JP4981460B2 - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、異なる波長のレーザ光を結合して出射するレーザ光源からのレーザ光の一部をビームスプリッタにより分離して、交換可能なフィルタにより波長を選択し、選択された波長のレーザ光を光検出器により受光して、その波長のレーザ光の強度を検出し、検出信号に基づいて、レーザ光の強度調節を行うレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ顕微鏡においては、光検出器の位置から対物レンズまでの波長毎の透過率や反射率を考慮することで、対物レンズから出射されるレーザ光の強度を知ることができる。

特開平１１−２３１２２２号公報

しかしながら、レーザ光の伝送経路に、ブロードバンドのシングルモード伝送が可能なＰＣＦ(Photonic Crystal
Fiber)を用いる場合にはＰＣＦから出射されるレーザ光の開口数（ＮＡ）が波長に比例するという関係がある。このため、ＰＣＦから出射されるレーザ光をコリメートレンズを用いて略平行光にする場合には、長波長のレーザ光のビーム径が短波長のレーザ光のビーム径より大きくなってしまうという不都合がある。

また、多光子励起を目的とした近赤外の極短パルスレーザ光を出射する高出力のレーザ光源を用いた場合、導光する光学系の熱レンズ効果によってもレーザ光のビーム径が変化する。レーザ光源のパワーが大きいほど、また、波長が近赤外領域に近いほど熱レンズ効果を起こし易く、ビーム径の変化が大きく現れる。

この場合において、レーザ光の波長が変更されたり、熱レンズ効果が発生したりしてレーザ光のビーム径が変化すると、ビーム径が対物レンズの瞳径より大きくなってしまうことがある。
ビーム径が対物レンズの瞳径より大きくなると、レーザ光の外側部分が対物レンズの瞳によりけられてしまうため、実際に対物レンズの先端から出射されるレーザ光の強度は、光検出器に入射されるレーザ光の強度より減少してしまい、正確な強度を知ることができなくなってしまうという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光の波長や強度が変化しても、対物レンズの先端から出射されるレーザ光の強度を簡易にかつ精度よく検出することができ、精度よく設定された強度のレーザ光を標本に照射することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、多光子励起観察用のレーザ光を出射するレーザ光源と、前記レーザ光を走査するスキャナと、前記レーザ光源から出射されたレーザ光を標本に照射し、該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、レーザ光とレーザ光の照射により励起された蛍光とを分岐するダイクロイックミラーと、前記レーザ光源と前記対物レンズとの間であって、前記スキャナ及び前記ダイクロイックミラーの前記レーザ光源側に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の一部を分岐するビームスプリッタと、該ビームスプリッタにより分岐されたレーザ光の光量を検出する光量検出手段と、該光量検出手段と前記ビームスプリッタとの間に配置され、光束径を制限する絞り装置とを備え、前記絞り装置がその開口径を変更可能に設けられ、前記対物レンズが交換可能に設けられ、光軸上に配置された前記対物レンズの瞳位置の開口径に合わせて前記絞り装置の開口径を調節する調節装置が設けられているレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が対物レンズにより標本に照射されることにより、標本に含まれる蛍光物質が励起され蛍光が発生する。この蛍光を検出することにより、標本の蛍光画像を観察することができる。レーザ光源から発せられたレーザ光の一部がビームスプリッタにより分岐され、光量検出手段により検出される。これにより、対物レンズから標本に対して照射されるレーザ光の強度を把握できる。

この場合において、レーザ光源から出射されるレーザ光が多光子励起観察用のレーザ光である場合、導光する光学系の熱レンズ効果等により、レーザ光の光束径が変化する。そして、レーザ光の光束径が拡大した場合には、対物レンズから出射されるレーザ光の光束径が、ビームスプリッタから対物レンズを含む光路上に配置される絞り要素、例えば、対物レンズの瞳等によって制限される場合がある。

本発明によれば、ビームスプリッタによって分岐されたレーザ光の光束径が所定の径寸法より大きい場合には、光量検出手段とビームスプリッタとの間に配置された絞り装置によりその光束径が制限された後に、光量検出手段により検出される。したがって、絞り装置を上記絞り要素に一致させておくことにより、熱レンズ効果等が発生して、光束径が変動しても、対物レンズから照射されるレーザ光の光量を、光量検出手段により正確に検出することができる。
また、絞り装置がその開口径を変更可能としているので、対物レンズが交換された場合に、絞り装置の開口径を変更して、異なる開口径の対物レンズに対しても、同様に、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量を精度よく検出することができる。
さらに、調節装置を設けることで、対物レンズが交換されると調節装置の作動により絞り装置の開口径が調節されるので、光軸上に配置される対物レンズの種類にかかわらず、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量を精度よく検出することができる。

また、本発明は、異なる波長のレーザ光を出射可能なレーザ光源と、前記レーザ光を走査するスキャナと、前記レーザ光源から出射されたレーザ光を標本に照射し、該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、レーザ光とレーザ光の照射により励起された蛍光とを分岐するダイクロイックミラーと、前記レーザ光源と対物レンズとの間であって、前記スキャナ及び前記ダイクロイックミラーの前記レーザ光源側に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の一部を分岐するビームスプリッタと、該ビームスプリッタにより分岐されたレーザ光の光量を検出する光量検出手段と、該光量検出手段と前記ビームスプリッタとの間に配置され、光束径を制限する絞り装置とを備え、前記絞り装置が、その開口径を変更可能に設けられ、前記対物レンズが交換可能に設けられ、光軸上に配置された前記対物レンズの瞳位置の開口径に合わせて前記絞り装置の開口径を調節する調節装置が設けられているレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が対物レンズにより標本に照射されることにより、標本に含まれる蛍光物質が励起され蛍光が発生する。レーザ光源から複数の波長のレーザ光を出射することにより、複数の波長帯域の蛍光を検出することが可能となり、標本のより詳細な蛍光観察を行うことができる。

この場合において、レーザ光源から出射されるレーザ光が広い波長帯域に及ぶ場合、導光する光学系、例えば、フォトニッククリスタルファイバ（ＰＣＦ）の出射開口数が波長に比例するために、レーザ光の光束径が変化する。
本発明によれば、ビームスプリッタによって分岐されたレーザ光の光束径が所定の径寸法より大きい場合には、光量検出手段とビームスプリッタとの間に配置された絞り装置によりその光束径が制限された後に、光量検出手段により検出される。したがって、絞り装置を、対物レンズの瞳等の光路上の絞り要素に一致させておくことにより、光束径が変動しても、対物レンズから照射されるレーザ光の光量を、光量検出手段により正確に検出することができる。
また、絞り装置がその開口径を変更可能としているので、対物レンズが交換された場合に、絞り装置の開口径を変更して、異なる開口径の対物レンズに対しても、同様に、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量を精度よく検出することができる。
さらに、調節装置を設けることで、対物レンズが交換されると調節装置の作動により絞り装置の開口径が調節されるので、光軸上に配置される対物レンズの種類にかかわらず、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量を精度よく検出することができる。

上記発明においては、前記ビームスプリッタが、前記対物レンズにより集光された光を結像する結像レンズと、前記対物レンズとの間に配置されることが好ましい。
このようにすることで、レーザ光源からのレーザ光の光束径が制限される対物レンズに近い位置で光量検出用のレーザ光を分岐でき、対物レンズから照射されるレーザ光の光量をより正確に検出することが可能となる。

また、上記発明においては、前記絞り装置が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に等価な位置に配置されていることが好ましい。
このようにすることで、レーザ光の光束径が制限される対物レンズの瞳と同じ条件で検出するレーザ光の光束径に制限を付与することができ、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量をより精度よく検出することができる。

また、上記発明においては、前記ビームスプリッタが、前記レーザ光源と前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、光量の検出時には、光路上にビームスプリッタを配置してレーザ光を分岐し、観察時にはビームスプリッタを光路上から外すことで、標本に照射するレーザ光の無駄をなくすことができる。

また、上記発明においては、前記絞り装置が、前記対物レンズの瞳位置の開口形状とほぼ同一の開口形状を有することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの瞳位置における制限と同一の条件で検出用のレーザ光の光束径を制限することができ、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量をより精度よく検出することができる。

また、上記発明においては、前記絞り装置の開口径が、前記対物レンズと前記ビームスプリッタとの間に配置される光学系の倍率を、対物レンズの瞳位置の開口径に乗算した寸法であることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズとビームスプリッタとの間に拡大あるいは縮小光学系が備えられていても、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光量を精度よく検出することができる。

また、上記発明においては、レーザ光を走査するスキャナと、レーザ光とレーザ光の照射により励起された蛍光とを分岐するダイクロイックミラーとを備え、前記ビームスプリッタが前記スキャナ及び前記ダイクロイックミラーの前記光源側に配置されていることが好ましい。

本発明によれば、レーザ光の波長や強度が変化しても、対物レンズの先端から出射されるレーザ光の強度を簡易にかつ精度よく検出することができ、精度よく設定された強度のレーザ光を標本に照射することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光源２と、顕微鏡本体３と、レーザ光源２と顕微鏡本体３とを接続するフォトニッククリスタルファイバのようなシングルモードファイバ４と、制御ユニット５とを備えている。

レーザ光源２は、第１の光源ユニット６と、第２の光源ユニット７とを備えている。
第１の光源ユニット６は、複数の波長λ_１（例えば、４５８ｎｍ，４８８ｎｍ，５１４．５ｎｍ）のレーザ光Ｌ_１を同時に発振可能なアルゴンレーザ光源８と、波長λ_２（例えば、４０５ｎｍ）のレーザ光Ｌ_２を発振するレーザダイオード９と、これらアルゴンレーザ光源８およびレーザダイオード９から出射されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を合波するダイクロイックミラー１０と、音響光学素子１１とを備えている。図中符合１２はミラーである。
音響光学素子１１は、制御ユニット５からの信号に基づいて、顕微鏡本体３に向けて出射するレーザ光Ｌ_３の波長選択、強度変調およびオンオフのスイッチングを行うようになっている。

また、第２の光源ユニット７は、６９０〜１０４０ｎｍの広範囲にわたり、最適化されたフェムト秒のレーザ光Ｌ_４を発振するチタンサファイアレーザ光源（高出力のレーザ光源）１３と、制御ユニット５からの信号に基づいて顕微鏡本体３に向けて出射するレーザ光Ｌ_５の強度変調とオンオフのスイッチングとを行う音響光学素子１４とを備えている。

第１の光源ユニット６からのレーザ光Ｌ_３はシングルモードファイバ４を介して顕微鏡本体３に導かれ、第２の光源ユニット７からのレーザ光Ｌ_５は空間光路を介して直接顕微鏡本体３に導かれるようになっている。

前記顕微鏡本体３は、第１の光源ユニット６および第２の光源ユニット７からのレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を同一の光路上に入射させるミラー１５およびダイクロイックミラー１６と、レーザ光源２からのレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を２次元的に走査するスキャナ１７と、該スキャナ１７により走査されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を集光する瞳投影レンズ１８と、該瞳投影レンズ１８により集光され中間像を結像したレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を略平行光に変換する結像レンズ１９と、該結像レンズ１９により略平行光に変換されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を集光して標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る蛍光Ｆを集光する対物レンズ２０と、該対物レンズ２０により集光され、結像レンズ１９、瞳投影レンズ１８およびスキャナ１７を介して戻る蛍光Ｆをレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光路から分岐するダイクロイックミラー２１と、該ダイクロイックミラー２１により分岐された蛍光Ｆを検出する光検出ユニット２２とを備えている。

光検出ユニット２２は、ダイクロイックミラー２１によりレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５から分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ２３と、該集光レンズ２３の焦点位置に配置される共焦点ピンホール２４と、該共焦点ピンホール２４を通過した蛍光Ｆを略平行光にするコリメートレンズ２５と、略平行光となった蛍光Ｆを波長毎に分岐するダイクロイックミラー２６と、該ダイクロイックミラー２６により分岐された蛍光Ｆを波長毎に検出する光電子増倍管のような複数の光検出器２７，２８とを備えている。

図中、符号２９，３０はミラー、符号３１はバリアフィルタである。共焦点ピンホール２４は、対物レンズ２０の焦点面と光学的に共役な位置に配置されている。
また、瞳投影レンズ１８と結像レンズ１９との間には、ダイクロイックミラー３６が設けられ、結像レンズ１９により集光された蛍光Ｆのうち、チタンサファイアレーザ光源１３からのレーザ光Ｌ_５により励起された蛍光Ｆ_１を分岐するようになっている。分岐された蛍光Ｆ_１は光検出器３７により検出されるようになっている。

前記対物レンズ２０は、ターレット３２に配置された複数の対物レンズ２０の内から倍率等に応じて１つの対物レンズ２０が選択されるようになっている。選択された対物レンズ２０の情報は、制御ユニット５に送られるようになっている。

また、本実施形態においては、前記ダイクロイックミラー１６，２１間に、レーザ光源２からのレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の一部を分岐するビームスプリッタ３３が配置されている。また、ビームスプリッタ３３により分岐されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を検出するフォトダイオードのような光量検出器３４が設けられている。さらに、本実施形態においては、ビームスプリッタ３３と光量検出器３４との間に、可変絞り（絞り装置）３５が配置されている。

前記制御ユニット５は、光源ユニット６，７の音響光学素子１１，１４に対し、光源８，９，１３からのレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２，Ｌ_４の波長選択およびオンオフのスイッチングの指令を出力するようになっている。また、制御ユニット５は、光量検出器３４により検出されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量情報を受けて、音響光学素子１１，１４を制御して、光源ユニット６，７から出射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の強度変調を行うようになっている。

また、制御ユニット５は、対物レンズ２０を搭載したターレット３２から送られてくる対物レンズ２０の情報に基づいて、絞り装置３５の開口径を調節するようになっている。好ましくは、絞り装置３５の開口径は、対物レンズ２０の瞳径に瞳投影レンズ１８と結像レンズ１９の倍率を乗じた値に設定されている。また、絞り装置３５の開口形状は、対物レンズ２０の瞳位置に配置される絞りの形状と同一であることが好ましい。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａを観察するには、まず、第１の光源ユニット６からレーザ光Ｌ_１（またはレーザ光Ｌ_２）を出射させる。出射されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２は音響光学素子１１により調整されたレーザ光Ｌ_３としてシングルモードファイバ４を介して顕微鏡本体３に入射される。顕微鏡本体３においては、レーザ光Ｌ_３はミラー１５およびダイクロイックミラー１６により反射された後、スキャナ１７により２次元的に走査されて瞳投影レンズ１８、結像レンズ１９および対物レンズ２０を介して、ステージ３８上の標本Ａに照射される。

レーザ光Ｌ_３を照射されることにより標本Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ２０により集光された後、結像レンズ１９、ダイクロイックミラー３６、瞳投影レンズ１８およびスキャナ１７を介して戻り、ダイクロイックミラー２１によりレーザ光Ｌ_３の光路から分岐される。分岐された蛍光Ｆは集光レンズ２３により集光され、共焦点ピンホール２４を通過したもののみが、ミラー２９、コリメートレンズ２５、ダイクロイックミラー２６（およびミラー３０）を介して光検出器２７（または光検出器２８）により検出される。ダイクロイックミラー２１により分離されきれずに蛍光Ｆとともに透過したレーザ光Ｌ_３は、バリアフィルタ３１により遮断される。

共焦点ピンホール２４を設けているので、対物レンズ２０の焦点面から発せられた蛍光Ｆのみが共焦点ピンホール２４を通過でき、光検出器２７により検出される。したがって、光検出器２７により検出された蛍光Ｆの強度と該蛍光Ｆが検出された時点におけるスキャナ１７の走査位置情報とに基づいて、焦点面に沿って標本Ａ内の所定深さに２次元的に広がる平面における鮮明な蛍光画像を取得することができる。

また、標本Ａの多光子励起観察を行う場合には、第２の光源ユニット７のチタンサファイアレーザ光源１３からレーザ光Ｌ_４を出射させる。出射されたレーザ光Ｌ_４は音響光学素子１４により調整されたレーザ光Ｌ_５として、顕微鏡本体３に入射される。顕微鏡本体３においては、レーザ光Ｌ_５はダイクロイックミラー１６を透過した後、スキャナ１７により２次元的に走査されて瞳投影レンズ１８、結像レンズ１９および対物レンズ２０を介して、ステージ３８上の標本Ａに照射される。

レーザ光Ｌ_５を照射されることにより標本Ａにおいて発生した蛍光Ｆ_１は、対物レンズ２０により集光された後、結像レンズ１９を介して戻り、ダイクロイックミラー３６によりレーザ光Ｌ_５の光路から分岐される。分岐された蛍光Ｆ_１は光検出器３７により検出される。

多光子励起観察においては、レーザ光Ｌ_５の集光位置においてのみ蛍光Ｆ_１が発生するので、光検出器３７により検出された蛍光Ｆ_１の強度と該蛍光Ｆ_１が検出された時点におけるスキャナ１７の走査位置情報とに基づいて、焦点面に沿って標本Ａ内の所定深さに２次元的に広がる平面における鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。

この場合において、ダイクロイックミラー１６，２１間に配置されたビームスプリッタ３３により、光源ユニット６，７からのレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の一部が分岐されて光量検出器３４により検出される。したがって、ビームスプリッタ３３の透過率が既知であれば、検出されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量に基づいて、対物レンズ２０から標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の強度を正確に認識することが可能となる。さらに、本実施形態においては、ビームスプリッタ３３と光量検出器３４との間に配置された絞り装置３５の作動により、レーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光束径が所定以上となった場合に光量検出器３４に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光束径が制限される。

絞り装置３５の開口径は、対物レンズ２０の瞳径に瞳投影レンズ１８と結像レンズ１９の倍率を乗じた値に設定されているので、絞り装置３５に入射されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５に対する光量検出器３４に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の割合を、対物レンズ２０に入射されたレーザ光Ｌ_３に対する標本に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の割合と等しくすることができる。すなわち、対物レンズ２０に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光束径が、対物レンズ２０の瞳径より大きくなると、光束の外周部分が瞳位置に配置されている絞りによりけられて、実際に標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量は対物レンズ２０への入射光量より少なくなる。本実施形態においては、標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５が対物レンズ２０の瞳位置に配された絞りにより制限されるのと同様に、光量検出器３４に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量を絞り装置３５により制限することで、現実に標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量を精度よく把握することができるという利点がある。

例えば、ターレット３２を固定して対物レンズ２０を変更しない場合であっても、光源ユニット６から出射されるレーザ光Ｌ_３の波長に比例してシングルモードファイバ４から出射される際のレーザ光Ｌ_３の開口数が変化するので対物レンズ２０に入射されるレーザ光Ｌ_３の光束径が変化する。また、高出力のチタンサファイアレーザ光源１３から出射されるレーザ光Ｌ_５は、対物レンズ２０までの間に通過する光学系の熱レンズ効果により、その光束径が変動する。

本実施形態においては、このような場合においても、対物レンズ２０の瞳位置において光束径が制限されるのと同じ割合で、光量検出器３４に入射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光束径を絞り装置３５が制限するので、標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を正確に把握することができるという利点がある。
そして、光量検出器３４により検出されたレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量は、制御ユニット５に送られ、該光量情報に基づいて音響光学素子がフィードバック制御されることにより、所望の光量のレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を正確にかつ安定的に標本Ａに照射することができる。

また、チタンサファイアレーザ光源１３は、波長帯域６９０〜１０４０ｎｍにおいて波長可変であるので、レーザ光Ｌ_４の波長を変更して、標本Ａからの蛍光輝度値を取得することにより、標本Ａの励起スペクトルを取得することができる。この励起スペクトルを取得する際には、波長を変更しても、対物レンズ２０から出射されるレーザ光Ｌ_４の光量が一定である必要がある。

本実施形態によれば、波長を変更してレーザ光Ｌ_４の光束径が変化することにより、対物レンズ２０から出射されるレーザ光Ｌ_４の光量の変動が生じても、対物レンズ２０から出射される光量を正確に測定でき、その測定結果を用いて音響光学素子１４を制御することによりレーザ光Ｌ_４の光量を一定にできる。その結果、標本Ａの励起スペクトルを正確に取得することができる。

また、本実施形態においては、ターレット３２から送られてくる対物レンズ２０の情報に基づいて、制御ユニット５が絞り装置３５の開口径を調節するので、瞳径の異なる対物レンズ２０が使用されても、当該対物レンズ２０により制限される光束径の割合と同じ割合で、光量検出器３４により検出されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光束径を制限し、標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量を常に精度よく設定することができる。

なお、本実施形態においては、ダイクロイックミラー１６，２１間において、ビームスプリッタ３により光量検出用にレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の一部を分岐したが、これに代えて、図２に示されるように、対物レンズ２０の直前において分岐したレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５を用いて光量測定を行うこととしてもよい。このようにすることで、対物レンズ２０の瞳位置と光学的に等価な位置に絞り装置３５を配置することができ、他の光学系の影響を受けることなく、より精度よく対物レンズ２０から標本Ａに照射されるレーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光量を測定することができる。

また、本実施形態においては、絞り装置３５として可変絞りを採用したが、これに代えて、対物レンズ２０毎に用意された開口部と、該開口部を切り替えるターレット式あるいはスライド式の切替機構（図示略）とを有するものを採用してもよい。また絞り装置３５として対物レンズを採用してもよい。

また、ビームスプリッタ３３は、レーザ光Ｌ_３，Ｌ_５の光路に対して挿脱可能に設けられていることが好ましい。このようにすることで、光量測定時にはビームスプリッタ３３を光路に挿入し、標本Ａの観察時にはビームスプリッタ３３を光路から取り外して、レーザ光源２からの全てのレーザ光Ｌ_３．Ｌ_５を効率よく観察に使用することができる。この場合、ビームスプリッタ３３に代えて、ミラーを採用することとしてもよい。

また、絞り装置３５をビームスプリッタ３３と光量検出器３４との間に配置したが、これに代えて、ビームススプリッタ３３の前段に配置してもよい。このようにすることで、光量検出器３４の前段に配置する場合と比較して、絞り装置３５において発生したフレアが光量検出器に入射されてしまう不都合を防止し、光量検出の精度を向上することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、瞳径の異なる対物レンズ２０に対応するために、可変絞りからなる絞り装置３５を採用したが、これに代えて、所定の開口径を有する固定絞りと、該固定絞りに入射させるレーザ光Ｌ３，Ｌ５の光束径を変化させるズーム機構（図示略）とを採用することにしてもよい。
また、レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２，Ｌ_４を変調するＡＯＭやＡＯＴＦのような音響光学素子に代えて、電気光学素子や磁気光学素子を採用してもよい。

また、本実施形態においては、対物レンズ２０の瞳位置に配置される絞り要素により光束径が制限される場合について説明したが、これに代えて、瞳位置以外の金枠等により光束径が制限される場合には、該金枠等と等価な位置に絞り装置３５を配置することにしてもよい。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。 図１のレーザ顕微鏡の変形例を示す図である。

符号の説明

Ａ 標本
Ｌ_１，Ｌ_２，Ｌ_３，Ｌ_４，Ｌ_５ レーザ光
１ レーザ顕微鏡
５ 制御ユニット（調節装置）
８ アルゴンレーザ光源（レーザ光源）
９ レーザダイオード（レーザ光源）
１３ チタンサファイアレーザ光源（レーザ光源）
１９ 結像レンズ
２０ 対物レンズ
３３ ビームスプリッタ
３４ 光量検出器（光量検出手段）
３５ 絞り装置

Claims (4)

1. 多光子励起観察用のレーザ光を出射するレーザ光源と、
   前記レーザ光を走査するスキャナと、
   前記レーザ光源から出射されたレーザ光を標本に照射し、該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   レーザ光とレーザ光の照射により励起された蛍光とを分岐するダイクロイックミラーと、
   前記レーザ光源と前記対物レンズとの間であって、前記スキャナ及び前記ダイクロイックミラーの前記レーザ光源側に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の一部を分岐するビームスプリッタと、
   該ビームスプリッタにより分岐されたレーザ光の光量を検出する光量検出手段と、
   該光量検出手段と前記ビームスプリッタとの間に配置され、光束径を制限する絞り装置とを備え、
   前記絞り装置がその開口径を変更可能に設けられ、
   前記対物レンズが交換可能に設けられ、
   光軸上に配置された前記対物レンズの瞳位置の開口径に合わせて前記絞り装置の開口径を調節する調節装置が設けられているレーザ顕微鏡。
2. 異なる波長のレーザ光を出射可能なレーザ光源と、
   前記レーザ光を走査するスキャナと、
   前記レーザ光源から出射されたレーザ光を標本に照射し、該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   レーザ光とレーザ光の照射により励起された蛍光とを分岐するダイクロイックミラーと、
   前記レーザ光源と対物レンズとの間であって、前記スキャナ及び前記ダイクロイックミラーの前記レーザ光源側に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の一部を分岐するビームスプリッタと、
   該ビームスプリッタにより分岐されたレーザ光の光量を検出する光量検出手段と、
   該光量検出手段と前記ビームスプリッタとの間に配置され、光束径を制限する絞り装置とを備え、
   前記絞り装置が、その開口径を変更可能に設けられ、
   前記対物レンズが交換可能に設けられ、
   光軸上に配置された前記対物レンズの瞳位置の開口径に合わせて前記絞り装置の開口径を調節する調節装置が設けられているレーザ顕微鏡。
3. 前記ビームスプリッタが、前記レーザ光源と前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられている請求項１又は請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記絞り装置の開口径が、前記対物レンズと前記ビームスプリッタとの間に配置される光学系の倍率を、対物レンズの瞳位置の開口径に乗算した寸法である請求項１又は請求項２に記載のレーザ顕微鏡。

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