌ１抗原を免疫することにより、抗体を作製する。１実施形態において、前記非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きい断片を含み、マウス抗体産生を欠損する人工マウス系列であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３－２１（１９９４）並びに米国特許第５，９１６，７７１号、５，９３９，５９８号、５，９８５，６１５号、５，９９８，２０９号、６，０７５，１８１号、６，０９１，００１号、６，１１４，５９８号、及び６，１３０，３６４号参照。ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、ＷＯ９４／０２６０２号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９９／４５０３１号、ＷＯ９９／５３０４９号、ＷＯ００／０９５６０号、及びＷＯ００／３７５０４も参照。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座とｘ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列構造ＹＡＣ断片の導入により、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含む。その開示内容を本願に援用するＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７），Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：４８３－４９５（１９９８）参照。
（４）組換え抗体ライブラリーを使用した抗ＵＣＨ－Ｌ１モノクローナル抗体
抗体ライブラリーをスクリーニングして所望のＵＣＨ－Ｌ１結合特異性を有する抗体を同定するインビトロ方法も、本発明の抗体を作製するために使用することができる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングの方法は、当技術分野で周知であり、例えば、各々その開示内容を本願に援用する米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号（Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号（Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．）；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９－１３７２（１９９１）；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１－８５（１９９２）；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５－１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：７２５－７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７３－１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３－４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８－７９８２（１９９１）；米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号に記載されている方法が挙げられる。
前記組換え抗体ライブラリーは、ＵＣＨ－Ｌ１又はＵＣＨ－Ｌ１の一部を免疫した対象に由来することができる。あるいは、前記組換え抗体ライブラリーは、ヒトＵＣＨ－Ｌ１を免疫していないヒト対象に由来するヒト抗体ライブラリーのように、ナイーブ対象（即ち、ＵＣＨ－Ｌ１を免疫していない対象）に由来することができる。本発明の抗体は、ヒトＵＣＨ－Ｌ１を含むペプチドで組換え抗体ライブラリーをスクリーニングしてＵＣＨ－Ｌ１を認識する抗体を選択することにより選択される。このようなスクリーニングと選択を実施する方法は、前の段落に挙げた参考資料に記載されているように、当技術分野で周知である。ＵＣＨ－Ｌ１に対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体（例えば、特定のＫｏｆｆ速度定数でヒトＵＣＨ－Ｌ１から解離する抗体）を選択するためには、当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴法を使用し、所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。ｈＵＣＨ－Ｌ１に対して特定の中和活性を有する本発明の抗体（例えば、特定のＩＣ５０を有する抗体）を選択するためには、ＵＣＨ－Ｌ１活性の阻害を評定する方法として当技術分野で公知の標準方法を使用することができる。
１態様において、本発明は、ヒトＵＣＨ－Ｌ１と結合する単離抗体又はその抗原結合部分に関する。前記抗体は、中和抗体であることが好ましい。種々の実施形態において、前記抗体は、組換え抗体又はモノクローナル抗体である。
例えば、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して抗体を作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含むファージ粒子の表面に前記機能的抗体ドメインを提示させる。レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させるために、このようなファージを利用することができる。例えば、標識抗原又は固相表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉した抗原を使用し、着目抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを抗原で選択又は同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、一般的に、Ｆａｂ抗体ドメイン、Ｆｖ抗体ドメイン、又はジスルフィド結合により安定化させたＦｖ抗体ドメインをファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質と組換え融合させたファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１－５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７－１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２－９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８７：９－１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１－２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、５，５８０，７１７号、５，４２７，９０８号、５，７５０，７５３号、５，８２１，０４７号、５，５７１，６９８号、５，４２７，９０８号、５，５１６，６３７号、５，７８０，２２５号、５，６５８，７２７号、５，７３３，７４３号、及び５，９６９，１０８号に開示されている方法が挙げられる。
上記参考資料に記載されているように、ファージ選択後に、前記ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は他の任意の所望の抗原結合断片を含む全長抗体を作製するために使用し、例えば、以下に詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４－８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：２６－３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１－１０４３（１９８８）に開示されている方法等の当技術分野で公知の方法を使用し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片を組換え生産する技術を利用することもできる。一本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６－８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５－７９９９（１９９３）；並びにＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８－１０４１（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。
ファージディスプレイ法による組換え抗体ライブラリーのスクリーニングの代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法として当技術分野で公知の他の方法を本発明の抗体の同定に適用することもできる。代替発現システムの１例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３１７００号（Ｓｚｏｓｔａｋ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ）、及びＲｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７－１２３０２（１９９７）に記載されているように、組換え抗体ライブラリーをＲＮＡ－タンパク質融合体として発現させるシステムである。このシステムでは、ペプチジルアクセプター抗生物質であるピューロマイシンをその３’末端に付けた合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとこれによりコードされるペプチド又はタンパク質の共有結合的融合体を作製する。したがって、コードされるペプチド又はタンパク質（例えば、抗体又はその部分）の性質（例えば、抗体又はその部分とデュアル特異性抗原との結合）に基づいてｍＲＮＡの複合体混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から特定のｍＲＮＡを集積させることができる。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された抗体又はその部分をコードする核酸配列を上記のような組換え手段により（例えば、哺乳動物宿主細胞で）発現させることができ、更に、上記のように、当初に選択された配列に突然変異を導入したｍＲＮＡ－ペプチド融合体の付加ラウンドのスクリーニングにより、又は組換え抗体の他のインビトロ親和性成熟法により、更に親和性成熟に供することができる。この方法の好ましい１例はＰＲＯｆｕｓｉｏｎディスプレイ技術である。
別のアプローチでは、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を使用して抗体を作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、遺伝子工学的手法を用いて抗体ドメインを酵母細胞壁に繋ぎ、酵母の表面に提示させる。このような酵母を利用してレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例としては、本願に援用する米国特許第６，６９９，６５８号（Ｗｉｔｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．）に開示されている方法が挙げられる。
ｄ．組換えＵＣＨ－Ｌ１抗体の作製
当技術分野で公知の多数の技術のいずれかにより、抗体を作製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種変形は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものとし、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも本発明の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体をアセンブル・分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させるほうが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。
本発明の組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入すると、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間をかけて宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。
Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子等の機能的抗体断片を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形を実施してもよい。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましいと思われる。着目抗原との結合に不要な軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体に含まれる。更に、標準化学的架橋方法により本発明の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と軽鎖が本発明の抗体であり（即ち、ヒトＵＣＨ－Ｌ１と結合する）、他方の重鎖と軽鎖がヒトＵＣＨ－Ｌ１以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することもできる。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の好ましい組換え発現システムでは、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションにより、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの内側で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結し、前記遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も組込んでいるので、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択することができる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、培養培地から無傷の抗体を回収する。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するには、標準分子生物学技術を使用する。更に、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで本発明の宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。前記方法は更に、前記組換え抗体を培養培地から単離する工程を含むことができる。
（１）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、着目抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログ若しくは部分とすることができる。ヒト化抗体は、所望の抗原と結合し、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種抗体に由来することができる。
ＣＤＲに関して本願で使用する「実質的に」なる用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％一致するアミノ酸配列を有するＣＤＲを意味する。ヒト化抗体は、少なくとも１個、一般的には２個の可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。１態様によると、ヒト化抗体は更に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。前記抗体は更に、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及びＣＨ４領域を含むことができる。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖及び／又は重鎖のヒト化可変ドメインのみを含む。
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラスと、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、２種類以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当技術分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化させるように特定の定常ドメインを選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域とＣＤＲ領域は、親配列と厳密に対応する必要はなく、例えば、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれとも対応しないように、少なくとも１アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに突然変異を誘発してもよい。しかし、１実施形態において、このような突然変異は、広範囲にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列と対応するであろう。本願で使用する場合に「コンセンサスフレームワーク」なる用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を意味する。本願で使用する場合に「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は、同族免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、前記ファミリーにおけるその位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占められる。２個のアミノ酸が同等の頻度で存在する場合には、どちらがコンセンサス配列に含まれていてもよい。
齧歯類抗ヒト抗体に対する免疫応答は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療適用の持続時間と有効性を制限するので、このような望ましくない免疫応答を最小限にするように、ヒト化抗体を設計することができる。ヒト化抗体は、非ヒト資源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒト残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、一般的に可変ドメインから取り出される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列に置き換えることにより実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種に由来する対応する配列で置き換えられたキメラ抗体である。例えば、その開示内容を本願に援用する米国特許第４，８１６，５６７号参照。ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、恐らく一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基で置き換えられたヒト抗体とすることができる。本発明の抗体のヒト化又はエンジニアリングは、限定されないが、米国特許第５，７２３，３２３号、５，９７６，８６２号、５，８２４，５１４号、５，８１７，４８３号、５，８１４，４７６号、５，７６３，１９２号、５，７２３，３２３号、５，７６６，８８６号、５，７１４，３５２号、６，２０４，０２３号、６，１８０，３７０号、５，６９３，７６２号、５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、５，２２５，５３９号、及び４，８１６，５６７号に記載されている方法等の任意の公知方法を使用して実施することができる。
ヒト化抗体は、ＵＣＨ－Ｌ１に対する高い親和性と、他の好ましい生物学的性質を維持することができる。ヒト化抗体は、親配列とヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列と種々の概念ヒト化産物の分析法により作製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、広く入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体構造を描画・表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予想される役割を解析することができ、即ち、その抗原と結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基を解析することができる。こうして、ＵＣＨ－Ｌ１に対する親和性の増加等の望ましい抗体特性が得られるように、レシピエント配列とインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、抗原結合に影響を与えるのに直接的且つ最も実質的に関与しているのは、超可変領域残基であると思われる。
ヒト化の代用として、ヒト抗体（本願では「完全ヒト抗体」とも言う）を作製することもできる。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ及び／又は酵母関連技術により、ライブラリーからヒト抗体を単離することが可能である。トランスジェニック動物（例えば、免疫後に、内在性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なマウス）を作製することも可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内在性抗体産生が完全に阻害される。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子配列をこのような生殖細胞系列突然変異体マウスに移入すると、抗原チャレンジ後にヒト抗体が産生されるであろう。ヒト化抗体又は完全ヒト抗体は、各々その開示内容を本願に援用する米国特許第５，７７０，４２９号、５，８３３，９８５号、５，８３７，２４３号、５，９２２，８４５号、６，０１７，５１７号、６，０９６，３１１号、６，１１１，１６６号、６，２７０，７６５号、６，３０３，７５５号、６，３６５，１１６号、６，４１０，６９０号、６，６８２，９２８号、及び６，９８４，７２０号に記載されている方法に従って作製することができる。
ｅ．抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体
上記技術と、当技術分野で公知の慣用技術を使用して抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体を作製することができる。所定の実施形態において、抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号：０３１３２０）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号：３５２４）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号：ＨＰＡ００５９９３）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（カタログ番号：ｓｃ－５８５９３又はｓｃ－５８５９４）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号：ＭＡＢ６００７）、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カタログ番号：ＮＢ６００－１１６０）、Ｂｉｏｒｂｙｔ（カタログ番号：ｏｒｂ３３７１５）、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（カタログ番号：ＡＤＩ－９０５－５２０－１）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（カタログ番号：ＶＭＡ００００４）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（カタログ番号：６１３０－５０）、Ａｂｃａｍ（カタログ番号：ａｂ７５２７５又はａｂ１０４９３８）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（カタログ番号：４８００１２）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号：ＭＡ１－４６０７９、ＭＡ５－１７２３５、ＭＡ１－９０００８、又はＭＡ１－８３４２８）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号：ＭＡＢＮ４８）、又はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（カタログ番号：５０６９０－Ｒ０１１）の各社から入手可能なＵＣＨ－Ｌ１抗体等の共役していない抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体とすることができる。ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（カタログ番号：６９６０－２５）又はＡｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃａｔ．Ｎｏｓ．ＯＡＡＦ０１９０４－ＦＩＴＣ）の各社から入手可能な共役ＵＣＨ－Ｌ１抗体のように、ＵＣＨ－Ｌ１抗体をフルオロフォアと共役させてもよい。
６．ＧＦＡＰ値の測定方法
上記方法では、任意の手段によりＧＦＡＰ値を測定することができ、イムノアッセイ、タンパク質免疫沈降法、免疫電気泳動法、化学分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析又はタンパク質免疫染色法、電気泳動分析、タンパク質アッセイ、競合結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ等の抗体依存方法や、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等のクロマトグラフィー又はスペクトロメトリー法が挙げられる。また、当業者に公知のように、臨床化学フォーマットで前記アッセイを利用することもできる。
所定の実施形態において、ＧＦＡＰ値の測定は、前記試料を第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーと接触させる工程を含む。所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、捕捉抗体であり、前記第２の特異的結合メンバーは、検出抗体である。所定の実施形態において、ＧＦＡＰ値の測定は、捕捉抗体とＧＦＡＰ抗原と検出抗体の複合体（例えば、ＧＦＡＰ捕捉抗体とＧＦＡＰ抗原とＧＦＡＰ検出抗体の複合体）が形成されるように、前記試料を、（１）ＧＦＡＰ又はＧＦＡＰ断片上のエピトープと結合して捕捉抗体とＧＦＡＰ抗原の複合体（例えば、ＧＦＡＰ捕捉抗体とＧＦＡＰ抗原の複合体）を形成する捕捉抗体（例えば、ＧＦＡＰ捕捉抗体）と、（２）検出可能なラベルを含み、捕捉抗体と結合していないＧＦＡＰ上のエピトープと結合してＧＦＡＰ抗原と検出抗体の複合体（例えば、ＧＦＡＰ抗原とＧＦＡＰ検出抗体の複合体）を形成する検出抗体（例えば、ＧＦＡＰ検出抗体）とに、同時又は任意の順序で逐次接触させる工程と、前記捕捉抗体とＧＦＡＰ抗原と検出抗体の複合体中の検出可能なラベルにより発生されるシグナルに基づいて前記試料中のＧＦＡＰの量又は濃度を測定する工程を含む。
所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、固相担体に固相化されている。所定の実施形態において、前記第２の特異的結合メンバーは、固相担体に固相化されている。所定の実施形態において、前記第１の特異的結合メンバーは、以下に記載するようなＧＦＡＰ抗体である。
所定の実施形態において、前記試料は、希釈されているか、又は希釈されていない。前記試料は、約１～約２５マイクロリットル、約１～約２４マイクロリットル、約１～約２３マイクロリットル、約１～約２２マイクロリットル、約１～約２１マイクロリットル、約１～約２０マイクロリットル、約１～約１８マイクロリットル、約１～約１７マイクロリットル、約１～約１６マイクロリットル、約１５マイクロリットル又は約１マイクロリットル、約２マイクロリットル、約３マイクロリットル、約４マイクロリットル、約５マイクロリットル、約６マイクロリットル、約７マイクロリットル、約８マイクロリットル、約９マイクロリットル、約１０マイクロリットル、約１１マイクロリットル、約１２マイクロリットル、約１３マイクロリットル、約１４マイクロリットル、約１５マイクロリットル、約１６マイクロリットル、約１７マイクロリットル、約１８マイクロリットル、約１９マイクロリットル、約２０マイクロリットル、約２１マイクロリットル、約２２マイクロリットル、約２３マイクロリットル、約２４マイクロリットル又は約２５マイクロリットルとすることができる。所定の実施形態において、前記試料は、約１～約１５０マイクロリットル以下又は約１～約２５マイクロリットル以下である。
ポイントオブケアデバイス以外の（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製機器ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）や、他のコアラボラトリー機器等の）所定の機器は、試料中の２５，０００ｐｇ／ｍＬ超のＧＦＡＰ値を測定することが可能であると思われる。
他の検出方法としては、ナノポアデバイス又はナノウェルデバイスの使用が挙げられ、あるいはこれらのデバイスで使用するように適応させることができる。ナノポアデバイスの例は、その開示内容全体を本願に援用する国際特許公開第ＷＯ２０１６／１６１４０２号に記載されている。ナノウェルデバイスの例は、その開示内容全体を本願に援用する国際特許公開第ＷＯ２０１６／１６１４００号に記載されている。
７．ＧＦＡＰ抗体
本願に記載する方法は、グリア線維性酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」）（又はその断片）と特異的に結合する単離抗体（「ＧＦＡＰ抗体」と言う）を使用することができる。ＧＦＡＰ抗体は、外傷性脳損傷の尺度としてのＧＦＡＰ状態を評定するため、試料中のＧＦＡＰの存在を検出するため、試料中に存在するＧＦＡＰの量を定量するため、又は試料中のＧＦＡＰの存在を検出し、定量するために使用することができる。
ａ．グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、アストロサイトにおける細胞骨格の一部を構成する５０ｋＤａ細胞質内繊維状タンパク質であり、アストロサイト由来細胞に最も特異的なマーカーであることが証明されている。ＧＦＡＰタンパク質は、ヒトではＧＦＡＰ遺伝子によりコードされる。ＧＦＡＰは、成熟アストロサイトの主要な中間径フィラメントである。分子の中心ロッドドメインにおいて、ＧＦＡＰは、他の中間径フィラメントと顕著な構造相同性を有する。ＧＦＡＰは、アストロサイト突起に構造安定性を提供することにより、アストロサイト運動性及び形状に関与する。グリア線維性酸性タンパク質とその分解物（ＧＦＡＰ－ＢＤＰ）は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）後に病態生理学的応答の一部として血液中に放出される脳特異的タンパク質である。外傷、遺伝障害、又は化学物質により起因するヒトＣＮＳの損傷後、アストロサイトは増殖し、細胞本体及び突起の広範な肥大を示し、ＧＦＡＰが著しくアップレギュレートされる。一方、アストロサイト悪性度の上昇と共に、ＧＦＡＰ産生の漸進的低下が生じる。ＧＦＡＰは、シュワン細胞、腸管グリア細胞、唾液腺新生物、転移性腎臓がん、喉頭蓋軟骨、下垂体細胞、未成熟乏突起膠細胞、乳頭状髄膜腫、及び乳房の筋上皮細胞でも検出することができる。
ヒトＧＦＡＰは、以下のアミノ酸配列を有することができる。
Figure 2023552755000004
 ヒトＧＦＡＰは、配列番号２の断片又は変異体でもよい。ＧＦＡＰの断片は、５～４００アミノ酸長、１０～４００アミノ酸長、５０～４００アミノ酸長、６０～４００アミノ酸長、６５～４００アミノ酸長、１００～４００アミノ酸長、１５０～４００アミノ酸長、１００～３００アミノ酸長、又は２００～３００アミノ酸長とすることができる。前記断片は、配列番号２に由来する連続数のアミノ酸を含むことができる。配列番号２のヒトＧＦＡＰ断片又は変異体は、ＧＦＡＰ分解物（ＢＤＰ）でもよい。ＧＦＡＰ ＢＤＰは、３８ｋＤａ、４２ｋＤａ（低分子４１ｋＤａ）、４７ｋＤａ（低分子４５ｋＤａ）、２５ｋＤａ（低分子２３ｋＤａ）、１９ｋＤａ、又は２０ｋＤａとすることができる。
ｂ．ＧＦＡＰ認識抗体
本抗体は、ＧＦＡＰ、その断片、ＧＦＡＰのエピトープ、又はその変異体と結合する抗体である。前記抗体は、抗ＧＦＡＰ抗体の断片又はその変異体若しくは誘導体でもよい。前記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。前記抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、若しくはＦａｂ断片等の抗体断片、又はその混合物とすることができる。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖ断片を含むことができる。抗体誘導体は、ペプチドミメティクスにより作製することができる。更に、一本鎖抗体の作製について記載されている技術を応用して一本鎖抗体を作製することもできる。
前記抗ＧＦＡＰ抗体は、キメラ抗ＧＦＡＰ抗体又はヒト化抗ＧＦＡＰ抗体とすることができる。１実施形態において、前記ヒト化抗体及びキメラ抗体はいずれも一価である。１実施形態において、前記ヒト化抗体及びキメラ抗体は、いずれもＦｃ領域と連結された１個のＦａｂ領域を含む。
ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから得ることができる。ヒト抗体は、ヒトインビボ免疫応答の結果として作製・単離することができる。例えば、Ｆｕｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８（８）：８５参照。したがって、前記抗体は、ヒト及び非動物レパートリーの産物とすることができる。ヒト由来であるため、自己抗原に対する反応性の危険を最小限にすることができる。あるいは、標準酵母ディスプレイライブラリー及びディスプレイ技術を使用してヒト抗ＧＦＡＰ抗体を選択・単離することもできる。例えば、ナイーブヒト一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）のライブラリーを使用してヒト抗ＧＦＡＰ抗体を選択することができる。トランスジェニック動物を使用してヒト抗体を発現させることができる。
ヒト化抗体は、所望の抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子であって、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有するものとすることができる。
前記抗体は、当技術分野で公知のものとは異なる生物学的機能を有するという点で公知抗体と区別することができる。
（１）エピトープ
前記抗体は、ＧＦＡＰ（配列番号２）、その断片、又はその変異体と免疫特異的に結合することができる。前記抗体は、エピトープ領域内の少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸を免疫特異的に認識し、これらと結合することができる。前記抗体は、エピトープ領域の少なくとも３連続アミノ酸、少なくとも４連続アミノ酸、少なくとも５連続アミノ酸、少なくとも６連続アミノ酸、少なくとも７連続アミノ酸、少なくとも８連続アミノ酸、少なくとも９連続アミノ酸、又は少なくとも１０連続アミノ酸を免疫特異的に認識し、これらと結合することができる。
ｃ．抗体作製／生産
抗体は、当業者に周知の技術を含む種々の技術のいずれかにより作製することができる。一般に、抗体は、細胞培養技術により作製することができ、従来技術により、あるいは抗体遺伝子、重鎖及び／又は軽鎖を適切な細菌又は哺乳動物細胞宿主にトランスフェクションして抗体を産生させることにより、モノクローナル抗体を作製する方法が挙げられ、前記抗体は組換え体でもよい。「トランスフェクション」なる用語の各種変形は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものとし、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体をアセンブル・分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させるほうが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。
組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入すると、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間をかけて宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。
Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子等の機能的抗体断片を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形を実施してもよい。例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましいと思われる。着目抗原との結合に不要な軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も、前記抗体に含まれる。更に、標準化学的架橋方法により第１の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が第１の抗体であり（即ち、ヒトＧＦＡＰと結合する）、他方の重鎖と軽鎖がヒトＧＦＡＰ以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することもできる。
抗体又はその抗原結合部分の好ましい組換え発現システムでは、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションにより、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの内側で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結し、前記遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も組込んでいるので、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択することができる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、培養培地から無傷の抗体を回収する。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するには、標準分子生物学技術を使用する。更に、組換え抗体が合成されるまで宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより、組換え抗体を合成する方法を実施してもよい。前記方法は更に、組換え抗体を培養培地から単離する工程を含むことができる。
モノクローナル抗体の作製方法は、所望の特異性を有する抗体を産生することが可能な不死細胞株の作製を含む。このような細胞株は、免疫動物から取得した脾細胞から作製することができる。動物にＧＦＡＰ又はその断片及び／若しくは変異体を免疫することができる。動物に免疫するために使用されるペプチドは、ヒトＦｃ（例えば、ヒト抗体の断片結晶化可能領域又はテール領域）をコードするアミノ酸を含むことができる。次に、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーと融合することにより、脾細胞を不死化させることができる。種々の融合技術を利用することができる。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞を非イオン性界面活性剤で数分間結合させた後、ハイブリッド細胞の増殖を助長するが、骨髄腫細胞の増殖は助長しない選択培地に低密度で撒くことができる。このような技術の１例は、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択を使用する。別の技術は、電気融合法を含む。十分な時間、通常では約１～２週間後に、ハイブリッドのコロニーが認められる。シングルコロニーを選択し、ポリペプチドに対する結合活性についてその培養上清を試験する。高い反応性と特異性を有するハイブリドーマを使用することができる。
増殖中のハイブリドーマコロニーの上清からモノクローナル抗体を単離することができる。更に、収率を上げるために種々の技術を利用することができ、ハイブリドーマ細胞株をマウス等の適切な脊椎動物宿主の腹腔に注入する方法が挙げられる。その後、腹水又は血液からモノクローナル抗体を回収することができる。クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、及び抽出等の従来技術により、汚染物質を抗体から除去することができる。抗体を精製するための工程で使用することができる方法の１例はアフィニティークロマトグラフィーである。
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して数個の断片とし、そのうちの２個（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々無傷の抗原結合部位を含む共有結合的ヘテロダイマーを構成する。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断し、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含む数個の断片にすることができる。
Ｆｖ断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子と、ごく稀であるが、ＩｇＧ又はＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断により作製することができる。Ｆｖ断片は、組換え技術を使用して得ることもできる。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識・結合能の多くを維持する抗原結合部位を含む非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含む。
前記抗体、抗体断片、又は誘導体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットと、夫々ＣＤＲを挟むように配置され、ＣＤＲを支えると共に、ＣＤＲの相互間の空間関係を規定する重鎖及び軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットは、重鎖又は軽鎖Ｖ領域の３個の超可変領域を含むことができる。
必要な特異性の抗体を作製又は単離する他の適切な方法も使用することができ、限定されないが、当技術分野で公知の方法を使用し、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（英国、ケンブリッジシャー）、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ社（英国、スコットランド、アバディーン）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社（スウェーデン、ルンド）等の種々の販売業者から入手可能なペプチド又はタンパク質ライブラリー（例えば、非限定的な例として、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、酵母等のディスプレイライブラリー）から組換え抗体を選択する方法が挙げられる。米国特許第４，７０４，６９２号、５，７２３，３２３号、５，７６３，１９２号、５，８１４，４７６号、５，８１７，４８３号、５，８２４，５１４号、５，９７６，８６２号参照。代替方法は、当技術分野で公知のように、及び／又は本願に記載するように、ヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１－９０７；Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５－１１８；Ｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４－１６１）の免疫に依存する。このような技術としては、限定されないが、リボソームディスプレイ法（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７－４９４２；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０－１４１３５）；シングルセル抗体作製技術（例えば、リンパ球選択抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号，Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７－８９２；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３－７８４８））；ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３－３３７；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）．；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５－１６３；Ｋｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７－７９０）；Ｂ細胞選択法（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５－１３４（１９９４））が挙げられる。
当技術分野で公知の多数の手順のいずれか１種により親和性成熟抗体を作製することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟について記載している。Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０－３３１９（１９９５）；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）には、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が記載されている。米国特許第６，９１４，１２８ Ｂ１号には、選択的突然変異誘発位置及び活性増強アミノ酸残基との接触又は超突然変異位置における選択的突然変異が記載されている。
その乳汁中にこのような抗体を産生するトランスジェニック動物又はヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳動物を作製するように、抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に送達することにより、抗体変異体を作製することもできる。これらの方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、５，８４９，９９２号、４，８７３，３１６号、５，８４９，９９２号、５，９９４，６１６号、５，５６５，３６２号、及び５，３０４，４８９号に記載されている。
このような抗体を産生するトランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば、非限定的な例として、タバコ、トウモロコシ、及びアオウキクサ）、特定の部分、又は前記植物部分若しくは前記部分から培養された細胞における変異体を提供するように、ポリヌクレオチドを送達することにより、抗体変異体を作製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５－１１８とその引用文献は、例えば、誘導プロモーターを使用して多量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の生産について記載している。他の組換えシステムで産生されるか又は天然源から精製される哺乳動物タンパク質と同等の生物学的活性を有する哺乳動物タンパク質を商業生産レベルで発現させるために、トランスジェニックトウモロコシが使用されている。例えば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）４６４：１２７－１４７とその引用文献参照。タバコ種子とジャガイモ塊茎をはじめとして、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗体断片を含むトランスジェニック植物種子からも抗体変異体が大量に生産されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１－１０９とその引用文献参照。したがって、公知方法に従い、トランスジェニック植物を使用して抗体を作製することもできる。
例えば、免疫原性を変更するように、又は結合親和性、会合速度、解離速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは他の任意の適切な特性を低下、増強若しくは変更するように、外来配列を付加することにより、抗体誘導体を作製することができる。一般に、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全部を維持し、可変領域と定常領域の非ヒト配列をヒト又は他のアミノ酸で置換する。
低分子抗体断片は、２個の抗原結合部位を有するダイアボディとすることができ、同一ポリペプチド鎖で重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した断片（ＶＨ－ＶＬ）である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８参照。同一の抗体鎖上のこれらの２個のドメインを対合させるには短か過ぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインを別の抗体鎖の相補的ドメインと対合させ、２個の抗原結合部位を形成する。Ｃｈｅｎら名義の米国特許第６，６３２，９２６号は、親抗体の超可変領域に１アミノ酸以上を挿入し、標的抗原に対する結合親和性を前記抗原に対する親抗体の結合親和性の少なくとも約２倍とした抗体変異体を開示しており、その開示内容全体を本願に援用する。
前記抗体は、線状抗体とすることができる。線状抗体の作製手順は、当技術分野で公知であり、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２に記載されている。要約すると、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性とすることができる。
前記抗体は、公知方法により組換え細胞培養から回収・精製することができ、このような方法としては、限定されないが、プロテインＡ精製、硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用できる。
前記抗体を検出可能に標識すると有用であると思われる。抗体をこれらの物質に共役させる方法は当技術分野で公知である。単に例証の目的に過ぎないが、放射性原子、発色団、フルオロフォア等の検出可能な部分で抗体を標識することができる。このような標識抗体をインビボで又は単離した被検試料で診断技術に使用することができる。抗体をサイトカイン、リガンド、別の抗体と連結することができる。抗腫瘍作用を奏するように抗体とカップリングするのに適した物質としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン；アルミニウム（ＩＩＩ）フタロシアニンテトラスルホン酸、ヘマトポルフィリン、及びフタロシアニンを含む光線力学的療法用光増感剤；ヨウ素－１３１（１３１Ｉ）、イットリウム－９０（９０Ｙ）、ビスマス－２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（２１３Ｂｉ）、テクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）、レニウム－１８６（１８６Ｒｅ）、及びレニウム－１８８（１８８Ｒｅ）等の放射性核種；ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、ダウノマイシン、ネオカルジノスタチン、及びカルボプラチン等の抗生物質；ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリンＡ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡ及び天然リシンＡ）、ＴＧＦ－α毒素、タイワンコブラ（ｎａｊａ ａｔｒａ）に由来する細胞毒、及びゲロニン（植物毒素）等の細菌、植物、及び他の毒素；レストリクトシン（アスペルギルス・レストリクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）により産生されるリボソーム不活性化タンパク質）、サポリン（サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）に由来するリボソーム不活性化タンパク質）、及びＲＮａｓｅ等の植物、細菌及び真菌に由来するリボソーム不活性化タンパク質；チロシンキナーゼ阻害剤；ｌｙ２０７７０２（ジフルオロ化プリンヌクレオチド）；抗嚢胞剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサート等）を内包するリポソーム；並びに他の抗体又はＦ（ａｂ）等の抗体断片が挙げられる。
ハイブリドーマ技術、リンパ球選択抗体法（ＳＬＡＭ）、トランスジェニック動物、及び組換え抗体ライブラリーの使用による抗体作製について、以下に詳述する。
（１）ハイブリドーマ技術を使用した抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体
ハイブリドーマ技術、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はその組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多様な技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。なお、本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、ハイブリドーマ技術により作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる用語は、任意の真核、原核、又はファージクローンを含むシングルクローンに由来する抗体を意味し、その作製方法を意味するものではない。
モノクローナル抗体の作製方法と、このような方法により作製された抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を含むことができ、前記ハイブリドーマは、ＧＦＡＰを免疫した動物（例えば、ラット又はマウス）から単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合した後、融合から得られたハイブリドーマをスクリーニングし、本発明のポリペプチドと結合することが可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することにより作製することが好ましい。要約すると、ラットにＧＦＡＰ抗原を免疫することができる。好ましい１実施形態では、ＧＦＡＰ抗原をアジュバントと共に投与し、免疫応答を刺激する。このようなアジュバントとしては、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局所貯留場所に隔離することにより急速に分散しないように保護することができ、又はマクロファージ及び免疫系の他の成分に対して走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有することができる。ポリペプチドを投与する場合には、数週間かけてポリペプチドを２回以上投与する免疫スケジュールが好ましいが、ポリペプチドの単回投与を使用してもよい。
動物にＧＦＡＰ抗原抗原を免疫後、動物から抗体及び／又は抗体産生細胞を取得することができる。動物の採血又は屠殺により抗ＧＦＡＰ抗体を含有する血清を動物から取得する。血清を動物から取得したまま使用してもよいし、血清から免疫グロブリン画分を取得してもよいし、血清から抗ＧＦＡＰ抗体を精製してもよい。こうして取得された血清又は免疫グロブリンは、ポリクローナルであるため、一連の不均一な性質を有する。
免疫応答が検出されたら（例えば、抗原ＧＦＡＰに特異的な抗体がラット血清中で検出されたら）、ラット脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知技術により任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，ＵＳ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０に由来する細胞）と融合する。ハイブリドーマを限界希釈法により選択・クローニングする。次に、ＧＦＡＰと結合することが可能な抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性のハイブリドーマクローンをラットに免疫することにより、一般に高値の抗体を含有する腹水を生成することができる。
別の実施形態では、免疫した動物から不死化ハイブリドーマを産生する抗体を作製することができる。免疫後、動物を屠殺し、当技術分野で周知のように、脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞と融合する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前出参照。好ましい１実施形態において、前記骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌型細胞株）。融合と抗生物質選択後、ＧＦＡＰ若しくはその一部、又はＧＦＡＰを発現する細胞を使用してハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい１実施形態では、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して初期スクリーニングを実施する。ＥＬＩＳＡスクリーニングの１例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／３７５０４号に記載されている。
抗ＧＦＡＰ抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングし、堅牢なハイブリドーマ増殖、高収率の抗体産生、及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性について更にスクリーニングする。同系動物、免疫系を欠損する動物（例えば、ヌードマウス）でインビボにて又は細胞培養でインビトロにてハイブリドーマを培養・増殖させることができる。ハイブリドーマの選択、クローニング及び増殖方法は当技術分野における通常の知識を有する者に周知である。
好ましい１実施形態において、ハイブリドーマは、ラットハイブリドーマである。別の実施形態では、マウス、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマ等の非ヒト非ラット生物種でハイブリドーマを産生させる。更に別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、抗ＧＦＡＰ抗体を発現するヒト細胞とヒト非分泌型骨髄腫を融合させたヒトハイブリドーマである。
公知技術により、非特異的エピトープを認識する抗体断片を作製することができる。例えば、（２個の同一のＦａｂ断片を作製するために）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するために）ペプシン等の酵素を使用して免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。ＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）２断片は、より大きい（「親」）ＩｇＧ分子の２個の抗原結合部位を維持し、親ＩｇＧ分子の（軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を含む）両方の軽鎖と、重鎖のＣＨ１ドメインと、ジスルフィド形成ヒンジ領域を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は依然として親ＩｇＧ分子と同様に抗原分子と架橋することが可能である。
（２）ＳＬＡＭを使用した抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体
本発明の別の態様では、当技術分野でリンパ球選択抗体法（ＳＬＡＭ）と呼ばれ、米国特許第５，６２７，０５２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２５５１号；及びＢａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７８４３－７８４８（１９９６）に記載されているような手順を使用し、単離されたシングルリンパ球から組換え抗体を作製する。この方法では、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用して着目抗体を分泌するシングルセル（例えば、免疫した動物のいずれか１個体に由来するリンパ球）をスクリーニングし、ビオチン等のリンカーを使用して抗原ＧＦＡＰ、ＧＦＡＰのサブユニット、又はその断片をヒツジ赤血球とカップリングし、ＧＦＡＰに対して特異性を有する抗体を分泌するシングルセルを同定するために使用する。着目抗体を分泌する細胞を同定後、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞からレスキューした後、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物宿主細胞で適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）のコンテキストにおいてこれらの可変領域を発現させることができる。インビボで選択したリンパ球に由来する免疫グロブリン配列を増幅して宿主細胞にトランスフェクトした後、例えば、トランスフェクトした細胞をパニングすることにより、インビトロで更に分析・選択し、ＧＦＡＰに対する抗体を発現する細胞を単離することができる。増幅した免疫グロブリン配列をインビトロ親和性成熟法等により、インビトロで更に操作することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／５６７７２号参照。
（３）トランスジェニック動物を使用した抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物にＧＦＡＰ抗原を免疫することにより、抗体を作製する。１実施形態において、前記非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きい断片を含み、マウス抗体産生を欠損する人工マウス系列であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３－２１（１９９４）並びに米国特許第５，９１６，７７１号、５，９３９，５９８号、５，９８５，６１５号、５，９９８，２０９号、６，０７５，１８１号、６，０９１，００１号、６，１１４，５９８号、及び６，１３０，３６４号参照。ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、ＷＯ９４／０２６０２号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９９／４５０３１号、ＷＯ９９／５３０４９号、ＷＯ００／０９５６０号、及びＷＯ００／３７５０４も参照。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ｒ）トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座とｘ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列構造ＹＡＣ断片の導入により、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含む。その開示内容を本願に援用するＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７），Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：４８３－４９５（１９９８）参照。
（４）組換え抗体ライブラリーを使用した抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体
抗体ライブラリーをスクリーニングして所望のＧＦＡＰ結合特異性を有する抗体を同定するインビトロ方法も、本発明の抗体を作製するために使用することができる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングの方法は、当技術分野で周知であり、例えば、各々その開示内容を本願に援用する米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号（Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号（Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．）；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９－１３７２（１９９１）；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１－８５（１９９２）；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５－１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：７２５－７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７３－１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３－４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８－７９８２（１９９１）；米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号に記載されている方法が挙げられる。
前記組換え抗体ライブラリーは、ＧＦＡＰ又はＧＦＡＰの一部を免疫した対象に由来することができる。あるいは、前記組換え抗体ライブラリーは、ヒトＧＦＡＰを免疫していないヒト対象に由来するヒト抗体ライブラリーのように、ナイーブ対象（即ち、ＧＦＡＰを免疫していない対象）に由来することができる。本発明の抗体は、ヒトＧＦＡＰを含むペプチドで組換え抗体ライブラリーをスクリーニングしてＧＦＡＰを認識する抗体を選択することにより選択される。このようなスクリーニングと選択を実施する方法は、前の段落に挙げた参考資料に記載されているように、当技術分野で周知である。ＧＦＡＰに対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体（例えば、特定のＫｏｆｆ速度定数でヒトＧＦＡＰから解離する抗体）を選択するためには、当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴法を使用し、所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。ＧＦＡＰに対して特定の中和活性を有する本発明の抗体（例えば、特定のＩＣ５０を有する抗体）を選択するためには、ＧＦＡＰ活性の阻害を評定する方法として当技術分野で公知の標準方法を使用することができる。
１態様において、本発明は、ヒトＧＦＡＰと結合する単離抗体又はその抗原結合部分に関する。前記抗体は、中和抗体であることが好ましい。種々の実施形態において、前記抗体は、組換え抗体又はモノクローナル抗体である。
例えば、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して抗体を作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含むファージ粒子の表面に前記機能的抗体ドメインを提示させる。レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させるために、このようなファージを利用することができる。例えば、標識抗原又は固相表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉した抗原を使用し、着目抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを抗原で選択又は同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、一般的に、Ｆａｂ抗体ドメイン、Ｆｖ抗体ドメイン、又はジスルフィド結合により安定化させたＦｖ抗体ドメインをファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質と組換え融合させたファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１－５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７－１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２－９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８７：９－１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１－２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、５，５８０，７１７号、５，４２７，９０８号、５，７５０，７５３号、５，８２１，０４７号、５，５７１，６９８号、５，４２７，９０８号、５，５１６，６３７号、５，７８０，２２５号、５，６５８，７２７号、５，７３３，７４３号、及び５，９６９，１０８号に開示されている方法が挙げられる。
上記参考資料に記載されているように、ファージ選択後に、前記ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は他の任意の所望の抗原結合断片を含む全長抗体を作製するために使用し、例えば、以下に詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４－８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：２６－３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１－１０４３（１９８８）に開示されている方法等の当技術分野で公知の方法を使用し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片を組換え生産する技術を利用することもできる。一本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６－８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５－７９９９（１９９３）；並びにＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８－１０４１（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。
ファージディスプレイ法による組換え抗体ライブラリーのスクリーニングの代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法として当技術分野で公知の他の方法を本発明の抗体の同定に適用することもできる。代替発現システムの１例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３１７００号（Ｓｚｏｓｔａｋ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ）、及びＲｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７－１２３０２（１９９７）に記載されているように、組換え抗体ライブラリーをＲＮＡ－タンパク質融合体として発現させるシステムである。このシステムでは、ペプチジルアクセプター抗生物質であるピューロマイシンをその３’末端に付けた合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとこれによりコードされるペプチド又はタンパク質の共有結合的融合体を作製する。したがって、コードされるペプチド又はタンパク質（例えば、抗体又はその部分）の性質（例えば、抗体又はその部分とデュアル特異性抗原との結合）に基づいてｍＲＮＡの複合体混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から特定のｍＲＮＡを集積させることができる。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された抗体又はその部分をコードする核酸配列を上記のような組換え手段により（例えば、哺乳動物宿主細胞で）発現させることができ、更に、上記のように、当初に選択された配列に突然変異を導入したｍＲＮＡ－ペプチド融合体の付加ラウンドのスクリーニングにより、又は組換え抗体の他のインビトロ親和性成熟法により、更に親和性成熟に供することができる。この方法の好ましい１例はＰＲＯｆｕｓｉｏｎディスプレイ技術である。
別のアプローチでは、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を使用して抗体を作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、遺伝子工学的手法を用いて抗体ドメインを酵母細胞壁に繋ぎ、酵母の表面に提示させる。このような酵母を利用してレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例としては、本願に援用する米国特許第６，６９９，６５８号（Ｗｉｔｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．）に開示されている方法が挙げられる。
ｄ．組換えＧＦＡＰ抗体の作製
当技術分野で公知の多数の技術のいずれかにより、抗体を作製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種変形は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものとし、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも本発明の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体をアセンブル・分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させるほうが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。
本発明の組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入すると、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間をかけて宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。
Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子等の機能的抗体断片を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形を実施してもよい。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましいと思われる。着目抗原との結合に不要な軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体に含まれる。更に、標準化学的架橋方法により本発明の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と軽鎖が本発明の抗体であり（即ち、ヒトＧＦＡＰと結合する）、他方の重鎖と軽鎖がヒトＧＦＡＰ以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することもできる。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の好ましい組換え発現システムでは、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションにより、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの内側で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結し、前記遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も組込んでいるので、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択することができる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、培養培地から無傷の抗体を回収する。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するには、標準分子生物学技術を使用する。更に、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで本発明の宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。前記方法は更に、前記組換え抗体を培養培地から単離する工程を含むことができる。
（１）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、着目抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログ若しくは部分とすることができる。ヒト化抗体は、所望の抗原と結合し、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種抗体に由来することができる。
ＣＤＲに関して本願で使用する「実質的に」なる用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％一致するアミノ酸配列を有するＣＤＲを意味する。ヒト化抗体は、少なくとも１個、一般的には２個の可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。１態様によると、ヒト化抗体は更に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。前記抗体は更に、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及びＣＨ４領域を含むことができる。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖及び／又は重鎖のヒト化可変ドメインのみを含む。
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラスと、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、２種類以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当技術分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化させるように特定の定常ドメインを選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域とＣＤＲ領域は、親配列と厳密に対応する必要はなく、例えば、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれとも対応しないように、少なくとも１アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに突然変異を誘発してもよい。しかし、１実施形態において、このような突然変異は、広範囲にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列と対応するであろう。本願で使用する場合に「コンセンサスフレームワーク」なる用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を意味する。本願で使用する場合に「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は、同族免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、前記ファミリーにおけるその位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占められる。２個のアミノ酸が同等の頻度で存在する場合には、どちらがコンセンサス配列に含まれていてもよい。
齧歯類抗ヒト抗体に対する免疫応答は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療適用の持続時間と有効性を制限するので、このような望ましくない免疫応答を最小限にするように、ヒト化抗体を設計することができる。ヒト化抗体は、非ヒト資源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒト残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、一般的に可変ドメインから取り出される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列に置き換えることにより実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種に由来する対応する配列で置き換えられたキメラ抗体である。例えば、その開示内容を本願に援用する米国特許第４，８１６，５６７号参照。ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、恐らく一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基で置き換えられたヒト抗体とすることができる。本発明の抗体のヒト化又はエンジニアリングは、限定されないが、米国特許第５，７２３，３２３号、５，９７６，８６２号、５，８２４，５１４号、５，８１７，４８３号、５，８１４，４７６号、５，７６３，１９２号、５，７２３，３２３号、５，７６６，８８６号、５，７１４，３５２号、６，２０４，０２３号、６，１８０，３７０号、５，６９３，７６２号、５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、５，２２５，５３９号、及び４，８１６，５６７号に記載されている方法等の任意の公知方法を使用して実施することができる。
ヒト化抗体は、ＧＦＡＰに対する高い親和性と、他の好ましい生物学的性質を維持することができる。ヒト化抗体は、親配列とヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列と種々の概念ヒト化産物の分析法により作製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、広く入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体構造を描画・表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予想される役割を解析することができ、即ち、その抗原と結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基を解析することができる。こうして、ＧＦＡＰに対する親和性の増加等の望ましい抗体特性が得られれるように、レシピエント配列とインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、抗原結合に影響を与えるのに直接的且つ最も実質的に関与しているのは、超可変領域残基であると思われる。
ヒト化の代用として、ヒト抗体（本願では「完全ヒト抗体」とも言う）を作製することもできる。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ及び／又は酵母関連技術により、ライブラリーからヒト抗体を単離することが可能である。トランスジェニック動物（例えば、免疫後に、内在性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なマウス）を作製することも可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内在性抗体産生が完全に阻害される。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子配列をこのような生殖細胞系列突然変異体マウスに移入すると、抗原チャレンジ後にヒト抗体が産生されるであろう。ヒト化抗体又は完全ヒト抗体は、各々その開示内容を本願に援用する米国特許第５，７７０，４２９号、５，８３３，９８５号、５，８３７，２４３号、５，９２２，８４５号、６，０１７，５１７号、６，０９６，３１１号、６，１１１，１６６号、６，２７０，７６５号、６，３０３，７５５号、６，３６５，１１６号、６，４１０，６９０号、６，６８２，９２８号、及び６，９８４，７２０号に記載されている方法に従って作製することができる。
ｅ．抗ＧＦＡＰ抗体
上記技術と、当技術分野で公知の慣用技術を使用して抗ＧＦＡＰ抗体を作製することができる。所定の実施形態において、抗ＧＦＡＰ抗体は、Ｄａｋｏ（カタログ番号：Ｍ０７６１）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号：ＭＡ５－１２０２３、Ａ－２１２８２、１３－０３００、ＭＡ１－１９１７０、ＭＡ１－１９３９５、ＭＡ５－１５０８６、ＭＡ５－１６３６７、ＭＡ１－３５３７７、ＭＡ１－０６７０１、又はＭＡ１－２００３５）、ＡｂＣａｍ（カタログ番号：ａｂ１００６２、ａｂ４６４８、ａｂ６８４２８、ａｂ３３９２２、ａｂ２０７１６５、ａｂ１９０２８８、ａｂ１１５８９８、又はａｂ２１８３７）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号：ＦＣＭＡＢ２５７Ｐ、ＭＡＢ３６０、ＭＡＢ３４０２、０４－１０３１、０４－１０６２、ＭＡＢ５６２８）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号：ｓｃ－１６６４８１、ｓｃ－１６６４５８、ｓｃ－５８７６６、ｓｃ－５６３９５、ｓｃ－５１９０８、ｓｃ－１３５９２１、ｓｃ－７１１４３、ｓｃ－６５３４３、又はｓｃ－３３６７３）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号：Ｇ３８９３又はＧ６１７１）又はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（カタログ番号：１００１４０－Ｒ０１２－５０）の各社から入手可能なＧＦＡＰ抗体等の共役していないＧＦＡＰ抗体とすることができる。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号：Ａ－２１２９５又はＡ－２１２９４）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号：ＭＡＢ３４０２Ｘ、ＭＡＢ３４０２Ｂ、ＭＡＢ３４０２Ｂ、又はＭＡＢ３４０２Ｃ３）又はＡｂＣａｍ（カタログ番号：ａｂ４９８７４又はａｂ１９４３２５）の各社から入手可能な共役ＧＦＡＰ抗体のように、抗ＧＦＡＰ抗体をフルオロフォアと共役させてもよい。
８．方法の変形
本願には、試料中に存在する着目被検体（ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の存在又は量の測定方法を開示するが、本方法は、本願に記載する通りに実施することができる。被検体の他の分析方法を考慮し、前記方法を改変してもよい。周知の変形の例としては、限定されないが、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、酵素検出法（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））をはじめとするモノクローナル－モノクローナルサンドイッチイムノアッセイ、モノクローナル－ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、多元酵素イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）等のイムノアッセイ、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー転移法（ＢＲＥＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、均一系アッセイ、不均一系アッセイ、キャプチャオンザフライ（ｃａｐｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ）アッセイ等が挙げられる。
ａ．イムノアッセイ
着目被検体、及び／又はそのペプチド若しくは断片（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ、及び／又はそのペプチド若しくは断片、即ち、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ断片）は、イムノアッセイでＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ抗体を使用して分析することができる。抗体を使用し、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）との特異的結合を検出することにより、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の存在又は量を測定することができる。例えば、抗体又はその抗体断片は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と特異的に結合することができる。必要に応じて、前記抗体の１種以上を１種以上の市販のモノクローナル／ポリクローナル抗体と併用することができる。このような抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）や、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）等の企業から入手可能である。
生体試料中に存在する被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の存在又は量は、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位体検出法（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））や、酵素検出法（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡアッセイ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））をはじめとするモノクローナル－モノクローナルサンドイッチイムノアッセイ、モノクローナル－ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）等のイムノアッセイを使用して容易に測定することができる。使用することができるポイントオブケアデバイスの１例は、ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）（Ａｂｂｏｔｔ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）である。使用することができる他の方法としては、化学発光微粒子イムノアッセイが挙げられ、特に、１例として、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）自動アナライザー（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を利用する方法が挙げられる。他の方法としては、例えば、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）に対する抗被検体（例えば、抗ＵＣＨ－Ｌ１及び／又は抗ＧＦＡＰ）抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ヒト等）又はその抗体断片を使用した質量分析法と、（例えば、組織生検からの切片を用いた）免疫組織化学分析法が挙げられる。他の検出方法としては、例えば、各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許第６，１４３，５７６号、６，１１３，８５５号、６，０１９，９４４号、５，９８５，５７９号、５，９４７，１２４号、５，９３９，２７２号、５，９２２，６１５号、５，８８５，５２７号、５，８５１，７７６号、５，８２４，７９９号、５，６７９，５２６号、５，５２５，５２４号、及び５，４８０，７９２に記載されている方法が挙げられる。抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の特異的免疫結合は、抗体に結合した蛍光若しくは発光タグ、金属及び放射性核種等の直接ラベル又はアルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ等の間接ラベルにより検出することができる。
固相化抗体又はその抗体断片の使用をイムノアッセイに組み入れてもよい。磁性又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、（マイクロタイターウェル等の）アッセイプレートの表面、固相基板材料の小片等の種々の担体上に抗体を固相化することができる。抗体又は複数の抗体を固相担体上に並べてコーティングすることにより、アッセイストリップを作製することができる。その後、このストリップを被検試料に浸し、洗浄と検出工程により短時間処理し、着色スポット等の測定可能なシグナルを生じることができる。
均一系フォーマットを使用してもよい。例えば、対象から被検試料を採取した後、混合物を調製する。混合物は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）について評定する被検試料と、第１の特異的結合パートナーと、第２の特異的結合パートナーを含む。混合物を形成するために被検試料、第１の特異的結合パートナー、及び第２の特異的結合パートナーを加える順序は重要ではない。被検試料を第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーと同時に接触させる。所定の実施形態において、第１の特異的結合パートナーと、被検試料に含まれるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰは、第１の特異的結合パートナーと被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と抗原の複合体を形成することができ、第２の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナーと着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の特異的結合パートナーの複合体を形成することができる。所定の実施形態において、第２の特異的結合パートナーと、被検試料に含まれるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰは、第２の特異的結合パートナーと被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１）と抗原の複合体を形成することができ、第１の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナーと着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の特異的結合パートナーの複合体を形成することができる。第１の特異的結合パートナーは、抗被検体抗体（例えば、配列番号１の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又は配列番号２の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＧＦＡＰ抗体）とすることができる。第２の特異的結合パートナーは、抗被検体抗体（例えば、配列番号１の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又は配列番号２の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＧＦＡＰ抗体）とすることができる。更に、第２の特異的結合パートナーは、上記のような検出可能なラベルで標識されているか、又はこのようなラベルを含む。
不均一系フォーマットを使用してもよい。例えば、対象から被検試料を採取した後、第１の混合物を調製する。混合物は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）について評定する被検試料と、第１の特異的結合パートナーを含み、第１の特異的結合パートナーと、被検試料に含まれるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰは、第１の特異的結合パートナーと被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）抗原の複合体を形成する。第１の特異的結合パートナーは、抗被検体抗体（例えば、配列番号１の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又は配列番号２の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＧＦＡＰ抗体）とすることができる。混合物を形成するために被検試料と第１の特異的結合パートナーを加える順序は、重要ではない。
第１の特異的結合パートナーを固相上に固相化してもよい。イムノアッセイで（第１の特異的結合パートナーと、任意に第２の特異的結合パートナーに）使用される固相は、当技術分野で公知の任意の固相とすることができ、限定されないが、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスク、及びチップが挙げられる。固相がビーズである実施形態において、前記ビーズは、磁気ビーズ又は磁性粒子とすることができる。磁気ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体とすることができる。典型的な強磁性材料としては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、及びＮｉＯ／Ｆｅが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ・Ｆｅ２Ｏ３）が挙げられる。ビーズは、磁性の固体コア部分を有することができ、その周囲に１層以上の非磁性層が配置されている。あるいは、磁性部分を非磁性コアの周囲の層とすることもできる。第１の特異的結合メンバーを固相化した固相担体は、乾燥状態又は液体中で保存することができる。第１の特異的結合メンバーを固相化した磁気ビーズと試料を接触させる前又は後に、磁気ビーズに磁場を印加することができる。
第１の特異的結合パートナーと被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１又はＧＦＡＰ）抗原の複合体を含む混合物が形成された後、当技術分野で公知の任意の技術を使用して複合体から未結合の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を除去する。例えば、洗浄により、未結合の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を除去することができる。但し、被検試料中に存在する全被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）が第１の特異的結合パートナーと結合するように、第１の特異的結合パートナーは、被検試料中に存在する被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）よりも過剰に存在することが望ましい。
未結合の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を除去した後に、第２の特異的結合パートナーを混合物に加え、第１の特異的結合パートナーと着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の特異的結合パートナーの複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、抗被検体抗体（例えば、配列番号１の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体又は配列番号２の少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープと結合する抗ＧＦＡＰ抗体）とすることができる。更に、第２の特異的結合パートナーは、上記のような検出可能なラベルで標識されているか、又はこのようなラベルを含む。
固相化抗体又はその抗体断片の使用をイムノアッセイに組み入れてもよい。（磁気ビーズ等の）磁性又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、ラテックス粒子又は表面修飾ラテックス粒子、ポリマー又はポリマーフィルム、プラスチック又はプラスチックフィルム、平面基板、（マイクロタイターウェル等の）アッセイプレートの表面、固相基板材料の小片等の種々の担体上に抗体を固相化することができる。抗体又は複数の抗体を固相担体上に並べてコーティングすることにより、アッセイストリップを作製することができる。その後、このストリップを被検試料に浸し、洗浄と検出工程により短時間処理し、着色スポット等の測定可能なシグナルを生じることができる。
所定の態様では、イムノアッセイのダイナミックレンジとローエンド感度を維持するのを同様に助長することができる他の抗体を選択できると考えられる。例えば、３８ｋＤａＢＤＰのＮ末端の付近のエピトープと結合する少なくとも１種の（捕捉抗体又は第１の特異的結合パートナー等の）第１の抗体と、３８ｋＤａＢＤＰの中央の付近（例えば、３８ｋＤａＢＤＰの中央の付近）のエピトープと結合し、第１の抗体とオーバーラップしない少なくとも１種の（検出抗体又は第２の特異的結合パートナー等の）第２の抗体を選択すると有用であると思われる。他の変形も考えられ、短いペプチドとの結合を試験した後にキャリブレーター濃度を使用して抗体対をスクリーニングすることにより、種々のエピトープと結合する抗体を確認する等の方法により、通常の知識を有する者が容易に試験することができる。更に、ＧＦＡＰに対する親和性の異なる抗体を選択する方法も、アッセイのダイナミックレンジを維持又は増加するのを助長できる。ＧＦＡＰ抗体は、文献に記載され、市販されている。
（１）サンドイッチイムノアッセイ
サンドイッチイムノアッセイは、２層の抗体（即ち、少なくとも１種の捕捉抗体）と検出抗体（即ち、少なくとも１種の検出抗体）の間の抗原量を測定する。捕捉抗体と検出抗体は、抗原（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ等の着目被検体）上の異なるエピトープと結合する。捕捉抗体とエピトープの結合は、検出抗体とエピトープの結合を妨害しないことが望ましい。サンドイッチイムノアッセイでは捕捉抗体及び検出抗体としてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のどちらを使用してもよい。
一般に、被検試料中の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を分離・定量するために、少なくとも２種の抗体を利用する。より具体的には、前記少なくとも２種の抗体は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の所定のエピトープと結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。被検試料中の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を捕捉するために１種以上の抗体を使用することができ（これらの抗体を「捕捉」抗体又は複数の「捕捉」抗体と呼ぶことが多い）、検出可能な（即ち、定量可能な）ラベルをサンドイッチと結合させるために１種以上の抗体を使用する（これらの抗体を「検出」抗体又は複数の「検出」抗体と呼ぶことが多い）。サンドイッチアッセイでは、抗体とそのエピトープの結合が、アッセイにおける他の抗体とその夫々のエピソームの結合により弱められないことが望ましい。被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を含有することが疑われる被験試料と接触させた１種以上の第１の抗体が、第２以降の抗体により認識されるエピトープの全部又は一部と結合しないように、抗体を選択し、１種以上の第２の検出抗体が被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と結合するのを妨害しないようにする。
前記イムノアッセイでは、本願の抗体を第１の抗体として使用することができる。前記抗体は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）上のエピトープと免疫特異的に結合する。本発明の抗体に加え、前記イムノアッセイは、第１の抗体により認識されないか又は結合されないエピトープと免疫特異的に結合する第２の抗体を含むことができる。
被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を含有することが疑われる被験試料を少なくとも１種の第１の捕捉抗体（又は複数の捕捉抗体）及び少なくとも１種の第２の検出抗体と同時又は逐次接触させることができる。サンドイッチアッセイフォーマットでは、第１の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）抗原の複合体の形成を可能にする条件下で、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を含有することが疑われる被験試料を、先ず特定のエピトープと特異的に結合する前記少なくとも１種の第１の捕捉抗体と接触させる。２種以上の捕捉抗体を使用する場合には、第１の複数の捕捉抗体とＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ抗原の複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、被検試料中の予想される被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の最大量よりも過剰のモル量で本願の抗体、好ましくは前記少なくとも１種の捕捉抗体を使用する。例えば、微粒子コーティングバッファー１ｍｌ当たり約５μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの抗体を使用することができる。
ｉ．抗ＵＣＨ－Ｌ１捕捉抗体
任意に、被検試料を少なくとも１種の第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１種の第１の捕捉抗体を固相担体に固定化し、第１の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の複合体を被検試料から分離し易くすることができる。当技術分野で公知の任意の固相担体を使用することができ、限定されないが、ウェル、チューブ、又はビーズ（例えば、微粒子）の形態のポリマー材料製の固相担体が挙げられる。抗体が被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と結合するのを妨害されないという条件で、吸着によるか、化学的カップリング剤を使用する共有結合によるか、又は当技術分野で公知の他の手段により、抗体（又は複数の抗体）を固相担体に固定化することができる。更に、必要に応じて、抗体上の種々の官能基に対して反応性となるように、固相担体を誘導体化することができる。このような誘導体化には、限定されないが、マレイン酸無水物、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等の所定のカップリング剤の使用が必要である。
その後、第１の捕捉抗体（又は複数の抗体）と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の複合体の形成を可能にするために、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を含有することが疑われる被験試料をインキュベートする。インキュベーションは、ｐＨ約４．５～約１０．０、温度約２℃～約４５℃で少なくとも約１分～約１８時間、約２～６分間、約７～１２分間、約５～１５分間、又は約３～４分間実施することができる。
ｉｉ．検出抗体
第１の／複数の捕捉抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の複合体の形成後、次に、（第１の／複数の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）抗原と第２の抗体の複合体の形成を可能にする条件下で）前記複合体を少なくとも１種の第２の検出抗体と接触させる。所定の実施形態では、被検試料を捕捉抗体と同時に検出抗体と接触させる。第１の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の複合体を２種以上の検出抗体と接触させる場合には、第１の／複数の捕捉抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と複数の検出抗体の複合体が形成される。第１の抗体の場合と同様に、上記と同様の条件下で第１の／複数の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の／複数の抗体の複合体の形成に必要なインキュベーション時間をかけて、少なくとも第２（以降）の抗体を第１の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の複合体と接触させる。少なくとも１種の第２の抗体は、検出可能なラベルを含んでいることが好ましい。第１の／複数の抗体と被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の／複数の抗体の複合体の形成の前、それと同時、又はその後に、検出可能なラベルを少なくとも１種の第２の抗体と結合させることができる。当技術分野で公知の任意の検出可能なラベルを使用することができる。
Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ５７９（１）：６１－６７（２００６）に記載されている方法に従い、化学発光アッセイを実施することができる。任意の適切なアッセイフォーマットを使用することができるが、マイクロプレートケミルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ－９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＬＬＣ，Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）を使用すると、複数の小量の試料のアッセイを迅速に実施できる。ケミルミノメーターは９６ウェル黒色ポリスチレン製マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３７９２）を使用し、複数の試薬インジェクターを搭載することができる。各試料を別々のウェルに加えた後、利用するアッセイの種類に応じて他の試薬を同時／逐次添加することができる。酸性化等により、アクリジニウムアリールエステルを利用する中性又は塩基性溶液中に擬似塩基が形成されないようにすることが望ましい。次に、化学発光応答をウェル毎に記録する。この点について、化学発光応答を記録する時間は、利用する試薬と特定のアクリジニウムの添加間の遅延時間によっても異なるであろう。
化学発光アッセイ用混合物を形成するために被検試料と特異的結合パートナーを加える順序は重要ではない。第１の特異的結合パートナーをアクリジニウム化合物で検出可能に標識する場合には、第１の特異的結合パートナーと抗原（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の検出可能に標識された複合体が形成される。あるいは、第２の特異的結合パートナーを使用し、第２の特異的結合パートナーをアクリジニウム化合物で検出可能に標識する場合には、第１の特異的結合パートナーと被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と第２の特異的結合パートナーの検出可能に標識された複合体が形成される。標識の有無に関係なく、洗浄等の当技術分野で公知の任意の技術を使用して未結合の特異的結合パートナーを混合物から除去することができる。
上記アクリジニウム化合物を加える前、それと同時、又はその後に、過酸化水素を混合物中でｉｎ ｓｉｔｕ生成させること又は混合物に提供若しくは供給することができる。過酸化水素は、当業者に自明のように多数の方法でｉｎ ｓｉｔｕ生成させることができる。
あるいは、単に混合物に過酸化水素源を加えることができる。例えば、過酸化水素源は、過酸化水素を含有することが知られている１種以上の緩衝液又は他の溶液とすることができる。この点については、単に過酸化水素溶液を加えることができる。
少なくとも１種の塩基性溶液を試料に同時に又は後から添加後に、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の存在を指示する検出可能なシグナル（即ち、化学発光シグナル）が発生される。塩基性溶液は、少なくとも１種の塩基を含有しており、ｐＨが１０以上、好ましくは１２以上である。塩基性溶液の例としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び炭酸水素カルシウムが挙げられる。試料に添加する塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度によって異なる。使用する塩基性溶液の濃度に基づき、当業者は、試料に添加する塩基性溶液の量を容易に決定することができる。化学発光ラベル以外の他のラベルを利用することもできる。例えば、酵素ラベル（限定されないが、アルカリホスファターゼを含む）を利用することができる。
発生される化学発光シグナル又は他のシグナルは、当業者に公知の慣用技術を使用して検出することができる。発生されるシグナルの強度に基づき、試料中の着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の量を定量することができる。具体的には、試料中の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の量は、発生されるシグナルの強度に比例する。発生される光の量を被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の標準曲線と比較することにより、又は参照標準と比較することにより、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の存在量を定量することができる。標準曲線は、質量分析法、重量分析法、又は当技術分野で公知の他の技術により、既知濃度の被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）の段階希釈液又は溶液を使用して作成することができる。
（２）フォワード競合阻害アッセイ
フォワード競合フォーマットでは、標識した既知濃度の着目被検体（例えば、蛍光ラベル、切断可能なリンカーと結合したタグ等を付けた被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ））のアリコートを使用し、着目被検体抗体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ抗体）との結合について被検試料中の着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と競合させる。
フォワード競合アッセイでは、固相化した特異的結合パートナー（例えば、抗体）を、被検試料と、標識した着目被検体、着目被検体断片又はその着目被検体変異体とに逐次又は同時に接触させることができる。前記着目被検体ペプチド、着目被検体断片又は着目被検体変異体は、切断可能なリンカーと結合したタグから構成される検出可能なラベルを含む任意の検出可能なラベルで標識することができる。このアッセイでは、前記抗体を固相担体上に固相化することができる。あるいは、微粒子又は平面基板等の固相担体上に固相化された抗種抗体等の抗体と前記抗体をカップリングすることができる。
サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上述したと同様の条件下で、前記標識着目被検体、前記被検試料及び前記抗体をインキュベートする。こうして、２種類の異なる種類の抗体と着目被検体の複合体を作製することができる。具体的には、作製された抗体と着目被検体の複合体の一方は、検出可能なラベル（例えば、蛍光ラベル等）を含み、他方の抗体と着目被検体の複合体は、検出可能なラベルを含まない。検出可能なラベルの定量前に、必ずしも必要ではないが、抗体と着目被検体の複合体を被検試料の残余から分離することができる。抗体と着目被検体の複合体を被検試料の残余から分離するか否かに関係なく、次に、抗体と着目被検体の複合体中の検出可能なラベルの量を定量する。その後、被検試料中の着目被検体（例えば、膜と結合した着目被検体、可溶性着目被検体、可溶性着目被検体の断片、着目被検体（膜と結合しているか又は可溶性の着目被検体）の変異体又は任意のその組み合わせ）の濃度を、例えば上記のように測定することができる。
（３）リバース競合阻害アッセイ
リバース競合アッセイでは、固相化した着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を、被検試料と、少なくとも１種の標識抗体とに逐次又は同時に接触させることができる。
サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上述した固相担体等の固相担体に着目被検体を固定化することができる。
サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上述したと同様の条件下で、前記固相化着目被検体、被検試料及び少なくとも１種の標識抗体をインキュベートする。こうして、２種類の異なる種類の着目被検体と抗体の複合体を作製する。具体的には、作製された着目被検体と抗体の複合体の一方は、固相化されており、検出可能なラベル（例えば、蛍光ラベル等）を含み、他方の着目被検体と抗体の複合体は、固相化されておらず、検出可能なラベルを含む。洗浄等の当技術分野で公知の技術により、固相化された着目被検体と抗体の複合体から、固相化されていない着目被検体と抗体の複合体と、被検試料の残余を除去する。固相化されていない着目被検体と抗体の複合体を除去したら、次に、タグの切断後に、固相化された着目被検体と抗体の複合体中の検出可能なラベルの量を定量する。その後、検出可能なラベルの量を上記のように比較することにより、被検試料中の着目被検体の濃度を測定することができる。
（４）ワンステップイムノアッセイ又は「キャプチャオンザフライ」アッセイ
キャプチャオンザフライイムノアッセイでは、固相担体に固相化剤をプレコーティングする。捕捉剤、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）及び検出剤を一緒に固相担体に加えた後、検出前に洗浄工程を行う。捕捉剤は、被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と結合することができ、固相化剤のリガンドを含む。捕捉剤と検出剤は、抗体とすることができ、あるいは、本願に記載するような又は当技術分野で公知の捕捉又は検出可能な他の任意の部分とすることができる。リガンドは、ペプチドタグを含むことができ、固相化剤は、抗ペプチドタグ抗体を含むことができる。あるいは、リガンドと固相化剤は、キャプチャオンザフライアッセイに利用されるように相互に結合することが可能な物質の任意の対（例えば、特異的結合対、及び当技術分野で公知の他の対）とすることができる。２種以上の被検体を測定することもできる。所定の実施形態では、固相担体に抗原をコーティングし、分析しようとする被検体を抗体とする。
所定の他の実施形態では、ワンステップイムノアッセイ又は「キャプチャオンザフライ」アッセイにおいて、（ビオチン、ストレプトアビジン等の）固相化剤をプレコーティングした（微粒子等の）固相担体と、（夫々捕捉剤及び検出試薬として機能する）少なくとも第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーを使用する。第１の特異的結合メンバーは、固相化剤のリガンドを含み（例えば、固相担体上の固相化剤がストレプトアビジンであるならば、第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、ビオチンとすることができる）、更に着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と結合する。第２の特異的結合メンバーは、検出可能なラベルを含み、着目被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）と結合する。固相担体と第１及び第２の特異的結合メンバーを（逐次又は同時に）被検試料に加えることができる。第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、固相担体上の固相化剤と結合し、固相担体と第１の特異的結合メンバーの複合体を形成する。試料中に着目被検体が存在する場合には、固相担体と第１の特異的結合メンバーの複合体と結合し、固相担体と第１の特異的結合メンバーと被検体の複合体を形成する。第２の特異的結合メンバーは、固相担体と第１の特異的結合メンバーと被検体の複合体と結合し、検出可能なラベルが検出される。検出の前に任意に洗浄工程を利用してもよい。所定の実施形態では、ワンステップアッセイにおいて、２種以上の被検体を測定することができる。所定の他の実施形態では、３種以上の特異的結合メンバーを利用することができる。所定の他の実施形態では、複数の検出可能なラベルを加えることができる。所定の他の実施形態では、複数の着目被検体を検出することができ、あるいは、その量、値又は濃度を測定、判定又は評定することができる。
本願に記載し、当技術分野で公知の種々のフォーマットでキャプチャオンザフライアッセイを使用することができる。例えば、前記フォーマットは、上記のようなサンドイッチアッセイとすることができ、あるいは、競合アッセイとすることができ、単一の特定結合メンバーを利用することができ、又は公知の他の変形を使用することができる。
９．他の因子
上記診断、予後判定及び／又は評定方法は更に、診断、予後判定及び評定の他の因子の使用を含む。所定の実施形態では、グラスゴーコーマスケールを使用して外傷性脳損傷を診断することができる。他の試験、スケール又は指標も単独又はグラスゴーコーマスケールと組み合わせて使用することができる。１例は、ランチョロスアミーゴススケール（Ｒａｎｃｈｏｓ Ｌｏｓ Ａｍｉｇｏｓ Ｓｃａｌｅ）である。ランチョロスアミーゴススケールは、意識、認知、行動、及び環境に対する反応のレベルを測定する。ランチョロスアミーゴススケールは、以下のレベルを含む。レベルＩ：反応なし；レベルＩＩ：全身反応；レベルＩＩＩ：局在反応；レベルＩＶ：混乱－興奮；レベルＶ：混乱－不適切；レベルＶＩ：混乱－適切；レベルＶＩＩ：自動的－適切；及びレベルＶＩＩＩ：意図的－適切。別の例は、ＴＢＩ後の脳震盪後症状の重症度を測定するための自己申告スケールであるリバーミード脳震盪後症状質問票である。患者は、過去２４時間に１６種類の症状（例えば、頭痛、眩暈、悪心、嘔吐）の各々がどの程度の重症度であったかを等級付けするように求められる。各場合に、症状を損傷が発生する前（発病前）の重症度と比較する。これらの症状を、無症状、障害なし、軽度障害、中等度障害、及び重度障害の０～４のスケールで重症度により報告する。
１０．試料
所定の実施形態では、ヒト対象等の対象が、身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部の損傷を生じた後に、試料を取得する。所定の実施形態では、ヒト対象等の対象が、火炎、化学物質、毒素、又は火炎、化学物質及び毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、試料を取得する。このような化学物質及び／又は毒素の例としては、カビ、アスベスト、駆除剤及び殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス（例えば、一酸化炭素、硫化水素、及びシアン化物）、有機金属（例えば、メチル水銀、四エチル鉛及び有機スズ）及び／又は１種以上の乱用薬物が挙げられる。所定の実施形態では、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患しているヒト対象等の対象から試料を取得する。
更に別の実施形態において、本願に記載する方法は、以下に記載する抗ＵＣＨ－Ｌ１及び／又は抗ＧＦＡＰ抗体又はその抗体断片を使用して対象におけるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの値を測定することにより、対象がＴＢＩ（例えば、軽度ＴＢＩ、中等度ＴＢＩ、重度ＴＢＩ、又は中等度～重度ＴＢＩ）を有するか否か又はその発症の危険があるか否かを判定するためにも使用することができる試料を使用する。したがって、特定の実施形態において、本開示は、本願に記載し、当技術分野で公知の外傷性脳損傷を有するか又はその危険のある対象が、療法又は治療の候補となるか否かを判定する方法も提供する。一般に、前記対象は、本願に記載するように、少なくとも（ｉ）頭部の損傷を生じている；（ｉｉ）１種以上の化学物質及び／若しくは毒素を吸い込んでいる及び／若しくはこれらに曝露されている；（ｉｉｉ）自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、若しくは任意のそれらの組み合わせに罹患している；又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせである対象であり、あるいは、（例えば、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象等の）ＴＢＩを有するか若しくはその危険があるとして実際に診断された対象、並びに／又は好ましくない（即ち、臨床的に望ましくない）濃度若しくは量のＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ又はＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ断片を示す対象である。
ａ．被検試料又は生体試料
本願で使用する場合に、「試料」、「被検試料」、「生体試料」とは、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰを含有するか又は含有することが疑われる液体試料を意味する。試料は、任意の適切な資源に由来することができる。場合により、試料は、液体、流動性粒状固体、又は固体粒子の懸濁液を含むことができる。場合により、試料は、本願に記載する分析前に処理してもよい。例えば、分析前に試料をその資源から分離又は精製してもよいが、所定の実施形態では、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰを含有する未処理の試料を直接アッセイしてもよい。特定の例において、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ源は、ヒト生体物質（例えば、体液、全血、血清、血漿等の血液、尿、唾液、汗、痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄液、脳脊髄液、口咽頭検体、鼻咽頭検体、糞便、組織、臓器等）である。組織としては、限定されないが、骨格筋組織、肝組織、肺組織、腎組織、心筋組織、脳組織、骨髄、子宮頸部組織、皮膚等が挙げられる。試料は液体試料でもよいし、固体試料の抽出液でもよい。所定の場合において、試料の資源は、生検試料のように臓器又は組織でもよく、組織分解／細胞溶解により可溶化してもよい。
広い範囲の体積の液体試料を分析することができる。少数の典型的な実施形態において、試料体積は、約０．５ｎＬ、約１ｎＬ、約３ｎＬ、約０．０１μＬ、約０．１μＬ、約１μＬ、約５μＬ、約１０μＬ、約１００μＬ、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ等とすることができる。場合により、体液試料の体積は、約０．０１μＬ～約１０ｍＬ、約０．０１μＬ～約１ｍＬ、約０．０１μＬ～約１００μＬ、又は約０．１μＬ～約１０μＬとすることができる。
場合により、アッセイで使用する前に液体試料を希釈してもよい。例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、体液を適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝液等の緩衝液）で希釈することができる。液体試料を使用前に、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上に希釈することができる。他の場合では、液体試料をアッセイで使用する前に希釈しない。
場合により、試料を分析前処理に供してもよい。分析前処理は、非特異的タンパク質除去及び／又は有効且つ廉価に実装可能な混合機能等の付加機能を提供することができる。分析前処理の一般方法としては、動電トラッピング、ＡＣ動電作用、表面音響波、等速電気泳動、誘電泳動、電気泳動、又は当技術分野で公知の他の前濃縮技術の使用が挙げられる。場合により、液体試料をアッセイで使用する前に濃縮してもよい。例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、体液を沈殿、蒸発、濾過、遠心、又はその組み合わせにより濃縮することができる。液体試料を使用前に、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上に濃縮することができる。
ｂ．対照
対照試料を加えると望ましいと思われる。対照試料は、上記のような対象からの試料と同時に分析することができる。対象試料から得られた結果を対照試料から得られた結果と比較することができる。試料のアッセイ結果を比較することができる標準曲線を準備することができる。このような標準曲線は、アッセイ単位の関数としてマーカー値（即ち、蛍光ラベルを使用する場合には、蛍光シグナル強度）を示す。複数のドナーから採取した試料を使用し、正常な健康組織におけるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの参照値と、上記特徴の１種以上を有する可能性のあるドナーから採取した組織におけるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの「危険」値について、標準曲線を準備することができる。
したがって、上記の点では、被検試料中のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの存在、量、又は濃度の測定方法が提供される。前記方法は、例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ上のエピトープと結合する少なくとも１種の捕捉抗体と、捕捉抗体のエピトープとは異なるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ上のエピトープと結合し、任意に検出可能なラベルを含む少なくとも１種の検出抗体を利用し、イムノアッセイにより被検試料をＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰについてアッセイする工程と、被検試料中のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの存在、量、又は濃度の直接又は間接的指標として検出可能なラベルにより発生されたシグナルを、キャリブレーター中のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの存在、量、又は濃度の直接又は間接的指標として発生されたシグナルと比較する工程を含む。前記キャリブレーターは、任意にキャリブレーターの各々のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの濃度が系列中の他のキャリブレーターと異なるようにしたキャリブレーター系列の一部であり、そのようにすることが好ましい。
１１．キット
本願では、ＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ又はＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ断片について被検試料をアッセイ又は評定するために使用することができるキットを提供する。前記キットは、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰについて被検試料をアッセイするための少なくとも１種のコンポーネントと、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰについて被検試料をアッセイするための説明書を含む。例えば、前記キットは、イムノアッセイ（例えば、化学発光微粒子イムノアッセイ）により被検試料をＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰについてアッセイするための説明書を含むことができる。前記キットに含まれる説明書は、包装材料に添付することもできるし、パッケージインサートとして同梱することもできる。説明書は、一般的には書面又は印刷物であるが、このようなものに限定されない。このような説明書を格納し、エンドユーザーに伝達することが可能な任意の媒体が本開示により想定される。このような媒体としては、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）等が挙げられる。本願で使用する場合に、「説明書」なる用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
前記少なくとも１種のコンポーネントとしては、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰと特異的に結合する１種以上の単離抗体又はその抗体断片を含む少なくとも１種の組成物が挙げられる。前記抗体は、ＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ捕捉抗体並びに／又はＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ検出抗体とすることができる。
上記の代わりに又は上記に加え、前記キットは、キャリブレーター若しくは対照（例えば、精製し、任意に凍結乾燥したＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）、及び／又はアッセイを実施するための少なくとも１個の容器（例えば、予め抗ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰモノクローナル抗体をコーティングしておくことができるチューブ、マイクロタイタープレート又はストリップ）、及び／又はアッセイ緩衝液若しくは洗浄緩衝液等の緩衝液を含むことができ、前記アッセイ緩衝液若しくは洗浄緩衝液のいずれか一方は、濃厚溶液、検出可能なラベル（例えば、酵素ラベル）の基質溶液、又は停止溶液として提供することができる。前記キットは、アッセイを実施するために必要な全コンポーネント（即ち、試薬、標準、緩衝液、希釈剤等）を含むことが好ましい。前記説明書は更に、標準曲線を作成するための説明書も含むことができる。
前記キットは更に、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰを定量するための参照標準を含むことができる。前記参照標準は、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ濃度の内挿及び／又は外挿用標準曲線を作成するために利用することができる。前記参照標準は、高値ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ濃度値（例えば、約１０００００ｐｇ／ｍＬ、約１２５０００ｐｇ／ｍＬ、約１５００００ｐｇ／ｍＬ、約１７５０００ｐｇ／ｍＬ、約２０００００ｐｇ／ｍＬ、約２２５０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００００ｐｇ／ｍＬ、約２７５０００ｐｇ／ｍＬ、又は約３０００００ｐｇ／ｍＬ）、中値ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ濃度値（例えば、約２５０００ｐｇ／ｍＬ、約４００００ｐｇ／ｍＬ、約４５０００ｐｇ／ｍＬ、約５００００ｐｇ／ｍＬ、約５５０００ｐｇ／ｍＬ、約６００００ｐｇ／ｍＬ、約７５０００ｐｇ／ｍＬ又は約１０００００ｐｇ／ｍＬ）、及び／又は低値ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ濃度値（例えば、約１ｐｇ／ｍＬ、約５ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約１２．５ｐｇ／ｍＬ、約１５ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約２５ｐｇ／ｍＬ、約３０ｐｇ／ｍＬ、約３５ｐｇ／ｍＬ、約４０ｐｇ／ｍＬ、約４５ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約５５ｐｇ／ｍＬ、約６０ｐｇ／ｍＬ、約６５ｐｇ／ｍＬ、約７０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約８０ｐｇ／ｍＬ、約８５ｐｇ／ｍＬ、約９０ｐｇ／ｍＬ、約９５ｐｇ／ｍＬ、又は約１００ｐｇ／ｍＬ）を含むことができる。
前記キットで提供されるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰに特異的な組換え抗体等の任意の抗体は、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジンラベル、発色団、化学発光ラベル等の検出可能なラベルを結合することができ、あるいは、前記キットは、抗体を標識するための試薬若しくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）、及び／又は被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を標識するための試薬若しくは被検体（例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰ）を検出するための試薬を含むことができる。前記抗体、キャリブレーター、及び／又は対照は、別々の容器で提供することもできるし、適切なアッセイフォーマット（例えば、マイクロタイタープレート）に予め分配しておくこともできる。
任意に、前記キットは、品質管理コンポーネント（例えば、感度パネル、キャリブレーター、及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は当技術分野で周知であり、種々の免疫診断製品のインサートシートに記載されている。感度パネルメンバーは、任意にアッセイ性能特性を設定するために使用され、更に任意に、イムノアッセイキット試薬の完全性とアッセイの標準化の有用な指標である。
前記キットは更に、任意に診断アッセイを実施するため又は品質管理評価を助長するために必要な他の試薬（例えば、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬等）を含むことができる。被検試料の単離及び／又は処理用の緩衝液及び溶液（例えば、前処理試薬）等の他のコンポーネントもキットに含むことができる。キットは更に、１種以上の他の対照を含むことができる。キットのコンポーネントの１種以上は、凍結乾燥することができ、その場合、キットは更に、凍結乾燥したコンポーネントの再構成に適した試薬を含むことができる。
前記キットの各種コンポーネントは、任意に必要に応じて適切な容器（例えば、マイクロタイタープレート）に収容して提供される。前記キットは更に、試料を保持又は保存するための容器（例えば、尿、全血、血漿、又は血清試料の容器又はカートリッジ）を含むことができる。必要に応じて前記キットは任意に更に、反応容器、混合容器、及び試薬又は被検試料の調製を助長する他のコンポーネントも含むことができる。前記キットは更に、被検試料を取得するのを補助するための１種以上の器具（例えば、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン等）を含むことができる。
前記検出可能なラベルが少なくとも１種のアクリジニウム化合物である場合には、前記キットは、少なくとも１種のアクリジニウム－９－カルボキサミド、少なくとも１種のアクリジニウム－９－カルボン酸アリールエステル、又は任意のその組み合わせを含むことができる。前記検出可能なラベルが少なくとも１種のアクリジニウム化合物である場合には、前記キットは更に、緩衝液、溶液、及び／又は少なくとも１種の塩基性溶液等の過酸化水素源を含むことができる。必要に応じて、前記キットは、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスク、又はチップ等の固相を含むことができる。
必要に応じて、前記キットは更に、被検試料を別の被検体についてアッセイするための１種以上のコンポーネントを単独で又は更に説明書と共に含むことができ、前記コンポーネントは、外傷性脳損傷又は障害のバイオマーカー等のバイオマーカーとすることができる。
ａ．キット及び方法の応用
本願に記載するようなイムノアッセイにより被検試料中のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの濃度を評定又は測定するためのキット（又はそのコンポーネント）及び方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、２００４／００１８５７７号、２００５／００５４０７８号、及び２００６／０１６０１６４号に記載され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）からＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）又はｉ－ＳＴＡＴ Ａｌｉｎｉｔｙ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として市販されている（固相を微粒子としたシステムを含む）種々の自動及び半自動システムと、米国特許第５，０８９，４２４号及び５，００６，３０９号に記載され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）からＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）又はＡｂｂｏｔｔ Ａｌｉｎｉｔｙデバイスのシリーズとして市販されているシステムで使用するように適応させることができる。
自動又は半自動システムと非自動システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）の違いをいくつか挙げると、第１の特異的結合パートナー（例えば、被検体抗体又は捕捉抗体）が結合される基板（サンドイッチ形成と被検体反応性に影響を与える可能性がある）と、捕捉工程、検出工程、及び／又は任意に実施される洗浄工程の長さとタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡ等の非自動フォーマットは、試料及び捕捉試薬の共存下のインキュベーション時間を比較的長くする必要がある（例えば、約２時間）と思われるが、自動又は半自動フォーマット（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）と任意の後継プラットフォーム）は、インキュベーション時間を比較的短くすることができる（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）では、約１８分間）。同様に、ＥＬＩＳＡ等の非自動フォーマットは、コンジュゲート試薬等の検出抗体のインキュベーション時間が比較的長い（例えば、約２時間）が、自動又は半自動フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）と任意の後継プラットフォーム）では、インキュベーション時間を比較的短くすることができる（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）と任意の後継プラットフォームでは、約４分間）。
Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能な他のプラットフォームとしては、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（Ｒ），ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、その開示内容全体を本願に援用する米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）、及びＱｕａｎｔｕｍ（ＴＭ）ＩＩ並びに他のプラットフォームが挙げられる。また、他のフォーマット（例えば、電気化学的又は他のハンドヘルド又はポイントオブケアアッセイシステム）で前記アッセイ、キット、及びキットコンポーネントを利用することもできる。上述したように、本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のポイントオブケア（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ））電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。使い捨て試験デバイスにおけるイムノセンサーとその製造・操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、２００４／００１８５７７号、２００５／００５４０７８号、及び２００６／０１６０１６４号に記載されており、この点に関するそれらの教示内容全体を本願に援用する。
ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのアッセイの適応については、以下の構成が好ましい。１対の金アンペロメトリック作用電極と銀－塩化銀参照電極を搭載した微細加工シリコンチップを作製する。作用電極の一方では、電極を覆うようにパターニングされたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに、捕捉抗体を固相化したポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）を付着させる。イムノアッセイに適したフルイディクスフォーマットを有するｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジにこのチップを埋め込む。シリコンチップの一部には、１種以上のＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ抗体（ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰと結合することができる１種以上のモノクローナル／ポリクローナル抗体又はその断片、その変異体、若しくはその変異体の断片）又は１種以上の抗ＵＣＨ－Ｌ１及び／若しくはＧＦＡＰ ＤＶＤ－Ｉｇ（又はＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰと結合することができるその断片、その変異体、若しくはその変異体の断片）等のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの特異的結合パートナーを配置し、いずれも検出可能に標識することができる。カートリッジの液体パウチ内には、リン酸ｐ－アミノフェノールを含む水性試薬を収容する。
操作時には、ＴＢＩを生じている疑いのある対象からの試料を試験カートリッジの保持チャンバーに注入し、カートリッジをｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）リーダーに挿入する。カートリッジ内のポンプエレメントが、チップを収容する導管内に試料を押し込む。試料をセンサーと接触させ、酵素コンジュゲートを試料に溶解させる。試料をセンサー間で揺動させて約２～１２分間のサンドイッチの形成を促進する。アッセイの最後から２番目の工程では、試料を廃棄チャンバーに押し込み、アルカリホスファターゼ酵素の基質を含有する洗浄液を使用して過剰の酵素コンジュゲートと試料をセンサーチップから洗い流す。アッセイの最終工程において、アルカリホスファターゼラベルは、リン酸ｐ－アミノフェノールと反応してリン酸基を切断し、遊離したｐ－アミノフェノールを作用電極で電気化学的に酸化させることができる。測定された電流に基づき、リーダーは、組み込みアルゴリズムと工場で決定された校正曲線により、試料中のＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの量を計算することができる。
本開示の方法で使用するための本願に記載する自動及び半自動システムは、（例えば、陽性結果に基づいて）ＣＴスキャンを実施すべきか又は（例えば、陰性結果に基づいて）ＣＴスキャンを実施すべきでないかの決定（読み出し）を提供するために、１種以上のコンピュータプログラム、ソフトウェア又はアルゴリズムを利用することができる。例えば、（例えば、アルゴリズムを使用する）コンピュータプログラム又はソフトウェアは、（１個の試料を使用するか、２個以上を使用するかに関係なく）（１）ＧＦＡＰ及びＵＣＨ－Ｌ１値が参照値（又はカットオフ値）未満である場合には、結果は陰性であり、ＣＴスキャンを実施しない；あるいは、（２）ＧＦＡＰ及び／又はＵＣＨ－Ｌ１が参照値（又はカットオフ値）以上である場合には、結果は陽性であり、ＣＴスキャンを実施するという解釈を提供することができる。コンピュータプログラム又はソフトウェアは、参照値が陽性頭部ＣＴ、頭蓋内病変の存在又は外傷性脳損傷を生じていない対照対象に相関しているか否か、ＴＢＩを生じている対象を経過観察及び／又はＴＢＩ治療すべきか否か等の他の適切な解釈を提供することもできる。このようなコンピュータプログラム又はソフトウェアは、当技術分野で周知である。
本願に記載する方法とキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬及び方法も必然的に包含する。例えば、当技術分野で公知の緩衝液、並びに／又は例えばコンジュゲート希釈剤、及び／若しくはキャリブレーター希釈剤として洗浄用に利用されるように容易に調製若しくは最適化することができる緩衝液等の種々の緩衝液を包含する。コンジュゲート希釈剤の１例は、所定のキットで利用され、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗微生物剤、及び界面活性剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）コンジュゲート希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）である。キャリブレーター希釈剤の１例は、所定のキットで利用され、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカー、及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含むＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトキャリブレーター希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）である。また、２００８年１２月３１日付け米国特許出願第６１／１４２，０４８号に記載されているように、シグナル増幅剤としてシグナル抗体に連結された核酸配列を使用すると、例えば、ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジフォーマットでシグナル発生の改善が得られる。
本願の所定の実施形態は、外傷性脳損傷等の疾患を評定するために利用する場合に有利であるが、任意に、必要に応じて他の疾患、障害、及び病態におけるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰを評定するために、前記アッセイ及びキットを利用することもできる。
外傷性脳損傷等の疾患を改善する化合物を同定するために、前記アッセイ方法を使用することもできる。例えば、ＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰを発現する細胞を候補化合物と接触させることができる。本願に記載するアッセイ方法を使用し、前記化合物と接触させた細胞におけるＵＣＨ－Ｌ１及び／又はＧＦＡＰの発現レベルを、対照細胞における発現レベルと比較することができる。
本発明は、以下の非限定的な実施例により例証される複数の態様を有する。
［実施例１］ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）ＵＣＨ－Ｌ１アッセイ
ＣＴスキャンが陰性の対象のＴＢＩ患者集団試験でｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）ＵＣＨ－Ｌ１アッセイを使用した。捕捉用モノクローナル抗体としての抗体Ａと、検出用モノクローナル抗体としての抗体Ｂ及びＣ等のモノクローナル抗体対を使用した。抗体Ａは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）の社内で開発された典型的な抗ＵＣＨ－Ｌ１抗体である。抗体Ｂ及びＣは、ＵＣＨ－Ｌ１の種々のエピトープを認識し、試料中の抗原の検出を増強するものであり、Ｂａｎｙａｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ社（Ａｌａｃｈｕａ，Ｆｌｏｒｉｄａ）により開発された。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）の社内で開発された他の抗体、又は他の市販抗体も、捕捉抗体又は検出抗体として種々の組み合わせで併用した場合に、同等のシグナル増強を示すか又は示すと予想される。ＵＣＨ－Ｌ１アッセイデザインを主要な性能属性に対して評価した。カートリッジ構成は、抗体Ａ（捕捉抗体）／抗体Ｂ＋Ｃ（検出抗体）の抗体構成とし、試薬条件は、固形分０．８％、Ｆａｂアルカリホスファターゼクラスターコンジュゲート１２５μｇ／ｍＬ、及びＳａｍｐｌｅ Ｉｎｌｅｔ Ｐｒｉｎｔ：ＵＣＨ－Ｌ１標準とした。アッセイ時間は、１０～１５分間とした（試料捕捉時間７～１２分間）。
［実施例２］ｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）ＧＦＡＰアッセイ
ＴＢＩ患者集団試験でｉ－ＳＴＡＴ（Ｒ）ＧＦＡＰアッセイを使用した。捕捉用モノクローナル抗体としての抗体Ａと、検出用モノクローナル抗体としての抗体Ｂ等のモノクローナル抗体対を使用した。抗体Ａと抗体Ｂは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）の社内で開発された典型的な抗ＧＦＡＰ抗体である。抗体Ａと抗体Ｂは、同一のＧＦＡＰ分解物内のエピトープと結合する。ＧＦＡＰアッセイデザインを主要な性能属性に対して評価した。カートリッジ構成は、抗体Ａ（捕捉抗体）／抗体Ｂ（検出抗体）の抗体構成とし、試薬条件は、固形分０．８％、Ｆａｂアルカリホスファターゼクラスターコンジュゲート２５０μｇ／ｍＬ、及びＳａｍｐｌｅ Ｉｎｌｅｔ Ｐｒｉｎｔ：ＧＦＡＰ特異的とした。アッセイ時間は、１０～１５分間とした（試料捕捉時間７～１２分間）。
［実施例３］ＣＴスキャン陰性対象におけるＧＦＡＰ及びＵＣＨ－Ｌ１値の評定
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）陰性ＴＢＩを予測する際にＧＦＡＰやＵＣＨ－Ｌ１等のバイオマーカーの血中値を評価するために、頭部ＣＴスキャンを受けた成人（即ち、１８歳以上の）外傷対象から血液試料を採取した。ＣＴスキャンが陰性（マーシャル分類＝１）の対象のバイオマーカー濃度を評価した。
図１Ａ～Ｄは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のグラスゴーコーマスコア（ＧＣＳ）重症度と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から１２時間以内（図１Ａ、１Ｃ）又は損傷から約２４時間以内（即ち、約２４．１時間以内）（図１Ｂ、１Ｄ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図１Ａ及び図１Ｂに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図１Ｃ及び図１Ｄに示す。
図２Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の損傷後の意識消失と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図２Ａ、２Ｄ）、１２時間以内（図２Ｂ、２Ｅ）、又は約２４時間以内（即ち、約２４．１時間以内）（図２Ｃ、２Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図２Ａ～２Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図２Ｄ～Ｆに示す。
図３Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象のＭＲＩ結果と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図３Ａ、３Ｄ）、１２時間以内（図３Ｂ、３Ｅ）又は約２４時間以内（即ち、約２４．１時間以内）（図３Ｃ、３Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図３Ａ～３Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図３Ｄ～Ｆに示す。
図４Ａ～Ｆは、ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性の対象の外傷後健忘（即ち、健忘の有無）と相関させたＵＣＨ－Ｌ１値又はＧＦＡＰ値のＲＯＣ分析を示す。損傷から４時間以内（図４Ａ、４Ｄ）、１２時間以内（図４Ｂ、４Ｅ）又は約２４時間以内（即ち、約２４．１時間以内）（図４Ｃ、４Ｆ）に試料を評定した。ＧＦＡＰ値を図４Ａ～Ｃに示す。ＵＣＨ－Ｌ１値を図４Ｄ～Ｆに示す。
当業者に自明の通り、本願に記載する本開示の方法の他の適切な改変と応用も容易に適用可能であり、妥当であり、本開示の範囲又は本願に開示する態様及び実施形態から逸脱しない限り、適切な均等物を使用して実施することができる。以上、本開示について詳細に記載したが、以下の実例を参照することにより更に明白に理解されよう。なお、これらの実例は本開示の一部の態様と実施形態を例証するものに過ぎず、本開示の範囲を制限するものとみなすべきではない。本願中に言及する全雑誌資料、米国特許及び刊行物の開示内容全体を本願に援用する。
本発明は、本願に記載する非限定的な実施例により例証される複数の態様を有する。
当然のことながら、以上の詳細な説明と添付図面は単に例証に過ぎず、本発明の範囲を制限するものとみなすべきではなく、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲とその均等物のみにより定義される。
本願に開示する実施形態の種々の変更及び改変が当業者に想到されよう。このような変更及び改変としては、限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、又は使用方法に関するものが挙げられ、本発明の趣旨と範囲から逸脱しない限り、このような変更及び改変も実施することができる。
完璧を期するために、本発明の種々の態様を以下に箇条書きにする。
第１項．頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象の診断と評価を補助する方法の改善において、前記方法が、（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施される頭部コンピュータ断層撮影スキャンを、同時又は逐次実施する工程を含み、前記改善が、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む、前記改善。
第２項．更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記画像法がＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む、第１項に記載の改善。
第３項．前記参照値が、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と相関されている、第１項又は第２項のいずれか一項に記載の改善。
第４項．前記試料が、実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内、又は疑われる頭部の損傷後約１２～約２４時間以内に採取される、第１項～第３項のいずれか一項に記載の改善。
第５項．ＵＣＨ－Ｌ１値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第１項～第４項のいずれか一項に記載の改善。
第６項．ＧＦＡＰ値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第１項～第５項のいずれか一項に記載の改善。
第７項．前記アッセイが、ポイントオブケアアッセイ又は単分子検出法を使用して実施される、第１項～第６項のいずれか一項に記載の改善。
第８項．前記試料が、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択される、第１項～第７項のいずれか一項に記載の改善。
第９項．前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部の損傷を生じた後又は生じた可能性があった後に、前記試料を取得する、第１項～第８項のいずれか一項に記載の改善。
第１０項．前記対象が火炎、化学物質、毒素、又は火炎、化学物質及び毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得する、第１項～第９項のいずれか一項に記載の改善。
第１１項．前記化学物質又は毒素が、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである、第１０項に記載の改善。
第１２項．前記試料が、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得される、第１項～第１１項のいずれか一項に記載の改善。
第１３項．対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度外傷性脳損傷のいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、及び前記対象が頭部の損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、任意の対象で前記方法を実施することができる、第１項～第１２項のいずれか一項に記載の改善。
第１４項．更に、前記対象を経過観察する工程を含む、第１項～第１３項のいずれか一項に記載の改善。
第１５項．頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象の診断と評価を補助する方法であって、前記方法が、
ａ．（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で実施される頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを、同時又は逐次実施する工程と；
ｂ．前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む、前記方法。
第１６項．更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む、第１５項に記載の方法。
第１７項．前記参照値が、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と相関されている、第１５項又は第１６項のいずれか一項に記載の方法。
第１８項．前記試料が、実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内、又は疑われる頭部の損傷後約１２～約２４時間以内に採取される、第１５項～第１７項のいずれか一項に記載の方法。
第１９項．ＵＣＨ－Ｌ１値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第１５項～第１８項のいずれか一項に記載の方法。
第２０項．ＧＦＡＰ値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第１５項～第１９項のいずれか一項に記載の方法。
第２１項．前記アッセイが、ポイントオブケアアッセイ又は単分子検出法を使用して実施される、第１５項～第２０項のいずれか一項に記載の方法。
第２２項．前記試料が、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択される、第１５項～第２１項のいずれか一項に記載の方法。
第２３項．前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する頭部の損傷を生じた後又は生じた可能性があった後に、前記試料を取得する、第１５項～第２２項のいずれか一項に記載の方法。
第２４項．前記対象が火炎、化学物質、毒素、又は火炎、化学物質及び毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に前記試料を取得する、第１５項～第２２項のいずれか一項に記載の方法。
第２５項．前記化学物質又は毒素が、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである、第２４項に記載の方法。
第２６項．前記試料が、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得される、第１５項～第２２項のいずれか一項に記載の方法。
第２７項．対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度外傷性脳損傷のいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、及び前記対象が頭部の損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、任意の対象で前記方法を実施することができる第１５項～第２２項のいずれか一項に記載の方法。
第２８項．更に、前記対象を経過観察する工程を含む、第１５項～第２７項のいずれか一項に記載の方法。
第２９項．頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象の診断と評価を補助する方法の改善において、前記対象が、実際の頭部損傷又は疑われる頭部損傷から臨床的に適切な時間枠内で頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを受けており、その結果が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に関して陰性であり、前記方法が、実際の頭部損傷又は疑われる頭部損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイを前記頭部ＣＴと同時又は逐次実施する工程を含み、前記改善が、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高いならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む、前記改善。
第３０項．頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象の診断と評価を補助する方法の改善において、前記方法が、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイを実施する工程を含み、前記改善が、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施された頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが、ＴＢＩに関して陰性であるか、又は前記対象で頭部ＣＴスキャンが実施されていないならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む、前記改善。
第３１項．更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、任意に、頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、その結果がＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む、第３０項に記載の改善。
第３２項．前記参照値が、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と相関されている、第３０項又は第３１項のいずれか一項に記載の改善。
第３３項．前記試料が、実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内、又は実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約１２～約２４時間以内に採取される、第３０項～第３２項のいずれか一項に記載の改善。
第３４項．ＵＣＨ－Ｌ１値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第３０項～第３３項のいずれか一項に記載の改善。
第３５項．ＧＦＡＰ値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、第３０項～第３４項のいずれか一項に記載の改善。
第３６項．前記アッセイが、ポイントオブケアアッセイ又は単分子検出法を使用して実施される、第３０項～第３５項のいずれか一項に記載の改善。
第３７項．前記試料が、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択される、第３０項～第３６項のいずれか一項に記載の改善。
第３８項．前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する実際の頭部の損傷を生じた後に、前記試料を取得する、第３０項～第３７項のいずれか一項に記載の改善。
第３９項．前記対象が火炎、化学物質、毒素、又は火炎、化学物質及び毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得する、第３０項～第３７項のいずれか一項に記載の改善。
第４０項．前記化学物質又は毒素が、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである、第３９項に記載の改善。
第４１項．前記試料が、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得される、第３０項～第３７項のいずれか一項に記載の改善。
第４２項．対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度外傷性脳損傷のいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、及び前記対象が頭部の損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、任意の対象で前記方法を実施することができる、第３０項～第４１項のいずれか一項に記載の改善。
第４３項．更に、前記対象を経過観察する工程を含む、第３０項～第４２項のいずれか一項に記載の改善。
第４４項．前記血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、第１項～第１４項のいずれか一項に記載の改善。
第４５項．前記対象が、ヒト対象である、第１項～第１４項又は第４４項のいずれか一項に記載の方法。
第４６項．前記血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、第１５項～第２８項のいずれか一項に記載の方法。
第４７項．前記対象が、ヒト対象である、第１５項～第２８項又は第４６項のいずれか一項に記載の方法。
第４８項．前記血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、第２９項～第４２項のいずれか一項に記載の改善。
第４９項．前記対象が、ヒト対象である、第２９項～第４２項又は第４８項のいずれか一項に記載の改善。

Claims (17)

  1. 頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のある対象の診断と評価を補助する方法の改善において、前記方法が、（１）実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイと、（２）臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施される頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを、同時又は逐次実施する工程を含み、前記改善が、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、前記頭部ＣＴスキャンがＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する工程を含む、前記改善。
  2. 頭部の損傷を生じているか又は生じている可能性のあるヒト対象の診断と評価を補助する方法の改善において、前記方法が、実際の頭部の損傷又は疑われる頭部の損傷後約２４時間以内に前記対象から取得した試料で、前記試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、又はその組み合わせを含むバイオマーカーの値を測定又は検出するためのアッセイを実施する工程を含み、前記改善が、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、かつ臨床的に適切な時間枠内で前記対象に実施された頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが、ＴＢＩに関して陰性であるか、又は前記対象で頭部ＣＴスキャンが実施されていないならば、前記対象が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する可能性の方が高いと診断する、前記改善。
  3. 更に、前記バイオマーカーの値が参照値よりも高く、任意に、頭部ＣＴスキャンを実施する場合に、ＴＢＩに関して陰性であるならば、前記対象にＴＢＩの治療を施す工程を含む、請求項１又は２に記載の改善。
  4. 前記参照値が、（ａ）頭部損傷を生じている対象における値；（ｂ）対象におけるＴＢＩの発生；（ｃ）対象における軽度、中等度、重度、若しくは中等度～重度等のＴＢＩのステージ；（ｄ）対象における意識消失；（ｅ）ＭＲＩがＴＢＩに関して陰性でなく陽性；（ｆ）対象における健忘の発生（即ち、健忘の有無）又は（ｇ）対象におけるＴＢＩの重症度に関連するカットオフ値と相関されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の改善。
  5. 前記試料が、実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約０～約１２時間以内、又は実際の頭部の損傷若しくは疑われる頭部の損傷後約１２～約２４時間以内に採取される、請求項１～４のいずれか一項に記載の改善。
  6. ＵＣＨ－Ｌ１値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、請求項１～５のいずれか一項に記載の改善。
  7. ＧＦＡＰ値の測定が、イムノアッセイ又は臨床化学検査により実施される、請求項１～６のいずれか一項に記載の改善。
  8. 前記アッセイが、ポイントオブケアアッセイ又は単分子検出法を使用して実施される、請求項１～７のいずれか一項に記載の改善。
  9. 前記試料が、血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、組織試料、体液試料、唾液試料、口咽頭検体、及び鼻咽頭検体から構成される群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の改善。
  10. 前記対象が身体揺さぶり、閉鎖性若しくは開放性頭部外傷をもたらす外的な機械的若しくは他の力による鈍的衝撃、１回以上の転倒、爆発若しくは爆破又は他の型の鈍力外傷に起因する実際の頭部の損傷を生じた後又は生じた可能性があった後に、前記試料を取得する、請求項１～９のいずれか一項に記載の改善。
  11. 前記対象が火炎、化学物質、毒素、又は火炎、化学物質及び毒素の組み合わせを吸い込んだ後又はこれらに曝露された後に、前記試料を取得する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改善。
  12. 前記化学物質又は毒素が、カビ、アスベスト、駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、接着剤、ガス、有機金属、乱用薬物又は１種以上のそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の改善。
  13. 前記試料が、自己免疫疾患、代謝障害、脳腫瘍、低酸素症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、髄膜炎、水頭症、又は任意のそれらの組み合わせに罹患している対象から取得される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改善。
  14. 対象の臨床状態、対象の臨床検査値、対象が軽度、中等度、重度、又は中等度～重度外傷性脳損傷のいずれを生じているかの分類、対象のＵＣＨ－Ｌ１値、ＧＦＡＰ値又はＵＣＨ－Ｌ１値とＧＦＡＰ値が低値、中値又は高値のいずれであるか、及び前記対象が頭部の損傷を生じた又は生じた可能性のあるイベントのタイミングから構成される群から選択される因子に関係なく、任意の対象で前記方法を実施することができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改善。
  15. 更に、前記対象を経過観察する工程を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の改善。
  16. 前記血液試料が、全血、血清又は血漿である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改善。
  17. 前記対象が、ヒト対象である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の改善。
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