JPH08334466A - 蛍光測光方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 スライドガラスに対する標本の相対的な位置
が蛍光染色の前後でずれたような場合でも、標本像同士
を容易に位置合わできる手段を提供する。 【構成】 標本２の自家蛍光を測光した後、標本２を蛍
光染色してその蛍光を測光し、染色後の蛍光の測光値か
ら自家蛍光の測光値を減算することにより前記標本の蛍
光測光値を求める方法において、自家蛍光の測光時にお
ける標本像と、染色後の蛍光の測光時における標本像と
をそれぞれ画像処理して、それら自家蛍光の測光時の標
本像と染色後の蛍光の測光時の標本像とを合致させる処
理のパラメータをパラメータ決定部３７で決定し、その
パラメータを用いて自家蛍光の測光時の標本像と染色後
の蛍光の測光時の標本像とを合致させた後、演算処理部
３８において染色後の蛍光の測光値から自家蛍光の測光
値を減算する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば生物標本中に存
在する物質の定量解析などを行うために、蛍光を測光す
る方法と装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】標本を蛍光染色し、蛍光染色後において
測光された標本の蛍光から、蛍光染色前において測光さ
れた、標本がもともと有している自家蛍光を減算するこ
とによって、標本の蛍光を測光する方法が知られてい
る。この方法は、例えば標本中に存在している特定の細
胞を定量解析する場合などにおいて、次のようにして実
際に活用されている。即ち、図３に示すように、先ず蛍
光染色を行う前において、顕微鏡のステージ上に配置さ
れたスライドガラス１の上に載置された標本２に励起光
を照射して蛍光を測光し、標本がもともと有している蛍
光（自家蛍光）の測光値を得る。次に、顕微鏡のステー
ジからスライドガラス１を一旦取り外し、標本２に含ま
れている所望の細胞に特異的に反応する蛍光物質を付け
る操作を行う（この蛍光物質を付ける操作を「蛍光染
色」という）。そして、蛍光染色後において、再び顕微
鏡のステージ上にスライドガラス１を配置し、標本２に
励起光を照射して蛍光物質の蛍光を測光し、その測光値
を得る。そして、蛍光物質の蛍光測光値から自家蛍光の
測光値を減算し、得られた値で標本２に含まれている所
望の細胞を定量解析する。この方法を利用することによ
って、透過観察では見ることが困難な細胞なども定量解
析できるようになる。

【０００３】ところで、以上のように蛍光物質の蛍光測
光値から自家蛍光の測光値を減算するに際しては、蛍光
染色の前後において測光される標本像同士を位置合わせ
し、蛍光染色前に測光した標本像と蛍光染色後に測光し
た標本像とを同じ位置に重ね合わせることが必要であ
る。蛍光染色前後の標本像同士が位置ずれしていては、
正確な減算を行うことができず、精度の高い定量解析は
行うことはできない。そこで従来は、図３に示すように
スライドガラス１の表面の数カ所にマーク３を記載し、
蛍光染色の前後において顕微鏡のステージ上にこれらマ
ーク３が同じ位置に来るようにスライドガラス１を配置
することにより、位置合わせを行っている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来のようにスライド
ガラス１に記載されたマーク３を用いて位置合わせをす
る方法は、図３に示すように、スライドガラス１に対す
る標本２の相対的な位置が蛍光染色の前後において一定
である場合は問題ない。しかし、図４に示すように、ス
ライドガラス１に対する標本２の相対的な位置が蛍光染
色の際に移動してしまったような場合は、この従来方法
では、蛍光染色前後の標本像同士を一致させることは、
もはや不可能となる。蛍光染色前後の標本像同士を一致
させなければ、正確な自家蛍光値の減算は困難となり、
その結果、標本中の部位によっては、蛍光測光による定
量解析ができなくなるという問題があった。

【０００５】本発明は上記の課題に鑑み、スライドガラ
スに対する標本の相対的な位置が蛍光染色の前後でずれ
たような場合でも、標本像同士を容易に位置合わせでき
る手段を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、標本の
自家蛍光を測光した後、前記標本を蛍光染色してその蛍
光を測光し、染色後の蛍光の測光値から自家蛍光の測光
値を減算することにより前記標本の蛍光測光値を求める
方法において、前記自家蛍光の測光時における標本像
と、前記染色後の蛍光の測光時における標本像とをそれ
ぞれ画像処理して、それら自家蛍光の測光時の標本像と
染色後の蛍光の測光時の標本像とを合致させる処理のパ
ラメータを決定し、前記パラメータを用いて自家蛍光の
測光時の標本像と染色後の蛍光の測光時の標本像とを合
致させた後、染色後の蛍光の測光値から自家蛍光の測光
値を減算することを特徴とする蛍光測光方法が提供され
る。

【０００７】この方法において、前記パラメータは、前
記自家蛍光の測光時の標本像を形成するピクセルと、前
記染色後の蛍光の測光時の標本像を形成するピクセルと
を合致させる座標変換とすることができる。また、前記
自家蛍光の測光時における標本像と、前記染色後の蛍光
の測光時における標本像とをそれぞれ画像処理する際、
前記標本から放射される蛍光よりも長い波長の光を前記
標本に照射することにより、それぞれの標本像を得るこ
とができる。

【０００８】また本発明によれば、標本に励起光を照射
する照明手段と、前記標本を撮像すると共に標本から放
出された蛍光を測光する測光手段を備えた蛍光測光装置
において、前記標本を蛍光染色する前後において、前記
標本の像を取得して画像処理する画像処理手段と、前記
画像処理手段によって画像処理された、前記蛍光染色す
る前の標本像と前記蛍光染色した後の標本像とを合致さ
せる処理のパラメータを決定するパラメータ決定手段
と、前記パラメータを用いて、前記測光手段によって得
られる前記蛍光染色する前の測光時の標本像と前記蛍光
染色した後の蛍光の測光時の標本像とを合致させた後、
前記測光手段によって測光した前記蛍光染色した後の蛍
光の測光値から前記蛍光染色する前の測光時の測光値を
減算する演算手段を備えていることを特徴とする蛍光測
光装置が提供される。

【０００９】この蛍光測光装置において、前記パラメー
タは、前記一方の像を形成するピクセルと、前記他方の
像を形成するピクセルとを合致させる座標変換とするこ
とができる。また、前記画像処理手段は、前記標本から
放射される蛍光よりも波長の長い光を前記標本に対して
照射する照射系と、前記標本からの光を受光する受光系
とを有する構成とすることができる。

【００１０】

【作用】本発明では、蛍光染色前において標本の自家蛍
光を測光するときに、同時に標本像を得る。また、蛍光
染色後において標本の自家蛍光を測光するときにも、同
時に標本像を得る。そして、これら自家蛍光の測光時に
おける標本像と染色後の蛍光の測光時における標本像と
をそれぞれ画像処理し、それら標本像を合致させる処理
のパラメータを決定する。そして、そのパラメータを用
いて自家蛍光の蛍光像と染色後の蛍光像とを合致させた
後、染色後の蛍光の測光値から自家蛍光の測光値を減算
する。

【００１１】

【実施例】図１は、本発明の一実施例にかかる蛍光測光
装置の主として光学的構成を示す構成図である。図１に
おいて、光源１０は短波長の励起光１１を射出する。励
起光１１の光路には、標本を励起させるために必要な特
定の波長の光のみを選択して透過する励起フィルタ１２
が配置されている。例えば、細胞内のＤＮＡ量を測定す
るには、代表的な蛍光試薬としてＤＡＰＩ等が知られて
おり、この場合は、励起フィルタによって波長が３５０
〜３６０ｎｍ程度の励起光１１を選択して透過させる。
励起フィルタ１２を配置しているので、光源１０には、
例えばキセノンランプ、水銀ランプなども用いることが
できる。励起フィルタ１２によって波長選択された励起
光１１の光路にはリレーレンズ１３、光軸に対して４５
゜傾斜して配置されたダイクロイックミラー１４、リレ
ーレンズ１５、光軸に対して４５゜傾斜して配置された
ダイクロイックミラー１６、および対物レンズ１７が順
次配置されている。ダイクロイックミラー１４は、励起
光１１は透過するが、標本２から発した蛍光２０は反射
する。また、ダイクロイックミラー１６は、励起光１１
および標本２から発した蛍光２０は反射するが、後述す
る透過光２６は透過する。そして、ステージ１８上に標
本２が載置されており、光源１０で射出され対物レンズ
１７で集光された励起光１１が標本２にビームスポット
となって照射されている。

【００１２】励起光１１に励起され、標本２から発せら
れた蛍光２０の光路は、励起光１１の光路を一部逆進
し、ダイクロイックミラー１４で反射する。先にも示し
たように、例えばＤＮＡ量の測定を行う場合であれば、
励起光の照射によってＤＡＰＩは波長４６０〜ｎｍの蛍
光を発する。ダイクロイックミラー１４で反射した後の
蛍光２０の光路には集光レンズ２１が配置されている。
そして、集光レンズ２１で集光された蛍光２０が蛍光検
出器２２にビームスポットとなって入光している。蛍光
検出器２２は蛍光２０を検出して電気信号を出力する光
電変換素子を備え、その出力した電気信号を画像処理し
てモニタ２３に蛍光像として映し出す。

【００１３】一方、光源２５は透過照明用の長波長の透
過光２６を射出する。光源２５には、例えばハロゲンラ
ンプを用いることができる。また、観察の目的によって
は他のキセノンランプ等も使用できる。透過光２６の光
路には、励起光１１および蛍光２０よりも長い波長の光
のみを選択して透過する励起フィルタ２７が配置されて
いる。このバンドパフィルタ２７によって波長選択され
た透過光２６が対物レンズ２８で集光されて標本２にビ
ームスポットとなって照射されている。バンドパスフィ
ルタ２７を透過する透過光２６は、例えば波長が５８０
ｎｍ程度以上の橙黄色乃至赤色光又は近赤外線である。

【００１４】標本２を透過した透過光２６の光路は、蛍
光２０と同様に励起光１１の光路を一部逆進し、ダイク
ロイックミラー１６を透過してミラー２９で反射する。
ミラー２９で反射した後の透過光２６の光路には集光レ
ンズ３０が配置されている。そして、集光レンズ３０で
集光された透過光２６が透過光検出器３１にビームスポ
ットとなって入光している。透過光検出器３１は透過光
２６を検出して電気信号を出力する光電変換素子を備
え、その出力した電気信号を画像処理してモニタ２３に
標本像として映し出す。

【００１５】そして、モニタ２３の背部には、第一メモ
リ３５および第二メモリ３６と、パラメータ決定部３７
と、演算処理部３８を備えている。図２をもとにして、
これらの機能を説明すると、第一メモリ３５は、蛍光染
色を行う前の標本２から発せられ、蛍光検出器２２によ
って測光されて、モニタ２３に映し出された蛍光２０の
測光値４０を各ピクセル毎に記憶する。一方、第二メモ
リ３６は、蛍光染色を行った後において標本２から発せ
られ、蛍光検出器２２によって測光されて、モニタ２３
に映し出された蛍光２０の測光値４１を各ピクセル毎に
記憶する。

【００１６】パラメータ決定部３７には、蛍光染色を行
う前の標本２の蛍光２０（自家蛍光）の測光時において
透過光検出器３１で測光された標本像の位置データ４２
と、蛍光染色を行った後の標本２の蛍光２０の測光時に
おいて透過光検出器３１で測光された標本像の位置デー
タ４３とが、それぞれ入力される。これにより、パラメ
ータ決定部３７は、それら自家蛍光２０の測光時の標本
像の位置と染色後の蛍光２０の測光時の標本像の位置を
把握し、自家蛍光２０の測光時の標本像を染色後の蛍光
２０の測光時の標本像に合致させる処理のパラメータを
決定する。このパラメータ決定部３７によって決定され
る処理のパラメータは、例えば、染色後の蛍光２０の測
光時の標本像を形成するピクセルを、自家蛍光２０の測
光時の（染色前の）標本像を形成するピクセルに合致さ
せるアドレスの座標変換である。

【００１７】また、パラメータ決定部３７には、先の第
二メモリ３６に記憶した染色後の蛍光２０の測光値４１
が各ピクセル毎にそれぞれ入力される。そして、パラメ
ータ決定部３７では、先に決定したパラメータを用いて
染色後の蛍光２０の測光値４１について座標変換を行
い、染色後の蛍光像を形成するピクセルを、自家蛍光の
蛍光像を形成するピクセルに合致させる処理を行う。こ
うして、パラメータ決定部３７に入力された染色後の蛍
光２０の測光値４１は、この処理を経て、測光値４１’
となってパラメータ決定部３７から出力される。

【００１８】演算処理部３８には、先の第一メモリ３５
に記憶した自家蛍光２０の測光値と、先のパラメータ決
定部３７で処理され出力された測光値４１’が入力され
る。そして、自家蛍光２０の測光値から、パラメータ決
定部３７で処理された染色後の蛍光２０の測光値４１’
を各ピクセル毎に減算する。次に、この実施例の蛍光測
光装置の動作について説明する。先ず、蛍光染色を行う
前の標本２をステージ１８に載置し、光源１０で射出し
た励起光１１を照射する。そして、標本２から発した蛍
光２０（自家蛍光）を蛍光検出器２２に入光させる。こ
れにより、モニタ２３に蛍光像が映し出され、第一メモ
リ３５に自家蛍光の測光値４０が蛍光像の各ピクセル毎
に記憶される。また、光源２５で射出した透過光２６を
ステージ１８上の標本２に照射する。そして、標本２を
透過した透過光２６を透過光検出器３１に入光させる。
これにより、モニタ２３に標本像が映し出され、自家蛍
光の測光時における標本像の位置データ４２がパラメー
タ決定部３７に入力されて、自家蛍光の測光時における
標本像の位置が把握される。

【００１９】自家蛍光の測光および自家蛍光の測光時に
おける標本像の位置の把握が終了したら、次に、観察者
は標本２をステージ１８から一旦取り外し、標本２に含
まれている所望の細胞に特異的に反応する蛍光物質を付
けるための蛍光染色を行う。そして、蛍光染色後、再び
顕微鏡のステージ１８上に標本２を載置する。そして、
再び光源１０で射出した励起光１１を照射し、標本２か
ら発した蛍光２０を蛍光検出器２２に入光させる。これ
により、モニタ２３に蛍光像が映し出され、第二メモリ
３６に蛍光染色後の蛍光の測光値４１が蛍光像の各ピク
セル毎に記憶される。また、光源２５で射出した透過光
２６をステージ１８上の標本２に照射する。そして、標
本２を透過した透過光２６を透過光検出器３１に入光さ
せる。これにより、モニタ２３に標本像が映し出され、
蛍光染色後の蛍光の測光時における標本像の位置データ
４３がパラメータ決定部３７に入力されて、蛍光染色後
の蛍光の測光時における標本像の位置が把握される。

【００２０】パラメータ決定部３７は、こうして位置を
把握した自家蛍光の測光時の標本像と染色後の蛍光の測
光時の標本像を合致させる処理のパラメータを決定す
る。このパラメータは、例えば、染色後の蛍光の測光時
の標本像を形成するピクセルを、自家蛍光の測光時の標
本像を形成するピクセルに合致させるアドレスの座標変
換である。そして、パラメータ決定部３７は、そのパラ
メータを用いて、染色後の蛍光像を形成するピクセル
を、自家蛍光の蛍光像を形成するピクセルに合致させる
処理を行い、処理済みの測光値４１’を出力する。

【００２１】そして、演算処理部３８において、自家蛍
光の測光値から、パラメータ決定部３７で処理された染
色後の蛍光の測光値４１’を各ピクセル毎に減算する。
かくして、蛍光染色前後の標本像同士を一致させるパラ
メータを用いて染色後の蛍光像を形成するピクセルを、
自家蛍光の蛍光像を形成するピクセルに正確に合致させ
て減算を行うことができるようになり、測定精度が向上
する。

【００２２】なお、以上の実施例では長波長の透過光２
６を射出するための光源２５を、励起光１１を射出する
光源１０とは別に設けた例を説明した。しかし、蛍光染
色前後において標本像を一致させるパラメータを決定す
るためには、少なくとも蛍光染色前後において標本の位
置さえ取得できれば足り、標本像を得るために用いる光
の波長は特に赤外光などの長波長に限定しなくてもよ
い。例えば、実施例で説明したような光源２５は省略
し、蛍光染色の前後において標本２の蛍光を測光する際
に、光源１０から標本２に照射した励起光１１のうち標
本２を透過した光を利用して標本像を得て、それぞれの
標本像を合致させるための処理のパラメータを決定する
構成とすることもできる。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、染色後の蛍光像を形成
するピクセルを自家蛍光の蛍光像を形成するピクセルに
正確に合致させて減算できるので、定量解析などの測定
精度を向上させることができる。染色前後における標本
像を一致させるためのパラメータを決定するには、蛍光
測光と同時に透過像を取得するようにすれば、標本の画
像取得をする回数は最低二回で足りる。また、染色前後
における標本の位置合わせに蛍光像ではなく透過像を用
いているので、自家蛍光の輝度分布や染色後の標本の蛍
光輝度分布と無関係に、純粋に標本の位置合わせを行う
ことができる。

【００２４】なお、標本像を取得するために標本に照射
する光の波長はどのようなものでも良いが、例えば近赤
外線などのように、標本から放射される蛍光よりも長い
波長の光を用いて標本像を取得するようにすれば、標本
を染色した蛍光色素などを褪色させることが少なく、蛍
光測光に影響を及ぼさない。この場合、蛍光測光と標本
像の画像処理とを同時に行うこともできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例にかかる蛍光測光装置の構成図
である。

【図２】実施例にかかる蛍光測光装置の動作を説明する
フロー図である。

【図３】従来技術の説明図である。

【図４】従来技術の問題点の説明図である。

【符号の説明】

２ 標本 １０ 光源 １１ 励起光 １４、１６ ダイクロイックミラー １８ ステージ ２０ 蛍光 ２２ 蛍光検出器 ２３ モニタ ２５ 光源 ２６ 透過光 ３１ 透過光検出器 ３５ 第一メモリ ３６ 第二メモリ ３７ パラメータ決定部 ３８ 演算処理部

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標本の自家蛍光を測光した後、前記標本
   を蛍光染色してその蛍光を測光し、染色後の蛍光の測光
   値から自家蛍光の測光値を減算することにより前記標本
   の蛍光測光値を求める方法において、 前記自家蛍光の測光時における標本像と、前記染色後の
   蛍光の測光時における標本像とをそれぞれ画像処理し
   て、それら自家蛍光の測光時の標本像と染色後の蛍光の
   測光時の標本像とを合致させる処理のパラメータを決定
   し、 前記パラメータを用いて自家蛍光の測光時の標本像と染
   色後の蛍光の測光時の標本像とを合致させた後、染色後
   の蛍光の測光値から自家蛍光の測光値を減算することを
   特徴とする、蛍光測光方法。
2. 【請求項２】 前記パラメータは、前記自家蛍光の測光
   時の標本像を形成するピクセルと、前記染色後の蛍光の
   測光時の標本像を形成するピクセルとを合致させる座標
   変換である、請求項１に記載の蛍光測光方法。
3. 【請求項３】 前記自家蛍光の測光時における標本像
   と、前記染色後の蛍光の測光時における標本像とをそれ
   ぞれ画像処理する際、前記標本から放射される蛍光より
   も長い波長の光を前記標本に照射することにより、それ
   ぞれの標本像を得ることを特徴とする請求項１又は２に
   記載の蛍光測光方法。
4. 【請求項４】 標本に励起光を照射する照明手段と、前
   記標本を撮像すると共に標本から放出された蛍光を測光
   する測光手段を備えた蛍光測光装置において、 前記標本を蛍光染色する前後において、前記標本の像を
   取得して画像処理する画像処理手段と、 前記画像処理手段によって画像処理された、前記蛍光染
   色する前の標本像と前記蛍光染色した後の標本像とを合
   致させる処理のパラメータを決定するパラメータ決定手
   段と、 前記パラメータを用いて、前記測光手段によって得られ
   る前記蛍光染色する前の測光時の標本像と前記蛍光染色
   した後の蛍光の測光時の標本像とを合致させた後、前記
   測光手段によって測光した前記蛍光染色した後の蛍光の
   測光値から前記蛍光染色する前の測光時の測光値を減算
   する演算手段を備えていることを特徴とする、蛍光測光
   装置。
5. 【請求項５】 前記パラメータは、前記一方の像を形成
   するピクセルと、前記他方の像を形成するピクセルとを
   合致させる座標変換である、請求項４に記載の蛍光測光
   装置。
6. 【請求項６】 前記画像処理手段は、前記標本から放射
   される蛍光よりも波長の長い光を前記標本に対して照射
   する照射系と、前記標本からの光を受光する受光系とを
   有することを特徴とする請求項４又は５に記載の蛍光測
   光装置。