JP2020506405A - 乳がんリスクを判定する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、一般的に、乳がんの発症リスクを判定することに関する。特に、本開示は、非癌性乳房腫瘍における複数の発癌バイオマーカーの発現に基づいて、非癌性乳房腫瘍と診断された対象ががんを発症するかどうかを判定する材料及び方法を提供する。本開示はまた、対象が、がん発症の低リスクを有するのか中間リスクを有するのか高リスクを有するのかを判定し、これによって対象を治療するための適切な治療法の選択を可能にするがんリスクスコアを提供する。本開示は、対象におけるその存在が、対象が最終的に浸潤性乳がんを発症することの有意な指標である早期過形成病変のための、改良された診断評価の必要性に対処するものである。

Description

本出願は、２０１７年２月８日に出願した米国仮特許出願第６２／４５６，５３３号の優先権及び利益を主張するものである。この出願は、あらゆる目的のために全体を参照により本明細書に組み込む。
政府支援
本発明の主題は、以下の助成金：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ）により授与された助成番号ＩＩＰ−１３１４２８７及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより授与された助成番号Ｒ４４ＣＡ２０６７７４の条件下で、一部、米国政府支援を得てなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、一般的に、乳がんの発症リスクを判定することに関する。特に、本開示は、非癌性乳房腫瘍における複数の発癌バイオマーカーの発現に基づいて、非癌性乳房腫瘍と診断された対象ががんを発症するかどうかを判定する材料及び方法を提供する。本開示はまた、対象が、がん発症の低リスクを有するのか中間リスクを有するのか高リスクを有するのかを判定し、これによって対象を治療するための適切な治療法の選択を可能にするがんリスクスコアを提供する。
浸潤性乳がん（ＩＢＣ）は、米国において、女性では最も多く診断されるがんであり、２番目に主要ながんの死因である。２０１８年には、約２２５，０００名の女性がＩＢＣと診断され、約４０，０００名が乳がんよって死亡することが予想されている（Ｓｉｅｇａｌら、Ａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６８：７〜３０頁）。乳がん患者の死亡率は、近年、若干低下しているものの、主にがんが発症した後でのがん治療の成功が限定的であることから、依然として非常に高いままである。乳がん患者の死亡率を低減させるための理論的根拠の１つは、乳がんの発症リスクが高い乳がん患者を同定し、治療することである。乳がんの発症リスクが上昇したと認められる１つのコホートは、増殖性異型及び非異型過形成のような前がん性乳房腫瘍を発症している対象を含む。このため、リスクが高まった前がん性乳房腫瘍を有する対象が、効果的に治療されて乳がん発症を予防し得るように、ＩＢＣへ発展する潜在性を有する前がん性腫瘍の生物学を理解することが、有利となる。
これまでの研究は、ＩＢＣの発症が多段階の過程であることを示している。動物実験及びヒトの疫学的証拠に基づくと、終末乳管小葉単位における幹細胞が、異型性のない過形成への増殖を経て、異型過形成へと進行し、次いで上皮内癌へ進行し、最終的にＩＢＣへ進行することが提唱されている（Ａｌｌｒｅｄ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ、８：４７〜６１（２００１）；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｎａｔｏｍｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、９：１８５〜１９７頁（２００２））。乳房生検及び乳房切除標本を含む幾つかの後ろ向き及び前向き研究は、異型性ある無しのいずれの過形成性乳管も、非癌性乳房より癌性乳房で発生することが多いという、過形成が前がん病変であることを示唆した間接的証拠を示している（Ｒｙａｎ、Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｕｒｇｅ、５：２〜８頁（１９６２）；Ｋａｒｐｕｓ Ｃ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ、１６２：１〜８頁（１９９５））。また一部の後ろ向き及び前向き臨床試験は、非癌性乳房腫瘍と診断された対象の中で、異型過形成又は非異型過形成のいずれかであると診断された対象は、乳がんの発症リスクがより高いことも証明している。上記のタイプの腫瘍成長を有していなかった女性に比べて、異型乳管過形成を有する女性では、その相対的に上昇した乳がんの発症リスクは、約５．３倍高く、非異型過形成を有する女性のリスクは、２倍高い（Ｂｌａｃｋ、Ｍ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．２９：３３８〜４３頁（１９７２）；Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗ．Ｄ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１２：１４６〜５１頁（１９８５）；Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、７１：１２５８〜６５頁（１９９３）；Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓ．Ｊ．ら、ＪＡＭＡ、２６７：９４１〜４頁（１９９２）；Ｆｏｏｔｅ、Ｆ．Ｗ．ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ、１２１：１９７〜２２２頁（１９４５）；Ｗｅｌｌｉｎｇｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５５：２３１〜２４３頁（１９７５）；Ａｌｌｒｅｄ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ，８：４７〜６１頁（２００１）；Ｔａｖａｓｓｏｌｉ、Ｆ．Ａ及びＮｏｒｒｉｓ、Ｈ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ、６５：５１８〜２９頁（１９９０）；Ｗｅｌｌｉｎｇｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５５：２３１〜２７３頁（１９７５）；Ｐａｇｅ Ｄ．Ｌ．及びＤｕｐｏｎｔ Ｗ．Ｄ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、２８：１５７〜１６６頁（１９９３）；Ｇｕｒａｙ Ｍ．及びＳａｈｉｎ Ａ．Ａ．、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１１：４３５〜４４９頁（２００６））。まとめると、組織学的及び疫学的証拠は、異型及び非異型過形成病変を、ＩＢＣを発症する潜在性が有意に上昇した最も初期の前駆病変であることを指し示している。
腫瘍疑い又は増殖状態について、米国では１年当たり約８００，０００〜１００万例の乳房生検が実施され、これらのうち、約２００，０００〜２２５，０００例のみが癌性であると判明し、残りは非癌性の良性腫瘍であることが推定される。非癌性腫瘍のうち、約半数は真の良性であり、リスクはほとんどない。非癌性腫瘍の残りの半数は、異型及び非異型タイプの増殖性腫瘍である。すべての異型又は非異型増殖性病変がＩＢＣへと進行するわけではないものの、増殖性腫瘍と診断された女性の相当数ががんを発症する。ある研究は、異型過形成と診断された対象の約２０％が、その後、１〜５年又はそれ以上経つうちにがんを発症したことを明らかにした。通常型過形成、乳頭腫及び硬化性腺症を含んだ非異型増殖性腫瘍群のうち、約１０％が、１〜５年又はそれ以上経つうちにがんを発症した（Ｈａｒｔｍａｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ、３５３：２２９〜２３７頁（２００５））。追跡調査は、米国において、毎年診断される約３００，０００〜４００，０００例の増殖性腫瘍うち、約４０，０００例が、１〜５年又はそれ以上経ってのちにＩＢＣへと発展すると推定した（Ｗｏｒｓｈａｍら、Ｂｒｅａｓｔ Ｊ．、１３：１１６〜１２１頁（２００７）；Ｃｏｏｐｅｙら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、１０５４９−０１２、２３１８（２０１２））。したがって、がんへ進行する約４０，０００名の対象を層別化し、その対象を予防的治療の標的として乳がんの発症を予防することが有利となる。
Ｓｉｅｇａｌら、Ａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６８：７〜３０頁 Ａｌｌｒｅｄ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ、８：４７〜６１（２００１） Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｎａｔｏｍｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、９：１８５〜１９７頁（２００２） Ｒｙａｎ、Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｕｒｇｅ、５：２〜８頁（１９６２） Ｋａｒｐｕｓ Ｃ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ、１６２：１〜８頁（１９９５） Ｂｌａｃｋ、Ｍ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．２９：３３８〜４３頁（１９７２） Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１２：１４６〜５１頁（１９８５） Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、７１：１２５８〜６５頁（１９９３） Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓ．Ｊ．ら、ＪＡＭＡ、２６７：９４１〜４頁（１９９２） Ｆｏｏｔｅ、Ｆ．Ｗ．ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ、１２１：１９７〜２２２頁（１９４５） Ｗｅｌｌｉｎｇｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５５：２３１〜２４３頁（１９７５） Ｔａｖａｓｓｏｌｉ、Ｆ．Ａ及びＮｏｒｒｉｓ、Ｈ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ、６５：５１８〜２９頁（１９９０） Ｐａｇｅ Ｄ．Ｌ．及びＤｕｐｏｎｔ Ｗ．Ｄ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、２８：１５７〜１６６頁（１９９３） Ｇｕｒａｙ Ｍ．及びＳａｈｉｎ Ａ．Ａ．、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１１：４３５〜４４９頁（２００６） Ｈａｒｔｍａｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ、３５３：２２９〜２３７頁（２００５） Ｗｏｒｓｈａｍら、Ｂｒｅａｓｔ Ｊ．、１３：１１６〜１２１頁（２００７） Ｃｏｏｐｅｙら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、１０５４９−０１２、２３１８頁（２０１２）
したがって、対象の早期の過形成病変を評価するためには、材料および方法の改良が必要であり、その存在は、対象が最終的に浸潤性乳がんを発症しているかを評価するうえで重要な指標となる。本明細書に記載した本開示の実施形態が、このような改良を提供する。
（要旨）
本開示の実施形態は、対象におけるがんを予測する方法を含む。これらの実施形態によれば、この方法は、対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること；少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいて、リスクスコアを算出すること；及び算出したリスクスコアに基づいて、対象ががん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定することを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つは、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される。
本開示の実施形態はまた、対象におけるがんリスクを判定するバイオマーカーパネルを含む。これらの実施形態よれば、パネルは、以下の発癌バイオマーカー：ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１の少なくとも２つを含み、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のうちの１つのレベルの定量化を用いて、がん発症の低、中間又は高リスクを予測するリスクスコアを算出する。
本開示の実施形態はまた、がんを発症するリスクのある患者を分類する方法を含む。これらの実施形態によれば、この方法は、対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること；少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいて、リスクスコアを算出すること；及び算出したリスクスコアに基づいて、対象をがん発症の低、中間又は高リスクを有するとして分類することを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つは、ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される。
過形成、これに続く異型過形成の中間段階、並びに非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）及び浸潤性乳がん（ＩＢＣ）を経る、正常な乳房上皮からがんへの乳がん進行の段階の代表的な画像である。 非異型良性過形成と診断された対象（２倍の上昇）及び異型過形成と診断された対象（５倍の上昇）の間で上昇した乳がんのリスクを示す、代表的な組織学的画像である。 のちにがんを発症した対象からの前がん性腫瘍と少なくとも５年間がんを発症しなかった対象からの前がん性腫瘍との間の類似形態を示す、代表的な組織学的画像である。 マイクロアレイ解析を使用して同定された上方調節された遺伝子及び下方調節された遺伝子上位３０個を示す代表的なヒートマップであり、このヒートマップにおいて、のちに乳がんを発症した対象からの異型過形成を、がんを発症しなかった対象と比較した。 のちにがんを発症した対象（ＡＤＨＣ）からの異型組織における、がんを発症しなかった対象（ＡＤＨ）と比較した、マイクロアレイ解析（上段パネル）及びＲＴ−ＱＰＣＲ（下段パネル）を使用したｍＲＮＡレベルに基づく４つの遺伝子（ＢＣＬ２Ａ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＥＣ１及びＭＭＰ−１）の上方調節及び１つの無変化の遺伝子（エストロゲン受容体ベータ、ＥＳＲ２とも呼ぶ）を示す代表的な棒グラフである。 ５年以上乳がんを発症しなかった対象（ＡＤＨ）と比較して、のちに乳がんを発症した対象（ＡＤＨＣ）からの異型過形成腫瘍において調節不全となっている分子経路の代表的な画像である。 のちにがんを発症した対象からの乳房の通常型過剰増殖状態（異型性のない通常型乳管過形成（ＵＤＨＣ））における、がんマーカー、ＣＥＡＣＭ６、ＨＥＣ１、ＨＹＡＬ１、ＭＰＰ−１及びＥＲの発現の代表的な画像である。 のちにがんを発症した対象からの異型性のない乳房の乳頭腫タイプの過剰増殖状態における、がんマーカー、ＣＥＡＣＭ６、ＨＥＣ１、ＨＹＡＬ１、ＭＰＰ−１及びＥＲの発現の代表的な画像である。 のちにがんを発症した対象からの乳房の異型タイプの過剰増殖状態における、がんマーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＣ１、ＨＹＡＬ１及びＥＲの発現の代表的な画像である。 乳房の癌性状態における、がんマーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＣ１、ＨＹＡＬ１、ＭＰＰ−１及びＥＲの発現の代表的な画像である。 ４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の２つの組合せのうちの１つの、合算した発現レベルについて作成した、代表的な受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。ＡＵＣ（「曲線下面積」）を示す。 ４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの、合算した発現レベルについて作成した、代表的な受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。ＡＵＣを示す。 ４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１すべての組合せの、合算した発現レベルについて作成した、代表的な受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。ＡＵＣを示す。 １年以上経つうちにがんを発症した対象の組織（検査症例組織；赤の三角形）及び５年以上がんを発症しなかった対象からの組織（対照組織；青の円）における、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアの代表的な散布図である。 １年以上経つうちにがんを発症した対象の組織（検査症例組織；赤の三角形）及び５年以上がんを発症しなかった対象からの組織（対照組織；青の円）における、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１すべての組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアの代表的な散布図である。 ５年以上がんを発症しなかった対象からの組織（対照組織；青の線）及び１年以上経つうちにがんを発症した対象の組織（検査症例組織；赤の線）における、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアの密度を示す、代表的なグラフである。 ５年以上がんを発症しなかった対象からの組織（対照組織；青の線）及び１年以上経つうちにがんを発症した対象の組織（検査症例組織；赤の線）における、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１すべての組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアの密度を示す、代表的なグラフである。 前がん性の対象の間の、４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の様々な組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。前がん性の対象の間での、４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の２つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。 前がん性の対象の間での、４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の様々な組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。前がん性の対象の間での、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。 前がん性の対象の間での、４つの腫瘍性タンパク質、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＨＥＣ１の様々な組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。前がん性の対象の間での、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１すべての組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた、前がん性生検後の年数で表した無がん生存率を示す代表的なグラフである。 １期の乳がん組織、ＤＣＩＳがん組織及びのちにがんを発症した対象からの異型組織（ＡＤＨ）、少なくとも５年間がんを発症しなかった対象からの異型組織（上段パネル）、並びに乳管洗浄試料（下段パネル）における、ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＭＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルの代表的な画像である。 乳管洗浄（ＤＬ）から単離した乳管細胞における、発癌マーカーの１つ、ＣＥＡＣＡＭ６のＲＴ−ＱＰＣＲ解析からの代表的な増幅プロットである。 ＤＣＩＳ腫瘍（オレンジ色のバー）、浸潤性乳がん（ＩＢＣ）腫瘍（赤色のバー）及び乳管洗浄（ＤＬ）試料（がん患者からのＤＬ細胞（黒色／赤色のバー）、異型ＤＬ細胞（桃色のバー）及び良性ＤＬ細胞（緑色のバー）における、ＲＴ−ＱＰＣＲによって測定されたＣＥＡＣＡＭ６ ｍＲＮＡ発現レベルの代表的なグラフである。 ＤＣＩＳ腫瘍（オレンジ色のバー）、浸潤性乳がん（ＩＢＣ）腫瘍（赤色のバー）及び乳管洗浄（ＤＬ）試料（がん患者からのＤＬ細胞（黒色／赤色のバー）、異型ＤＬ細胞（桃色のバー）及び良性ＤＬ細胞（緑色のバー）における、ＲＴ−ＱＰＣＲによって測定されたＭＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現レベルの代表的なグラフである。
本開示は、一般的に、乳がんの発症リスクを判定することに関する。特に、本開示は、非癌性乳房腫瘍における複数の発癌バイオマーカーの発現に基づいて、非癌性乳房腫瘍と診断された対象ががんを発症するかどうかを判定する材料及び方法を提供する。本開示はまた、対象が、がん発症の低リスクを有するのか中間リスクを有するのか高リスクを有するのかを判定し、これによって対象を治療するための適切な治療法の選択を可能にするがんリスクスコアを提供する。
本セクション及び本明細書における開示全体において使用したセクションの見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、限定することを意図するものではない。
１．定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語及びそれらの変化形は、本明細書において使用される場合、追加の作用又は構造の可能性を排除しない非制限的な移行句、用語又は単語であると意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確な指示がない限り、複数形を含む。本開示はまた、明確に記載されていても記載されていなくても、本明細書において示された実施形態又は要素「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」その他の実施形態も企図する。
量に関連して使用される「約」という修飾語は、記載した値を含み、文脈が規定する意図を有する（例えば、少なくとも、特定の量の測定に関連した誤差の程度を含む）。「約」という修飾語はまた、２つの端点の絶対値によって定義された範囲を開示するとみなされるべきである。例えば、「約２から約４まで」という表現は、範囲「２〜４まで」も開示する。「約」という用語は、指示された数のプラス又はマイナス１０％を指してもよい。例えば、「約１０％」は９％〜１１％の範囲を示してもよく、「約１」は０．９〜１．１を意味してもよい。「約」のその他の意図は、四捨五入のように、文脈から明白であることもあり、よって、例えば「約１」はまた、０．５〜１．４を意味してもよい。
「抗体」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二機能性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的なヒト化）、動物抗体（限定されるものではないが、（例えば、アヒル又はガチョウのような）トリ、サメ、クジラ及び非霊長類（例えば、雌ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）又は非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）を含む哺乳動物から得た又は由来の抗体）、組換え抗体、キメラ型抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、シングルドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、デュアルドメイン抗体、二重可変領域（ＤＶＤ）又は三重可変領域（ＴＶＤ）抗体（例えば、Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（１１）：１２９０〜１２９７頁（２００７）及び国際特許出願公開第ＷＯ２００１／０５８９５６号）を参照されたい。）、並びに上記のいずれかの、機能的に有効なエピトープ結合断片を指す。「二機能性抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ある抗原部位に対する特異性を有する第１の腕及び異なる抗原部位に対する特異性を有する第２の腕を含む抗体を指し、すなわち、二機能性抗体は、二重特異性を有する。
「抗体断片」という用語は、抗原結合部位を含む又は可変部を含む無傷の抗体の一部を指す。この部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の重鎖定常領域（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４、抗体のアイソタイプによる）を含まない。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変領域のみ含有する単鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみ含有する単鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチドを含むが、それらだけに限定されない。
本明細書において使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、その検出が特定の疾患を示す又は特定の疾患に罹るリスクを示す、測定可能な物質を指す。「バイオマーカー」は、疾患の予後と相関する、測定可能な物質の発現又は状態における変化を示していてよい。「バイオマーカー」は、タンパク質若しくはペプチド、核酸又は低分子であってよい。「バイオマーカー」は、血漿のような体液及び／又は組織（例えば、乳房組織）において測定され得る。本明細書に記載の方法の関連において、「バイオマーカー」は、発癌ポリペプチド又は核酸（例えば、エストロゲン受容体）であり得る。
本明細書において使用される場合、「診断」及び同様の用語は、特定の疾患の同定を指す。
「標識」及び「検出可能な標識」は、一般的に、分析物結合分子（例えば、抗体又はその分析物反応性断片、核酸プローブなど）と分析物との間の反応を検出可能にする、分析物結合分子（例えば、抗体又はその分析物反応性断片）又は分析物に直接又は間接的に結合する部分を指し、そのように標識された分析物結合分子（例えば、抗体又はその分析物反応性断片）又は分析物は、「検出可能に標識された」と呼ばれる。標識は、可視手段又は器械を用いる手段によるような検出が可能であるシグナルを発生され得る。幾つかの態様において、標識は、任意のシグナル発生部分であってよく、本明細書において、レポーター群と呼ばれることもある。本明細書において使用される場合、標識（又はシグナル発生部分）は、電磁放射線の測定によるような外部手段による検出が可能な、測定可能なシグナルを発生し、用いたシステムによって、シグナルのレベルは、標識が置かれている固形支持体の環境（例えば、電極、微粒子又はビーズ）の範囲で異なる場合がある。
「所定のカットオフ」、「カットオフ」、「所定のレベル」及び「参照レベル」とは、本明細書において使用される場合、アッセイ結果を様々な臨床的パラメーター（例えば、疾患の存在、疾患の病期、疾患の重症度、疾患の進行、非進行又は改善など）とすでに関連付けられているか、又は関係付けられている所定のカットオフ／レベルに対して比較することによって、診断的、予後的又は治療的有効性の結果を評価するために使用されるアッセイカットオフ値を指す。幾つかの態様において、本開示は、例示的な所定のレベル及び参照レベルを提供する。ただし、カットオフ値は、イムノアッセイの性質（例えば、用いた抗体、反応条件、試料純度など）によって異なってよいことは周知である。さらに、本開示により提供された説明に基づいて、本明細書における開示を他のイムノアッセイに適合させて、これらの他のイムノアッセイのイムノアッセイ特有のカットオフ値を得ることは、当業者の間では周知である。所定のカットオフ／レベルの正確な値は、アッセイ間で異なってよいが、本明細書に記載のような相関が一般的に適用されるべきである。
本明細書において使用される、対象（例えば、患者）の「リスク評価」、「リスク分類」、「リスク同定」又は「リスク層別化」とは、対象に関する治療判断がより多くの情報に基づきなされ得るように、疾患発症又は疾患進行を含む将来イベントの発現のリスクを予測する、バイオマーカーを含む因子の評価を指す。
本明細書において使用される「試料」、「生物学的試料」、「検査試料」、「標本」、「対象からの試料」及び「患者試料」は、互換的に使用してよく、血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞若しくは組織、内皮細胞、白血球又は単球の試料であってよい。試料は、患者から得られた場合は直接使用されてもよく、又は本明細書において論じているような幾つかの方法又は当技術分野で既知であるような別の方法で試料の性質を改変するために、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加などによるような事前処理をされてもよい。
あらゆる細胞型、組織又は体液が、試料を得るために利用され得る。このような細胞型、組織及び体液は、生検及び剖検試料のような組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、（全血のような）血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、毛、皮膚、赤血球、血小板、間質液、眼水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻水、滑液、月経、羊水、精液などを含んでよい。細胞型及び組織はまた、リンパ液、乳房組織、上皮組織、腹水、婦人科体液、尿、腹腔水、脳脊髄液、膣洗浄により採取された体液又は膣水洗により採取された体液、乳房組織、卵巣組織、脳組織、骨組織、生殖器組織、消化管組織、神経系組織、肺組織、前立腺組織及び免疫系組織を含んでもよい。組織又は細胞型は、動物から細胞の試料を取り出すことにより提供され得るが、すでに単離された（例えば、別の個人によって、別の時期に及び／又は別の目的のために単離された）細胞を使用することによっても得られうる。治療又は転帰歴のあるような保存組織もまた、使用され得る。タンパク質又はヌクレオチドの単離及び／又は精製は、必要としなくてよい。
本明細書において使用される場合、「予後」、「予後を判定する」という用語及び関連用語は、浸潤性乳がん（ＩＢＣ）のような、起こり得る特定の状態の転帰の説明を指す。例えば、本明細書において、特定のがん遺伝子の発現がＩＢＣの発症による死亡のリスクの上昇と相関することが示されたため、ＩＢＣが疑われる対象において、特定のがん遺伝子の発現の測定が死亡のリスクの判定を可能にする。
本明細書において使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、対象が何らかの形態の治療を受けていたのか現在受けているのかに関わらず、互換的に使用される。本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物（例えば、雌ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルのようなサル、チンパンジーなど）並びにヒト）を含む任意の脊椎動物を指すが、それらだけに限定されない。幾つかの態様において、対象はヒトである。
「治療する」、「治療された」又は「治療すること」という用語は、本明細書において使用される場合、目的が、望ましくない生理的状態、障害若しくは疾患の進行を遅める（軽減する）か、又は有益な若しくは所望の臨床的結果を得る治療的方法を指す。本開示の幾つかの態様において、有益な又は所望の臨床的結果は、状態、障害又は疾患が、検出可能であるにせよ検出不可能であるにせよ、又は亢進するにせよ改善するにせよ、症状の緩和；状態、障害又は疾患の程度の減少；状態、障害又は疾患の状況の安定化（すなわち、悪化していない。）；状態、障害又は疾患の発症の遅延又は進行の緩徐化；状態、障害又は疾患状況の改善；及び寛解（部分的にせよ全体的にせよ）を含むが、それらだけに限定されない。治療はまた、治療を受けなかった場合に予想される生存時間と比較して生存時間を延長することを含む。
本明細書において使用される場合、「乳管洗浄」という用語は、乳房の乳管から取り出された細胞を指す。一般的に、これらの細胞は、例えば、局所麻酔下で細い軟性カテーテルを乳頭の乳管開口部に挿入し、生理食塩水を注入し、体液を静かに押して乳管全体において剥がれた細胞を洗い出すことによって得られる。
本明細書において使用される場合、「乳頭分泌物」とは、体液を押し出す任意の機械的な力を適用することなしに、乳房から滲出している体液を指す。
本明細書において使用される場合、「過剰増殖」、「過剰増殖な」という用語及びそれらの変化形は、一般的に、組織学的には正常であるが、正常細胞より速い速度で分裂するか、又は肥大化する核を有する細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「良性」という用語は、乳管上皮細胞の増殖とは独立して、正常より速く肥大化する、乳房組織における細胞又は乳管（例えば、良性過形成）を指すために使用され得る。
本明細書において使用される場合、「異型乳管過形成」又は「ＡＤＨ」という用語は、一般的に、乳管における細胞が正常より速い速度で分裂し、組織学的に異常を示す核を有するが、癌性細胞はみられない前がん状態を指す。本明細書において使用される場合、「ＡＤＨＣ」という用語は、一般的に、ＡＤＨの診断後１〜５年又はそれ以上経つうちにがんを発症したＡＤＨ対象を指す。
本明細書において使用される場合、「異型小葉過形成」又は「ＡＬＨ」という用語は、一般的に、小葉における細胞が正常より速い速度で分裂し、組織学的に異常を示す核を有するが、癌性細胞はみられない前がん状態を指す。本明細書において使用される場合、「ＡＬＨＣ」という用語は、一般的に、のちにがんを発症したＡＬＨ対象を指す。
本明細書において使用される場合、「通常型乳管過形成」又は「ＵＤＨ」という用語は、一般的に、乳管の細胞が、正常な速度より速い速度で分裂し、幾つかの層を形成し、場合によって腫瘍を形成しているが、細胞の核は組織学的に正常を示している前がん状態を指す。本明細書において使用される場合、「ＵＤＨＣ」という用語は、一般的に、ＵＤＨの診断後１〜５年又はそれ以上経つうちにがんを発症したＵＤＨ対象を指す。
本明細書において使用される場合、「通常型小葉過形成」又は「ＵＬＨ」は、一般的に、小葉細胞が正常な速度より速い速度で分裂し、幾つかの層を形成し、場合によって腫瘍を形成しているが、細胞の核は組織学的に正常を示している前がん状態を指す。
本明細書において使用される場合、「乳頭腫」又は「ＰＡＰ」という用語は、一般的に、ＡＤＨ、ＡＬＨ及びＵＤＨとは異なる乳頭状突起を有する、乳管の前がん性の非ＡＤＨ過形成を指す。
本明細書において定義されていない限り、本開示に関連して使用された科学及び技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有することとする。例えば、本明細書に記載の細胞及び組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用した任意の名称及び技術は、当技術分野で周知であり、通常使用される名称及び技術である。用語の意味及び範囲は明白であるべきであるが、何らかのあいまいさが潜在する場合には、本明細書において示された定義が、あらゆる辞書又は外来の定義に優先する。さらに、文脈によって特段の断りがない限り、単数の用語は複数を含むこととし、複数の用語は単数を含むこととする。
２．発癌バイオマーカーの検出
組織学的には、のちにがんを発症する対象からの増殖性腫瘍は、のちにがんを発症しない対象の腫瘍と異なっていない（例えば、図１〜３を参照されたい。）。したがって、組織学に基づく診断は、のちにがんへ発展する腫瘍とがんへ発展しない腫瘍とを識別するのに十分な方法ではない。さらに、乳がんを発症し始めた前がん性腫瘍を有する患者集団を正確に同定し、その後層別化する現行の手段はない。本開示は、予防的治療から治療上の効果を得る可能性が高い高リスクの候補者を、不要な治療的介入を避けることを望む低リスクの対象と識別する材料及び方法を提供することによって、この必要性に対処するものである。
現在、タモキシフェン、ラロキシフェン及び／又はアロマターゼ阻害剤（ＡＩ）を含む予防的治療が、増殖性前がん性腫瘍（例えば、異型過形成、乳頭腫、硬化性腺症及び通常型過形成）と診断され患者の標準推奨治療法である。しかしながら、がん発症リスクに従って対象を正確に層別化する臨床的方法論が何もないため、患者も彼らの腫瘍学者のいずれも、これらの治療を受け入れるのかそれともやめるのかというジレンマに直面する。結果として、がんリスクの低い患者が、不必要にこれらの予防薬の重度の副作用を被る恐れがある（例えば、肺塞栓症、深部静脈血栓症、脳卒中、子宮体がん、白内障、血管運動不安定、筋骨格痛、骨量減少など）。これに対して、がんの発症リスクが高いが予防的治療を受けないことを選択している患者が、彼らが必要とする救命治療を受けていない可能性がある。したがって、前がん性腫瘍がどのようにがんへと進行するかという根底にある分子及び遺伝学的メカニズムを理解することが、がんリスクに基づいて前がん性腫瘍を有する患者を層別化する臨床検査を設計するために重要であり、新規の分子治療の開発を促進することとなる。
本開示は、がんを発症する可能性が高い対象の前がん性組織を、がんを発症する可能性が高くない対象と識別する材料及び方法を提供する。本開示の実施形態は、様々なタイプの前がん性腫瘍組織における遺伝子発現パターンの解析を提供し、特定のがん遺伝子の発現が、のちにがんを発症した対象では前がん性腫瘍組織において、がんを発症しなかった対象と比較して高まっていたことを確認した（図４）。例えば、４つの遺伝子、ＢＣＬ２Ａ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＥＣ１及びＭＭＰ−１は、がんを発症しなかった患者と比較して、がんを発症した患者では前がん性腫瘍組織において有意に上方調節されていることがわかり、非過形成組織においては検出不可能であった（図５）。
本開示の実施形態は、異型性及び非異型性のような非癌性であるが増殖性乳房腫瘍（例えば、通常型過形成、乳頭腫、硬化性腺症）を発症している対象について、乳がんを発症する尤度を予測することができる診断検査を基にしたバイオマーカーを提供する。加えて、本開示は、前がん性腫瘍を治療し、ＩＢＣ発症を予防する新規予防薬のデザインを促進する分子標的を同定する方法を提供する。
本開示の実施形態は、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）、ＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）及びそれらの任意の組合せを含む様々な発癌マーカーの発現を検出することによって、対象におけるがんを予測する方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、これらの発癌バイオマーカーのうちの１つ、２つ、３つ又は４つすべての発現レベルを検出することを含んでよい。幾つかの実施形態において、方法は、４つの発癌バイオマーカーのうちの２つの発現レベルを検出することを含んでよく、他の実施形態において、方法は、４つの発癌バイオマーカーのうちの３つ（すなわち、３つの組合せ）を検出することを含む。さらに他の実施形態において、方法は、本開示に基づいた、当業者に既知のその他の発癌バイオマーカーに加えて、これらの４つの発癌バイオマーカーのうちの１つ以上を検出することを含む。
ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のような発癌バイオマーカーの検出は、対象から、細胞を含む組織試料を得ることを含む。幾つかの実施形態において、組織試料は、前がん性腫瘍からの過形成組織のような過形成組織試料であり、又は組織試料は、異型過形成組織、通常型過形成組織若しくは乳頭腫組織である。幾つかの実施形態において、過形成組織試料は、乳房組織、卵巣組織、脳組織、骨組織、尿路組織、腎臓組織、リンパ組織、血液、精巣組織、生殖器組織、消化管組織、神経系組織、肺組織、前立腺組織、頭頸部組織及び免疫系組織の少なくとも１つから得られうる。幾つかの実施形態において、組織試料は、コア生検、外科生検、穿刺吸引法、乳管洗浄、乳頭吸引液法及び乳頭分泌物採取の少なくとも１つを使用して得られた過形成組織由来である。その他の好適な組織試料が、本明細書に記載のような方法を実行する目的のために対象から得られうる。上記で定義したように、好適な試料は、血液、血清、尿、唾液、乳房組織、胸水、上皮組織、乳房上皮組織及び乳管組織を含むが、それらだけに限定されない。
発癌バイオマーカーは、当技術分野で既知の様々な手段によってｍＲＮＡレベルを測定することによるような、遺伝子発現に基づいたアッセイがなされ得る。遺伝子発現を測定する方法は、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ｔａｑ−ｍａｎ ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、遺伝子チップ解析、マイクロアレイ解析及び定量的配列解析を含むが、これらだけに限定されない。物理的及び分子生物学的方法を含む、本開示に基づいて当業者に明らかであるような、遺伝子発現を測定するこの他の手段もまた使用され得る。例えば、好適な物理的方法は、質量分光測定法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ及び色素検出アッセイを含む。好適な分子生物学的方法は、サザンブロットハイブリダイゼーション、核酸ドット又はスロットブロットハイブリダイゼーション、インサイツハイブリダイゼーション、核酸チップアッセイなどを含むが、これらだけに限定されない。バイオマーカーを検出するこの他の方法は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、蛍光光度分析、比色定量分析、放射分析、発光分析又はこの他の分光測定法、プラズモン共鳴（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）及び１次元若しくは２次元ゲル電気泳動を含む。
発癌バイオマーカーは、タンパク質レベル、又はタンパク質発現を示す腫瘍性タンパク質の副産物若しくは断片を測定することによるような、タンパク質発現に基づいたアッセイがなされ得る。本開示の様々な腫瘍性タンパク質のタンパク質発現の測定する方法は、当技術分野で既知の任意の好適なアッセイを使用して実施され得る。好適なアッセイの例は、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、酵素検出（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ））又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、多元酵素免疫測定法（ＥＭＩＴ）、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、均一系アッセイ、不均一系アッセイ、オンザフライ捕捉アッセイなどのようなイムノアッセイを含むが、これらだけに限定されない。本開示に基づき当業者に明らかであるような、タンパク質発現を測定するこの他の手段もまた使用され得る。
本開示の腫瘍性タンパク質のタンパク質発現及び／又は活性を測定するイムノアッセイ方法は、例えば、Ａｓａｉ、ｅｄ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３７巻：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、及びＳｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ、ｅｄｓ．、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版、（１９９１）に記載されている、多様なフォーマットのうちのいずれかで実行され得る。本明細書に記載の方法に関連して使用され得るこの他のアッセイフォーマットは、例えば、迅速検査、ウェスタンブロット及び例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイにおける常磁性粒子の使用（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編、３６３〜３６７頁（２００１）を参照されたい。）並びに当業者に既知のこの他の適切なフォーマットを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載したように、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が、様々な発癌バイオマーカーの発現を検出するために使用され得、がんリスクを判定する基礎であり得る。一般的には、ＩＨＣは、解剖学的、免疫学的及び生化学的技術を組み合わせて、標的抗原と可視標識でタグ付けされた特異的抗体との相互作用によって個別の組織成分を同定する。ＩＨＣは、細胞内及び適切な組織状況における特異的な細胞成分の分布及び局在化並びに様々な腫瘍性タンパク質の発現の可視化を可能にする。ＩＨＣは、個別のスライド上で調製される組織試料を得ることを含み、又は組織マイクロアレイを用いるような比較解析については、複数の試料が１つのスライド上に配置され得る。今日では、科学技術的進歩によって、ハイスループットの試料調製及び染色の自動化が実現してはいるが、ＩＨＣスライドは、手作業によって処理され得、染色され得る。試料は、光学又は蛍光顕微鏡法よって検査され得、例えば、画像が捕捉され、定量化され得る（例えば、マルチパラメトリックなＩＨＣデータ）。アッセイの必要条件によって、患者若しくは動物生検又は動物臓器全体が、保存及びＩＨＣ解析のために採取され得る。組織は、一般的に、細胞タンパク質及び組織構築物の分解を防止するために、迅速に保存されなければならない。多くの場合、組織は、標的抗原の検出を妨害する恐れのある血液抗原の検出を防止するために、保存の前に、灌流するか、又は血液を洗い流す。組織灌流は、蠕動ポンプを使用して動物を失血させ、脈管構造を無菌生理食塩水ですすいで、動物全体からすべての血液成分を除去することによって、麻酔された動物に対して実施され得る。組織を切断した後、ＩＨＣのために、次いで、標的器官又は組織が採取され得る。抗体を用いて標的抗原を検出することは、レベル毎にシグナル検出を最大化するための最適化が必要となる、多段階工程である。一次及び二次抗体はいずれも、抗体の安定化を助け、試料全体に均一にいきわたることを促進し、非特異的な結合を防止するために、バッファーに希釈され得る。ある希釈剤がある抗体と作用することができる一方で、同じ希釈剤が別の抗体とは作用しないこともあり、このことは、各抗体に対する最適化の必要性を示している。ＩＨＣ標的抗原は、発色又は蛍光手段のいずれかによって検出され得、表示データの種類は、実験計画による。蛍光検出のためには、一次又は二次抗体が結合されたレポーターは、蛍光顕微鏡法によって検出されるフルオロフォアである。発色検出は、酵素の活性に基づいており、ほとんどの場合、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であり、それぞれ、ＤＡＢ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰのような基質を添加すると、着色した不溶性沈殿物を形成する。本開示に基づいた当業者によって認識されるような、ＩＨＣプロトコール及び手順のこの他の変形形態が、本明細書に記載の方法と共に使用され得る。
幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡの解析は、本明細書に記載のように、様々な発癌バイオマーカーの発現若しくは発現のレベルを検出、測定及び／又は定量化するために使用され得、がんリスクを判定する基礎であり得る。ｍＲＮＡ解析法の非限定的な例は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、ノーザンブロッティング、次世代シーケンシング、マイクロアレイ解析及びＤＮＡチップを含む。本開示において、ｍＲＮＡのレベルを測定する調合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対又はプローブであってよい。
上記のアッセイの要素は、キットの形態でも使用され得る。キットはまた、アッセイの実行に必要とされるアッセイ構成要素及び試薬（例えば、洗浄、処理及び指示試薬）を含む、１つ以上の容器（例えば、バイアル、ボトル又はストリップ）も含んでよい。
３．がん発症リスク上昇の判定
本開示の実施形態は、前がん性腫瘍ががんに発展するリスクを判定する方法及び無がん生存率を決定する方法を含む、リスクを判定する方法を提供し、それらすべては、本明細書に記載の様々な発癌バイオマーカーの発現レベルに基づくものである。ある実施形態において、対象におけるがんを予測する方法は、２つ以上の、ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のような発癌バイオマーカーの発現に基づいた、リスクスコアを算出することを含む。他の実施形態において、対象におけるがんを予測する方法は、３つ以上の、ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のような発癌バイオマーカーの発現に基づいた、リスクスコアを算出することを含む。特定の他の実施形態において、対象におけるがんを予測する方法は、ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のような４つの発癌バイオマーカーの発現に基づいたリスクスコアを算出することを含む。
幾つかの実施形態において、対象におけるがんを予測する方法は、本明細書に記載のように、１つ以上の、ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のような発癌バイオマーカーの発現に基づいたリスクスコアを算出することを含む。幾つかの実施形態において、リスクスコアは、ロジスティック回帰分析を使用して、複数の試料について、各マーカーの免疫組織化学的（ＩＨＣ）異型度を定量化して各マーカーの係数を得ること、次いで、各試料について各マーカーのＩＨＣ異型度にその個々の回帰分析係数を掛け、値を得ること、その後、試料中の全マーカーの得られた値を足して発癌バイオマーカーの組合せの「複合リスクスコア」を導出することを含むロジスティック回帰分析を使用して、これらの発癌マーカーの発現レベルに基づき得ることができる。
これらの方法によれば、様々な対象集団についてのリスクスコアは、がんリスクを判定するか、又は個人ががんを発症する尤度を予測するツールとして役立ち得るデータベース中に収集され、保管され得る。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、個人のリスクスコア又は基となる発癌マーカー発現データをリスクスコア又は発現データの適切なデータベースと比較することに少なくとも部分的に基づいて、個人のリスクスコアを低リスク、中間リスク又は高リスクとして分類することを含む。幾つかの実施形態において、１以下のリスクスコアは、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアは、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアは、対象のがん発症が高リスクであることを示す（例えば、図１５Ａ〜１５Ｃを参照されたい。）。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の様々な発癌バイオマーカーの発現に基づいて算出されたリスクスコアは、無がん生存率を予測するか、又は算出するために使用され得る。リスクを予測する「リスク予測確率スコア」（平均リスクスコア）及び％精度を導出するために、対照及び検査症例の（０〜１０で評価した）リスクスコアの分布には、散布図及び密度プロットを用いることができる（図１３Ａ〜１３Ｂ及び図１４Ａ〜１４Ｂ）。リスクスコア分布プロットから、がん発症の確率を予測するスコアの推定値及び９５％信頼区間が算出され得る。対照及び検査症例のリスクスコア分布データから、がん予測率が、誤差範囲及び有意性レベルによって決定され得る。幾つかの実施形態において、低と分類されたリスクスコアは、対象が、少なくとも１９年間少なくとも、９５％の無がん生存率を有することを示し、中間と分類されたリスクスコアは、対象が、少なくとも５年、少なくとも８０％の無がん生存率を有することを示し、高と分類されたリスクスコアは、対象が最初の５年間、４５％以下の無がん生存率を有することを示す。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、例えば、がんの発症リスクが高い対象を同定することに使用され得るだけでなく、これらの方法は、対象を治療するための予防的治療の一部として使用され得る。例えば、本明細書に記載の様々な発癌マーカーの発現レベルに基づいてがんの発症リスクが高い対象は、治療的抗がん剤によって治療され得、場合によって、従来の手段によって診断されれば別の方法で治療される対象より早く治療され得る。予防的治療は、例えば、当業者に既知である薬剤及び／又は手術療法を含んでよい。薬剤は、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン及び／又はアロマターゼ阻害剤を含んでよい。手術療法は、例えば、片方又は両方の乳房切除を含んでよい。
幾つかの実施形態において、本開示の方法は、がんを治療する新規治療薬のような新規がん治療法を、同定するか、設計するか、又は開発するために使用され得る。例えば、有望な抗がん剤によって実施形態は、過形成組織及び／又は過形成組織の細胞を治療すること、及び抗がん剤での治療後に、本明細書に記載の様々な発癌マーカーの発現レベルを測定することを含んでよい。これらのバイオマーカーの発現が低減すれば、有望な抗がん剤は、安全性及び有効性についてさらに試験され得る。これらの発癌マーカーはまた、有望な抗がん特性について、多数の低分子薬物を検定するために設計されたハイスループット薬物スクリーニングプラットフォームの一部としても使用され得る。
４．患者のモニタリング
本開示の実施形態は、がんを発症するリスクのある対象をモニタリングすることを含む。対象は、がんを有すると診断されてはいないが、様々な臨床的又は医学的評価（例えば、家族歴、組織学的評価、遺伝学的評価、及び環境因子）によってがんを発症するリスクのある患者であってよい。他の実施形態において、対象は、前がん性腫瘍又は前がん性過形成を有するが、まだがんを発症していないと診断されていてもよい。これらの実施形態によれば、方法は、対象から、前がん性過形成組織試料のような組織試料を得ること、及び本明細書に開示した方法を使用して、発癌バイオマーカーのうちの１つ以上の発現のレベルを定量化することを含む。さらに、方法はまた、本明細書において開示したような、発癌バイオマーカーのうちの１つ以上の発現のレベルに基づいたリスクスコアを算出することを含む。過形成組織試料は、対象から直接得ることができ、又は過形成組織試料は、対象から生検で外科的に取り出された過形成組織から得ることができる。
幾つかの実施形態において、方法は、抗がん治療を施すべきかどうかを判断するために、又は抗がん治療の現行の方針を変更するかどうかを判断するために、対象を評価することを含む。例えば、対象は、対象からの過形成組織試料における発癌バイオマーカー（例えば、少なくとも２つの発癌バイオマーカー）のうちの１つ以上の発現レベルに基づいた、リスクスコアが割り当てられてよい。リスクスコアに基づき、判断は、対象に投与されるべき抗がん治療レジメンの種類に応じてなされ得る。場合によって、がん発症の中間リスクを有するか、又は高リスクを有すると評価された対象は、がんの発症を予防する抗がん治療が施され得るが、がん発症の低リスクを有すると評価された対象は、抗がん治療は施されない。
幾つかの実施形態において、方法は、抗がん治療の現行の方針が有効かどうか評価するために、対象から第２の組織試料を得ることを含む。組織試料は、過形成組織又は非過形成組織であってよい。例えば、対象は、対象からの第２の過形成組織試料（又は非過形成組織試料）における発癌バイオマーカーのうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つの発癌バイオマーカー）の発現レベルに基づいてリスクスコアを割り当てられ得、場合によって、抗がん治療の所与のレジメンが対象に施された後にリスクスコアを割り当てられ得る。リスクスコアは、発癌バイオマーカーのうちの１つ以上の発現レベルにおける変化に基づいて算出され得る。すなわち、リスクスコアは、第１の過形成組織試料における発癌バイオマーカーの発現レベルと比較した、発癌バイオマーカーのうちの１つの発現の上昇又は低減に基づくものであり得る。リスクスコアはまた、対象からの第２の過形成又は非過形成組織試料からの発癌バイオマーカーのうちの１つの発現に基づき算出され得、場合によって、続いて、第１の過形成組織試料に基づいて算出されたリスクスコアと比較され得る。次いで、リスクスコアにおけるあらゆる変化が、（ｉ）対象における抗がん剤の使用を中止すべきか、（ｉｉ）対象における抗がん剤による治療を続けるべきか、又は（ｉｉｉ）第１のリスクスコアと第２のリスクスコアとの比較に基づいて、対象へ異なる抗がん剤を投与すべきか、を判断するために比較され得るか、又は評価され得る。例えば、第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより低いために、抗がん剤による治療は中止されてよい。第１のリスクスコアと第２のリスクスコアが同一であるために、抗がん剤による治療は継続されてよい。又は、第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより高いために、抗がん剤による治療は中止されてよく、新規抗がん剤による治療が患者に施されてもよい。
５．実施例
本明細書に記載の本開示の方法のこの他の好適な改変及び適合が、容易に適用かつ評価でき、本開示又は本明細書において開示された態様及び実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を使用してなされ得ることは、当業者には容易に明らかである。ここで本開示を詳細に説明してきたが、本開示は、以下の実施例を参照にすることにより、より明確に理解されるが、これらの実施例は、単に本開示の幾つかの態様及び実施形態を例示することを意図しているにすぎず、本開示の範囲に対する限定としてみなされるべきではない。本明細書において言及されたすべての定期刊行物の参考文献、米国特許及び公開の開示は、全体が参照により本明細書に組み込む。
本開示には、以下の非限定的な実施例によって例示された、多数の態様がある。
［実施例１］
のちにがんを発症した対象からの前がん性組織では、幾つかの相互接続した経路が調節不全となっている（図６）。例えば、腫瘍進行へ関与することが既知である増殖因子介在経路は、ＡＤＨＣにおいて調節不全となった主要な経路である。図６に図示した経路は、細胞表面の安定性、接着、運動性を制御し（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６、フィブロネクチン）、細胞遊走を促進する経路を含み、そのすべてが、ＡＤＨＣでは遮断されている。さらに、腫瘍進行、血管新生、転移及び生存経路に関与するＣＸＣＲ４経路もまた、ＡＤＨＣでは影響を受けている。この他の遮断された経路は、ＷＮＴ、ＰＴＰＲＣ及びＣＤ４０シグナル経路を含む。すべての遮断された経路は、がん進行を助長することが知られている。地図に表した遮断された経路に基づくと、ＡＤＨＣ組織が、細胞の平衡を劇的に狂わせ、がんの発症の開始を促すと考えられる、幾つかの調節不全となった細胞プロセスを有することが明らかである。
［実施例２］
本開示の実施形態は、前がん性腫瘍において上方調節され、これらの前がん性腫瘍ががんに発展するリスクの上昇と相関する、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１を含む４つの遺伝子を同定した。例えば、ＡＤＨＣ組織試料を使用するマイクロアレイ解析（図４）及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図５）を含む遺伝子発現研究は、これらの発癌マーカーが、がん発症の信頼性の高い予測因子であることを実証した。これらの発癌マーカーのタンパク質レベルもまた、１〜５年又はそれ以上経つうちにがんを発症した対象からの異型過形成組織、通常型過形成組織及び乳頭腫型の過形成組織において（図７〜９）、がん組織（図１０）と同様のレベルで検出された。
［実施例３］
下記の表１では、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）統計値、感度、特異度、陽性適中率（ＰＰＶ）（マーカーが陽性であった対象におけるがん発症を正しく予測する）及び陰性適中率（ＮＰＶ）（マーカーが陰性であった対象におけるがん非発症を正しく予測する）並びにｐ値は、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の４つの個別の発癌バイオマーカーの各々、２つの組合せのうちの１つ、３つの組合せのうちの１つ並びにすべての組合せの発現レベルから算出された。ＲＯＣ解析は、４つの発癌マーカーの２つの組合せが、前がん性乳房組織におけるがん発症のリスクの正確な予測因子であったことを実証している。
Figure 2020506405
［実施例４］
図１１に示されるように、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の２つの組合せのうちの１つの発現レベルから作成されたＲＯＣ曲線からは、０．８４３７のＡＵＣが得られ、これは、２つの組合せが、前がん性乳房組織におけるがん発症のリスクを、少なくとも８４％精度で正確に予測することを示している。図１２Ａに示されるように、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから作成されたＲＯＣ曲線からは、０．８７０９のＡＵＣが得られ、このことは、３つの組合せが、前がん性乳房組織におけるがん発症のリスクを、少なくとも８７％精度で正確に予測することを示している。図１２Ｂに示したように、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の発現レベルから作成されたＲＯＣ曲線からは、０．８９８３のＡＵＣが得られ、これは、これらの４つのマーカーの組合せが、前がん性乳房組織におけるがん発症のリスクを、少なくとも８９．８３％精度で正確に予測することを示している。
［実施例５］
下記の表２では、のちにがんを発症した検査症例組織における、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアは、５年以上がんを発症しなかった対照と異なっている。リスクスコアにおけるこれらの違いは、これらの４つの発癌マーカーの３つの組合せの発現に基づいて、前がん性腫瘍を有する対象を、低、中間及び高リスク群へ層別化することを可能にする。
Figure 2020506405
［実施例６］
図１３Ａ〜１３Ｂに示されるように、１年以上経つうちにがんを発症した対象からの組織（検査症例；赤色の三角形）及び５年以上がんを発症しなかった対象からの組織（対照；青色の円）における、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つ（図１３Ａ）又はすべての組合せ（図１３Ｂ）の発現レベルから算出されたリスクスコアは、散布図に示されたように、分離している。リスクスコアにおけるこれらの違いは、これらの４つの発癌マーカーうちの少なくとも３つの組合せの発現に基づいて、前がん性腫瘍を有する対象を、低、中間及び高リスク群へ層別化することを可能にする。
［実施例７］
図１４Ａ〜１４Ｂに示されるように、検査症例及び対照におけるリスクスコアの密度を示す。対照前がん性組織における、４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコア（図１４Ａ）並びに４つの発癌マーカー、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１のすべての組合せから算出されたリスクスコア（図１４Ｂ）は、検査症例前がん性組織からのリスクスコアと異なっている。対照組織におけるリスクスコア密度が１以下のスコア周辺に集中しているのに対し、検査症例組織では、リスクスコア密度は、（１０の全体のうちの）５以上に集中している。リスクスコアにおけるこれらの違いは、これらの４つの発癌マーカーうちの少なくとも３つの組合せの発現レベルに基づいて、前がん性腫瘍を有する対象を、低、中間及び高リスク群へ層別化することを可能にする。
［実施例８］
４つの発癌マーカー、ＨＥＣ１、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＣＥＡＣＡＭ６の、２つの組合せ、３つの組合せ又はすべての組合せのうちの１つの発現レベルに基づいたがん発症のリスクを正しく予測する精度は、下記の式に基づいて算出された。精度百分率は、次式：
Figure 2020506405
 を使用して、真の陽性及び真の陰性の有病率に基づいて算出され、
式中、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、
Figure 2020506405
 である。
４つの発癌マーカー、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＣ１及びＨＹＡＬ１のうちの少なくとも２つの組合せの発現レベルに基づいた前がん性腫瘍におけるがんの発症を正しく予測する精度は、上記の式を使用して、対照２６９例及び１３９症例からのデータに基づいて算出され、約８２％であることがわかった。４つの発癌マーカー、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＣ１及びＨＹＡＬ１のうちの少なくとも３つの組合せの発現レベルに基づいた前がん性腫瘍におけるがんの発症を正しく予測する精度は、上記の式を使用して、対照２５５例及び１３０症例からのデータに基づいて算出され、約８５％であることがわかった。４つの発癌マーカー、ＭＭＰ−１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＣ１及びＨＹＡＬ１すべての組合せの発現レベルに基づいた前がん性腫瘍におけるがんの発症を正しく予測する精度は、上記の式を使用して、対照２０１例及び７４症例からのデータに基づいて算出され、約８７％であることがわかった。
［実施例９］
図１５Ａに示されるように、カプラン・マイヤー生存曲線は、前がん性である対象が、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の２つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた３つの群：１）１以下のリスクスコアを有する低リスク群、２）１より大きく５以下のリスクを有する中間リスク群、３）５を超えるリスクスコアを有するリスク上昇群に層別化され得ることを示している。低リスク群は、少なくとも１９年間、９５％を超える無がん生存を有する。中間リスク群は、最初の５年間は、９５％の無がん生存を有し、これは１０年後には約７５％に低下する。５を超えるリスクスコアを有する上昇／高リスク群については、最初の５年間の無がん生存は約４５％以下であり、前がん性生検の１０年後に２０％まで低下する。
図１５Ｂに示されるように、カプラン・マイヤー生存曲線は、前がん性である対象が、４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１の３つの組合せのうちの１つの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた３つの群：１）１以下のリスクスコアを有する低リスク群、２）１より大きく５以下のリスクを有する中間リスク群、３）５を超えるリスクスコアを有するリスク上昇群に層別化され得ることを示している。低リスク群は、少なくとも１９年間、９５％を超える無がん生存を有する。中間リスク群は、最初の５年間、９５％の無がん生存を有し、これは１０年後には約７５％に低下する。５を超えるリスクスコアを有する上昇／高リスク群については、最初の５年間、無がん生存は約４０％以下であり、これは、前がん性生検の１０年後に２０％まで低下する。
図１５Ｃに示されるように、カプラン・マイヤー生存曲線は、前がん性である対象が４つの腫瘍性タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ−１及びＨＥＣ１すべての組合せの発現レベルから算出されたリスクスコアに基づいた３つの群：１）１以下のリスクスコアを有する低リスク群、２）１より大きく５以下のリスクを有する中間リスク群、３）５より大きいリスクスコアを有するリスク上昇群に層別化され得ることを示している。低リスク群は、少なくとも１９年間、９５％を超える無がん生存を有する。中間リスク群は、最初の５年間、９０％の無がん生存を有し、これは１０年後に約６５％に低下する。５を超えるリスクスコアを有する上昇／高リスク群については、最初の５年間、無がん生存は約４０％であり、これは、前がん性生検の１０年後に１５％まで低下する。
さらに、下記の表３に示されるように、ＡＤＨＣ対象のがん群（ｎ＝１０８）における平均スコアは、ＵＤＨ対象のがん群（ｎ＝１１１）（ＵＤＨＣ）より有意に高かった（ｐ値は０．００４８４）。これらの結果は、形態学的／組織学的評価を基にすると難しい場合が多い、ＡＤＨＣ群のＵＤＨＣ群との識別が可能であることを実証している。さらに、この違いは、５年又はそれ以上経ってのちに乳がんの発症が始まった女性のコホートにおいて観察されたが、対照群では観察されなかった。
Figure 2020506405
［実施例１０］
図１６に示されるように、がんを発症した対象（ＡＤＨＣ）からのがん組織及び異型組織（上段パネル）、並びに乳管洗浄（ＤＬ）試料（下段パネル）において、ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルによって測定した場合の、リスク予測発癌マーカーの１つ、ＭＭＰ−１の発現を示す。ＭＭＰ−１及びＧＡＰＤＨ転写物は、乳管洗浄細胞全ＲＮＡ又はＡＤＨＣ組織全ＲＮＡを逆転写して調製したｃＤＮＡを使用してＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動によって分離させ、エチジウムブロマイド染色によって検出した。
［実施例１１］
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、乳管洗浄（ＤＬ）試料から単離した細胞からのＣＥＡＣＡＭ６ ｍＲＮＡの発現レベルを、図１７に示す。陽性対照として、乳がん腫瘍組織ｃＤＮＡを使用した。増幅は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨの陽性発現を示した試料に対して実施した。代表的な増幅プロットを図１７に示し、表４（下記）は、２７例のＤＬ試料及び２例のがん組織試料（Ｍ７５及びＭ９）のＣｔ値の例を示す。
Figure 2020506405
Figure 2020506405
［実施例１２］
下記の表５では、マンモグラフィーで腫瘍組織が検出できなかった対象において、乳管洗浄試料を、４つの発癌マーカーのうちの２つ、ＭＭＰ−１及びＣＥＡＣＡＭ６の定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、陽性ｍＲＮＡ発現について検査した。がん患者からの２つのＤＬ試料におけるマーカー発現も、陽性対照として示す。
Figure 2020506405
［実施例１３］
図１８に示されるように、ＣＥＡＣＡＭ６（図１８Ａ）及びＭＭＰ−１（図１８Ｂ）のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＣＩＳ腫瘍（オレンジ色のバー）、浸潤性乳がん（ＩＢＣ）腫瘍（赤色のバー）及び乳管洗浄（ＤＬ；がん患者からのＤＬ細胞（黒色／赤色のバー）；異型ＤＬ細胞（桃色のバー）；及び良性ＤＬ細胞（緑色のバー））において、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定し、試料は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。
６．材料及び方法
ＡＤＨ、ＡＬＨ、ＵＤＨ、ＵＬＨ及びＰＡＰを含む対照前がん性組織は、以前に乳がんを有さず、５年以上発症しなかった対象から得た。ＡＤＨＣ、ＡＬＨＣ、ＵＤＨＣ及びＰＡＰＨを含む検査症例前がん性組織（「症例」又は「検査症例」とも呼ぶ）は、最低１年から５年又はそれ以上経ってのちにがんを発症した対象から得た。これらの組織は、発生したがんのＰＲ、Ｈｅｒ２、結節状態、病期、異型度又は組織構造と関係なく、のちにＥＲ＋及びＥＲ−がんを発症した患者から得た。本検査における検査症例及び対照はすべて、いかなる予防的治療も受けていない対象から得た。検査症例及び対照の両方おいて、異型及び非異型（例えば、乳頭腫、ＵＤＨ及び硬化性腺症）タイプの組織が含まれていた。異型の種類については、異型乳管及び異型小葉過形成の両方が含まれていた。すべての試料は、ＵＣＬＡ医学部病理学部門及びＬｅｅｄｓ病院病理学部門から得られた。
標本は、以下のステップ：１）標本を追跡情報によって同定したステップ、２）各標本のすべてのＨ＆Ｅスライドを検索したステップ、３）所望の組織を有する塊を同定したステップ、４）塊を検索したステップ、５）５〜８μｍ切片を切り取ったステップ、及び６）塊から最初と最後に切り取った切片をＨ＆Ｅ染色後、検討し、最初と最後に切り取った切片の間で切片が無傷の組織構造を有することを確かめたステップにおいて、対象の個人情報を用いずに得られた。検査症例において、増殖性診断からがん発症までの間の平均期間が約３年であったため、最低５年の臨床的追跡調査が選択された。
のちにがんを発症した前がん性組織の生物学を理解するために、ＩＰＡプログラムを使用して、ＡＤＨＣにおいて差次的に発現した遺伝子の上位２００個を解析して、遮断された経路を地図に表した。マーカーの免疫組織化学的（ＩＨＣ）検出のために、未染色のパラフィン包埋腫瘍組織切片は、特異的抗体を使用して免疫染色した。簡潔に述べると、スライドは、キシレンを２回換えて脱パラフィンさせ、段階的な濃度のＥｔＯＨに通すことによって徐々に再水和させた。抗原は、スライドを蒸し器の中で処理することによって賦活化させ、染色は、特異的抗体を使用して実施した。スライドは、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質とインキュベートした。最後に、スライドは、洗浄し、ヘマトキシリンで染色して、マウントした。すべてのＩＨＣ染色スライドは、病理学者によって評価され、染色強度を０．５〜４．０に段階分けした。
幾つかのがんマーカーの発現データを、統計的に解析して、感度、特異度、陽性適中率（ＰＰＶ）（陽性の女性におけるがん発症を正しく予測する）及び陰性適中率（ＮＰＶ）（陰性の女性におけるがん非発症を正しく予測する）を決定した。マーカー発現及びがん発症の有意性は、カイ二乗検定を使用して評価した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、がん発症のリスクを予測するマーカーの様々な組合せについて作成した。
複数のマーカー発現レベルに基づいた「リスクスコア」を得るために、各試料のリスクスコアを、以下のステップ：１）すべての試料について各マーカーのＩＨＣスコアを、ロジスティック回帰分析によって解析して、各マーカーの係数を得たステップ、及び２）始めに各マーカーのＩＨＣ異型度に各試料についての個々の回帰分析係数を掛けて値を得、次いで試料中のすべてのマーカーの得られた値を足してマーカーの組合せの「複合リスクスコア」を導出することによって、マーカーの組合せのリスクスコアを得たステップにおいて、ロジスティック回帰分析で算出した。
リスクを予測する「リスク予測確率スコア」（平均リスクスコア）及び％精度を導出するために、対照及び検査症例の（０〜１０で評価された）リスクスコアの分布を、散布図及び密度プロットを使用して解析した。リスクスコア分布プロットから、がん発症の確率を予測するスコアの推定値及び９５％信頼区間を算出した。対照及び検査症例のリスクスコア分布データから、がん予測率は、誤差範囲及び有意なレベルを用いて決定した。
リスクスコアデータはまた、カプラン・マイヤー曲線を用いて無がん生存時間についても解析し、リスク層別化のための無がん率を得た。
本明細書において引用された刊行物、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別かつ具体的に参照により組み込むことが指示され、全体として本明細書に記載されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込む。
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」という用語並びに同様の指示対象の使用は、本明細書において特段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。１つ以上の項目の列挙に続いた「少なくとも１つ」という用語は（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）、本明細書において特段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、列挙された項目（Ａ又はＢ）から選択される１つの項目を意味するか、又は列挙された項目（Ａ及びＢ）のうちの２つ以上の任意の組合せを意味すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特段の断りがない限り、非制限的な（すなわち、「含むが、それだけに限定されない」を意味する）用語として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特段の指示がない限り、範囲内に入る個々の各値に個別に言及する簡潔な方法として用いることが意図されているにすぎず、個々の各値は、本明細書に個別に記載されたかのように、本明細書に組み込む。本明細書において記載のすべての方法は、本明細書において特段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書において示された任意及びすべての例又は例示的な表現（例えば、「のような」）の使用は、特段の主張がない限り、単に本発明をより明確にすることが意図されているにすぎず、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書におけるいかなる表現も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。
本発明を実施するための発明者らに既知の最良の方法を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読めば、当業者には明らかとなり得る。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を使用することを予想し、さらに発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載された以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用される法律よって許可されているように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変及び均等物を含む。さらに、それらのすべての可能な変形形態における上述の要素のあらゆる組合せは、本明細書において特段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、本発明によって包含される。
前述の詳細な説明及び付随する実施例は、単に例示にすぎず、添付の特許請求の範囲及びこれらの均等物によってのみ定義される、本開示の範囲に対する限定とみなされるべきではないことが理解される。
開示された実施形態に対する種々の変更及び改変は、当業者には明らかである。化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、調合物又は本開示の使用の方法に関する変更及び改変を含むがこれらに限定されないこのような変更及び改変は、それらの趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。
完全を期すために、本開示の種々の態様を、以下の番号付けされた条項に記載する。
条項１．対象におけるがんを予測する方法であって、対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいたリスクスコアを算出すること、及び算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定することを含む、方法。
条項２．少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、条項１に記載の方法。
条項３．少なくとも２つの発癌バイオマーカーが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、条項１に記載の方法。
条項４．対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも７０％の特異度を有するアッセイを含む、条項１〜３のいずれかに記載の方法。
条項５．対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも９０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも７０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、条項１〜４のいずれかに記載の方法。
条項６．ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも３つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、条項１に記載の方法。
条項７．対象からの過形成組織試料からの少なくとも３つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも７０％の特異度を有するアッセイを含む、条項６に記載の方法。
条項８．対象からの過形成組織試料からの少なくとも３つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも８０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、条項６に記載の方法。
条項９．ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも４つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、条項１に記載の方法。
条項１０．対象からの過形成組織試料からの少なくとも４つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異度を有するアッセイを含む、条項９に記載の方法。
条項１１．対象からの過形成組織試料からの少なくとも４つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも８０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、条項９に記載の方法。
条項１２．少なくとも２つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することが、ウェスタンブロット解析、タンパク質／ペプチド機能アッセイ、免疫組織化学分析、ＥＬＩＳＡ解析、ＤＮＡチップ解析、又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、次世代ＲＮＡシーケンシング、マイクロアレイ解析及びノーザンブロッティングのうちの１つ以上によるｍＲＮＡ解析のうちの１つ以上を含む、条項１〜１１のいずれかに記載の方法。
条項１３．１以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、条項１〜１２のいずれかに記載の方法。
条項１４．ｉ）低と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも１９年間、少なくとも９５％の無がん生存率を有することを示し、ｉｉ）中間と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも５年間、少なくとも９５％の無がん生存率を有すること、及び少なくとも１０年間、少なくとも７５％の無がん生存率を有することを示し、ｉｉｉ）高と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも５年間、４５％以下の無がん生存率を有すること、及び少なくとも１０年間、少なくとも２０％の無がん生存率を有することを示す、条項１３に記載の方法。
条項１５．過形成組織試料が、コア生検、外科生検、穿刺吸引法、乳管洗浄、乳頭吸引液法及び乳頭分泌物採取の少なくとも１つを使用して得られる、条項１〜１４のいずれかに記載の方法。
条項１６．過形成組織試料が、乳房組織、卵巣組織、血液、尿路組織、腎臓組織、リンパ組織、脳組織、骨組織、生殖器組織、消化管組織、神経系組織、前立腺組織、精巣組織、肺組織、頭頸部組織及び免疫系組織のうちの少なくとも１つから得られる、条項１〜１５のいずれかに記載の方法。
条項１７．対象が、がんの病歴のないヒト哺乳動物である、条項１〜１６のいずれかに記載の方法。
条項１８．治療的抗がん剤により対象を治療することをさらに含む、条項１〜１７のいずれかに記載の方法。
条項１９．治療薬が、タモキシフェン、ラロキシフェン及びアロマターゼ阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、条項１８に記載の方法。
条項２０．手術療法を使用して対象を治療することをさらに含む、条項１〜１９のいずれかに記載の方法。
条項２１．手術療法が乳房切除術である、条項２０に記載の方法。
条項２２．対象におけるがんリスクを判定するバイオマーカーパネルであって、以下の発癌バイオマーカー：ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）のうちの少なくとも２つを含み、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルの定量化を用いて、がん発症の低、中間又は高リスクを予測するリスクスコアを算出する、バイオマーカーパネル。
条項２３．以下のバイオマーカー：ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のうちの少なくとも３つを含む、条項２２に記載のバイオマーカーパネル。
条項２４．少なくとも４つの以下のバイオマーカー：ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１を含む、条項２２に記載のバイオマーカーパネル。
条項２５．１以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、条項２２〜２４のいずれかに記載のバイオマーカーパネル。
条項２６．がんを発症するリスクのある患者を分類する方法であって、対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいたリスクスコアを算出すること、及び算出したリスクスコアに基づいて、対象を、がん発症の低、中間又は高リスクを有すると分類することを含む、方法。
条項２７．少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、条項２６に記載の方法。
条項２８．少なくとも２つの発癌バイオマーカーが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、条項２６に記載の方法。
条項２９．ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも３つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、条項２６に記載の方法。
条項３０．ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも４つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、条項２６に記載の方法
条項３１．１以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、条項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
条項３２．がんのリスクがある患者をモニタリングする方法であって、対象からの第１の過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、第１の過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいた第１のリスクスコアを算出すること、算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定すること、がん発症の中間リスクを有するか、又は高リスクを有する対象へ、一定期間、がんを予防するために抗がん剤を投与すること、対象から第２の過形成又は非過形成組織試料を得ること、第１の過形成組織試料に基づいて、第２の過形成又は非過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルにおける変化を評価すること、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいた第２のリスクスコアを算出すること、及び第１のリスクスコアと第２のリスクスコアを比較し、（ｉ）対象における抗がん剤の使用を中止するべきか、（ｉｉ）対象における抗がん剤による治療を続けるべきか、又は（ｉｉｉ）第１のリスクスコアと第２のリスクスコアとの比較に基づいて、対象へ異なる抗がん剤を投与するべきか、を判断することを含む、方法。
条項３３．第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより低いために、抗がん剤による治療が中止される、条項３２に記載の方法。
条項３４．第１のリスクスコアと第２のリスクスコアが同一であるために、抗がん剤による治療が継続される、条項３２に記載の方法。
条項３５．第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより高いために、抗がん剤による治療が中止され、新規抗がん剤による治療が患者へ施される、条項３２に記載の方法。
条項３６．がんのリスクがある対象をモニタリングする方法であって、対象から外科的に取り出された前がん性過形成又は非過形成組織試料を得ること、試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいたリスクスコアを算出すること、算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定すること、及びがん発症の中間高リスクを有するか、又は高リスクを有する対象へ、がんの発症を予防するために抗がん剤を投与することを含む、方法。

Claims (36)

  1. 対象におけるがんを予測する方法であって、
    対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、
    少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいたリスクスコアを算出すること、及び
    算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定すること
    を含む、方法。
  2. 少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも２つの発癌バイオマーカーが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも７０％の特異度を有するアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも９０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも７０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも３つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも３つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも７０％の特異度を有するアッセイを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも３つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも８０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、請求項６に記載の方法。
  9. ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも４つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも４つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異度を有するアッセイを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 対象からの過形成組織試料からの少なくとも４つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化することが、少なくとも８０％の陰性適中率（ＮＰＶ）及び少なくとも８０％の陽性適中率（ＰＰＶ）を有するアッセイを含む、請求項９に記載の方法。
  12. 少なくとも２つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することが、ウェスタンブロット解析、タンパク質／ペプチド機能アッセイ、免疫組織化学分析、ＥＬＩＳＡ解析、ＤＮＡチップ解析、又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、次世代ＲＮＡシーケンシング及びノーザンブロッティングのうちの１つ以上によるｍＲＮＡ解析のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  13. １以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、請求項１に記載の方法。
  14. ｉ）低と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも１９年間、少なくとも９５％の無がん生存率を有することを示し、
    ｉｉ）中間と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも５年間、少なくとも９５％の無がん生存率を有すること、及び少なくとも１０年間、少なくとも７５％の無がん生存率を有することを示し、
    ｉｉｉ）高と分類されたリスクスコアが、対象が、少なくとも５年間、４５％以下の無がん生存率を有すること、及び少なくとも１０年間、少なくとも２０％の無がん生存率を有することを示す、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 過形成組織試料が、コア生検、外科生検、穿刺吸引法、乳管洗浄、乳頭吸引液法及び乳頭分泌物採取の少なくとも１つを使用して得られる、請求項１に記載の方法。
  16. 過形成組織試料が、乳房組織、卵巣組織、血液、尿路組織、腎臓組織、リンパ組織、脳組織、骨組織、生殖器組織、消化管組織、神経系組織、前立腺組織、精巣組織、肺組織、頭頸部組織及び免疫系組織のうちの少なくとも１つから得られる、請求項１に記載の方法。
  17. 対象が、がんの病歴のないヒト哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  18. 治療的抗がん剤により対象を治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  19. 治療薬が、タモキシフェン、ラロキシフェン及びアロマターゼ阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 手術療法を使用して対象を治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  21. 手術療法が乳房切除術である、請求項２０に記載の方法。
  22. 対象におけるがんリスクを判定するバイオマーカーパネルであって、以下の発癌バイオマーカー：ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）のうちの少なくとも２つを含み、
    少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルの定量化を用いて、がん発症の低、中間又は高リスクを予測するリスクスコアを算出する、
    バイオマーカーパネル。
  23. 以下のバイオマーカー：ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１のうちの少なくとも３つを含む、請求項２２に記載のバイオマーカーパネル。
  24. 少なくとも４つの以下のバイオマーカー：ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１を含む、請求項２２に記載のバイオマーカーパネル。
  25. １以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、請求項２２に記載のバイオマーカーパネル。
  26. がんを発症するリスクのある患者を分類する方法であって、
    対象からの過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、
    少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいたリスクスコアを算出すること、及び
    算出したリスクスコアに基づいて、対象を、がん発症の低、中間又は高リスクを有すると分類すること
    を含む、方法。
  27. 少なくとも２つの発癌バイオマーカーのうちの１つが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 少なくとも２つの発癌バイオマーカーが、ＨＥＣ１（がんで高発現されるタンパク質）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原細胞接着分子６）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）及びＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  29. ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも３つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、請求項２６に記載の方法。
  30. ＨＥＣ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＹＡＬ１及びＭＭＰ−１からなる群から選択される少なくとも４つの発癌バイオマーカーのレベルを定量化することを含む、請求項２６に記載の方法。
  31. １以下のリスクスコアが、対象のがん発症が低リスクであることを示し、１より大きいが５以下のリスクスコアが、対象のがん発症が中間リスクであることを示し、５を超えるリスクスコアが、対象のがん発症が高リスクであることを示す、請求項２６に記載の方法。
  32. がんのリスクがある患者をモニタリングする方法であって、
    対象からの第１の過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、
    第１の過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいた第１のリスクスコアを算出すること、
    算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定すること、
    がん発症の中間リスクを有するか、又は高リスクを有する対象へ、一定期間、がんを予防するために抗がん剤を投与すること、
    対象から第２の過形成又は非過形成組織試料を得ること、
    第１の過形成組織試料に基づいて、第２の過形成又は非過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルにおける変化を評価すること、
    第２の過形成又は非過形成組織試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいた第２のリスクスコアを算出すること、及び
    第１のリスクスコアと第２のリスクスコアを比較し、（ｉ）対象における抗がん剤の使用を中止するべきか、（ｉｉ）対象における抗がん剤による治療を続けるべきか、又は（ｉｉｉ）第１のリスクスコアと第２のリスクスコアとの比較に基づいて、対象へ異なる抗がん剤を投与するべきか、を判断すること
    を含む、方法。
  33. 第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより低いために、抗がん剤による治療が中止される、請求項３２に記載の方法。
  34. 第１のリスクスコアと第２のリスクスコアが同一であるために、抗がん剤による治療が継続される、請求項３２に記載の方法。
  35. 第２のリスクスコアが第１のリスクスコアより高いために、抗がん剤による治療が中止され、新規抗がん剤による治療が患者へ施される、請求項３２に記載の方法。
  36. がんのリスクがある対象をモニタリングする方法であって、
    対象から外科的に取り出された前がん性過形成又は非過形成組織試料を得ること、
    試料からの少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルを定量化すること、
    少なくとも２つの発癌バイオマーカー又はそれらの断片のレベルに基づいた、リスクスコアを算出すること、
    算出したリスクスコアに基づいて、対象が、がん発症の低、中間又は高リスクを有することを判定すること、及び
    がん発症の中間リスクを有するか、又は高リスクを有する対象へ、がんの発症を予防するために抗がん剤を投与すること
    を含む、方法。
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