JP6602481B2 - 予後診断方法及び該方法において有用なキット - Google Patents
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Description
本発明は、大まかには、乳がんための診断、予後診断及びモニタリング方法並びにアッセイ、そしてかかる方法において用いられ得るキットに関する。
乳がんは、世界中で最も頻発する悪性腫瘍の1つであり、公衆衛生上の重要な問題となっている。乳がんは、該疾患の理解が継続的に改善しているにもかかわらず、医学的介入に対する抵抗が依然として大きい。大抵の臨床戦略は早期診断に焦点を当てており、従来型の介入、特に外科手術、放射線、ホルモン抑制、及び化学療法はその次になっている。かかる介入の成功は、特に腫瘍が転移を経た患者においては、限定的である。従って、可能な限り侵襲の少ない方法で首尾よく治療することを可能にする、より正確でより効果的な情報を提供するために、有利な診断のツール及び方法を改良することが急務である。引き続き、薬物治療の更なる、より良好な標的を同定する必要もある。
本発明者らは、HER2/CB2の発現が、乳がん患者における局所無病生存期間と相関することを発見した。最近、HER2/CB2が、乳がん細胞においてヘテロマーとして存在することも記述された。本発明者らは、HER2/CB2ヘテロマーの発現が、患者の不良な予後と相関することも示した。HER2/CB2ヘテロマーが、がん細胞をΔ9−テトラヒドロカンナビノール(THC)で処理すると解離することも示した。
本発明の方法及びキットが記述される前に、本発明は、記述される特定の方法論、プロトコール及び試薬には、これらが変わることがあるため、限定されないことが理解される。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によって記述される本発明の範囲の限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
HER2/CB2ヘテロマー発現の測定は、当業者に知られている1以上の方法によって行われ得る。例えば、HER2/CB2ヘテロマー発現レベルは、共局在プロトコール、共免疫沈降アッセイ、共鳴エネルギー移動技術、近接ライゲーションアッセイを用いて、又はヘテロマーを検出するように設計された特異的プローブの使用によって、測定され得る。
本明細書で用いられる場合、用語「乳がん」は、in situの乳管がん腫(乳管内がん腫)、in situの小葉がん腫、浸潤性(invasive)(又は浸潤性(infiltrating))乳管がん腫、浸潤性(invasive)(又は浸潤性(infiltrating))小葉がん腫、炎症性乳がん、トリプルネガティブ乳がん、乳頭のパジェット病、葉状腫瘍、血管肉腫又は浸潤性乳がん腫を含む。いくつかの実施形態において、浸潤性乳がん腫は更にサブタイプに分類される。いくつかの実施形態においては、サブタイプとしては、腺様嚢胞(又は腺嚢)がん腫、低悪性度腺扁平上皮がん腫、髄様がん腫、粘液(又はコロイド)がん腫、乳頭がん腫、管状がん腫、化生性がん腫、微小乳頭がん腫又は混合がん腫が挙げられる。好ましくは、本明細書で用いられる場合、該用語は、HER2+乳がんを指す。
本発明の検出方法は、望ましくは、従来の任意の試験キットの様式で行われる。例えば、イムノアッセイは、固体捕捉、競合、又はサンドイッチイムノアッセイであり得る。
1999年から2013年の間、12 de Octubre Hospital(Madrid,Spain)で手術された症例に対応する57のHER2+乳がん試料を含有する組織マイクロアレイ(TMA)において、HER2−CB2ヘテロマーの発現を解析した。発現解析は、Duolink II in situ PLA検出キット(Olink、Bioscience、Uppsala、Sweden)を用いて、近接ライゲーションアッセイにより行った。試料を共焦点顕微鏡下で観察し、赤色蛍光シグナル(ヘテロマーに対応する)をImageJソフトウェアで処理した。試料をHER2−CB2ヘテロマー発現によってランク付けし、最良のカットオフを手動で選択した。
我々は以前に、THCが、抗腫瘍応答をもたらす濃度で用いられると、BT474細胞中のHER2−CB2ヘテロマーを破壊することを報告した。実施例1で検討したように、我々は、近接ライゲーションアッセイ(PLA)及び生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)アッセイを用いてこれらの効果を観察した。我々は、同一細胞株において、付随するHER2の分解も観察したが、これは、THCが、HER2−CB2ヘテロマーを破壊し、HER2を不安定化することによって、その抗増殖効果を誘導することを示唆している。
細胞、細胞培養、及びトランスフェクション
BT474及びHCC1954ヒト乳腺がん腫細胞を、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で維持した。
細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、20mmグリシンを含有するPBSで洗浄し、0.05%Triton X−100を含有する同じ緩衝液で透過処理し、PBSで連続的に洗浄した。Duolink in situ Probemarker kit(Olink,Bioscience,Uppsala,Sweden)を用いて、HER2−CB2Rヘテロマーを検出した。予熱した湿度室中で、ブロッキング溶液と37℃で1時間インキュベーション後、細胞を、等量の、プラスPLAプローブに直接結合した抗CB2ウサギ抗体(1:50,Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)と、マイナスPLAプローブに直接結合した抗HER2ウサギ抗体(1:50,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,US)との混合物を含む抗体希釈培地中で、一晩インキュベーションした。細胞を、室温で洗浄緩衝液Aで洗浄し、ライゲーション溶液(Duolink II ligation stock,1:5,及びDuolink II ligase,1:40)と、予熱した湿度室中で37℃で30分間インキュベーションして2つのDNAプローブのアニーリング及びライゲーションを誘導した。蛍光ヌクレオチドを含有するDuolink II detection reagents red kitを用いて増幅を行った。洗浄緩衝液Bを用いて室温で徹底的に洗浄した後、細胞を、DAPIを含む封入剤を用いて封入した。Leica SP2共焦点顕微鏡(Leica Microsystems,Mannheim,Germany)の下で試料を観察した。赤色蛍光画像をImageJソフトウェアで処理した。PLAは、両方の受容体が、2つの異なる抗体−DNAプローブをライゲーション可能にするよう、十分に近接している(17nm未満)ことを要する(Soderberg et al.,(2008),Methods.,45:227-232;Trifilieff et al.,(2011),BioTechniques,51:111-118)。受容体が十分に近接している場合、点状の蛍光シグナルが共焦点顕微鏡法によって検出され得る。
プロテアーゼインヒビター(ペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、キモスタチン、アンチパイン、及びフェニルメチルスルホニルフルオライド)のカクテル及びホスファターゼ阻害剤(Na3VO4及びNaF;Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)を含有するRIPAバッファー(50mM Tris,150mM NaCl,1%NP−40,0.5%デオキシコール酸ナトリウム,及び0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)でHCC1954細胞を処理した。ドデシル硫酸ナトリウム−10%ポリアクリルアミド還元ゲルによって分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド膜(Bio−Rad Laboratories,Hercules,Calif.)に転写した。5%スキムミルク及び1%ウシ血清アルブミンでブロッキングの後、膜を、1:500に希釈した抗ErbB2抗血清(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California)と、室温で3時間インキュベーションした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリンG(IgG)ヤギ抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif.)で可視化した。ペルオキシダーゼを可視化するために、化学発光検出システム(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)を用いた。1:5,000に希釈した抗アクチンモノクローナル抗体(MAb;Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.)、続いて1:4,000に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(Zymed)を用いて対照を実施した。
Fugene HD Transfection Reagent(Promega,Madison,WI)を用いて、HCC1954及びBT474細胞を、pcDNA3−HA−hCB2又は対応する空ベクター(pcDNA3)で一過的にトランスフェクションした。トランスフェクション後48時間で、細胞を3μM THC又は対応するビヒクル(DMSO)で4時間処理し、共免疫沈降のための特定の緩衝液(1mMベンズアミジン及び0.1mM PMSFを新たに添加した、40mM Hepes pH7.5,120mM NaCl,1mM EDTA,10mMピロリン酸ナトリウム,10mMグリセロリン酸ナトリウム,50mMフッ化ナトリウム,0.5mMオルトバナジン酸ナトリウム,0.3%CHAPS)を用いて溶解した。5μLプロテインG−セファロースに共有結合した5μgの抗ErbB2抗体(Neu C−18,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,US)を用いて、細胞溶解物(1mg)を免疫沈降させた。免疫沈降後、タンパク質をSDS−10%ポリアクリルアミド還元ゲルにより分離し、PVDF膜に転写した。TBST中5%w/v脱脂粉乳でブロッキング後、膜を、抗ErbB2抗体(1:1000)及び抗HA抗体(1:1000,Cell Signaling Technology,Danvers,MA)と4℃で一晩インキュベーションした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリンG(IgG)ロバ抗体(GE Healthcare,UK)で検出した。ペルオキシダーゼ活性を検出するために、化学発光検出システム(Bio−Rad,California,EEUU)を用いた。
Claims (10)
- 乳がん患者の局所無病生存期間の長さを予測するための方法であって、前記患者から得られた生体試料中のHER2/CB2ヘテロマー発現のレベルを測定すること;前記レベルを、健康な個人を示す基準又はより長いか、若しくはより短い全生存期間を示す基準と比較すること;及びHER2/CB2ヘテロマー発現の前記レベルに基づいて予測される局所無病生存期間の長さを示すことを含む、方法。
- HER2/CB2ヘテロマーの発現レベルを測定する工程が、HER2/CB2ヘテロマー結合組成物を接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- HER2/CB2ヘテロマーの発現レベルを測定する工程が、共局在プロトコール、共免疫沈降アッセイ、共鳴エネルギー移動技術、近接ライゲーションアッセイ及びヘテロマーを検出するように設計された特異的プローブの使用からなる群から選択される、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- HER2/CB2ヘテロマーの発現レベルを測定する工程が、近接ライゲーションアッセイ(PLA)又は生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)アッセイである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- HER2/CB2ヘテロマー結合組成物が、HER2/CB2ヘテロマーに特異的に結合することができる抗体を含む、請求項2に記載の方法。
- HER2/CB2ヘテロマーを検出することができる薬剤及び使用のための説明書を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法で用いられるキット。
- 前記薬剤がHER2/CB2ヘテロマー結合組成物である、請求項6に記載のキット。
- 前記HER2/CB2結合組成物が、HER2/CB2ヘテロマーに特異的に結合することができる抗体を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項8に記載のキット。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項8に記載のキット。
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