CN103168242A - 癌症发病或癌症发病风险的判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供癌症发病或癌症发病风险的高精度、且定量的判定方法，所述判定方法通过在生物体组织中进行定量组织染色法来进行，所述组织染色法中使用了诸如抑制癌细胞的运动性及浸润性的PAR1抗体等识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。本发明使用下述组织染色方法，判定癌症发病或癌症发病风险，所述组织染色方法包括如下工序：用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体、使该经荧光标记的抗体与组织试样接触的工序；向所述抗体接触的组织部位照射激发光、获得荧光图像的工序；获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像的工序；进行图像处理、从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度、获得校正荧光图像的工序；对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数的工序；计算测量1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度的工序；算出每1个细胞的荧光粒子数的工序。

Description

癌症发病或癌症发病风险的判定方法
技术领域
本发明涉及癌症发病或癌症发病风险的判定方法，所述判定方法使用了有效排除自身荧光导致的影响、能以高精度定量地进行分析的组织染色法。
背景技术
癌症与心肌梗塞、脑梗塞代表的血管系统疾病一起，是成年人死亡原因两大类疾病。例如，虽然日本人的乳癌罹患率比欧美诸国低，但近年来有增加的倾向，1998年超过胃癌的罹患率，成为女性罹患率的第1位。根据作为最近的报告的2005年日本厚生劳动省统计，乳癌的年罹患数超过5万人。
关于癌症的诊断，除了X射线CT、MRI等图像诊断之外，检测对特定的癌症来说特异性表达的癌症标志物、血液、组织中渗出的癌症标志物等的方法也是常用的。作为乳癌的一般性筛查检查，实施问诊、触诊、乳房X射线照相术(乳房造影术(mammography))、超声波检查等，如果产生临床怀疑，则实施细胞诊断、活组织检查，通过病理学诊断判别是否是癌症。为了判定癌症治疗、预后的发展，病理学诊断很重要，成为这种诊断的中心的是“为进行形态观察的HE染色法”和“使用针对癌症标志物因子的抗体的免疫组织化学法”。特别地，由于近年来抗体药物的登场，免疫组织化学的重要性急剧增高。
例如，作为抗体药物代表的赫赛汀(HER2抗体：针对人上皮生长因子受体2的抗体)(注册商标)是乳癌代表性的抗癌剂，作为给予该药剂的判定基准，临床上进行使用HER2抗体的免疫组织化学法。但是，迄今为止通过免疫组织化学法的方法均使用DAB为代表的酶法、通过病理医师的目视诊断来进行。因此，检测灵敏度低，还存在定量上的问题。
近年来，代替通过DAB的酶法，作为检测灵敏度·定量性优秀的检测方法，量子点等荧光性粒子受到关注。对量子点而言，因为粒子数与荧光亮度呈比例关系，因此通过在免疫组织化学法中使用使量子点与癌症标志物的抗体结合的探针，有可能能高精度、定量地分析癌症标志物的表达量。
作为癌症最具威胁的一点，可以举出转移。已知PAR1(蛋白酶活化受体1)是活化癌细胞移动能力及浸润能力的膜蛋白质，其与多种癌症(乳癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等)的转移相关。特别地，人们认为，对乳癌而言，具有转移能力的癌培养细胞株几乎都表达PAR1，通过基质金属蛋白酶1(MMP1：Matrix Metalloprotease 1)切断PAR1的N末端的细胞外区域时，PAR1活化，细胞移动能力及浸润能力得到增强(例如参见非专利文献1)。本发明人等报道了如下内容：制作抑制由MMP1导致的对PAR1的切断，从而抑制癌细胞的移动性及浸润能力的PAR1抗体，该抗体抑制由MMP1诱导的细胞运动活性及细胞浸润活性(例如参见专利文献1)。
专利文献1国际公开第09/119455号说明书
非专利文献1 Boire A，Covic L，Agarwal A，Jacques S，Sheriff S，Kuliopulos A.PAR1 is a matrix metalloprotease-1 receptor thatpromotes invasion and tumorigenesis of breast cancer cells.Cell120：303-313(2005)
发明内容
虽然量子点等荧光粒子因为能发挥自身具有的稳定性和定量分析的威力、人们对其作为荧光免疫染色中的新途径期望较高，但作为定量分析却仅限于培养细胞。作为其理由，很大的原因在于，培养细胞由于细胞自身荧光较弱，量子点荧光粒子的荧光亮度能以足够高的S(信号)/N(噪声)比形式算出，与之相对，生物体组织由于具有与培养细胞相比为非常强的自身荧光，因此量子点荧光粒子的荧光亮度不能以足够高的S/N比算出。虽然生物体组织的长波长的自身荧光比短波长的自身荧光量少，但是也不能忽视在观察中的影响，难于进行生物体组织中量子点荧光粒子的定量分析。本发明的课题是，提供通过生物体组织中定量的组织染色法而进行的高精度且定量的癌症发病或癌症发病风险的判定方法，所述组织染色法使用了抑制癌细胞的运动性及浸润性的PAR1抗体等识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。
作为除去生物体组织染色法中自身荧光的影响的方法，已知有(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法、(b)对比度调整法等(参见图2)。关于上述(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法，其利用量子点荧光粒子具有的光稳定性，通过长时间光照射，能够使得来源于量子点荧光粒子的亮度不褪色而仅使自身荧光褪色，但完全褪色需要长时间，另外仅照射面的自身荧光能褪色也是缺点。另外，关于上述(b)对比度调整法，在量子点荧光粒子的荧光强度比自身荧光的强度弱的情况下，通过消除自身荧光图像的对比度调整，量子点荧光粒子的荧光亮度也消失了，并且，还存在自身荧光根据试样的种类、场所大为不同因此无法确定一定的阈值的缺点。本发明的发明人对代替上述(a)或(b)方法的除去自身荧光的影响方法进行了深入研究，发现：用波长为488nm的激发光照射用经量子点荧光粒子(Qdot705)标记的PAR1抗体(PAR1ab-QD705)免疫染色的乳癌组织试样，通过荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器获得量子点荧光粒子的荧光图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)，之后通过荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器获得与上述荧光图像为完全相同焦平面及完全相同视野中的仅自身荧光的自身荧光图像，通过从荧光静止图像的各像素的荧光亮度减去自身荧光图像中相应的各像素的荧光亮度，能获得从荧光静止图像减去了自身荧光图像(自身荧光)的仅量子点荧光粒子的荧光的图像(校正荧光图像)。另外，为了确定上述校正荧光图像中含有的量子点荧光粒子的粒子数，利用了量子点特有的“闪烁(明灭)性”。即，确认了：对1粒子的量子点荧光粒子来说，因为在20秒的激发光照射时间中关闭状态(off-state，灭失状态)呈约4秒，所以算出具有约4秒的关闭状态(灭失状态)的粒子的平均亮度作为1粒子的量子点荧光粒子的荧光亮度，然后即可算出校正荧光图像中每1个细胞的量子点的荧光粒子的粒子数。进一步地，使用未复发存活乳癌患者组织、复发患者乳癌组织、癌患者的正常乳腺组织，算出以PAR1ab-QD705检测的量子点荧光粒子数，结果发现，较之癌患者的正常乳腺组织，未复发存活乳癌患者组织、复发患者乳癌组织中，以PAR1ab-QD705检测的量子点荧光粒子数显著更多。本发明基于上述发现而完成。
即，本发明涉及：
(1)癌症发病或癌症发病风险的判定方法，其特征在于使用包括下述工序(a)～(d)的组织染色方法，
工序(a)，用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；
工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；
工序(c)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；
工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。
(2)上述1所述的判定方法，特征在于癌症的增殖控制因子或转移控制因子是PAR1(蛋白酶活化受体1)。
(3)上述(1)或(2)所述的判定方法，特征在于，癌症为乳癌。
(4)上述(1)～(3)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在100nm以内。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域。
(6)上述(1)～(5)中任一项所述的判定方法，特征在于，激发光的波长为400～700nm。
(7)上述(1)～(6)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质为荧光粒子。
(8)上述(7)所述的判定方法，特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
(9)上述(7)或(8)所述的判定方法，特征在于，进一步包括以下工序(e)～(g)，
工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；
工序(f)，基于荧光图像，确定1粒子的荧光粒子，计算测量对应于该1粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；
工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每1个细胞的荧光粒子数。
(10)上述(9)所述的判定方法，特征在于，利用荧光粒子具有的明灭性，来确定1粒子的荧光粒子。
另外，本发明涉及：
(11)癌症发病或癌症发病风险的判定系统，特征在于包括以下(A)～(D)，
(A)经荧光物质标记的识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体；
(B)激发光照射装置；
(C)获得荧光图像的装置；
(D)用于获得荧光图像的带通滤波器。
(12)上述(11)所述的判定系统，特征在于，识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体为PAR1(蛋白酶活化受体1)。
(13)上述(11)或(12)所述的判定系统，特征在于，进一步包括(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器。
(14)上述(11)～(13)中任一项所述的判定系统，特征在于，荧光物质为荧光粒子。
(15)上述(14)所述的判定系统，特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
通过除去自身荧光的影响、使用经量子点荧光粒子标记的PAR1抗体的本发明的组织染色法，得到如下结果：对于乳腺组织中的每1个细胞的量子点荧光粒子数(通过PAR1抗体检测)的平均值而言，对癌患者的正常乳腺组织的4份检测样品来说为0.2，与此相对，Hercep Test(通过HER2抗体检测)为阴性的5年以上未复发存活乳癌患者组织的5份检测样品来说为3.2，Hercep Test(通过HER2抗体检测)为阴性的复发患者乳癌组织(约1年以内复发、4年以内死亡)的3份检测样品来说为14.8，存在显著差异。进一步地，报道了与乳癌增殖相关的三种主要因子(雌激素受体(ER；estrogenrecepter)、孕酮受体(PgR；progesterone recepter)、人上皮生长因子受体2(HER2：human epidermal growth factor receptor 2))无关而发生的乳癌的“三阴性”病例，因为“三阴性”不能由Hercep Test处理故而是重要的问题，但“三阴性”乳癌组织的8份检测样品的每细胞的荧光量子点粒子数(通过PAR1抗体检测)的平均值为6.0，与乳癌患者的正常乳腺组织相比存在显著差异。通过使用该组织染色法，即使对Hercep Test判定为阴性的乳癌患者也可进行高灵敏度、定量的乳癌病例诊断。由此，通过本发明，不仅能判定癌症复发或癌症复发风险，还能判定癌症发病或癌症发病风险。
附图说明
【图1】(a)为表示经免疫染色的组织试样的制作方法的图。(b)为表示通过荧光显微镜对经免疫染色的组织试样进行分析的结果的图。白色虚线表示癌细胞的轮廓。白色箭头符号表示量子点荧光粒子(通过PAR1ab-QD705检测)的荧光，白色箭头头部表示自身荧光。
【图2】为说明除去自身荧光的影响的现有方法的图。(a)为表示通过激发光照射的自身荧光褪色法(参见Hikage等人，Nanotechnology(2010))的结果的图，(b)为对比度调整法的示意图。(b)中表示的灰色区域表示人眼可见为黑色的范围。
【图3】(a)为表示通过减法进行的图像处理中的图像转换的图。(b)为表示量子点荧光粒子的荧光波长特性与自身荧光的荧光波长特性的图。实线表示量子点荧光粒子(QD705)的荧光波长特性。另外，附有误差条的点图表示了分别用荧光波长的获得区域为505～545nm、565～595nm、585～630nm、640～690nm、695～740nm及760～800nm的共计6种带通滤波器获得的组织试样切片上的自身荧光的荧光亮度的实测值。上述实测值的平均值的点以虚线连接，作为自身荧光的荧光波长特性表示。另外，带通滤波器的波长宽度以条(bar)表示。
【图4】为表示除去了自身荧光的校正荧光图像的制作法的图。
【图5】为表示使用癌细胞组织与正常细胞组织附近存在的组织试样，获得的除去了自身荧光的校正荧光图像的结果的图。
【图6】为表示量子点荧光粒子具有的闪烁(明灭)性的图。纵轴表示量子点荧光粒子的荧光亮度，横轴表示量子点荧光粒子的激发光的照射时间(秒)。箭头头部表示将量子点荧光粒子的最大荧光亮度的10％设定为荧光亮度的阈值。
【图7】(a)为表示计算的每细胞的以PAR1抗体检测的真实粒子数(以纵轴表示)的结果的图。横轴的1～4分别表示如下内容：1：癌患者的正常乳腺组织，2：5年以上未复发存活乳癌患者组织，3：复发患者乳癌组织(4年以内复发·6年以内死亡的病例)，4：“三阴性”的复发患者乳癌组织(4年以内复发·6年以内死亡的病例)的图。(b)为表示每细胞的以PAR1抗体检测的真实粒子数(以纵轴表示)与至乳癌复发的年数(以横轴表示)的关系的图。(c)为仅表示图7(b)的数据中“三阴性”的复发乳癌组织的结果的图。需要说明的是，为用于参考，“三阴性”以外的复发患者乳癌组织的结果用浅色的○表示。
【图8】为表示对激发光的激发波长为488nm和532nm进行比较的结果的图。
【图9】为表示激发光的激发波长为488nm条件下时，验证获得自身荧光图像的带通滤波器的波长区域的结果的图。
【图10】为表示激发光的激发波长为532nm条件下时，验证获得自身荧光图像的带通滤波器的波长区域的结果的图。
【图11】为表示对计算出了量子点荧光粒子数的癌组织试样进行了DAB染色的结果的图。
作为本发明的癌症发病或癌症发病风险的判定方法，只要是使用了包括下述工序的组织染色方法的方法(但通过医师进行的诊断行为除外)则没有特别限制，
工序(a)，用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；
工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；
工序(c)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；
工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像；
进一步地，优选包括如下工序：
工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；
工序(f)，基于荧光图像，确定1粒子的荧光粒子，计算测量对应于该1粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；
工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每1个细胞的荧光粒子数，另外，作为本发明的癌症发病或癌症发病风险的判定系统，只要是包括下述(A)～(D)的系统则没有特别限制，
(A)经荧光物质标记的识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体；
(B)激发光照射装置；
(C)获得荧光图像的装置；
(D)用于获得荧光图像的带通滤波器；
进一步地，优选为包括下述(E)的系统：
(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器；
作为上述判定的对象的癌症，可举出大肠癌、直肠癌、肾癌、乳癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、血癌、肝癌、胰癌、皮肤癌、肺癌、乳癌等。
上述工序(a)中的癌症的增殖控制因子或转移控制因子中，作为癌症的增殖控制因子，可举出例如上皮生长因子(EGF)、EGF受体(EGFR)、血小板来源的生长因子(PDGF：platelet-derivedgrowth factor)、PDGF受体(PDGFR)、胰岛素样生长因子(IGF：insulin-like growth factor)、IGF受体(IGFR)、成纤维细胞生长因子(FGF：fibroblast growth factor)、FGF受体(FGFR)、血管内皮生长因子(VEGF：vascular endotherial growth factor)、VEGF受体(VEGFR)、肝细胞生长因子(HGF：hepatocyte growth factor)、HGF受体(HGFR)、神经营养因子(NT：neurotropin)、转化生长因子β(TGFβ：transforming growth factor-β)家族、人上皮生长因子受体1、2、3或4(HER1、2、3或4：human epidermal growth factorreceptor 1，2，3或4)、巨噬细胞集落刺激因子(CSF1：macrophagecolony-stimulating factor 1)、CSF1受体(CSF1R)等调节细胞增殖的因子，或细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK：cyclin-dependent kinase)、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p16INK、p15、p21、p27、RB(视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))等调节细胞周期的因子；作为癌症的转移控制因子，可举出例如基质金属激酶1(MMP1)、基质金属激酶2(MMP2)、PAR1(蛋白酶活化受体1，protease activated receptor 1)、CXCR4(趋化因子[C-X-C基序]受体4，chemokine[C-X-C motif]receptor 4)、CCR7(趋化因子[C--C基序]受体7，chemokine[C--C motif]receptor7)等，其中可优选举例PAR1。
作为上述工序(a)中识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，优选特异性识别增殖控制因子、转移控制因子的抗体，作为抗体的种类，可举例为单克隆抗体、多克隆抗体。另外，对上述抗体的类别或亚类没有特别限制，作为类别，可举出IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等，作为亚类，可举出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。另外，此处的术语“抗体”以包含任意抗体片段或诱导体的含义而使用，例如，包含Fab、Fab’2、CDR、人源化抗体、多功能抗体、单链抗体(ScFv)等。所述抗体可按照公知的方法制造(例如，参考Harlow E.& Lane D.，Antibody，Cold Spring HarborLaboratory Press(1988))，也可使用市售品。例如，作为上述识别PAR1的抗体，可举出识别PAR1的N末端区域的市售PAR1抗体、国际公开第09/119455号说明书中公开的PAR1抗体。
作为上述工序(a)中的荧光物质，只要是响应于选定波长的紫外光、可见光等放射线的照射而发出荧光的物质就没有特别限制，例如，作为有机荧光物质，可举出荧光素、罗丹明、Cy-5、Cy-3、Alexa等，作为无机荧光物质，可举出荧光二氧化硅纳米粒子、量子点荧光粒子等荧光粒子。而且，因为长波长侧自身荧光的影响较少，所以优选使用发出近红外区域侧、特别是近红外区域的荧光的荧光物质，该荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域侧(570～800nm)，特别是近红外区域(700～800nm)。上述有机荧光物质通过激发光而急速发生褪色，不适合长时间激发光照射的分析，因此优选使用光稳定性高、即使长时间激发光照射也稳定的荧光粒子，其中优选量子点荧光粒子。作为荧光粒子，通过激发光的照射而发出荧光的粒子即可，对其材料等没有限制，可以为材料自身发出荧光的物质，也可以为含有荧光物质的粒子或通过涂布荧光物质而能发出荧光的粒子。另外，荧光粒子的形状、大小没有特别限制，可以举出方形、圆盘状、多面体、球状，但优选球状，其大小为直径0.00001nm～1mm，优选为直径0.001nm～100μm，更优选为直径0.01nm～10μm，还可适当选择荧光粒子发出的荧光的波长。荧光粒子可按照日本特开平9-241634、日本特开2010-242059等公开的方法来制作，但也可购入在聚苯乙烯芯粒子存在下通过适当的荧光染料或苯乙烯的荧光染料的聚合对聚苯乙烯粒子染色而制备的SPHERO荧光粒子(Bay Bioscience公司制)、荧光粒子Estapor(注册商标)标准微粒(Merck Chime公司制)等市售品。荧光粒子中，也被称为胶体状量子点(QD：Quantum Dot)的量子点荧光粒子由于荧光粒子兼具非常锐利的发光光谱和高度量子效率的特性而优选。量子点荧光粒子是发光性的半导体纳米粒子，直径范围为1～20nm，在生物学和医学诊断领域中被利用于荧光显像。就量子点荧光粒子而言，电子被量子性地封闭在轮廓明确、三维且为纳米大小的半导体结晶中，量子点荧光粒子的大小变小时，半导体的能隙(band gap)变大，因此，可通过大小在整个可见光谱的范围内来调节半导体光致发光的发光波长。作为本发明中的量子点荧光粒子，发光性的半导体纳米粒子即可，关于其大小，优选根据激发光及荧光波长对粒子大小进行适当调节。作为所述量子点荧光粒子，例如，可利用以半导体壳(ZnS)被覆的半导体材料(CdSe)的纳米晶体、Qdot(注册商标)525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot625、Qdot655、Qdot705、Qdot800(全部Invitrogen公司制)。获得的荧光波长超过800nm时，摄像装置的灵敏度降低，因此在发出近红外区域的荧光的量子点荧光粒子中，优选使用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子(Qdot705)。
上述工序(a)中，作为以荧光物质标记抗体的方法，可举出对该抗体具有特异的亲和性的抗体(二抗)介入的方法、生物素-亲和素法、硫醇基-马来酰亚胺基的偶联反应、使用既有化学接头的方法、交联剂(EDC等)的交联反应、离子键等。例如，可使用Qdot抗体缀合试剂盒(Qdot Antibody Conjugation Kit)(Invitrogen)等，按照制造者的说明书来进行抗体与量子点荧光粒子的结合。
作为上述工序(a)中的组织试样，可举例为福尔马林固定的石蜡切片、冻结切片等固定组织试样切片，可举出病理组织试样、外周血液组织试样、从组织分离的细胞、从体液分离的细胞的细胞封闭(cell block)试样、对外周血液白血球或细胞的悬浮试样进行沉降或离心制成的细胞封闭试样、组织擦拭试样、外周血液、体液、渗出液、含有细胞的液体的涂抹试样等。
上述工序(a)中，作为所述经荧光标记的抗体与组织试样接触的方法，没有特别限制，因为通过所述接触发生抗原-抗体反应，所以接触时的温度优选0～40℃。另外，接触时间随着使用的组织试样的种类、抗体浓度、效价的高度、上述接触(反应)温度、靶因子(抗原)的量、局部部位的不同等而不同，对其没有特别限制，可进行适当选择，可举出10分钟～12小时，优选10分钟～2小时。另外，为防止抗体的非特异性结合，在使抗体与组织试样接触之前，可进行FBS、BSA、IgG等封闭处理。
作为上述工序(b)中的激发光的激发波长，其为比荧光物质发光的荧光波长短的波长，从对人体安全性的方面来说优选400～700nm，更优选450～650nm，特别地，可具体举出一般用作为激发波长的488nm、532nm或635nm。
作为上述工序(b)中的荧光图像，可举出荧光静止图像、荧光静止图像及对应于该荧光静止图像的荧光动态图像。上述荧光静止图像能使用荧光显微镜来获得，所述荧光显微镜能使用一般的PC等计算机作为控制器，进行对CCD摄像装置的摄影条件的控制、获得的荧光静止图像的图像化表示、对光源的光亮度的控制等。为了荧光物质发光的荧光亮度不饱和，进行激发光侧的滤光器、二向色镜等的必要的设定，进一步地优选激发光的曝光时间设定为0.0003至30～60秒。作为荧光物质的荧光各像素亮度是否不饱和的确认方法，也可如下进行：设定预先指定的亮度值或针对亮度值的最大值预先指定的比例的亮度值(例如，8位图像的情况下255为最大值，由此设定220这样的数值或亮度值的最大值的90％)，超过该值时判断为饱和。另外，此时也可不仅用一个像素，而使用图像全体的预先指定的比例的多个像素来判断。在对荧光静止图像中荧光物质的荧光亮度是否来源于1个粒子进行确定的情况下，可根据需要获得荧光动态图像。作为上述荧光动态图像，优选以2～500msec的分辨能力获得50～200帧与上述荧光静止图像相同视野及相同焦点下的动态图像。作为获得上述荧光图像的带通滤波器，使用为了仅能让荧光物质发出的红色、蓝绿色、橙色、绿色、蓝色等特定波长的荧光透过而选择的带通滤波器，希望使用能获得上述荧光物质的总荧光亮度的25％以上、优选50％以上、更优选75％以上的带通滤波器。进一步地，关于获得上述荧光图像的带通滤波器，希望使用能在30nm以内、优选15nm以内、更优选5nm以内的波长区域中获得上述荧光物质的荧光亮度的30％的带通滤波器。例如，使用发出705nm的荧光的荧光物质的情况下，获得上述荧光图像的带通滤波器优选为荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器。
上述工序(c)中，作为获得自身荧光图像的方法，可举出下述方法：将用于获得荧光物质发出的荧光波长的带通滤波器用能获得与该带通滤波器相比为短波长侧或长波长侧的附近区域、优选短波长侧的附近区域的波长的带通滤波器代替，在与上述荧光静止图像相同视野和相同焦点的条件下获得图像，获得不含荧光物质的荧光而仅含自身荧光的图像。由于长波长的荧光比短波长的荧光折射率小、比短波长的荧光在更远处汇聚焦点，因此上述荧光物质发出的荧光波长的获得区域与获得自身荧光图像的波长区域的波长差异大时，上述荧光静止图像中含有的自身荧光的焦点和自身荧光图像中自身荧光的焦点的间距就会变大。因此，上述荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差可优选举例为130nm以内、优选120nm以内、更优选110nm以内的区域，特别是100nm以内。作为用于获得本发明的荧光图像、自身荧光图像的带通滤波器，具体可举出荧光波长的获得领域为505～545nm、565～595nm、585～630nm、640～690nm、695～740nm、760～800nm等的带通滤波器，例如使用荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器获得上述荧光静止图像的情况下，获得自身荧光图像的带通滤波器优选为荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器。用于获得上述自身荧光图像的摄影条件设定为，比较上述荧光静止图像与该自身荧光图像的相同区域的自身荧光的亮度，自身荧光图像的任意的ROI、例如25×25像素的自身荧光的最大值，是荧光静止图像的1.1～1.3倍，优选1.2倍。即，较之荧光静止图像，自身荧光图像的自身荧光的亮度值优选高10～30％，特别是20％左右。
上述工序(d)中，作为获得校正荧光图像的方法，可举出：在荧光静止图像及自身荧光图像转换为JPEG、TIF等图像文件之后，用Image·J(http://rsb.info.nih.gov/ij/)、Photoshop(Adobe公司制)、After Effect(Adobe公司制)、G-Count(G-Angstrom公司制)的图像分析软件，基于自身荧光图像的亮度从荧光静止图像的亮度除去自身荧光的亮度的处理。需要说明的是，转换图像文件时，优选选择全部荧光分布均被包括进去的阈值。
上述工序(e)中，作为对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数的方法，可举出在用DAPI、Hoechst、PI(碘化丙啶)等与DNA结合发出荧光的核酸染色剂对细胞核染色之后、对与荧光图像相同视野中的被染色的细胞核数的总数进行计数的方法，但在荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域的情况下，较之发出荧光特性类似的红色荧光的PI而言，优选使用发出蓝色荧光的DAPI或Hoechst。
上述工序(f)中，作为确定1粒子的荧光粒子的方法，可举出例如测定荧光图像中的荧光粒子的荧光亮度、基于荧光1粒子发出的荧光的亮度信息求出上述荧光粒子相当于何种粒子的方法，或利用荧光粒子具有的“闪烁(明灭)性”的方法等，但在荧光粒子是量子点荧光粒子的情况下，优选为利用闪烁(明灭)性的方法。此处，“闪烁(明灭)性”指下述情况反复进行的性质：相对于照射激发光时的照射时间或照射量，发光强度突然变为几乎为零(OFF)的消失时间(灭失时间)持续大约数毫秒～5秒、再得到原发光强度。另外，利用“闪烁(明灭)性”确定1粒子的荧光粒子的方法指下述方法：基于荧光静止图像或荧光动态图像，测定照射激发光任意时间、例如10～100秒的情况下荧光粒子的灭失时间、进行该荧光粒子是否为1粒子的评价、确定1粒子的荧光粒子。例如，使用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子作为荧光粒子的情况下，照射激发光20秒的情况下量子点荧光1粒子的灭失时间为约4秒，即，能将灭失时间为约4秒的荧光粒子确定为来源于1粒子的量子点荧光粒子。此处，为了判断量子点荧光粒子是否灭失，可合适地设定量子点荧光粒子的荧光亮度的阈值，例如将量子点荧光粒子的最大荧光亮度的0～30％、优选5～15％、更优选10％设定为阈值。使用Image·J、Photoshop、After Effect、G-Count等图像分析软件，测定与已确定的1粒子对应的校正荧光图像内的荧光亮度。就通过上述测定进行的对1粒子的平均荧光亮度的计算而言，从精力和准确性方面考虑，使用2～200个荧光粒子、优选5～10个荧光粒子来进行。
上述工序(g)中，算出每1个细胞的荧光粒子数。每1个细胞的荧光粒子数能通过下述方法算出：将从上述校正荧光图像得到的量子点荧光粒子的总荧光亮度值(画面内的总荧光亮度)、从上述细胞核染色图像得到的细胞数、及每1个粒子的量子点荧光粒子的平均荧光亮度的值(1粒子荧光亮度)代入下式中算出：
(画面内的总荧光亮度/1粒子荧光亮度)/细胞数＝画面内的总荧光粒子数/细胞数＝荧光粒子数/细胞。
通过包括上述工序(a)～(d)的本发明的判定方法，分别获得判定对象组织试样与正常组织试样的校正荧光图像，比较两种校正荧光图像内的荧光亮度，在判定对象组织试样的校正荧光图像中的荧光亮度更高的情况下，由于这暗示了判定对象组织试样的癌症增殖控制因子或转移控制因子蛋白质的质量较多，因此可判定为所述判定对象组织中癌症为发病状态或有癌症发病风险。另外，通过包括上述工序(a)～(g)的本发明的判定方法，分别算出判定对象组织试样与正常组织试样的每1个细胞的荧光粒子数，对两者加以比较，当判定对象组织试样中每1个细胞的荧光粒子数较多的情况下，因为暗示了判定对象组织试样中癌症增殖控制因子或转移控制因子蛋白质质量较多，可判定为所述判定对象组织中癌症为发病状态或有癌症发病风险。例如，可以用量子点荧光粒子标记检测乳癌标志物因子的抗PAR1抗体，使用所述量子点荧光粒子标记抗体，算出每1个细胞的通过抗PAR1抗体检测出的荧光粒子数，以该数作为指标，进行乳癌的癌症发病或癌症发病风险的病理诊断。
作为前述本发明的判定系统中的激发光照射装置，可举出水银灯(100V)、水银灯(200V)、氙气灯(75V)、氙气灯(150V)、卤素灯(12V 100W)、钨灯(6V 30W)、氙气灯(波长250～1000nm)、钨灯(波长250～1000nm)、Cr:LiSAF灯(波长430nm)、氦-镉激光器(波长325、442nm)、UV氩激光器(波长351、364nm)、氩离子激光器(波长488、514nm)、氦氖激光器(波长543、594、633nm)、氪离子激光器(波长568、647nm)、LD激发CW/Q-CW(连续振荡/准连续振荡)固体激光器(波长375nm、405、440、473、488、505、515、532、561、594、635、785、1064nm)等，其中从对人体的安全性方面考虑，可合适地举例为400～700nm的激发波长、优选为LD激发CW/Q-CW固体激光器(波长488、532、635nm)。
另外，作为本发明的判定系统中的荧光图像获得装置，可举出荧光显微镜、共聚焦激光扫描型荧光显微镜等。作为通过所述荧光图像获得装置能获得的荧光图像，可举出荧光静止图像与自身荧光图像，必要时还有荧光动态图像。
另外，作为本发明的判定系统中用于获得荧光图像的带通滤波器，可举出用于获得荧光静止图像(荧光动态图像)及自身荧光图像的带通滤波器，另外，作为获得细胞核荧光图像的带通滤波器，根据使用的核酸染色剂的荧光特性而有所不同，例如因为DAPI的最大荧光波长为461nm，Hoechst 33342及Hoechst 33258的最大荧光波长为465nm、PI(碘化丙啶)的最大荧光波长为617nm，优选使用能充分覆盖这些波长的带通滤波器。
通过以下实施例具体地说明本发明，但本发明的技术范围不受这些实施例限制。
实施例1
经免疫染色的组织试样的制作方法
为了区分与Hercep Test(通过HER2抗体检测乳癌组织)的差别，使用全部为Hercep Test阴性的组织试样作为人乳癌病理组织。另一方面，存在与乳癌增殖相关的三种主要因子(ER、PgR、HER2)无关的癌症发生病例，一般认为该“三阴性”乳癌预后较差、治疗困难。此处，还针对“三阴性”的乳癌组织试样进行了讨论。具体而言，复发患者乳癌组织(约1年以内复发、4年以内死亡)4份检测样品(其中1份检测样品为三阴性[由于复发患者中20～25％为“三阴性”，因此随机向4份检测样品中的1份检测样品添加“三阴性”标签])、“三阴性”的复发患者乳癌组织(4年以内复发、6年以内死亡)8份检测样品(包括上述1份检测样品)、5年以上未复发存活乳癌患者组织5份检测样品，共计16份检测样品，针对这些组织采用常规病理组织诊断中使用的方法，制备组织试样。即，用福尔马林固定癌症患者的检测样品，用乙醇进行脱水处理，之后进行二甲苯处理，浸于高温的石蜡中进行石蜡包埋，制作组织试样(图1(a))。需要说明的是，使用了癌症患者的正常乳腺组织的4份检测样品作为对照。将上述20份检测样品的组织试样进行2～4μm的切片，用二甲苯进行脱石蜡处理，进行乙醇处理，之后用去离子水洗净。为了使PAR1抗体能高效接近固定组织内的PAR1抗原部位，在10mM柠檬酸(pH 6.0)中于121℃、15分钟的条件下进行对上述试样的活化，实施缓和固定组织结构的处理。接下来，用去离子水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)依序洗净上述试样，之后为了防止非特异性的PAR1抗体结合，将该试样依序于50mM NH4Cl/PBS溶液中于25℃浸30分钟、于10％FBS/PBS中于25℃浸60分钟、及于10％FBS+1μM小鼠IgG/PBS溶液中于25℃浸3小时，进行封闭处理。接着，于25℃，在含有用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子(Qdot705)标记的PAR1抗体(PAR1ab-QD705)4.5nM的溶液(10％FBS+1μM小鼠IgG/PBS)中，将上述试样进行1.5小时的抗体反应。需要说明的是，使用经发出705nm的荧光的量子点荧光粒子(Qdot705)标记的小鼠IgG(小鼠IgG-QD705)作为对照。用PBS溶液进行4次洗净，之后为了对细胞数计数，通过于25℃进行10分钟的DAPI染色(2μg/ml PBS)来对细胞核染色。用PBS进行3次洗净，之后封入，制作了经免疫染色的组织试样。
实施例2
荧光免疫组织染色法的问题
针对上述实施例1中制作的经免疫染色的组织试样，使用组合了共聚焦单元(横河电机公司制)、荧光显微镜(Olympus公司制)、电子倍增CCD(EM-CCD)摄像装置(Andor公司制)的装置，以488nm的激发光照射，之后使用695～740nm的带通滤波器，获得了量子点荧光粒子(通过PAR1ab-QD705检测)的荧光图像(荧光静止图像)。图1(b)中将复发乳癌患者的组织试样的荧光静止图像作为例子示出，自身荧光很强，强到乍观察时不能发现量子点荧光粒子(通过PAR1ab-QD705检测)的程度。实际上，对自身荧光与量子点荧光粒子(通过PAR1-抗体检测)的荧光亮度加以比较时，仅能确认2～3倍左右的差异。另外，由于自身荧光随组织试样的种类、组织试样内的场所而大为不同，无法确定一定的阈值。因此，为了正确计算测量量子点荧光粒子(通过PAR1抗体检测)的荧光亮度，必须要排除自身荧光。
作为在生物体组织染色中除去自身荧光的影响的方法，已知(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法或(b)对比度调整法等。关于上述(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法，其通过量子点荧光粒子具有的光稳定性，即使长时间光照射，来源于量子点荧光粒子的亮度也不褪色，仅使自身荧光褪色，但自身荧光的完全褪色需要长时间，另外仅照射面的自身荧光才能褪色也是缺点。另外，上述(b)对比度调整法中，虽然在量子点荧光粒子(PAR1ab-QD705)的荧光亮度与自身荧光的亮度相比为足够强的情况下可以仅使自身荧光的亮度消失，但考虑在量子点荧光粒子(PAR1ab-QD705)的荧光亮度与自身荧光的亮度没有足够差异的情况下，通过对比度的调整，量子点荧光粒子的荧光亮度也会消失。并且，自身荧光根据试样的种类、场所大为不同，因此无法确定一定的阈值。
实施例3
除去了自身荧光的校正荧光图像的制作
需要作为背景的自身荧光的荧光强度为零(0)的荧光静止图像。这样的话，能将荧光静止图像内的总荧光作为来源于量子点荧光粒子的荧光来计算。上述实施例2的对比度调整法因为是荧光强度的除法，除法的话不能得到零(0)，因此必须是使用能得到零(0)的减法的图像处理方法。由此，作为除去荧光静止图像的自身荧光的图像处理方法，考虑下文示出的方法。首先，向经量子点荧光粒子免疫染色的乳癌组织试样照射激发波长为488nm的激发光(激光)，使用荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器获得量子点荧光粒子的荧光图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)，之后使用荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器，在与所述荧光图像完全相同焦平面及相同视野下获得仅自身荧光的自身荧光图像。接下来，是以512×512像素将所述荧光图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)及自身荧光图像取得在内、转化为256灰度的JPEG图像之后(图3(a))、通过从荧光静止图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)的各像素所含的亮度信息(0-255的值)减去自身荧光图像(自身荧光)所含的亮度信息(0-255的值)、制作仅量子点荧光粒子的荧光的图像(校正荧光图像)的方法。
为了制作所述校正荧光图像，首先研究各种波长范围中自身荧光的荧光波长特性。向没有用量子点荧光粒子免疫染色的癌组织试样照射488nm的激发波长的激发光，然后使用荧光波长的获得区域为505～545nm、565～595nm、585～630nm、640～690nm、695～740nm及760～800nm的共计6种带通滤波器，获得了相同视野及相同焦点的自身荧光图像。将用所述6种带通滤波器获得的各自的自身荧光图像的相同区域的512×512像素的图像转换为JPEG图像，在所述JPEG图像中切出相同区域的512×420像素(合计210540像素)的图像，之后求出所述图像内的荧光亮度的平均值，算出了“自身荧光图像的荧光亮度平均值/像素”(值1))。另外，在用上述6种带通滤波器获得的分别的自身荧光图像中，获得自身荧光不存在的背景的图像作为背景荧光图像，测定了所述背景荧光图像的荧光亮度。所述测定中，在任意3个区域求出25×25像素的背景荧光图像中的荧光亮度，算出“背景荧光图像的荧光亮度平均值/像素”(值2))。需要说明的是，所述3个区域在用上述6种带通滤波器获得的各自身荧光图像中是在相同区域测定的。使用上述1)和2)的值，基于式[(自身荧光图像的荧光亮度平均值/像素-背景荧光图像的荧光亮度平均值/像素)×像素数]＝[(值1)-值2))×像素数]算出除去了背景荧光的荧光亮度的自身荧光的荧光亮度平均值(下文中简称为“自身荧光的荧光亮度”)。算出上述6种带通滤波器的分别的自身荧光的荧光亮度，通过将其除以各带通滤波器获得的荧光波长宽度(505～545nm：40nm，565～595nm：30nm，585～630nm：45nm，640～690nm：50nm，695～740nm：45nm，760～800nm：40nm)，算出了相对于波长宽度的自身荧光的荧光亮度平均值。通过针对所述相对于波长的自身荧光的荧光亮度相对于各带通滤波器获得的荧光波长的中心绘点，并以虚线相连，制作了表示自身荧光的荧光波长特性的图(图3(b))。
接着，为了使量子点荧光粒子的荧光波长特性与上述自身荧光的荧光波长特性对应，用488nm的激发光激发通过上述实施例1中所述的方法用量子点荧光粒子进行了免疫染色的乳癌组织试样，使用荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器，获得了荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)。接下来，获得与所述荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)相同视野及相同焦点的荧光动态图像，使用所述荧光动态图像，通过下述实施例4中所示的方法(利用量子点荧光粒子具有的明灭反应的方法)，确定了量子点荧光粒子的1粒子。这之后，使用荧光静止图像，测定确定了的量子点荧光粒子的1粒子的荧光亮度。即，关注与自身荧光不重合的量子点荧光粒子的1粒子，求出能将所述1粒子的荧光全部覆盖的像素范围(9～25像素)的荧光亮度，算出了“荧光静止图像的荧光亮度/像素”(值3))。另外，在荧光静止图像中，获得自身荧光与量子点荧光粒子的荧光均不存在的背景的图像作为背景荧光图像，测定了所述背景荧光图像的荧光亮度。所述测定中，求出具有与测定1粒子的量子点荧光粒子的荧光背景时相同像素数的任意3个区域的荧光亮度，算出了“背景荧光图像的荧光亮度平均值/像素”(值4))。使用上述值3)及值4)，基于式[(荧光静止图像的荧光亮度平均值/像素-背景荧光图像的荧光亮度平均值/像素)×像素数]＝[(值3)-值4))×像素数]求出除去了背景荧光的荧光亮度的量子点荧光粒子的荧光亮度(下文简称为“量子点荧光粒子的荧光亮度”)。进一步地，在荧光静止图像(量子点荧光粒子+自家荧光)中，从不含量子点荧光粒子的荧光的仅自身荧光的区域，求出具有与测定量子点荧光粒子1粒子的荧光亮度时相同像素数的任意3个区域的荧光亮度，算出了“自身荧光图像的荧光亮度平均值/像素”(值5))。使用所述值5)，基于式“量子点荧光粒子的荧光亮度/([自身荧光图像的荧光亮度平均值/像素]×像素数)”＝([值3)-值4)]×像素数)/([值5)-值4)]×像素数)算出了相对于自身荧光的荧光亮度的量子点荧光粒子的荧光亮度。针对15个不同的荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)进行以上操作，从得到的共计15个荧光粒子的值，求出其平均值(相对于自身荧光的荧光亮度的量子点荧光粒子的荧光亮度平均值)，结果算出为1.88±0.10(平均值±s.e.m.)。关于量子点荧光粒子(Qdot705)的荧光亮度变化，例如参照Invitrogen的主页(http://www.invitrogen.jp/qdot/index.shtml)公开的小册子(文件名2008-20-CBQdot)中的记载，以(表示Qdot705的荧光亮度的面积)/(表示自身荧光的荧光亮度的面积)成为1.88的方式，确定表示量子点荧光粒子和自身荧光的荧光亮度的面积，绘制表示自身荧光与Qdot705的荧光波长特性的图(图3(b))。需要说明的是，关于对所述面积的确定，将表示荧光波长为695～740nm的自身荧光的荧光亮度的面积视为方形来方便地进行。(表示Qdot705的荧光亮度的面积)/(表示自身荧光的荧光亮度的面积)比为1.88表示在荧光静止图像中总荧光亮度(量子点荧光粒子的荧光亮度+自身荧光的荧光亮度)中作为背景的自身荧光的荧光亮度所占的比例超过50％，为了对量子点荧光粒子的荧光亮度进行定量，再次确认需要除去自身荧光的荧光亮度。
按照下述步骤制作除去了自身荧光的校正荧光图像。即，对用PAR1ab-QD705进行了染色的组织试样用488nm激发光照射20秒，得到了通过荧光波长的获得区域为695～740nm的带通滤波器获得的荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)(20秒/帧×1张)以及与上述荧光静止图像相同视野及相同焦点处通过荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器获得的自身荧光图像(20秒/帧×1张)。另外，为了对细胞数计数，用400nm激发光激发组织试样，得到了通过荧光波长的获得区域为420～500nm的带通滤波器获得的细胞核图像(通过DAPI检测)(图4右起第一张)。对荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)和自身荧光图像内的相同区域的自身荧光加以比较，使任意ROI(例如25×25像素)的自身荧光的最大值成为“荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)×1.2倍＝自身荧光图像”。即，自身荧光图像与荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)相比时，自身荧光的亮度成为高约20％左右的值。在以这样的方式对来源于自身荧光的亮度进行了调整的状态下，转换为JPEG图像(图4左起第1张及左起第2张)。需要说明的是，在转化为JPEG图像时，设定了使得所有荧光都能被包括进去的阈值。为了除去自身荧光、获得仅量子点荧光粒子的荧光静止图像，用Photoshop图像分析软件，进行“荧光静止图像(量子点荧光粒子+自身荧光)-自身荧光图像”的处理(图4右起第2张)。此时，在任意的多个区域，确认了量子点荧光粒子1个的亮度没有消失，而且自身荧光部分的荧光强度在做减法之后变为零(0)。
由于能高效除去癌组织试样的自身荧光，因而随后研究了在癌细胞组织与正常细胞组织接近存在的组织试样中是否也能同样地除去自身荧光。在确认了用量子点荧光粒子(通过PAR1ab-QD705检测)能对癌细胞组织进行特异性染色之后(图5(b))，进行除去自身荧光的图像处理，可知，通过仅高效地除去癌细胞组织及正常细胞组织的自身荧光，能获得癌细胞组织的仅量子点荧光粒子的荧光静止图像(校正荧光图像)(图5(c))。该结果表示，用于获得校正荧光图像的荧光静止图像不限于图4所示那样的视野全部为癌组织的荧光静止图像。
实施例4
每1粒子的量子点荧光粒子的平均荧光亮度的算出方法
为了算出每1粒子的量子点荧光粒子的平均荧光亮度，需要确定荧光亮度是否来源于1个粒子，此处利用了量子点特有的“闪烁(明灭)性”。如果设定量子点荧光粒子的最大荧光亮度的10％作为闪烁(明灭)的界限的阈值(参照图6的箭头头部)，1粒子的量子点荧光粒子的话，20秒的照射时间中关闭状态(灭失状态)为约4秒(图6)。因此，测定具有约4秒的关闭状态(灭失状态)的粒子的平均强度的话，就能得到1粒子的荧光亮度。由此，为了获得对应于荧光静止图像的荧光动态图像，在激发光照射之后用荧光波长的获得区域为690～730nm的带通滤波器以200毫秒的分辨能力获得100张连续的荧光静止图像，得到荧光动态图像(200毫秒/帧×100张)。使用上述荧光动态图像，将具有约4秒的关闭状态(灭失状态)的粒子确定作为1粒子的荧光粒子之后，用Image J图像分析软件确定了静止图像中相应粒子的荧光亮度。对5～10个粒子进行上述过程，算出了每1粒子的平均荧光亮度。
实施例5
每1个细胞的粒子数的算出方法
将从校正荧光图像得到的量子点荧光粒子的总荧光亮度值(画面内的总荧光亮度)和从细胞核染色图像(通过DAPI检测)得到的细胞数以及每1粒子的量子点荧光粒子的平均荧光亮度值(1粒子荧光亮度)代入下式，
[(画面内的总荧光亮度/1粒子荧光亮度)/细胞数＝图像内的总荧光粒子数/细胞数＝荧光粒子数/细胞]
由此能算出每1个细胞的量子点荧光粒子数。
进一步地，在使用作为对照的经量子点荧光粒子标记的小鼠IgG的情况下进行同样的过程，通过进行“通过PAR1抗体检测的量子点荧光粒子数/细胞-通过小鼠IgG检测的量子点荧光粒子数/细胞”，从量子点荧光粒子数(通过PAR1抗体检测)除去非特异性的粒子数，算出了用PAR1抗体检测的每1个细胞的真实荧光粒子数。关于所述荧光粒子数的计算，针对表1记载的各试样(样品1～20)，分别以300～1000个细胞进行，求出以PAR1抗体检测的真实的粒子数的平均值。其结果示于表1(表示为“PAR1ab-QDs分数”)。
实施例6
相对于乳癌组织细胞的通过PAR1抗体检测的粒子数的计算
关于通过PAR1抗体检测的真实粒子数(表1中表示为“PAR1ab-QDs分数”)，复发患者乳癌组织(约1年以内复发、4年以内死亡)的3份检测样品(样品10～12，参照表1)的平均值为14.8，5年以上未复发存活乳癌患者组织的5份检测样品(样品5～9，参照表1)的平均值仍高于3.2，另一方面，癌患者的正常乳腺组织的4份检测样品(样品1～4，参照表1)的平均值为0.2，比起乳癌组织来说显著更少(表1，图7(a))。进一步地，为了算出“三阴性”乳癌组织中的粒子数，针对“三阴性”的复发患者乳癌组织(4年以内复发、6年以内死亡)的8份检测样品(样品13～20，参照表1)算出平均粒子数，其结果为6.0，这显示了比癌患者的正常乳腺组织、5年以上未复发存活乳癌患者组织均更高的值(表1，图7(a))。因为“三阴性”是赫赛汀无法处置的重要问题，本发明的使用PAR1抗体的免疫组织染色方法中隐含了成为该问题的解决方案的可能性。进一步地，基于复发患者乳癌组织试样(样品10～20，参照表1)，验证了用PAR1抗体检测的真实粒子数与直至乳癌复发的年数之间是否存在关联性，其结果为，PAR1抗体检测的真实粒子数越高，直至乳癌复发的时间就越短，显示了强相关性(图7(b))(相关系数(R)＝0.75)。此处，即使限于“三阴性”的复发患者乳癌组织进行验证，也得到了同样的结果(图7(c))(相关系数(R)＝0.71)。由这些结果显示了：本发明的使用PAR1抗体的免疫组织染色方法中隐含了能够预测包括“三阴性”在内的乳癌复发时间的可能性。
实施例7
激发波长的条件讨论
进一步地，以532nm的激发波长验证了激发光的激发波长为488nm以外时是否可以应用，其结果为，样品13组织试样的每细胞的以PAR1抗体检测的粒子数为：用488nm的激发波长时为15.5(粒子数/细胞数)，与之相对地，用532nm的激发波长时为15.8(粒子数/细胞数)(图8)，两者之间算出的每细胞的以PAR1抗体检测的粒子数的值没有发现大的差异(图8)。上述内容表示：激发光的波长不限定于488nm。
实施例8
关于自身荧光波长除外的波长特性的讨论
进一步地，关于获得自身荧光图像的带通滤波器的波长区域，对于激发光的激发波长为488nm的情况(图9)，除了讨论了荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器之外，还讨论了505～545nm、585～630nm、640～690nm、或760～840nm的带通滤波器，对于激发光的激发波长为532nm的情况(图10)，除了讨论了荧光波长的获得区域为640～690nm的带通滤波器之外，还讨论了585～630nm、640～690nm、或760～840nm的带通滤波器。在488nm、532nm的激发光的任一的情况下，基于在与荧光波长的获得区域为635～685nm的带通滤波器相比为短波长侧的波长区域中获得的自身荧光图像获得校正荧光图像时，如箭头头部所示的那样，自身荧光有残留。这是因为，在远离获得荧光静止图像的波长区域的波长区域获得自身荧光图像时，焦平面偏移的自身荧光被检测到，在进行自身荧光的减法之后还有焦平面偏移的自身荧光残留。另外，反之基于长波长侧的760～840nm处获得的自身荧光图像来获得校正荧光图像时，虽然自身荧光被扣除，但在画面中观察到伴随焦平面偏移的荧光。荧光波长的获得区域为505～545nm或585～630nm的带通滤波器程度时，未观察到焦点偏移，认为其原因如下：使用的摄像装置的灵敏度以800nm为界急剧下降，因此即使使用荧光波长的获得区域为760～840nm的带通滤波器，实际上检测到的自身荧光是“760～800nm+若干的800nm以上”。作为结论，相对于荧光粒子的荧光波长为短波长侧和长波长侧的任一侧均可扣除自身荧光，但考虑到因为有色差的问题，因而在荧光粒子的荧光波长的附近波长处进行扣除的方式较好。
实施例9
为了验证本发明的算出量子点的粒子数的免疫组织染色法与DAB染色法相比实际上是否存在何种程度的差异，进行与DAB染色法的比较实验。通过上述实施例1中示出的方法，对表1所示的样品12组织试样及样品14组织试样进行直到脱石蜡处理的处理工序，之后用去离子水洗净。为了除去该组织试样的内源性过氧化物酶，用含有30％过氧化氢水(H2O2)的甲醇溶液处理10分钟，之后用蒸馏水洗净3次。为了使PAR1抗体能高效接近固定组织内的PAR抗原部位，在10mM柠檬酸(pH 6.0)中于121℃、15分钟的条件下进行对上述试样的活化，实施缓和固定组织结构的处理。接下来，用去离子水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)依序洗净上述试样，之后为了防止非特异性的PAR1抗体结合，将该试样于含有50mM NH4Cl的PBS溶液中于25℃处理30分钟，再于含有10％FBS的PBS溶液中于25℃处理2小时，进行封闭反应。接着，将该试样在含有33nMPAR1抗体的10％FBS/PBS溶液中于25℃进行2小时的一抗反应。用PBS溶液洗净4次，之后，在含有22nM小鼠抗体用二抗的10％FBS/PBS溶液中于25℃进行1小时的二抗反应。用PBS溶液洗净4次后，DAB发光使用过氧化物酶染色DAB试剂盒(NAKARAI公司制)在发色时间为在25℃下的5分钟的条件下进行。用自来水洗净该组织试样，之后进行苏木精染色。用自来水洗净该组织试样，之后澄清、脱水、封入，得到经DAB染色的组织试样，图10示出了通过显微镜观察的结果。对于量子点的粒子数多的样品12组织试样，观察到了核、细胞质、膜被染色(仅观察到核苏木精染色的是正常细胞)(图11(a))。另一方面，量子点的粒子数少的样品14组织试样的特异性染色也少(图11(b))。另外，还如Even-Ram etal.，Nature Med.，4；909-914(1998)所示，通过使用了PAR1抗体的DAB法对乳癌细胞进行染色时(图11(c)及(d))，PAR1的高表达株染色直到核，即，非特异性的通过DAB法的染色成为问题。而另一方面，使用本发明的组织染色方法时，能与DAB法相关地对乳癌细胞染色，并且，与现有技术的DAB法相比，能以更高精度定量地确定乳癌细胞。采用本发明的组织染色方法，癌细胞的核内非特异性的PAR1的信号基本不被检测，认为这是合适地除去自身荧光、并且利用明灭性来确定真正的量子点荧光粒子的本发明的技术特征带来的。
本发明的判定方法可有效用于下述情形，例如，使用检测乳癌标志物因子的PAR1抗体作为经量子点荧光粒子标记的抗体，求出每1细胞的通过PAR1抗体检测出的荧光粒子数，以该数为指标，进行乳癌癌症发病或癌症发病风险的病理诊断。

Claims (15)

1.一种癌症发病或癌症发病风险的判定方法，其特征在于，使用包括下述工序(a)～(d)的组织染色方法，
工序(a)，用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；
工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；
工序(c)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；
工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。
2.如权利要求1所述的判定方法，其特征在于，癌症的增殖控制因子或转移控制因子是PAR1，所述PAR1是蛋白酶活化受体1。
3.如权利要求1或2所述的判定方法，其特征在于，癌症为乳癌。
4.如权利要求1～3中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在100nm以内。
5.如权利要求1～4中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域。
6.如权利要求1～5中任一项所述的判定方法，其特征在于，激发光的波长为400～700nm。
7.如权利要求1～6中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质为荧光粒子。
8.如权利要求7所述的判定方法，其特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
9.如权利要求7或8所述的判定方法，其特征在于，进一步包括下述工序(e)～(g)，
工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；
工序(f)，基于荧光图像，确定1粒子的荧光粒子，计算测量对应于该1粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；
工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每1个细胞的荧光粒子数。
10.如权利要求9所述的判定方法，其特征在于，利用荧光粒子具有的明灭性，来确定1粒子的荧光粒子。
11.一种癌症发病或癌症发病风险的判定系统，其特征在于，包括以下(A)～(D)，
(A)经荧光物质标记的识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体；
(B)激发光照射装置；
(C)获得荧光图像的装置；
(D)用于获得荧光图像的带通滤波器。
12.如权利要求11所述的判定系统，其特征在于，识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体为PAR1，所述PAR1是蛋白酶活化受体1。
13.如权利要求11或12所述的判定系统，其特征在于，进一步包括(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器。
14.如权利要求11～13中任一项所述的判定系统，其特征在于，荧光物质为荧光粒子。
15.如权利要求14所述的判定系统，其特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
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