JP4994940B2

JP4994940B2 - レーザ走査型顕微鏡

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Publication number: JP4994940B2
Application number: JP2007124829A
Authority: JP
Inventors: 純一岡田; 牧男上野
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2007-05-09
Filing date: 2007-05-09
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2027-05-09
Also published as: JP2008281708A

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、蛍光色素を選択することで、レーザ光の波長を自動的に選択するレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ走査型顕微鏡によれば、蛍光色素に対する励起波長の関係やレーザ光の発振波長の調節等の知識のないユーザも、簡単に使用することができるという利点がある。

特開２００３−１５０４５号公報

しかしながら、レーザ走査型顕微鏡においては、蛍光色素が選択された場合に、調節されるべき項目はレーザ光の波長選択のみではなく、種々の設定を調節する必要がある。特に、連続レーザ光を照射することにより行われる共焦点観察および超短パルスレーザ光を照射することにより行われる多光子励起観察の両方を行うことができるレーザ走査型顕微鏡においては、その調節は複雑となり、単にレーザ光の波長を自動調整しただけでは、適正な観察を行うことはできないという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、ユーザにかかる負担をさらに軽減して、より適正な蛍光観察を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源を含む多光子励起照明光学系と、連続レーザ光を出射する連続レーザ光源を含む１光子励起照明光学系と、これら照明光学系から出射されたレーザ光を２次元的に走査して標本に照射する走査光学系と、標本に対してレーザ光を照射することにより、標本から発生する蛍光を前記走査光学系より前記標本側で検出する多光子蛍光観察光学系、および、前記走査光学系よりも前記１光子励起照明光学系側で検出する共焦点観察光学系と、蛍光色素および多光子観察か１光子観察かの観察方法を選択入力する入力部と、前記蛍光色素および多光子励起観察もしくは１光子励起観察に対応づけて前記照明光学系および前記観察光学系の設定を記憶する記憶部と、前記入力部により入力された蛍光色素および観察方法に対応して前記記憶部に記憶されている設定に前記照明光学系および前記観察光学系を設定する設定制御部と、を備え、前記記憶部が、前記多光子励起照明光学系に関する設定として、少なくとも、パルスレーザ光の波長、および、分散補償光学系の設定値を含み、前記１光子励起照明光学系に関する設定として、少なくとも、連続レーザ光源から出射させる連続レーザ光の波長の設定値を含み、前記多光子蛍光観察光学系に関する設定として、少なくとも、照明光路から多光子観察光路へ分岐する部分に配置されているダイクロイックミラーの種類、バリアフィルターの切替、および光検出回路設定を含み、前記共焦点観察光学系に関する設定として、少なくとも、照明光路から共焦点観察光路へ分岐する部分に配置されているダイクロイックミラーの種類、ピンホールの開口径、バリアフィルタの切替、および光検出器の検出回路設定が含まれるレーザ走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、設定制御部の作動により、入力部から入力された蛍光色素および観察方法に対応する照明光学系および観察光学系の設定が記憶部内から読み出され、照明光学系および観察光学系が設定される。照明光学系の設定としては、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長、多光子励起観察光学系においては、アライメント光学系、波面調整光学系、ビーム系調整光学系、ネガティブチャープ、調光手段等の設定等が挙げられる。また、観察光学系の設定としては、共焦点観察光学系においては、検出される蛍光を分離する励起ダイクロイックミラーおよび蛍光を波長毎に分離する分光ダイクロイックミラーの波長特性、共焦点ピンホールの開口径、バリアフィルタの特性および光検出器の検出回路設定等が挙げられる。

上記発明においては、前記共焦点観察光学系が、開口量を変更可能な共焦点ピンホールを備え、前記入力部から観察方法として多光子蛍光観察が選択された場合に、前記多光子蛍光観察光学系および前記共焦点ピンホールを開放した共焦点観察光学系により標本から発生する蛍光を検出することとしてもよい。
このようにすることで、共焦点観察光学系を利用して多光子蛍光観察を行うことができる。これにより、多光子蛍光観察光学系の検出チャネルを越える数の波長の多光子蛍光を検出する場合に、共焦点観察光学系の検出チャネルを割り当てて検出することができる。

また、上記発明においては、前記記憶部に、蛍光色素の励起波長に対する励起効率のプロファイル情報が記憶され、前記入力部から、励起波長が重複する複数の蛍光色素が入力された場合に、前記記憶部に記憶されている各蛍光色素のプロファイル情報が交差する波長に前記レーザ光の波長を設定することとしてもよい。
このようにすることで、複数の蛍光色素を最も効率的に励起することが可能となり、１つの波長のレーザ光によって、複数の蛍光色素を同時励起して観察することができる。

本発明によれば、ユーザにかかる負担をさらに軽減して、より適正な蛍光観察を行うことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、超短パルスレーザ光（以下、パルスレーザ光またはレーザ光という。）を出射するパルスレーザ光源２を備える多光子励起照明光学系３と、連続レーザ光を出射する連続レーザ光源４を備える１光子励起照明光学系５と、多光子励起照明光学系３または１光子励起照明光学系５のいずれかから出射されたレーザ光を２次元的に走査する走査光学系６と、該走査光学系６により走査されたレーザ光を標本Ｓに集光する対物レンズ７と、レーザ光が照射されることにより、標本Ｓから発生した蛍光を検出する多光子蛍光観察光学系８および共焦点観察光学系９と、各種設定を記憶する記憶部１０と、蛍光色素の種類および観察方法を入力する入力部１１と、前記各光学系３，８，９を制御する制御部１２とを備えている。

前記多光子励起照明光学系３は、パルスレーザ光源２と、該パルスレーザ光源２から出射されるパルスレーザ光の光軸調整を行うアライメントミラー１３と、パルスレーザ光の波長選択および強度調整を行う音響光学素子からなる調光素子１４と、該調光素子１４から出射されたパルスレーザ光の光軸調整を行うアライメントミラー１５と、パルスレーザ光の負の分散を付与する分散補償光学系１６と、レーザ光を略平行光にしてその光束径を調節するコリメート光学系１７と、多光子励起照明光学系３からの出力となるパルスレーザ光の最終的な光軸調整を行うアライメントミラー１８とを備えている。

分散補償光学系１６は、λ／２板１９と、相互に間隔調整可能に設けられた一対のグレーティング２０ａ，２０ｂと、該グレーティング２０ａ，２０ｂ対から出射されるレーザ光の出射位置を調節するアライメントミラー２０ｃと、λ／４板２１とを備えている。グレーティング２０ａ，２０ｂ対は、一対のグレーティング２０ａ，２０ｂの間隔を調節することにより、レーザ光に付与する負分散量を調節することができるようになっている。ミラー２０ｃは、グレーティング２０ａ，２０ｂ対の移動により光路が変動しても、分散補償光学系１６から出射されるレーザ光の出射位置および角度が変化しないように調節するようになっている。

前記１光子励起照明光学系５は、連続レーザ光源４により構成されている。
前記多光子励起照明光学系３と１光子励起照明光学系５の光路は、ダイクロイックミラー２２によって合流されている。

走査光学系６は、例えば、相互に交差する軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー（図示略）を対向させてなる、いわゆる近接ガルバノミラーからなるスキャナ６ａと、該スキャナ６ａにより走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ６ｂとを備えている。

前記多光子蛍光観察光学系８は、落射観察光学系８Ａと、透過観察光学系８Ｂとを備えている。
落射観察光学系８Ａは、前記対物レンズ７と瞳投影レンズ６ｂとの間の光路に挿脱可能に設けられたダイクロイックミラー２３と、該ダイクロイックミラー２３が光路に挿入された状態で、反射される多光子蛍光を波長毎に分岐するダイクロイックミラー２４と、多光子蛍光に含まれるパルスレーザ光を遮断するバリアフィルタ２５と、多光子蛍光をそれぞれ検出する光検出器２６とを備えている。

また、透過観察光学系８Ｂは、前記標本Ａを挟んで対物レンズ７と対向する位置に配置されたコンデンサレンズ２７と、該コンデンサレンズ２７により集光された多光子蛍光を反射する光路に挿脱可能なミラー２８と、該ミラー２８により反射された多光子蛍光を波長毎に分岐するダイクロイックミラー２９と、多光子蛍光に含まれるパルスレーザ光を遮断するバリアフィルタ３０と、多光子蛍光をそれぞれ検出する光検出器３１とを備えている。

前記共焦点観察光学系９は、前記１光子励起照明光学系５とスキャナ６ａとの間に配置され、スキャナ６ａを介して戻る蛍光を分岐するダイクロイックミラー３２と、分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ３３と、該共焦点レンズ３３により集光された光を通過させる調節可能な開口を有する共焦点ピンホール３４と、該共焦点ピンホール３４を通過した蛍光を集光する集光レンズ３５と、蛍光を波長毎に分岐するダイクロイックミラー３６およびミラー３７と、バリアフィルタ３８と、光検出器３９とを備えている。

前記記憶部１０には、選択可能な蛍光色素の種類および観察方法（多光子観察か１光子観察か等）と対応づけて、多光子励起照明光学系３、１光子励起照明光学系５、多光子蛍光観察光学系８および共焦点観察光学系９の各種設定が記憶されている。

多光子励起照明光学系３に関しては、記憶部１０に記憶される設定には、パルスレーザ光源２から出射させるパルスレーザ光の波長、各アライメントミラー１３，１５の角度、調光素子１４により選択するパルスレーザ光の波長および強度、λ／２板１９の調整、分散補償光学系１６のグレーティング２０ａ，２０ｂ対およびアライメントミラー２０ｃの位置調整、λ／４板２１の調整、コリメート光学系１７による光束径の調整、アライメントミラー１８の角度等の設定値が含まれている。
１光子励起照明光学系５に関しては、記憶部１０に記憶される設定には、連続レーザ光源４から出射させる連続レーザ光の波長の設定値が含まれている。

多光子蛍光観察光学系８に関しては、記憶部１０に記憶される設定には、ダイクロイックミラー２３，２８の種類、バリアフィルタ２５，３０の切替、光検出器２６，３１の検出回路設定が含まれている。
共焦点観察光学系９に関しては、ダイクロイックミラー３２，３６の種類、共焦点ピンホール３４の開口径、バリアフィルタ３８の切替、光検出器３９の検出回路設定が含まれている。

入力部１１から入力される蛍光色素の種類および観察方法は、例えば、図２に示されるように、画面上に表示されたアイコンＰ１〜Ｐ５を選択することにより行われる。図２に示される例では、同じ蛍光色素に対して観察方法毎にアイコンＰ１〜Ｐ５が用意されているので、ユーザは、アイコンＰ１〜Ｐ５を選択するだけで、蛍光色素の種類および観察方法を入力することができるようになっている。図中「２Ｐ」は二光子励起観察用であることを意味している。

制御部１２は、蛍光色素の種類および観察方法が入力部１１から入力されると、これらの蛍光色素の種類および観察方法をキーとして記憶部１０内を検索し、対応して記憶されている各種設定を読み出すようになっている。そして、制御部１２は、読み出した設定を多光子励起照明光学系３、１光子励起照明光学系５、多光子蛍光観察光学系８または共焦点観察光学系９に適用するようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、まず、図３に示されるように、ユーザは、入力部１１を操作して蛍光色素の種類と観察方法とを選択する（ステップＳ１）。

制御部１２は、入力部１１から入力された蛍光色素および観察方法に基づいて記憶部１０内のデータベースを検索し、対応して記憶されている各部の設定データを読み出す（ステップＳ２）。読み出されるデータには、各部の設定データの他、入力された蛍光色素を励起するのに適したレーザ光の波長、当該レーザ光により蛍光色素が励起されることにより発せられる蛍光の波長も含まれている。

そして、制御部１２は、入力された観察方法が、共焦点観察であるか多光子励起観察であるかを判断し（ステップＳ３）、判断の結果、共焦点観察である場合には、１光子励起照明光学系５および共焦点観察光学系９の設定が行われ（ステップＳ４）、多光子励起観察が入力された場合には、多光子励起照明光学系３および多光子蛍光観察光学系８の設定が行われる（ステップＳ５）。

ここで、入力された観察方法が共焦点観察である場合について、図４を参照して、さらに詳細に説明する。
まず、１光子励起照明光学系５の設定を行う（ステップＳ１１）。
すなわち、ステップＳ２において記憶部１０から読み出された、入力された蛍光色素を励起するのに適した連続レーザ光の波長を連続レーザ光源４に設定する（ステップＳ１１）。これにより、１光子励起照明光学系５に対する設定が終了する。

次に、共焦点観察光学系９の設定を行う（ステップＳ１２〜Ｓ１７）。
まず、標本Ａから発生した蛍光を分岐するための蛍光波長に適合したダイクロイックミラー（励起ダイクロイックミラー）３２を光路上に設定する（ステップＳ１２）。次いで、共焦点ピンホール３４の開口径を十分に小さく絞り、光軸の調整を行う（ステップＳ１３）。

そして、読み出された蛍光波長を検出するために必要なダイクロイックミラー（分光ダイクロイックミラー）３６の切り替えを行い（ステップＳ１４）、読み出された波長のレーザ光を効果的に遮断できるバリアフィルタ３８に切り替える（ステップＳ１５）。その後、読み出された蛍光波長を検出するのに適した光検出器３９の検出回路設定が行われる（ステップＳ１６）。これにより、共焦点観察用の各部の設定が終了する。

一方、入力された観察方法が多光子励起観察である場合について、図５を参照して、さらに詳細に説明する。
まず、多光子励起照明光学系３の設定を行う（ステップＳ２１〜Ｓ３１）。
すなわち、ステップ２において記憶部１０から読み出された、入力された蛍光色素を励起するのに適したパルスレーザ光の波長をパルスレーザ光源２に設定する（ステップＳ２１）。パルスレーザ光源２の波長が変更された場合には、出力が安定するのを待って、次の設定が行われる（ステップＳ２２）。

パルスレーザ光源２から出射されるパルスレーザ光の波長が変更されると、パルスレーザ光源２からのパルスレーザ光の光軸が変動するので、アライメントミラー１３を揺動させて、光軸調整を行う（ステップＳ２３）。そして、調光素子１４を調節することにより、パルスレーザ光の波長を選択し、その強度を調節する（ステップＳ２４）。調光素子１４は、音響光学素子により構成されているので、パルスレーザ光の波長選択および強度調整を行うことにより、出射されるパルスレーザ光の光軸が変動する。

そこで、アライメントミラー１５を揺動させて光軸調整を行う（ステップＳ２５）。
その後、λ／２板１９を調節することにより、パルスレーザ光の偏光方向を調整し（ステップＳ２６）、分散補償光学系１６のグレーティング２０ａ，２０ｂ対を調節することにより、パルスレーザ光に付与する負分散量を調整し（ステップＳ２７）、グレーティング２０ａ，２０ｂ対の調整によりずれた光軸をアライメントミラー２０ｃを並進移動させることで調節する（ステップＳ２８）。そして、λ／４板２１を調節することによりパルスレーザ光を円偏光に変換する（ステップＳ２９）。

次いで、コリメート光学系１７を調節することにより、パルスレーザ光の光束径が、対物レンズ７の瞳を満たすように調整され（ステップＳ３０）、アライメントミラー１８の調節により、最終的に多光子励起照明光学系３から出射させるパルスレーザ光の光軸調整を行う（ステップＳ３１）。
これにより、多光子励起照明光学系３の各部の設定が終了する。

次に、多光子蛍光観察光学系８の設定を行う（ステップＳ３２〜Ｓ３６）。
多光子蛍光観察光学系８は、落射観察光学系８Ａおよび透過観察光学系８Ｂを備えているので、両方を使用する場合について説明する。

まず、標本Ａから発生した多光子蛍光を分岐するための蛍光波長に適合したダイクロイックミラー（励起ダイクロイックミラー）３２を光路上に設定する（ステップＳ３２）。これにより、場合によっては、共焦点観察光学系９の光検出器３９を多光子蛍光観察用に流用することが可能となる。

次いで、標本Ａから発生した多光子蛍光を分岐するための蛍光波長に適合したダイクロイックミラー２３を光路上に設定する（ステップＳ３３）。
そして、記憶部１０から読み出された蛍光波長を検出するために必要なダイクロイックミラー（分光ダイクロイックミラー）２４，２９の切り替えを行い（ステップＳ３４）、読み出された波長のレーザ光を効果的に遮断できるバリアフィルタ２５，３０に切り替える（ステップＳ３５）。その後、読み出された蛍光波長を検出するのに適した光検出器２６，３１の検出回路設定が行われる（ステップＳ３６）。これにより、多光子蛍光観察用の各部の設定が終了する。

このようにして、各部の設定が行われた後に、共焦点観察または多光子励起観察のいずれかが行われる。
共焦点観察が行われる場合には、連続レーザ光源４から出射された連続レーザ光がスキャナ６ａにより２次元的に走査され、瞳投影レンズ６ｂによって集光され、対物レンズ７によって標本Ａ上に集光される。連続レーザ光源４から出射される連続レーザ光の波長は、入力された蛍光色素の種類に適したものが記憶部１０から読み出されて設定されているので、標本Ａに含有されている蛍光色素を効率的に励起して所望の波長の蛍光を発生させることができる。

連続レーザ光が照射されることにより標本Ａにおいて発生した蛍光は、対物レンズ７、瞳投影レンズ６ｂ、スキャナ６ａを介して戻り、ダイクロイックミラー３２により分岐されて共焦点観察光学系９に入射される。ダイクロイックミラー３２は、入力された蛍光色素の種類に応じた蛍光波長に適したものが記憶部１０から読み出されて設定されているので、蛍光を効率的に分岐して検出させることができる。

ダイクロイックミラー３２により分岐された蛍光は、共焦点レンズ３３によって集光され、共焦点ピンホール３４を通過させられたものが集光レンズ３５により集光され、ダイクロイックミラー３６によって波長毎に分岐されて光検出器３９により検出される。共焦点ピンホール３４の開口径は、共焦点観察用に十分に小さく設定されているので、標本Ａにおける連続レーザ光の集光位置において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール３４を通過させられて光検出器３９により検出される。

これにより、対物レンズ７の焦点面に広がる標本Ａのスライス画像を高い分解能で取得して鮮明な蛍光画像を観察することができる。この場合において、本実施形態によれば、入力された蛍光色素の種類に適したダイクロイックミラー３２の波長設定および光検出器３９の検出回路設定が行われているので、共焦点ピンホール３４を通過した微弱な蛍光を精度よく波長毎に分岐して無駄なく検出することができる。

なお、入力部１１からの入力として、蛍光画像の分解能を指定できる場合には、これに合わせて共焦点ピンホール３４の開口径を調節可能とすることにしてもよい。この場合には、共焦点ピンホール３４の開口径を増大させると、分解能は低下するが、明るい蛍光画像を取得することができる。

また、多光子蛍光観察が行われる場合には、パルスレーザ光源２から出射されたパルスレーザ光が、アライメントミラー１３により光軸調整され、調光素子１４により調光され、アライメントミラー１５により光軸調整され、分散補償光学系１６により負分散を付与され、コリメート光学系１７により光束径を調整され、アライメントミラー１８によって光軸調整されてダイクロイックミラー２２によりスキャナ６ａに指向される。パルスレーザ光源２から出射されるパルスレーザ光の波長は、入力された蛍光色素の種類に適したものが記憶部１０から読み出されて設定されているので、標本Ａに含有されている蛍光色素を効率的に励起して所望の波長の多光子蛍光を発生させることができる。

分散補償光学系１６に入射される前にλ／２板１９の調節が行われることで、負分散の付与を効率的に行うことができる。分散補償光学系１６のグレーティング２０ａ，２０ｂ対がパルスレーザ光の波長に合わせて調節されるので、対物レンズ７の先端から十分に短いパルス幅の超短パルスレーザ光を出射させることができる。また、コリメート光学系１７によりパルスレーザ光の光束径が対物レンズ７の瞳を満たすように設定されることにより、対物レンズ７の性能を十分に発揮させた高い開口数のパルスレーザ光を標本Ａに照射させることができる。これにより、パルスレーザ光によって多光子励起現象を発生させる光軸方向の長さを短くして、分解能の高い多光子蛍光画像を取得することができる。

標本Ａにおいてパルスレーザ光が集光された位置から発生した多光子蛍光のうち、対物レンズ７方向に出射された多光子蛍光は、対物レンズ７により集光された直後に、ダイクロイックミラー２３，２４により波長毎に分解されて光検出器２６により検出される。ダイクロイックミラー２３，２４は、入力された蛍光色素の種類に応じた蛍光波長に適したものが記憶部１０から読み出されて設定されているので、多光子蛍光を効率的に分岐して検出させることができる。

一方、標本Ａにおいてパルスレーザ光が集光された位置から発生した多光子蛍光のうち、標本Ａを透過してコンデンサレンズ２７方向に出射された多光子蛍光は、コンデンサレンズ２７により集光された直後に、ミラー２８により反射され、ダイクロイックミラー２９によって波長毎に分解されて光検出器３１により検出される。

これにより、対物レンズ７の焦点面に広がる標本Ａのスライス画像を高い分解能で取得して鮮明な多光子蛍光画像を観察することができる。この場合において、本実施形態によれば、入力された蛍光色素の種類に適したダイクロイックミラー２３，２４，２９の波長設定、バリアフィルタ２５，３０の設定および光検出器２６，３１の検出回路設定が行われているので、多光子蛍光を精度よく波長毎に分岐して無駄なく検出することができる。

また、入力部１１から多数種の蛍光色素が入力され、多光子蛍光観察が選択された場合には、検出される蛍光波長が多くなり、場合によっては、多光子蛍光観察光学系８のみでは検出しきれないこともある。そのような場合には、共焦点観察光学系９の共焦点ピンホール３４を最大限に開放し、また、ダイクロイックミラー３２，３６およびバリアフィルタ３８の設定を調節する。このようにすることで、多光子蛍光観察光学系８の光検出器２６，３１のみでは検出しきれない数の波長の多光子蛍光を共焦点観察光学系９を流用して検出することができる。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、蛍光色素および観察方法を入力するだけで、記憶部１０に記憶された各部の設定が読み出されて設定されるので、入力された蛍光色素に適したレーザ光の波長で、蛍光色素から発生する蛍光を効率的に検出して、鮮明で明るい蛍光画像を取得することができる。したがって、ユーザが蛍光色素やレーザ走査型顕微鏡１の設定に関する詳細な知識を持ち合わせていなくても、適正な蛍光観察を行うことができる。その結果、ユーザにかかる負担をさらに軽減することができるという効果がある。

なお、本実施形態においては、蛍光色素の種類を入力してこれに適した励起波長のレーザ光を照射するよう設定することとした。この設定には、蛍光色素毎に異なる励起波長のレーザ光を照射することが含まれることはもちろんのことであるが、単一の励起波長で異なる複数の蛍光色素を励起することができる場合に、この励起波長を選択することとしてもよい。

この場合、例えば、図６に示されるように、異なる蛍光色素Ｄ１，Ｄ２が相互に重なる励起効率の波長特性（プロファイル情報）を有する場合に、それぞれの励起効率の波長特性を記憶部１０に記憶しておき、図中に鎖線で示される最大励起効率となる励起波長λ_１，λ_２を選択する代わりに、実線で示されるように励行効率特性が交差する励起波長λ_３を選択することにすればよい。このようにすることで、単一の励起波長λ_３のレーザ光によって、複数の蛍光色素Ｄ１，Ｄ２を比較的大きな励起効率で同時に励起することができる。したがって、同時性を要求される蛍光観察を簡易に行うことができる。

また、本実施形態においては、多光子励起照明光学系３と１光子励起照明光学系５とを有するレーザ走査型顕微鏡１を例示して説明したが、これに代えて、図７に示されるように、多光子励起照明光学系３と同様の構成からなる多光子励起刺激光学系３′を有するレーザ走査型顕微鏡１′を採用してもよい。図中、多光子励起刺激光学系３′において多光子励起照明光学系３と構成を共通とする箇所には「′（ダッシュ）」を付して同一符号を使用し、説明を省略する。
この場合、記憶部１０には、入力される蛍光色素に適した波長の刺激用のレーザ光の波長を含む多光子励起刺激光学系３′の各部の設定が記憶されていることとすればよい。

また、本実施形態においては、入力部１１からの蛍光色素の種類および観察方法の入力方法として、蛍光色素に対して観察方法毎に用意されたアイコンＰ１〜Ｐ５を選択する方法を例示したが、これに代えて、観察方法の情報を含まない蛍光色素のアイコンを、観察方法毎に用意されたボックスに割り当てることで、蛍光色素および観察方法を入力することにしてもよい。また、蛍光色素および観察方法を含むアイコンを光検出器に割り当てることにしてもよい。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。図１のレーザ走査型顕微鏡の入力部による蛍光色素および観察方法の入力の一例を示す図である。図１のレーザ走査型顕微鏡による各部の設定手順を説明するフローチャートである。図３の設定手順の内、共焦点観察用の設定手順を示すフローチャートである。図３の設定手順の内、多光子蛍光観察用の設定手順を示すフローチャートである。多数の蛍光色素を単一の励起波長で励起する場合の励起波長の選択方法を説明する励起効率の波長特性を示すグラフである。図１のレーザ走査型顕微鏡の変形例であって、刺激用照明光学系を有するレーザ走査型顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。

符号の説明

Ａ標本
１，１′ レーザ走査型顕微鏡
２パルスレーザ光源
３多光子励起照明光学系
４連続レーザ光源
５１光子励起照明光学系
６走査光学系
８多光子蛍光観察光学系
９共焦点観察光学系
１０記憶部
１１入力部
１２制御部（設定制御部）
３４共焦点ピンホール

Claims

超短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源を含む多光子励起照明光学系と、
連続レーザ光を出射する連続レーザ光源を含む１光子励起照明光学系と、
これら照明光学系から出射されたレーザ光を２次元的に走査して標本に照射する走査光学系と、
標本に対してレーザ光を照射することにより、標本から発生する蛍光を前記走査光学系より前記標本側で検出する多光子蛍光観察光学系、および、前記走査光学系よりも前記１光子励起照明光学系側で検出する共焦点観察光学系と、
蛍光色素および多光子観察か１光子観察かの観察方法を選択入力する入力部と、
前記蛍光色素および多光子励起観察もしくは１光子励起観察に対応づけて前記照明光学系および前記観察光学系の設定を記憶する記憶部と、
前記入力部により入力された蛍光色素および観察方法に対応して前記記憶部に記憶されている設定に前記照明光学系および前記観察光学系を設定する設定制御部と、を備え、
前記記憶部が、
前記多光子励起照明光学系に関する設定として、少なくとも、パルスレーザ光の波長、および、分散補償光学系の設定値を含み、
前記１光子励起照明光学系に関する設定として、少なくとも、連続レーザ光源から出射させる連続レーザ光の波長の設定値を含み、
前記多光子蛍光観察光学系に関する設定として、少なくとも、照明光路から多光子観察光路へ分岐する部分に配置されているダイクロイックミラーの種類、バリアフィルターの切替、および光検出回路設定を含み、
前記共焦点観察光学系に関する設定として、少なくとも、照明光路から共焦点観察光路へ分岐する部分に配置されているダイクロイックミラーの種類、ピンホールの開口径、バリアフィルタの切替、および光検出器の検出回路設定が含まれるレーザ走査型顕微鏡。
前記共焦点観察光学系が、開口量を変更可能な共焦点ピンホールを備え、
前記入力部から観察方法として多光子蛍光観察が選択された場合に、前記多光子蛍光観察光学系および前記共焦点ピンホールを開放した共焦点観察光学系により標本から発生する蛍光を検出する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
前記記憶部に、蛍光色素の励起波長に対する励起効率のプロファイル情報が記憶され、
前記入力部から、励起波長が重複する複数の蛍光色素が入力された場合に、前記記憶部に記憶されている各蛍光色素のプロファイル情報が交差する波長に前記レーザ光の波長を設定する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。