JPH11258512A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents
蛍光顕微鏡Info
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- JPH11258512A JPH11258512A JP10078555A JP7855598A JPH11258512A JP H11258512 A JPH11258512 A JP H11258512A JP 10078555 A JP10078555 A JP 10078555A JP 7855598 A JP7855598 A JP 7855598A JP H11258512 A JPH11258512 A JP H11258512A
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- light
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 励起光の正確な計測が可能な蛍光顕微鏡を提
供すること。 【解決手段】 レーザ光源１１からの励起光ＥＬは、制
御装置３０によって所望の強度に調節されてピント面１
８上に投影される。ピント面１８上に投影された励起光
ＥＬは、走査光学系１４によってサンプルＳＰ上で走査
される。試料本体１７から発生した蛍光は、対物レンズ
１５を逆行し、検出器２３にて検出される。制御装置３
０は、検出器２３の検出信号と走査光学系１４の制御信
号とに基づいて、試料本体１７のピント面１８における
蛍光画像を作成する。励起光ＥＬのうち顕微鏡ステージ
２０上の観察位置を透過した通過光ＰＬは、コンデンサ
レンズ２４によって集光され、検出器２６によって検出
される。検出器２６の検出出力は、制御装置３０に入力
されて、顕微鏡ステージ２０上の観察位置に照射される
励起光ＥＬの強度を調節するためモニタ信号として利用
されたり、サンプルＳＰの透過画像の作成に利用され
る。
供すること。 【解決手段】 レーザ光源１１からの励起光ＥＬは、制
御装置３０によって所望の強度に調節されてピント面１
８上に投影される。ピント面１８上に投影された励起光
ＥＬは、走査光学系１４によってサンプルＳＰ上で走査
される。試料本体１７から発生した蛍光は、対物レンズ
１５を逆行し、検出器２３にて検出される。制御装置３
０は、検出器２３の検出信号と走査光学系１４の制御信
号とに基づいて、試料本体１７のピント面１８における
蛍光画像を作成する。励起光ＥＬのうち顕微鏡ステージ
２０上の観察位置を透過した通過光ＰＬは、コンデンサ
レンズ２４によって集光され、検出器２６によって検出
される。検出器２６の検出出力は、制御装置３０に入力
されて、顕微鏡ステージ２０上の観察位置に照射される
励起光ＥＬの強度を調節するためモニタ信号として利用
されたり、サンプルＳＰの透過画像の作成に利用され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、励起光を照射した
試料の蛍光像を検出する蛍光顕微鏡に関する。
試料の蛍光像を検出する蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光顕微鏡では、例えば観察下の細胞内
で起こる変化を経時的に変化する現象の画像として解析
する所謂顕微鏡画像解析実験が行われる。このような顕
微鏡画像解析実験おいては、複数回の実験を繰返して行
うことことが一般的である。その際、蛍光顕微鏡側で種
々の条件を予め設定して、このような条件設定の下で実
験に再現性を持たせることが重要になる。
で起こる変化を経時的に変化する現象の画像として解析
する所謂顕微鏡画像解析実験が行われる。このような顕
微鏡画像解析実験おいては、複数回の実験を繰返して行
うことことが一般的である。その際、蛍光顕微鏡側で種
々の条件を予め設定して、このような条件設定の下で実
験に再現性を持たせることが重要になる。
【０００３】例えば光走査型顕微鏡を用いて生きている
細胞試料を蛍光観察の対象とする場合、観察のために照
射する走査光（励起光）によって、試料を蛍光可視化す
るための蛍光色素の光退色のみならず、細胞試料自身に
対する光障害が現実的な問題となってしまう。つまり、
光走査型顕微鏡を用いた顕微鏡画像解析実験において、
試料に照射する励起光の光量等の条件設定を適切に行う
ことが、再現性のある結果を得るための必須の前提とな
る。
細胞試料を蛍光観察の対象とする場合、観察のために照
射する走査光（励起光）によって、試料を蛍光可視化す
るための蛍光色素の光退色のみならず、細胞試料自身に
対する光障害が現実的な問題となってしまう。つまり、
光走査型顕微鏡を用いた顕微鏡画像解析実験において、
試料に照射する励起光の光量等の条件設定を適切に行う
ことが、再現性のある結果を得るための必須の前提とな
る。
【０００４】従来は、このような励起光の条件設定が、
光源から対物レンズまでの間の所謂中間光学系に光セン
サ等の光量モニタを導入し、この光量モニタの出力に基
づいて励起光の光量を調整することによって行われてい
た。
光源から対物レンズまでの間の所謂中間光学系に光セン
サ等の光量モニタを導入し、この光量モニタの出力に基
づいて励起光の光量を調整することによって行われてい
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のような
構成での光量モニタ及び光量の調整では、以下のような
間題がある。
構成での光量モニタ及び光量の調整では、以下のような
間題がある。
【０００６】（１）励起光の光量モニタとして受光面が
大きなものを用いることは、光学系を含む装置自体の大
型化につながってしまうので、小さな受光面を持つもの
（ＳＰＤ等）を使用することが望ましい。しかし、受光
面の小さな光量モニタを用いた場合、例えば光源から対
物レンズに至る中間光学系の各光学素子の微妙な位置ズ
レや変更、或いは光学素子自身の劣化等の影響が大きく
なり、必ずしも高い精度で光量をモニタすることができ
なかった。
大きなものを用いることは、光学系を含む装置自体の大
型化につながってしまうので、小さな受光面を持つもの
（ＳＰＤ等）を使用することが望ましい。しかし、受光
面の小さな光量モニタを用いた場合、例えば光源から対
物レンズに至る中間光学系の各光学素子の微妙な位置ズ
レや変更、或いは光学素子自身の劣化等の影響が大きく
なり、必ずしも高い精度で光量をモニタすることができ
なかった。
【０００７】（２）光源から複数の波長の励起光が出射
する場合、検出感度のダイナミックレンジの限界から、
必ずしも同一の検出器ですべての励起光を検出可能とは
限らない。上記のような小型化の要求から複数の検出器
を切換可能に構成することも難しかった。
する場合、検出感度のダイナミックレンジの限界から、
必ずしも同一の検出器ですべての励起光を検出可能とは
限らない。上記のような小型化の要求から複数の検出器
を切換可能に構成することも難しかった。
【０００８】（３）光源から試料にかけての所謂光源側
の分割光を利用して励起光の光量をモニタするために、
試料に照射される励起光のロスが否めなかった。
の分割光を利用して励起光の光量をモニタするために、
試料に照射される励起光のロスが否めなかった。
【０００９】（４）光源側の分割光を利用する際に、こ
の分割光が対物レンズに入射する励起光と干渉してしま
う危険性がある。これは直接顕微鏡画像に影響するの
で、干渉回避のための調整に難を要した。
の分割光が対物レンズに入射する励起光と干渉してしま
う危険性がある。これは直接顕微鏡画像に影響するの
で、干渉回避のための調整に難を要した。
【００１０】（５）対物レンズまでの間で励起光を分割
してその強度を測定することから、対物レンズ下すなわ
ち試料面上での励起光の絶対強度を見積もることが難し
かった。
してその強度を測定することから、対物レンズ下すなわ
ち試料面上での励起光の絶対強度を見積もることが難し
かった。
【００１１】そこで、本発明は、励起光のロスが少な
く、調整が容易で、試料面上での絶対強度を見積もるこ
とが容易な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
く、調整が容易で、試料面上での絶対強度を見積もるこ
とが容易な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１２】また、本発明は、励起光の光量モニタの受
光面が小さな場合であっても、励起光の正確な計測が可
能な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
光面が小さな場合であっても、励起光の正確な計測が可
能な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１３】また、本発明は、光源から複数の波長の励
起光が出射する場合であっても、励起光の正確な計測が
可能な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
起光が出射する場合であっても、励起光の正確な計測が
可能な蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の蛍光顕微鏡は、励起光を発生する光源と、
前記光源からの前記励起光を対物レンズを介して観察位
置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光
の照射により前記試料から発する蛍光を取得して試料像
を得る観察系と、前記試料を前記観察位置から退避させ
た状態で当該観察位置を通過した励起光の強度を検出す
る強度検出装置とを備えることを特徴とする。
め、本発明の蛍光顕微鏡は、励起光を発生する光源と、
前記光源からの前記励起光を対物レンズを介して観察位
置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光
の照射により前記試料から発する蛍光を取得して試料像
を得る観察系と、前記試料を前記観察位置から退避させ
た状態で当該観察位置を通過した励起光の強度を検出す
る強度検出装置とを備えることを特徴とする。
【００１５】また、好ましい態様では、前記強度検出装
置の検出信号に基づいて前記光源から発生させる励起光
の強度を調整する調整装置をさらに備えることを特徴と
する。
置の検出信号に基づいて前記光源から発生させる励起光
の強度を調整する調整装置をさらに備えることを特徴と
する。
【００１６】また、好ましい態様では、前記試料を透過
した励起光の一部分を分割する分割装置と、当該分割装
置によって分割された前記励起光の一部分を検出して前
記試料の透過像を得る透過像検出装置とをさらに備える
ことを特徴とする。
した励起光の一部分を分割する分割装置と、当該分割装
置によって分割された前記励起光の一部分を検出して前
記試料の透過像を得る透過像検出装置とをさらに備える
ことを特徴とする。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本発明に係る蛍光顕微鏡の
一実施形態である光走査型顕微鏡を図面を参照しつつ説
明する。
一実施形態である光走査型顕微鏡を図面を参照しつつ説
明する。
【００１８】図１は、光走査型顕微鏡の概略構成図であ
る。この光走査型顕微鏡は、励起光ＥＬ含む所定波長の
光を発生するレーザ光源１１と、特定波長の励起光ＥＬ
を選択する波長選択フィルタ１２と、サンプルＳＰに照
射する励起光ＥＬとサンプルＳＰから発生する蛍光とを
分離するためのビームスプリッタ１３と、励起光ＥＬを
サンプルＳＰ位置でＸ−Ｙ方向に走査するための走査光
学系１４と、励起光ＥＬをサンプルＳＰ位置に集光する
対物レンズ１５と、サンプルＳＰを支持して３次元に移
動可能な顕微鏡ステージ２０と、サンプルＳＰから発生
して対物レンズ１５及び走査光学系１４を逆行してビー
ムスプリッタ１３を透過した蛍光を集光する集光レンズ
２１と、共焦点効果を発生するピンホール２２と、ピン
ホール２２を通過した蛍光のみを検出する検出器２３と
を備える。
る。この光走査型顕微鏡は、励起光ＥＬ含む所定波長の
光を発生するレーザ光源１１と、特定波長の励起光ＥＬ
を選択する波長選択フィルタ１２と、サンプルＳＰに照
射する励起光ＥＬとサンプルＳＰから発生する蛍光とを
分離するためのビームスプリッタ１３と、励起光ＥＬを
サンプルＳＰ位置でＸ−Ｙ方向に走査するための走査光
学系１４と、励起光ＥＬをサンプルＳＰ位置に集光する
対物レンズ１５と、サンプルＳＰを支持して３次元に移
動可能な顕微鏡ステージ２０と、サンプルＳＰから発生
して対物レンズ１５及び走査光学系１４を逆行してビー
ムスプリッタ１３を透過した蛍光を集光する集光レンズ
２１と、共焦点効果を発生するピンホール２２と、ピン
ホール２２を通過した蛍光のみを検出する検出器２３と
を備える。
【００１９】また、この光走査型顕微鏡は、サンプルＳ
Ｐに照射される励起光ＥＬの強度を検出するための強度
検出装置として、サンプルＳＰが配置される顕微鏡ステ
ージ２０上の観察位置を挟んで対物レンズ１５の反対側
に配置されるコンデンサレンズ２４と、観察位置を通過
してコンデンサレンズ２４によって集められた励起光Ｅ
Ｌを光電変換して検出する検出器２６とを備える。ここ
で、検出器２６の受光面は、コンデンサレンズ２４に関
しサンプルＳＰ中のピント面１８と光学的に共役な位置
に配置されている。
Ｐに照射される励起光ＥＬの強度を検出するための強度
検出装置として、サンプルＳＰが配置される顕微鏡ステ
ージ２０上の観察位置を挟んで対物レンズ１５の反対側
に配置されるコンデンサレンズ２４と、観察位置を通過
してコンデンサレンズ２４によって集められた励起光Ｅ
Ｌを光電変換して検出する検出器２６とを備える。ここ
で、検出器２６の受光面は、コンデンサレンズ２４に関
しサンプルＳＰ中のピント面１８と光学的に共役な位置
に配置されている。
【００２０】なお、サンプルＳＰは、例えば蛍光色素で
染色されている試料本体１７と、試料本体１７を支持す
るスライドグラス１９と、試料本体１７上に載置される
カバーグラス１６とから構成されている。
染色されている試料本体１７と、試料本体１７を支持す
るスライドグラス１９と、試料本体１７上に載置される
カバーグラス１６とから構成されている。
【００２１】制御装置３０は、走査光学系１４を駆動し
つつ検出器２３の検出信号を読み取って試料本体１７の
ピント面１８における蛍光画像を構成する。また、制御
装置３０は、検出器２６の検出出力に基づいてレーザ光
源１１の出力を制御し、サンプルＳＰが配置される顕微
鏡ステージ２０上の観察位置に照射される励起光ＥＬの
強度を予め設定された強度に調節する。なお、レーザ光
源１１自体の出力を制御する代わりに、レーザ光源１１
と波長選択フィルタ１２との間等に調光フィルタを介在
させて励起光ＥＬの強度を調節することもできる。励起
光の強度は、操作者が予め制御装置に対して任意の値に
設定することができる。
つつ検出器２３の検出信号を読み取って試料本体１７の
ピント面１８における蛍光画像を構成する。また、制御
装置３０は、検出器２６の検出出力に基づいてレーザ光
源１１の出力を制御し、サンプルＳＰが配置される顕微
鏡ステージ２０上の観察位置に照射される励起光ＥＬの
強度を予め設定された強度に調節する。なお、レーザ光
源１１自体の出力を制御する代わりに、レーザ光源１１
と波長選択フィルタ１２との間等に調光フィルタを介在
させて励起光ＥＬの強度を調節することもできる。励起
光の強度は、操作者が予め制御装置に対して任意の値に
設定することができる。
【００２２】以下、図１の装置の動作について説明す
る。レーザ光源１１からの励起光ＥＬは、制御装置３０
によって所望の強度に調節されてピント面１８上に集光
される。ピント面１８上に集光された励起光ＥＬは、走
査光学系１４によってサンプルＳＰ上をＸ−Ｙ方向に２
次元的に走査される。試料本体１７から発生した蛍光
は、対物レンズ１５、走査光学系１４及びビームスプリ
ッタ１３を逆行し、集光レンズ２１によって集光され、
ピンホール２２を通過して検出器２３にて検出される。
制御装置３０は、検出器２３の検出信号と走査光学系１
４の制御信号とに基づいて、試料本体１７のピント面１
８における蛍光画像を作成する。なお、ここまでの光路
で励起光ＥＬの強度を検出する検出器２６はどこにも配
置されていない。すなわち、検出器２６は、レーザ光源
１１や、波長選択フィルタ１２、ビームスプリッタ１
３、走査光学系１４及び対物レンズ１５からなる照明光
学系と一切干渉しない。また、検出器２６は、対物レン
ズ１５、走査光学系１４、ビームスプリッタ１３、集光
レンズ２１、ピンホール２２及び検出器２３からなる検
出系とも一切干渉しない。
る。レーザ光源１１からの励起光ＥＬは、制御装置３０
によって所望の強度に調節されてピント面１８上に集光
される。ピント面１８上に集光された励起光ＥＬは、走
査光学系１４によってサンプルＳＰ上をＸ−Ｙ方向に２
次元的に走査される。試料本体１７から発生した蛍光
は、対物レンズ１５、走査光学系１４及びビームスプリ
ッタ１３を逆行し、集光レンズ２１によって集光され、
ピンホール２２を通過して検出器２３にて検出される。
制御装置３０は、検出器２３の検出信号と走査光学系１
４の制御信号とに基づいて、試料本体１７のピント面１
８における蛍光画像を作成する。なお、ここまでの光路
で励起光ＥＬの強度を検出する検出器２６はどこにも配
置されていない。すなわち、検出器２６は、レーザ光源
１１や、波長選択フィルタ１２、ビームスプリッタ１
３、走査光学系１４及び対物レンズ１５からなる照明光
学系と一切干渉しない。また、検出器２６は、対物レン
ズ１５、走査光学系１４、ビームスプリッタ１３、集光
レンズ２１、ピンホール２２及び検出器２３からなる検
出系とも一切干渉しない。
【００２３】一方、励起光ＥＬのうち顕微鏡ステージ２
０上の観察位置を透過した通過光ＰＬは、コンデンサレ
ンズ２４によって集光され、検出器２６によって検出さ
れる。検出器２６の検出出力は、制御装置３０に入力さ
れて、顕微鏡ステージ２０上の観察位置に照射される励
起光ＥＬの強度を調節するためモニタ信号として利用さ
れたり、サンプルＳＰの透過画像の作成に利用される。
０上の観察位置を透過した通過光ＰＬは、コンデンサレ
ンズ２４によって集光され、検出器２６によって検出さ
れる。検出器２６の検出出力は、制御装置３０に入力さ
れて、顕微鏡ステージ２０上の観察位置に照射される励
起光ＥＬの強度を調節するためモニタ信号として利用さ
れたり、サンプルＳＰの透過画像の作成に利用される。
【００２４】以下、図２を参照して、サンプルＳＰに照
射する励起光ＥＬの強度を制御する方法を説明する。
射する励起光ＥＬの強度を制御する方法を説明する。
【００２５】まず、図２（ａ）を参照して、サンプルＳ
Ｐに照射する励起光ＥＬの強度を一定値に制御する方法
を説明する。図示のように、顕微鏡ステージ２０上にサ
ンプルＳＰを載せない状態で通過光ＰＬを検出器２６に
入射させてその出力を測定する。この時の測定値をＡと
して制御装置３０内に設けた記憶装置に保存する。波長
選択フィルタ１２から対物レンズ１５にかけてのいずれ
かの光学素子を変更・交換した場合には、この測定値Ａ
を基準として、サンプルＳＰを観測位置から退避させた
状態で検出器２６の出力が再度測定値Ａを示すようにレ
ーザ光源１１の出力を再調整する。これにより、サンプ
ルＳＰに照射する励起光ＥＬの強度を常に一定に保つこ
とができる。
Ｐに照射する励起光ＥＬの強度を一定値に制御する方法
を説明する。図示のように、顕微鏡ステージ２０上にサ
ンプルＳＰを載せない状態で通過光ＰＬを検出器２６に
入射させてその出力を測定する。この時の測定値をＡと
して制御装置３０内に設けた記憶装置に保存する。波長
選択フィルタ１２から対物レンズ１５にかけてのいずれ
かの光学素子を変更・交換した場合には、この測定値Ａ
を基準として、サンプルＳＰを観測位置から退避させた
状態で検出器２６の出力が再度測定値Ａを示すようにレ
ーザ光源１１の出力を再調整する。これにより、サンプ
ルＳＰに照射する励起光ＥＬの強度を常に一定に保つこ
とができる。
【００２６】次に、図２（ｂ）及び（ｃ）を参照して、
試料本体１７のピント面１８での励起光ＥＬの強度を見
積もる方法を説明する。予め、図１に示すようにサンプ
ルＳＰを顕微鏡ステージ２０に載せた状態で顕微鏡ステ
ージ２０を移動させてピント面１８を試料１７内に設定
しておく。次に、図２（ｂ）に示すように、顕微鏡ステ
ージ２０やサンプルＳＰ自体を水平方向に移動させてス
ライドグラス１９のみでカバーグラス１６及び試料本体
１７が存在しない部位において通過光ＰＬの強度を検出
器で測定する。この際の測定値をＢとし制御装置３０内
の記憶装置に保存する。さらに、図２（ｃ）に示すよう
に、顕微鏡ステージ２０等を再度水平方向に移動させて
カバーグラス１６及びスライドグラス１９のみで試料本
体１７が存在しない部位において通過光ＰＬの強度を検
出器２６で測定する。この際の測定値をＣとし制御装置
３０内の記憶装置に保存する。
試料本体１７のピント面１８での励起光ＥＬの強度を見
積もる方法を説明する。予め、図１に示すようにサンプ
ルＳＰを顕微鏡ステージ２０に載せた状態で顕微鏡ステ
ージ２０を移動させてピント面１８を試料１７内に設定
しておく。次に、図２（ｂ）に示すように、顕微鏡ステ
ージ２０やサンプルＳＰ自体を水平方向に移動させてス
ライドグラス１９のみでカバーグラス１６及び試料本体
１７が存在しない部位において通過光ＰＬの強度を検出
器で測定する。この際の測定値をＢとし制御装置３０内
の記憶装置に保存する。さらに、図２（ｃ）に示すよう
に、顕微鏡ステージ２０等を再度水平方向に移動させて
カバーグラス１６及びスライドグラス１９のみで試料本
体１７が存在しない部位において通過光ＰＬの強度を検
出器２６で測定する。この際の測定値をＣとし制御装置
３０内の記憶装置に保存する。
【００２７】以上のようにして得られた測定値Ａと測定
値Ｂから、スライドグラス１９による励起光の減衰率
（Ａ−Ｂ）／Ａが得られる。また、測定値Ｂと測定値Ｃ
から、カバーグラス１６による励起光の減衰率（Ｂ−
Ｃ）／Ｂが得られる。したがって、試料本体１７のピン
ト面１８における励起光ＥＬの強度の絶対値は、コンデ
ンサレンズの減衰率をαとし、試料本体１７による減光
を無視して、Ａ・（Ｂ−Ｃ）／Ｂ・（１−α）と推測さ
れる。なお、試料本体１７は何らかの溶媒に封入されて
いる場合が多いので、ピント面１８までの励起光ＥＬの
減衰は必ずしも一様であるとは限らない。したがって、
試料本体１７表面からピント面１８までの距離を考慮し
てピント面１８における励起光ＥＬの強度の絶対値を推
定することもできる。
値Ｂから、スライドグラス１９による励起光の減衰率
（Ａ−Ｂ）／Ａが得られる。また、測定値Ｂと測定値Ｃ
から、カバーグラス１６による励起光の減衰率（Ｂ−
Ｃ）／Ｂが得られる。したがって、試料本体１７のピン
ト面１８における励起光ＥＬの強度の絶対値は、コンデ
ンサレンズの減衰率をαとし、試料本体１７による減光
を無視して、Ａ・（Ｂ−Ｃ）／Ｂ・（１−α）と推測さ
れる。なお、試料本体１７は何らかの溶媒に封入されて
いる場合が多いので、ピント面１８までの励起光ＥＬの
減衰は必ずしも一様であるとは限らない。したがって、
試料本体１７表面からピント面１８までの距離を考慮し
てピント面１８における励起光ＥＬの強度の絶対値を推
定することもできる。
【００２８】なお、カバーグラス１６は単体で扱うより
も、試料本体１７及びスライドグラス１９を一体として
サンプルＳＰの形で取り扱った方が一般に取り扱いが楽
であるが、カバーグラス１６単体で扱えるような場合も
ある。このような場合は、図２（ａ）のような状態で検
出器２６の出力を測定してその測定値Ａをピント面１８
における励起光ＥＬの強度の絶対値としても良い。
も、試料本体１７及びスライドグラス１９を一体として
サンプルＳＰの形で取り扱った方が一般に取り扱いが楽
であるが、カバーグラス１６単体で扱えるような場合も
ある。このような場合は、図２（ａ）のような状態で検
出器２６の出力を測定してその測定値Ａをピント面１８
における励起光ＥＬの強度の絶対値としても良い。
【００２９】また、以上では、空気を介して所謂サンプ
ルＳＰを観察する通常の対物レンズ１５を用いる場合に
ついて説明したが、オイルや水といった液浸系の対物レ
ンズを用いる場合も上記同様と同様の方法で励起光ＥＬ
の絶対値を見積もることができる。
ルＳＰを観察する通常の対物レンズ１５を用いる場合に
ついて説明したが、オイルや水といった液浸系の対物レ
ンズを用いる場合も上記同様と同様の方法で励起光ＥＬ
の絶対値を見積もることができる。
【００３０】以上の説明から明らかなように、上記実施
形態の光走査型顕微鏡では、サンプルＳＰを照明する励
起光ＥＬの損失が少ない。また、上記実施形態によれ
ば、励起光ＥＬの強度を簡易に制御することができ、試
料に照射されている励起光ＥＬの絶対強度を見積もるこ
とも可能である。また、上記実施形態によれば、励起光
ＥＬの監視用の検出器２６の受光面の大小に拘わらず、
励起光の正確な計測が可能である。また、レーザ光源１
１から複数の波長の励起光ＥＬが出射する場合であって
も、励起光ＥＬの帯域に応じて検出器２６を選択し或い
は交換することが容易であるので、励起光ＥＬの正確な
計測が可能になる。
形態の光走査型顕微鏡では、サンプルＳＰを照明する励
起光ＥＬの損失が少ない。また、上記実施形態によれ
ば、励起光ＥＬの強度を簡易に制御することができ、試
料に照射されている励起光ＥＬの絶対強度を見積もるこ
とも可能である。また、上記実施形態によれば、励起光
ＥＬの監視用の検出器２６の受光面の大小に拘わらず、
励起光の正確な計測が可能である。また、レーザ光源１
１から複数の波長の励起光ＥＬが出射する場合であって
も、励起光ＥＬの帯域に応じて検出器２６を選択し或い
は交換することが容易であるので、励起光ＥＬの正確な
計測が可能になる。
【００３１】以上、実施形態に即してこの発明を説明し
たが、この発明は上記実施形態に限定されるものではな
い。例えば、試料本体１７が蛍光色素で染色されている
場合、試料本体１７から出射して下方のコンデンサレン
ズ２４で集められる通過光ＰＬの中には、サンプルＳＰ
を透過する励起光のほかに試料本体１７から発生した蛍
光が含まれる。このような蛍光を遮断して透過励起光の
みを観察したい場合には、図３に示されるように、コン
デンサレンズ２４と検出器２６との間に適当な波長選択
フィルタ１２を挿入してこれを通過した透過励起光のみ
を検出器２６によって検出する。前述した試料本体１７
における強度を見積もる際には、この波長選択フィルタ
１２を挿入することによる光量のロスを事前に測定して
おけば良い。
たが、この発明は上記実施形態に限定されるものではな
い。例えば、試料本体１７が蛍光色素で染色されている
場合、試料本体１７から出射して下方のコンデンサレン
ズ２４で集められる通過光ＰＬの中には、サンプルＳＰ
を透過する励起光のほかに試料本体１７から発生した蛍
光が含まれる。このような蛍光を遮断して透過励起光の
みを観察したい場合には、図３に示されるように、コン
デンサレンズ２４と検出器２６との間に適当な波長選択
フィルタ１２を挿入してこれを通過した透過励起光のみ
を検出器２６によって検出する。前述した試料本体１７
における強度を見積もる際には、この波長選択フィルタ
１２を挿入することによる光量のロスを事前に測定して
おけば良い。
【００３２】また、観察位置を通過した通過光ＰＬを検
出するためのコンデンサレンズ２４や検出器２６の配置
構成は、目的や用途に応じて適宜変更することができ
る。例えば、図４に示すように、サンプルＳＰの下方側
にサンプルＳＰから発生した蛍光を画像化するための検
出器２８を配置することもできる。この場合、同図に示
すように、光分割用のハーフミラー２７によって波長選
択フィルタ１２を通過した通過光ＰＬを分割して、一方
の反射光を励起光ＥＬの強度監視用の検出器２６に導
き、他方の透過光を上述のような蛍光検出用の検出器２
８に導くこともできる。また、図１おいてコンデンサレ
ンズ２４を取り除き、検出器２６をステージ２０の直下
に配置することも可能である。この場合、コンデンサレ
ンズ２４による励起光の減衰を考慮する必要がなくな
る。
出するためのコンデンサレンズ２４や検出器２６の配置
構成は、目的や用途に応じて適宜変更することができ
る。例えば、図４に示すように、サンプルＳＰの下方側
にサンプルＳＰから発生した蛍光を画像化するための検
出器２８を配置することもできる。この場合、同図に示
すように、光分割用のハーフミラー２７によって波長選
択フィルタ１２を通過した通過光ＰＬを分割して、一方
の反射光を励起光ＥＬの強度監視用の検出器２６に導
き、他方の透過光を上述のような蛍光検出用の検出器２
８に導くこともできる。また、図１おいてコンデンサレ
ンズ２４を取り除き、検出器２６をステージ２０の直下
に配置することも可能である。この場合、コンデンサレ
ンズ２４による励起光の減衰を考慮する必要がなくな
る。
【００３３】なお、図４の場合において、ハーフミラー
２７に代えて波長選択用のダイクロイックミラーを用い
れば、効果的な光検出が可能になる。また、以上の場合
において、ハーフミラー２７の透過率もしくは反射率を
事前に計測しておけば、レーザ光源１１からの励起光Ｅ
Ｌをキャリブレートすることが可能になる。
２７に代えて波長選択用のダイクロイックミラーを用い
れば、効果的な光検出が可能になる。また、以上の場合
において、ハーフミラー２７の透過率もしくは反射率を
事前に計測しておけば、レーザ光源１１からの励起光Ｅ
Ｌをキャリブレートすることが可能になる。
【００３４】また、上記実施形態では、光走査型顕微鏡
について説明したが、走査を行わないでサンプル上の観
察領域を一度に照明するタイプの蛍光顕微鏡であって
も、上記光走査型顕微鏡の場合と同様に、サンプルに照
射される励起光の強度をある程度の精度で見積もって制
御することができる。
について説明したが、走査を行わないでサンプル上の観
察領域を一度に照明するタイプの蛍光顕微鏡であって
も、上記光走査型顕微鏡の場合と同様に、サンプルに照
射される励起光の強度をある程度の精度で見積もって制
御することができる。
【００３５】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の蛍光顕微鏡によれば、前記試料を観察位置から退避さ
せた状態で当該観察位置を通過した励起光の強度を検出
する強度検出装置を備えるので、前記試料に照射される
励起光の絶対強度を簡易に見積もることができ、励起光
の簡易で正確で効率的な計測が可能になる。
の蛍光顕微鏡によれば、前記試料を観察位置から退避さ
せた状態で当該観察位置を通過した励起光の強度を検出
する強度検出装置を備えるので、前記試料に照射される
励起光の絶対強度を簡易に見積もることができ、励起光
の簡易で正確で効率的な計測が可能になる。
【００３６】また、好ましい態様によれば、前記強度検
出装置の検出信号に基づいて前記光源から発生させる励
起光の強度を調整する調整装置をさらに備えるので、前
記試料に照射される励起光の強度を所望の値に適宜調節
することができる。
出装置の検出信号に基づいて前記光源から発生させる励
起光の強度を調整する調整装置をさらに備えるので、前
記試料に照射される励起光の強度を所望の値に適宜調節
することができる。
【００３７】また、好ましい態様によれば、前記試料を
透過した励起光の一部分を分割する分割装置と、当該分
割装置によって分割された前記励起光の一部分を検出し
て前記試料の透過像を得る透過像検出装置とをさらに備
えるので、前記試料に照射される励起光の強度を調節し
つつ励起光による試料の透過像を観察することができる
ようになる。
透過した励起光の一部分を分割する分割装置と、当該分
割装置によって分割された前記励起光の一部分を検出し
て前記試料の透過像を得る透過像検出装置とをさらに備
えるので、前記試料に照射される励起光の強度を調節し
つつ励起光による試料の透過像を観察することができる
ようになる。
【図１】実施形態の光走査型顕微鏡の構成を説明する図
である。
である。
【図２】図１の光走査型顕微鏡における励起光の光量調
節を説明する図である。
節を説明する図である。
【図３】図１の光走査型顕微鏡の変形例を説明する図で
ある。
ある。
【図４】図１の光走査型顕微鏡の変形例を説明する図で
ある。
ある。
１１ レーザ光源 １２ 波長選択フィルタ １３ ビームスプリッタ １４ 走査光学系 １５ 対物レンズ １７ 試料本体 １８ ピント面 １９ スライドグラス ２０ 顕微鏡ステージ ２１ 集光レンズ ２２ ピンホール ２３ 検出器 ２４ コンデンサレンズ ２６ 検出器 ２７ ハーフミラー ３０ 制御装置 ＳＰ サンプル ＥＬ 励起光
Claims (3)
- 【請求項１】 励起光を発生する光源と、 前記光源からの前記励起光を対物レンズを介して観察位
置に配置した試料に照射する照明光学系と、 前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を取得
して試料像を得る観察系と、 前記試料を前記観察位置から退避させた状態で当該観察
位置を通過した励起光の強度を検出する強度検出装置
と、を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 【請求項２】 前記強度検出装置の検出信号に基づいて
前記光源から発生させる励起光の強度を調整する調整装
置をさらに備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光
顕微鏡。 - 【請求項３】 前記試料を透過した励起光の一部分を分
割する分割装置と、当該分割装置によって分割された前
記励起光の一部分を検出して前記試料の透過像を得る透
過像検出装置とをさらに備えることを特徴とする請求項
１記載の蛍光顕微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10078555A JPH11258512A (ja) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | 蛍光顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10078555A JPH11258512A (ja) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | 蛍光顕微鏡 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11258512A true JPH11258512A (ja) | 1999-09-24 |
Family
ID=13665171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10078555A Withdrawn JPH11258512A (ja) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | 蛍光顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11258512A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002090638A (ja) * | 2000-09-20 | 2002-03-27 | Olympus Optical Co Ltd | レーザ走査型光学顕微鏡 |
| JP2003536067A (ja) * | 2000-06-07 | 2003-12-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための基準デバイス、およびその評価を行うための方法およびシステム |
| JP2005352146A (ja) * | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Olympus Corp | 顕微鏡照明強度測定装置 |
| EP2784565A1 (en) | 2013-03-27 | 2014-10-01 | Olympus Corporation | Optical intensity measuremepparatus |
| US20140291492A1 (en) * | 2013-03-27 | 2014-10-02 | Olympus Corporation | Irradiance measuring instrument for microscope, and microscope having the irradiance measuring instrument |
| US9551659B2 (en) | 2011-10-11 | 2017-01-24 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt | Optical apparatus and method for fluorescence measurement of analytes comprising backscattering detection |
-
1998
- 1998-03-12 JP JP10078555A patent/JPH11258512A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003536067A (ja) * | 2000-06-07 | 2003-12-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための基準デバイス、およびその評価を行うための方法およびシステム |
| US7053384B2 (en) | 2000-06-07 | 2006-05-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reference device for evaluating the performance of a confocal laser scanning microscope, and a method and system for performing that evaluation |
| JP2002090638A (ja) * | 2000-09-20 | 2002-03-27 | Olympus Optical Co Ltd | レーザ走査型光学顕微鏡 |
| JP2005352146A (ja) * | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Olympus Corp | 顕微鏡照明強度測定装置 |
| JP4689975B2 (ja) * | 2004-06-10 | 2011-06-01 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡照明強度測定装置 |
| US9551659B2 (en) | 2011-10-11 | 2017-01-24 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt | Optical apparatus and method for fluorescence measurement of analytes comprising backscattering detection |
| EP2784565A1 (en) | 2013-03-27 | 2014-10-01 | Olympus Corporation | Optical intensity measuremepparatus |
| US20140291492A1 (en) * | 2013-03-27 | 2014-10-02 | Olympus Corporation | Irradiance measuring instrument for microscope, and microscope having the irradiance measuring instrument |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20050607 |