JP2009192527A - 癌マーカー及び癌細胞の検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、癌の予後を判断するための新規癌マーカー及び当該マーカーを用いた癌細胞の検査方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ＲＢ１ＣＣ１(RB1-inducible coiled-coil 1)に着目し、ＲＢ１ＣＣ１と癌患者の予後との関係を調べた結果、ＲＢ１ＣＣ１が陰性の場合には陽性の場合に比べて生存率、無病生存率が有意に低いことが確認され、ＲＢ１ＣＣ１の発現の有無が癌の予後判断のために有意な癌マーカーとなりうることを見出した。例えば乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１の検出により、乳癌の予後を判断することができる。さらにｐ５３、ＲＢ１をＲＢ１ＣＣ１と並行して検出することにより、乳癌の予後をより精度良く予測することができる。
【選択図】図５

Description

本発明は、癌の予後を判断するための新規癌マーカー及び当該マーカーを用いた癌細胞の検査方法に関する。より詳しくは、乳癌を患う患者の予後を予測するための検査方法に関し、さらには検査のための検査用試薬キットに関する。

癌は、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、乳癌罹患率は、日本人では欧米諸国に比べて低いが、近年では増加傾向にあり、胃癌の罹患率を抜いて女性罹患率の第１位となることが予想される。

癌の診断にはＸ線ＣＴやＭＲＩなどの画像診断のほか、特定の癌に特異的に発現する癌マーカーや血液、組織中に漏出する癌マーカーなどを検出する方法も汎用されている。乳癌の一般的なスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され臨床的に疑いが生じると、細胞診や生検が実施され病理学的診断により癌であるかどうか判別される。上記診断のほか、乳癌に特異的に発現する癌マーカーを検出する方法も汎用されている。乳癌のマーカーとしては、ＣＡ１５−３ (carbohydrate antigen 15-3)、ＣＥＡ (carcinoembryonic antigen)、ＢＣＡ２２５ (breast cancer antigen-225) 、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ｃ−ｅｒｂＢ−２などが知られている。さらに、ＨＥＲ−２も乳癌マーカーとして用いられる。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌以外にも、卵巣癌、胃癌、膀胱癌などで高頻度に認められる。ＨＥＲ−２の検査方法では、免疫組織染色やFISH法などが挙げられる。ＨＥＲ−２陽性の場合の治療方法として、ＨＥＲ−２に対するヒト化マウスモノクロナール抗体（ハーセプチン^(R)(Trastuzumab)）を投与する抗体療法が挙げられる。

乳癌の治療は原則的には外科手術であり、化学療法や放射線療法等が併用されることもある。腫瘍のタイプと病期（ステージ）によって、乳腺腫瘤摘出、乳房部分切除又は外科的に完全に乳房を切除する方法である乳房切除術などが挙げられる。また、判断によっては、腋窩リンパ節も手術の際に切除される。化学療法は、主に術前、術後の補助化学療法や進行、再発乳癌の治療に用いる。また、放射線療法なども挙げられる。放射線療法は乳房温存療法における術後照射が広く行われている。また転移リンパ節、遠隔転移の治療に用いられることも多い。

なお、癌マーカーにおいては、診断マーカー、予後予測マーカー、治療奏効性予測マーカーなどの種類が挙げられる。乳癌の予後については、癌細胞の分化の程度、リンパ節、血管侵襲の有無などの病理学的所見に応じて判断するのが一般的である。特に低分化型幹細胞癌のほうが高分化型細胞癌に比べて、予後が悪い傾向がある。しかしながら、生検により得られた検体について癌細胞の分化程度を判断するのは、必ずしも容易ではなく、また乳癌においては分化程度と予後について、明確に解明されているわけではない。乳癌に関し、予後を予測しうるマーカーがあれば、例えば外科的療法の場合に、より効果的な切除方法を選択することができ、患者にとって肉体的、精神的負担を軽減化することができる。このように、予後診断マーカーは、癌診断後の治療方法を選択する上の重要な判断基準となるため、強く望まれている。

癌の発生に関連して、各種癌抑制因子が知られている。例えば、網膜芽細胞腫は網膜から発生する悪性腫瘍であるが、この腫瘍は１３番染色体上の13q14領域で癌抑制遺伝子であるＲＢ１(retinoblastoma 1)遺伝子の異常によって発生することが知られている。ＲＢ１遺伝子の発現等についてはＲＢ１ＣＣ１(retinoblastoma 1 (RB1)-inducible coiled-coil 1)）タンパク質が重要な役割を果たしていることが報告されている（特許文献１）。

ヒトの癌全体の約８０％において、ＲＢ１遺伝子が関与する分子経路の欠陥がみられるが、乳癌の場合にはＲＢ１遺伝子の突然変異ではなくＲＢ１遺伝子の調節にかかわる遺伝子としてＲＢ１ＣＣ１遺伝子の突然変異及び機能消失により乳房組織内でのＲＢ１の発現レベルが下がり、癌の形成につながること可能性が示唆されている（非特許文献１）。ここでは、３５例のヒトの乳がんについてスクリーニング解析を行い、そのうちの２０％（７例）において、対になっている２つのＲＢ１ＣＣ１遺伝子に突然変異を認めた。これらの癌において９種類の突然変異が見られた。これらの突然変異では、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の一部が欠失していることを確認し、その結果、ＲＢ１ＣＣ１タンパク質が何らの機能も果たさないことが報告されている。この結果、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の突然変異によって乳房組織内でのＲＢ１の発現レベルが下がり、癌の形成に繋がっている可能性が示されている。しかしながら、ＲＢ１ＣＣ１と乳癌の予後との関係については、一切開示がない。

特開２００４−５７００３号公報

Nature Genetics vol.31 (2), (Jun 2002)

本発明は、癌の予後を判断するための新規癌マーカー及び当該マーカーを用いた癌細胞の検査方法を提供することを課題とする。さらには当該マーカーを用いて検査するための検査用試薬キットを提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、生体検体から分離した癌細胞を含む組織について、ＲＢ１ＣＣ１(RB1-inducible coiled-coil 1) に着目し、ＲＢ１ＣＣ１と癌患者の予後との関係を調べた結果、ＲＢ１ＣＣ１が陰性の場合には陽性の場合に比べて生存率が有意に低いことが確認され、ＲＢ１ＣＣ１の発現の有無が癌の予後判断のために有意な癌マーカーとなりうることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下よりなる。
１．生体から生体検体を分離し、当該生体検体中のＲＢ１ＣＣ１(retinoblastoma 1 (RB1)-inducible coiled-coil 1)を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする癌細胞の検査方法。
２．癌細胞が乳癌細胞である、前項１に記載の癌細胞の検査方法。
３．生体検体が、ＲＢ１陽性と評価されたものである、前項１又は２に記載の検査方法。
４．さらに、上記生体検体中のｐ５３を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする前項１〜３のいずれか１に記載の癌細胞の検査方法。
５．ＲＢ１ＣＣ１が陰性の場合に、予後が不良と判断する前項１〜４のいずれか１に記載の癌細胞の検査方法。
６．さらに、ｐ５３が陽性の場合に、予後が不良と判断する前項４又は５に記載の癌細胞の検査方法。
７．ＲＢ１ＣＣ１及び／又はｐ５３、ＲＢ１の検出を、免疫学的手法により行う前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
８．免疫学的手法が、免疫組織染色である前項７に記載の検査方法。
９．生体検体中のＲＢ１ＣＣ１を検出するための抗ＲＢ１ＣＣ１抗体を含む前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
１０．前項９に記載の抗ＲＢ１ＣＣ１抗体と、生体検体中のｐ５３を検出するための抗ｐ５３抗体及び／又は生体検体中のＲＢ１を検出するための抗ＲＢ１抗体とを含む、前項３〜８のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。

本発明の乳癌の検査方法によると、乳癌組織がＲＢ１ＣＣ１−（陰性）症例での術後５年生存率は５３．９％であったのに対し、ＲＢ１ＣＣ１＋（陽性）症例では９０．５％であり、陰性症例は陽性症例に比べて有意に予後不良であった。同様に、ｐ５３陽性（ｐ５３変異を示唆する：ｐ５３mut）、ｐ５３陰性（ｐ５３正常を示唆する：ｐ５３wt）と併せて症例を分類し、生存率との関係を調べた結果、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wtでは９３．５％、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３mutでは３３．３％の５年生存率であり、生存率について有意な差を認めた。
また、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wtでは、術後５年再発率が５．８８％、術後５年以降再発率が６．４７％であるものの、術後生存率は９６．４７％であり、成績良好であった。一方、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt以外の症例では、術後５年以内再発率が２７．７４％と高く、術後生存率も７８．１％と低かった。ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt以外の症例では、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wtの症例に比べ、術後５年以内の早期再発、早期死亡症例が多く、有意に予後不良であった。
これにより、術後生存、術後再発ともにＲＢ１ＣＣ１は乳癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。さらに、ＲＢ１ＣＣ１と並行してｐ５３及び／又はＲＢ１について検出することで、乳癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。乳癌と診断された患者について、生検などで乳房組織を採取した際や手術で切除された乳房組織の乳癌検体に、本発明の検査方法を用いて検査することで予後を判断することができ、適切な治療方法を選択することができる。

ＲＢ１の発現及び機能に及ぼすＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３の作用を示す図である。 各マーカーについて検査したときの５年生存率を示す図である。（実施例１） 各マーカーについて検査したときの５年無病生存率を示す図である。（実施例１） 各マーカーについて検査したときの免疫組織染色の写真を示す図である。（実施例２） 各マーカーについて検査したときの生存率を示す図である。（実施例２） ＲＢ１陰性（異常）症例について検査したときの生存率、無病生存率を示す図である。（実施例２） 各マーカーについて検査したときの無病生存率を示す図である。（実施例２） 実施例２の結果のまとめを示す図である。

本発明の癌細胞の検査方法は、ＲＢ１ＣＣ１を単独マーカーで、又はＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３をマーカーとして検出することによる。ＲＢ１ＣＣ１を単独のマーカーとしてもよいが、ｐ５３についても併せてマーカー確認を行うことで、より効果的な癌予後の判断を行うことが可能となる。さらに、ＲＢ１についてもマーカー確認を行うことが効果的であり、ＲＢ１についてのマーカー確認は、ＲＢ１ＣＣ１のマーカー確認の前に予め行っていてもよい。
ＲＢ１遺伝子は癌抑制遺伝子であり、ＲＢ１ＣＣ１タンパク質は、ＲＢ１遺伝子の発現に重要であることは上記特許文献１にて報告したとおりである。ｐ５３タンパク質は、細胞周期制御遺伝子（Cdk inhibitor）の一種であるｐ２１に作用し、ＲＢ１ＣＣ１タンパク質とともにＲＢ１の機能増強に重要な役割を有する（図１参照）。ｐ５３タンパク質はまた腫瘍細胞死、いわゆるアポトーシスにも関与し、腫瘍進展に重要な役割を果たすことが知られている。しかしながら、これらタンパク質の発現を複合的に評価し、指標とする病理診断が、乳癌の予後を予測しうることは本発明者らが初めて見出した。

本明細書において、生体から取得した検体を生体検体といい、各種検査や試験に供するために前処理された検体を試料ということとする。本発明の癌細胞の検査方法に供するための生体検体は、癌患者の癌組織に由来するものであり、好ましくは乳癌患者の乳房組織に由来するものであればよく、さらに好ましくは乳癌細胞を含む検体であれば良い。生体検体は、患者から採取された検体であり、本発明の検査方法のために取得した検体であってもよいが、他の検査に供するために取得した検体や、手術により採取した検体であってもよい。例えば検体を免疫組織染色検査に供する場合、検査に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば検体をウェスタンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲ法に供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液、又はｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。また本発明における生体検体は、ＲＢ１についてのマーカー検出に供された場合にＲＢ１陽性であると判断された生体検体もしくは試料が好ましい。

本発明の癌細胞の検査方法において、ＲＢ１ＣＣ１又はｐ５３、ＲＢ１を癌マーカーとして検出する方法は、生体検体中のＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１を確認可能な方法であれば良く、定性的であってもよいし、定量的であってもよい。例えば、単にＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の有無を検出するものであってもよく、またＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の発現量を相対的若しくは絶対的に決定するものでもよい。ＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の発現は、タンパク質レベルで検出又は定量してもよく、またｍＲＮＡレベルで検出又は定量してもよい。例えば、ＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１は、各遺伝子の突然変異等に起因して、各正常タンパク質の発現が抑制されるのであれば、各々について遺伝子レベルでの野生型や突然変異型を確認する方法であってもよい。

本発明において、ＲＢ１ＣＣ１が陰性の場合に、予後が不良と判断する。さらに、ｐ５３が陽性の場合に、予後が不良と判断する。また、ＲＢ１ＣＣ１とｐ５３、ＲＢ１の発現を併せて確認することにより、詳細に予後予測をすることも可能と考えられる。例えば、ＲＢ１ＣＣ１が陰性、ｐ５３が陽性、もしくはＲＢ１が陰性のいずれかの場合、または、ＲＢ１が陽性であっても、ＲＢ１ＣＣ１が陰性かつ／またはｐ５３が陽性の場合には、術後５年以内の再発および死亡の可能性が高いと予測する。ＲＢ１とＲＢ１ＣＣ１が陽性であり、かつｐ５３が陰性の場合、生存率は高く、術後死亡率も非常に低い。これらの場合、死亡率は非常に低く、成績は良好であると判断される。しかし、術後５年以降の遅発性再発の可能性も残存しており、長期にわたる観察が必要であると、判断できる。
ここにおいて、ｐ５３陽性とはｐ５３変異を示唆するｐ５３mutの場合をいい、ｐ５３陰性とはｐ５３正常を示唆するｐ５３wtの場合をいう。ｐ５３mutの場合は、変異無機能型のタンパク質が分解されず、細胞内に蓄積し続けるからである。

ＲＢ１ＣＣ１又はｐ５３、ＲＢ１の発現のタンパク質レベルでの検出は、免疫学的手法によるのが簡便であり、好適である。例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。また、ｍＲＮＡレベルでの検出は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ等により行うことができる。

免疫組織染色法は自体公知の方法を採用することができる。その具体例を以下に示すが、以下は例示であって、本方法に限定されるものではない。

乳癌と診断された患者から、生検や手術切除等により分離した生体検体を、常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋してミクロトームにて厚さ４μｍ程度の組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用する。切片試料は完全にパラフィンを除き、１００％から徐々に濃度を下げたアルコール溶液にくぐらせ親水化し水洗する。その後、抗体の浸透性を高めるために耐熱ガラス容器に入れた約ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に切片試料を漬け、例えばオートクレーブ等の加熱処理により抗原を賦活化する。室温まで放置し冷却し流水で緩衝液を水洗後、例えば市販の免疫組織染色キットを用いて免疫組織染色を行う。非特異的反応等をブロッキングした後、切片試料を抗ＲＢ１ＣＣ１抗体又は抗ｐ５３抗体、抗ＲＢ１抗体を滴下し常温で反応させる。洗浄後、標識抗体、増幅試薬等を用いてそれぞれ反応させる。洗浄後、発色試薬を用いて発色を行なったのち、流水にて洗浄を行う。その後、染色液にて検体の細胞核を染色する。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせ脱水し、検体上に封入剤を滴下しカバーグラスを被せて顕微鏡にて観察する。顕微鏡下では乳癌のＲＢ１ＣＣ１タンパク質又はｐ５３タンパク質、ＲＢ１タンパク質の発色を観察する。以下に説明するように、その発色により陽性陰性の判定を行うことができる。

なお、ＲＢ１ＣＣ１発現及びｐ５３発現、ＲＢ１発現の分類は、患者からの生体検体における各タンパク質の発現量を、コントロールにおけるＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の発現量と比較することにより行うことが好ましい。各タンパク質の発現結果を分類する段階の数に応じて、複数のコントロールを用いることが好ましい。
例えば、ＲＢ１ＣＣ１発現の結果を２種類の段階（陽性及び陰性）に分類する場合は、各段階に対応した２種類のコントロール（ＲＢ１ＣＣ１陽性コントロール及びＲＢ１ＣＣ１陰性コントロール）を用いることが好ましい。また、陽性コントロールの１つとして、健常者又は予後良好な乳癌患者に由来するコントロールを用いることが好ましい。

免疫組織染色法による陽性と陰性の判断は、以下のようにすることができる。ＲＢ１ＣＣ１については、乳癌組織の癌細胞の染色強度を、「細胞の核に陽性染色あり」及び「染色なし」の２段階に分類し、陽性と陰性の判定をする。ｐ５３については、同様に細胞の核の染色で判断するが、ｐ５３mutの場合は、変異無機能型のタンパク質が分解されずに細胞内に蓄積するので、強い染色が認められ、ｐ５３wtの場合は若干の染色が認められる場合があるが、非常に微弱である。従って、ｐ５３の場合は、「細胞の核に強い染色」を認めるものと「弱い染色、もしくはほぼ無染色」しか認められないものの２段階に分類でき、容易に判別が可能であり、これにより陽性と陰性の判定をする。ＲＢ１についても同様に細胞の核の染色で判断するが、「細胞核に陽性所見あり」及び「染色なし」の２段階に分類し、陽性と陰性の判定をする。

免疫組織染色により、半定量的に評価する場合は、例えば全癌細胞数を１００としたときの陽性率を比較して評価することができる。ＲＢ１ＣＣ１について、具体的には、１）細胞質、核のいずれも陰性、２）細胞質には陽性も核においては全癌細胞数の＜１０％が陽性、３）核において全癌細胞数の１０−５０％が陽性、４）核において全癌細胞数の５１−８０％が陽性、５）核において全癌細胞数の＞８０％が陽性、のように評価することができる。定性的には上記１）−２）の場合はＲＢ１ＣＣ１−（陰性）、３）−５）の場合はＲＢ１ＣＣ１＋（陽性）と評価することができる。なお、ＲＢ１についても同様に評価を行うことができる。

また、ｐ５３の陽性陰性については例えば、次のように判断することができる。ｐ５３の「細胞の核に強い染色」が認められた癌細胞の割合が全癌細胞数の５０％より多い検体を、ｐ５３陽性とし、それ以外の検体をｐ５３陰性と評価することができる。判断が困難な場合は、補助的にｐ２１の染色を行い、これにより癌細胞中のｐ２１の染色が認められた陽性細胞の割合が全癌細胞数の１０％に満たない検体を、ｐ５３陽性と判断することもできる。

本発明は、癌を患う患者の予後を予測するための検査用試薬並びに検査用試薬キットも含まれる。当該キットにより、患者から得られた生体検体におけるＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の発現を検出又は定量することができる。すなわち、タンパク質レベルでＲＢ１ＣＣ１やｐ５３、ＲＢ１の発現を検出又は定量するための検査用試薬キットとして、免疫学的手法、例えば免疫組織染色やウェスタンブロット法などに使用される検査用キットが挙げられる。免疫学的手法によりＲＢ１ＣＣ１の検査を行う場合には、少なくとも抗ＲＢ１ＣＣ１抗体が検査用試薬に含まれる。さらに、ｐ５３の検査を行う場合には、抗ｐ５３抗体を含む検査用試薬、ＲＢ１の検査を行う場合には抗ＲＢ１抗体を含む検査用試薬も必要である。また、ｐ５３の検査を行う場合には、補助的に抗ｐ２１抗体を含む検査試薬が必要になる場合もある。

抗ＲＢ１ＣＣ１抗体は、ＲＢ１ＣＣ１の発現を検出しうる抗体であればよく、自体公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル、ポリクローナル抗体や、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。抗ｐ５３抗体、抗ＲＢ１抗体、抗ｐ２１抗体についても同様である。

本発明は、上記に使用する検査用試薬キットも含まれる。本発明の検査用キットには、ＲＢ１ＣＣ１を単一マーカーとする場合は、上記抗ＲＢ１ＣＣ１抗体のほか検出用に用いる標識を含んでいてもよい。また、ＲＢ１ＣＣ１と、ｐ５３および／またはＲＢ１とをマーカーとして検出又は定量する場合は、キットには、抗ＲＢ１ＣＣ１抗体と、抗ｐ５３抗体および／または抗ＲＢ１抗体とを含むことができる。さらには、抗ｐ２１抗体、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。

以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。

（実施例１）免疫組織染色によるＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３、ＲＢ１の確認
ＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３、ＲＢ１の予後予測能を検証する目的で、抗ＲＢ１ＣＣ１抗体及び抗ｐ５３抗体、抗ＲＢ１抗体を用いた免疫組織染色を乳癌５９症例の検体について行った。

１）免疫組織染色
外科的手術により取得した乳癌組織を含む検体（５９症例）を、１０％ホルマリンを含む緩衝液に加え、一晩固定した。固定検体を、７０％エタノール中で数回洗浄し、パラフィンに包埋し、５μｍの連続切片を作製した。脱パラフィンした切片試料を、０．３％のH₂0₂に浸し、１２０℃で１分間オートクレーブにより、滅菌及び免疫賦活化処理した。次に、抗ＲＢ１ＣＣ１抗体（自家製）及び抗ｐ５３抗体（Novocastra社製PAb1801、もしくはSanta Cruz社製FL393）、抗ＲＢ１抗体（Pharmingen社製G3-245）を加え、４℃に1×Tris緩衝液(TBS)で一晩置いた。各切片を1×TBSで洗浄し、二次抗体（Simple Stain MAX-PO^TM；ニチレイ社）を加え、室温にて１時間おいた。免疫組織染色のために更にＤＡＢ染色 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAKO社)を行い、さらにヘマトキシリン染色を行った。
すべての検体は、患者からの書面によるインフォームド・コンセントを得たものであり、施設の倫理委員会により使用を承認されたものである。

２）臨床の結果のための微視的な評価及び統計分析
免疫組織染色を行った５９症例のうち、４例はＲＢ１−（陰性：異常）で予後不良（５年生存率５０％）であった。ＲＢ１＋（陽性：正常）の５５例のうち、ＲＢ１ＣＣ１＋（陽性）症例は４２症例、ＲＢ１ＣＣ１−（陰性）症例は１３例であった。また、ｐ５３陰性症例（野生型(ｐ５３wt)）は４１症例、強陽性症例（変異型(ｐ５３mut)）は１４例であった。予後との関連を検討した結果、術後５年生存率はＲＢ１ＣＣ１を単独マーカーとした場合は、陽性症例では９０．５％であったのに対し、陰性症例では５３．９％であり、陰性症例は陽性症例よりも有意に予後不良であった（表１、図２：Log-Rank test p=0.0028）。さらに、ｐ５３を単独マーカーとした場合は、ｐ５３wt症例では８５．４％であったのに対し、ｐ５３mut症例では７１．４％であった。ＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３をマーカーとした場合は、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wtの場合（いずれのマーカーも正常。より正常細胞に近いと示唆される症例の場合。）は、術後５年生存率は９３．５％であったのに対し、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３mut症例の場合（いずれのマーカーも異常。より癌化が進行したと示唆される症例の場合。）は３３．３％であり、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３mut症例はＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt症例より有意に予後不良であった（表１、図２：Log-Rank test p=0.0094）。

また術後５年無病生存率に関しても、ＲＢ１ＣＣ１を単独マーカーとした場合は、陽性症例では８０．１％であったのに対し、陰性症例では３８．５％であり、陰性症例は陽性症例よりも有意に予後不良であった（表２、図３：Log-Rank test p=0.0023）。さらに、ｐ５３を単独マーカーとした場合は、ｐ５３wt症例では７５．６％であったのに対し、ｐ５３mut症例では５７．１％であった。ＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３をマーカーとした場合、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt症例の場合は８７．１％であったのに対し、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３mut症例は３３．３％であり、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３mut症例（いずれのマーカーも異常）はＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt症例（いずれのマーカーも正常）より有意に予後不良であった（表２、図３：Log-Rank test p=0.0084）。

（実施例２）免疫組織染色によるＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３、ＲＢ１の確認
実施例１と同様の手法により、抗ＲＢ１ＣＣ１抗体及び抗ｐ５３抗体、抗ＲＢ１抗体を用いた免疫組織染色を、原発性乳癌３２３症例の外科的手術により取得した乳癌組織を含む検体について行った。患者の平均追跡期間は７９．１ヶ月（３−１３７ヶ月）であり、平均年齢は５３．２歳（２６−９０歳）である。すべての検体は、患者からの書面によるインフォームド・コンセントを得たものであり、施設の倫理委員会により使用を承認されたものである。検体の病理学的診断は、２人以上の臨床病理医によって行い、ＷＨＯ（世界保健機構）のガイドラインに従って分類された。
図４に、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wt、ＲＢ１ＣＣ１−／ｐ５３wt、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３mutの代表的な症例について、検体の免疫組織染色の写真を示す。これら症例（Case1-3）についてＲＢ１は陽性（正常）である。

１）臨床の結果のための微視的な評価及び統計分析
３２３症例のうち、１６症例はＲＢ１の発現が認められず、ＲＢ１遺伝子が欠失しているものと考えられた。これらＲＢ１陰性（異常）１６症例の成績は不良で生存率、無病生存率ともに５６．３％であった（図６）。これらのＲＢ１陰性症例は除外し、ＲＢ１陽性の３０７症例について更に解析を行った。なおＲＢ１遺伝子が欠失している１６症例の生存曲線は、ＲＢ１ＣＣ１（−）９４症例とほぼ同様であった（図５ａ、図６）。
Multivariate Cox proportinal hazard解析を行ったところ、ＲＢ１ＣＣ１−（陰性）症例は死亡の危険度が高く（Hazard ratio=3.075, 95% Confidence Interval=1.544-6.124, p=0.001）（表３）、予後は明らかに不良であった（Log-rank test, Chi-Square value=15.569, p<0.0001）（図５ａ）。

また、ｐ５３のみについての評価では、統計的に有意な差異はなかった（Log-rank test, Chi-Square value=2.719, p=0.0992）（図５ｂ）。
しかし、ＲＢ１ＣＣ１とｐ５３の両方についての評価では、ＲＢ１ＣＣ１が陰性（−）またはｐ５３が陽性（ｐ５３mut）である場合は、ＲＢ１ＣＣ１が陽性（＋）かつｐ５３が陰性（ｐ５３wt）である場合に比べて臨床的に予後が悪い結果であった（図５ｃ）。
無病生存率に関しても、ＲＢ１ＣＣ１は、有意な危険度を示し、予後不良であった（表４、図７ａ）
また、ＲＢ１ＣＣ１とｐ５３の両方についての評価により、より正確に予後が予測可能であることが示唆された（図７ｂ、ｃ）。

これらの結果をまとめたものを、図８に示す。ＲＢ１ＣＣ１−かつ／またはｐ５３mutの症例については、術後５年以内の再発率と死亡率が高く、早期の再発、死亡に注意が必要である。一方、ＲＢ１ＣＣ１＋／ｐ５３wtの症例については、術後５年以降、死亡に至る症例はないものの、6.47％の症例に再発が認められ、術後長期にわたって追跡することが好ましいと考えられた。

以上詳述したように、術後生存率はＲＢ１ＣＣ１を単独マーカーとした場合、陰性症例は陽性症例よりも有意に予後不良であった（表１、図２、表３、図５）。さらに、ＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３、ＲＢ１をマーカーとした場合は、いずれかのマーカーが異常の症例の場合はいずれのマーカーも正常の症例の場合よりも予後不良であった（表１、図２、図５、図６）。また術後無病生存率に関しても、ＲＢ１ＣＣ１を単独マーカーとした場合は、陰性症例は陽性症例よりも有意に予後不良であった（表２、図３、表４、図７）。さらに、ＲＢ１ＣＣ１及びｐ５３、ＲＢ１をマーカーとした場合、いずれもが異常の症例の場合はいずれかが正常の症例の場合よりも予後不良であった（表２、図３、図６、図７）。

以上の結果より、癌と診断された患者について、生体検体中の癌細胞のＲＢ１ＣＣ１を単独のマーカーとした場合に予後を予測することができ、さらにｐ５３、ＲＢ１をマーカーとして並行して検査することで癌患者の予後を予測し、より的確な治療法を選択することができる。

なお、本発明の免疫組織染色による予後の予測を行うことで、外科的手術の場合には組織の適切な切除範囲を決定することができ、また術前後の化学療法、放射線療法、免疫療法などにおいて、適切な治療方法を選択することができる。また、経過を観察（医療監視下に）すべき期間も決定することができる。これにより、患者に対する経済的、肉体的、精神的な過度の負担が軽減化され、医療費の節減にも繋がるものと考えられる。

Claims (10)

1. 生体から生体検体を分離し、当該生体検体中のＲＢ１ＣＣ１(retinoblastoma 1 (RB1)-inducible coiled-coil 1)を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする癌細胞の検査方法。
2. 癌細胞が乳癌細胞である、請求項１に記載の癌細胞の検査方法。
3. 生体検体が、ＲＢ１陽性と評価されたものである、請求項１又は２に記載の検査方法。
4. さらに、上記生体検体中のｐ５３を癌予後予測マーカーとして検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の癌細胞の検査方法。
5. ＲＢ１ＣＣ１が陰性の場合に、予後が不良と判断する請求項１〜４のいずれか１に記載の癌細胞の検査方法。
6. さらに、ｐ５３が陽性の場合に、予後が不良と判断する請求項４又は５に記載の癌細胞の検査方法。
7. ＲＢ１ＣＣ１及び／又はｐ５３、ＲＢ１の検出を、免疫学的手法により行う請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
8. 免疫学的手法が、免疫組織染色である請求項７に記載の検査方法。
9. 生体検体中のＲＢ１ＣＣ１を検出するための抗ＲＢ１ＣＣ１抗体を含む請求項１〜８のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
10. 請求項９に記載の抗ＲＢ１ＣＣ１抗体と、生体検体中のｐ５３を検出するための抗ｐ５３抗体及び／又は生体検体中のＲＢ１を検出するための抗ＲＢ１抗体とを含む、請求項３〜８のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。