JP2006162994A

JP2006162994A - 全反射蛍光顕微鏡

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Publication number: JP2006162994A
Application number: JP2004354622A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sasaki; 浩佐々木; Tatsuo Nakada; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2024-12-07
Also published as: JP4700334B2

Abstract

【課題】常に平行光で標本を照射することができる全反射蛍光顕微鏡を提供すること。
【解決手段】光源（１）と、前記光源からの照明光を標本に照射する照射角度を制御する照射角度制御手段（１０，４８，４９）と、倍率の異なる複数の対物レンズを切り替える対物レンズ切り替え手段（１７）と、前記対物レンズが切り替えられた時に、標本への染み出し光の深さが切り替え前と同じになるように前記照射角制御手段を制御する制御手段と、を備えた。
【選択図】図１

Description

本発明は、全反射蛍光顕微鏡に関する。

最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するものとして、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）が注目されている。

この全反射蛍光顕微鏡は、カバーガラスと標本の境界面で照明光を全反射させた時に、標本側に数１００ｎｍ以下のわずかな範囲に浸み出すエバネッセント光と呼ばれる光を利用して蛍光物質を励起する方法で、カバーガラス近傍のわずかな範囲の蛍光だけが観察されるので、バックグランドが非常に暗く、コントラストの高い蛍光観察や微弱な蛍光の観察が可能である。

ところで、このような全反射蛍光顕微鏡を用いた生物研究の現場においては、境界面近傍のより浅い面内をコントラスト良く観察したい場合も有れば、或る程度の深さまで照明光を届かせて広範囲の観察をしたい場合も有る。このため、観察対象に応じてエバネッセント光の浸み出し深さが変えられるようになっているのが望ましい。

境界面からのエバネッセント光の浸み出し深さは、非特許文献１において開示されており、以下の公式が成り立つことが知られている。

ｄ＝λ／４π｛（ｎ_１ ^２ｓｉｎθ_１ ^２−ｎ_２ ^２）｝^１／２（１）
ここで、ｄ：エバネッセント光の浸み出し深さ、λ：光の波長、ｎ_１：入射側（カバーガラス）屈折率、θ_１：入射角、ｎ_２：出射側（標本）屈折率である。
従って、上式から明らかなように、全反射照明角度の境界面に対する照明光の入射角、すなわち境界面の垂線に対する照明光の傾射角が大きい程、エバネッセント光の浸み出し深さは浅くなる。

このような考え方を利用したものとして、特許文献１に開示されるように対物レンズの後側焦点面内における集光光の焦光点の位置を反射光学系の回転により調整することで、標本側に導入される光の入射角を調整可能にしたものがある。
特開２００２−３１７６２号公報 Daniel Axelrod, "5. Total Internal Reflection Fluorescence at Biological Surfaces", Noninvasive Technics in Cell Biology: 93-127, 1990, Wiley-Liss, Inc., pp111-113

しかし、図２に示すように、対物レンズの種別によって瞳径や瞳位置が異なるので、対物レンズを切り替えた時に、照明スポットが対物レンズの瞳位置からずれる。例えば、倍率が６０倍の対物レンズ１８の瞳位置（図２の（ａ））よりも、倍率が１００倍の対物レンズ１８の瞳位置（図２の（ｂ））の方が標本面２１側になっている。このため、この瞳位置に照明スポットが正しく結ばれるように照明スポットの位置を調節しなければならない。

また、対物レンズを切り替えない場合でも、レーザ光の波長を変えたときに光学系の色収差によって照明スポットの位置がずれる場合がある。従って、これについても、補正しないと正しいエバネッセント照明にならない。

このように、全反射照明顕微鏡において、対物レンズを切り替えたりすると対物レンズの特性（瞳位置）の違いから標本に常に平行な照明光の集光位置を変える必要がある。このため、対物レンズを切り替えた場合は光源と対物レンズの間の光路長を変えなければならない。

また対物レンズを切り替えると対物レンズの特性（倍率）の違いから照明光の照射角度が変わることがある。同じ深さのしみ出し光を得るためには、照明光の照射角度を切り替える前と同じにする必要がある。

本発明は、常に平行光で標本を照射することができる全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明では、対物レンズの倍率変更時に、照明スポットの位置を瞳径にあわせて光軸と垂直な方向に位置調整する。その他、対物レンズの瞳位置や照明スポットの位置が変わるときに、照明スポットを光軸方向に位置調整する。具体的には、以下のとおりである。

本発明の局面に係る発明は、光源と、前記光源からの照明光を標本に照射する照射角度を制御する照射角度制御手段と、倍率の異なる複数の対物レンズを切り替える対物レンズ切り替え手段と、前記対物レンズが切り替えられた時に、標本への染み出し光の深さが切り替え前と同じになるように前記照射角制御手段を制御する制御手段と、を具備することを特徴とする。なお、照射角制御手段は、例えば、光源からの照射光の波長が変更された場合や、照射角が変更された場合にも調整を行うことが好ましい。

本発明によれば、常に平行光で標本を照射することができる。

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明の一実施の形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
本実施の形態では、エバネッセント照明による蛍光観察と、光走査ミラーによりレーザ光を偏向し、標本上にスポット光を２次元走査し、標本から発する蛍光を共焦点ピンホールを介して共焦点観察の両方を行うことができる構成を示している。この走査ミラーは、共焦点観察時には、標本上のスポット光を２次元走査するために使用され、エバネッセント照明時には、しみ出し深さを決める照明角度を可変するために使用される。

図１において、レーザ光源ユニット１は、エバネッセント照明に用いられる、例えば４８８ｎｍのレーザ光を発振するアルゴン（Ａｒ）レーザ２と５４３ｎｍのレーザ光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３を有している。

グリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。つまり、ここでのダイクロイックミラー５は、５４３ｎｍのレーザ光を反射し、４８８ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、波長選択用の音響光学素子(ＡＯＴＦ)６が配置されている。ここでの音響光学素子６は、４８８ｎｍと５４３ｎｍのレーザ光を選択し、それぞれの波長を切り替え可能にしている。なお、別の波長選択手段として、音響光学素子６に代えて、異なる波長のレーザ光を発する複数のＬＤ光源を並べ、これらＬＤ光源の電源に供給する電流値を可変しオンオフさせることで、所望する波長のレーザ光を選択するようにしても良い。また、音響光学素子の代わりに電気光学素子、液晶シャッタで代用しても良い。

レーザ光源ユニット１の音響光学素子６の出射端は、ファイバ７を介して走査ユニット４１に接続されている。走査ユニット４１は、ファイバ７から出射されるレーザ光を導入するレーザ光導入ポート４１ａが設けられている。また、レーザ光導入ポート４１ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ４２、励起ダイクロイックミラー４３が配置されている。

コリメートレンズ４２は、レーザ光導入ポート４１ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換するものである。励起ダイクロイックミラー４３は、レーザ光の波長(４８８ｎｍ、５４３ｎｍ)を反射し、標本１９から発する蛍光の波長領域を透過するような特性を有している。

励起ダイクロイックミラー４３の反射光路上には、光走査手段としての光偏向ミラーユニット４４が配置されている。光偏向ミラーユニット４４は紙面の上下方向と紙面に垂直な方向に光を偏向する２組のガルバノスキャナミラーを有し、これらのガルバノスキャナミラーにより共焦点観察時には、標本面をスポット光が２次元走査され、エバネッセント照明時には、標本への照射角度が可変される。

光偏向ミラーユニット４４より出射されるレーザ光の光路上には、瞳投影レンズ４５が配置されている。瞳投影レンズ４５から出射されるレーザ光の光路上には、集光レンズ４６が配置されている。集光レンズ４６は、瞳投影レンズ４５から出射されるレーザ光を平行光（点線で示す光路）に変換し、キューブターレット１４に入射するようにしている。そして、キューブターレット１４に取り付けられた全反射ミラー１６ａからなるキューブユニット１６で上方に反射され、対物レンズ１８により、標本１９にスポット光を結ぶ。このように、標本１９にスポット光を結ぶのは、共焦点観察時の照明である。

また、瞳投影レンズ４５と集光レンズ４６との間に、挿脱可能にプリズム１０が配置されている。プリズム１０は、エバネッセント照明用のプリズムであり、エバネッセント照明時のみ光路に挿入され、共焦点観察では、光路より外されている。つまり、エバネッセント照明では、対物レンズ１８の瞳位置１８ａにレーザ光を集光させる必要があり、このために瞳投影レンズ４５により集光される結像位置４５ａを対物レンズ１８の瞳位置１８ａに結像させるためプリズム１０を光路に挿入可能にしている。対物レンズ１８の瞳位置１８ａでの結像位置は、光偏向ミラーユニット４４の偏向により、対物レンズ１８の半径方向に変化するので、標本への照射角度を可変できる。

また、プリズム１０は、制御部２９の指示で駆動される図示しないモータにより図示矢印方向に移動することにより、光路上に挿脱可能になっている。プリズム１０が光路上に挿入されたときには、レーザ光は、プリズム１０によって反射され、リレーレンズ１１、プリズム４８及びリレーレンズ１２を介して再度プリズム１０で反射されて、集光レンズ４６に入射する（実線で示す光路）。ここで、プリズム４８は、制御部２９の制御により駆動するモータ４９で図中矢印方向に移動可能であり、この移動により、対物レンズ１８の瞳位置１８ａに集光する集光位置を光軸方向に可変すること、つまり、光路長を変更することが出来るようになっている。

一方、励起ダイクロイックミラー４３の透過光路上には、共焦点観察手段を構成する反射ミラー５０、共焦点レンズ５１、共焦点ピンホール５２、励起レーザ光をカットし検出したい蛍光波長領域を取出すバリアフィルタ５３および光検出器５４が配置されている。ここでの光検出器５４には、例えばフォトマルチプライアが用いられる。

集光レンズ４６より出射するレーザ光の光路には、キューブターレット１４が配置されている。このキューブターレット１４は、複数のキューブユニットを保持可能にしたもので、モータ１５により図示しないベアリングなどの摺動機構を介して回転切り替え可能な構成になっている。図示例では、２種類のキューブユニット１６、４７が装着され、全反射蛍光観察を行うときは、このうちのキューブユニット４７が集光レンズ４６からのレーザ光の光路上に位置決めされている。

キューブユニット４７は、波長選択光学素子として、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長の光を励起光として反射し、この励起波長により標本１９から発生される５００〜５４０ｎｍ、５６０〜６００ｎｍの波長の蛍光を透過する特性を有する励起ダイクロイックミラー１６ａを有している。

キューブユニット４７のダイクロイックミラー４７ａ（集光レンズ４６からのレーザ光の光路上に位置決めされている）の反射光路には、対物レンズ１８が配置されている。本実施形態において、対物レンズ１８は複数であり（図は１つのみ記載）、制御部２９の制御で駆動するモータ１７により、所望の対物レンズに切り替え可能となっている。

対物レンズ１８の焦点位置には、蛍光色素で染色された標本１９が配置されている。この標本１９は、倒立顕微鏡本体９のステージ２０上に配置され、カバーガラス２１に固着している。この場合、カバーガラス２１と対物レンズ１８の間には、高いＮＡを確保してエバネッセント照明による全反射を起こさせるようにするためのイマージョンオイルが充填されている。

キューブユニット４７のダイクロイックミラー４７ａ（集光レンズ４６からのレーザ光の光路上に位置決めされている）の透過光路２２ａには、観察光学系を構成する結像レンズ２２、反射ミラー２３が配置されている。

反射ミラー２３は、図示しない切替機構により光路上から挿脱可能になっている。図示例では、反射ミラー２３が光路に挿入された状態を示している。

反射ミラー２３が光路上に挿入されている状態で、反射ミラー２３の反射光路には、蛍光観察手段を構成するフィルタホイール２４が配置されている。このフィルタホイール２４は、複数（図示例では２個）のフィルタ２４ａ、２４ｂを保持にしたもので、モータ２５により図示しない摺動機構を介して光路上への切り替えを可能にしている。この場合フィルタ２４ａは、４８８ｎｍの励起波長により発生した蛍光を、フィルタ２４ｂは、例えば５４３ｎｍの励起波長により発生した蛍光を透過させるようになっている。なお、図示例では、フィルタ２４ａが光路上に位置決めされている。

フィルタホイール２４を透過した光路上には、撮像手段としてのＣＣＤカメラ２６が配置されている。ＣＣＤカメラ２６には、結像レンズ２２を透過した標本１９からの蛍光が導かれ撮像面２６ａに結像される。

反射ミラー２３が光路から外れた状態で、目視観察光路２２ｂには、反射ミラー２７と目視観察用ユニット２８が配置されている。

一方、音響光学素子６、光偏向ミラーユニット４４、キューブターレット１４を回転駆動するモータ１５、フィルタホイール２４を回転駆動するモータ２５、ＣＣＤカメラ２６、プリズム４８の駆動用モータ４９には、制御手段としての制御部２９が接続されている。制御部２９は、これら音響光学素子６、光偏向ミラーユニット４４、モータ１５、２５、４９およびＣＣＤカメラ２６に制御信号を出力するとともに、ＣＣＤカメラ２６で撮像した画像データを処理してモニタ３０に表示可能にしている。また、制御部２９には、記憶手段としての記憶部２９ａが設けられている。

この場合、記憶部２９ａは、対物レンズ毎の瞳位置に照明スポットの位置を合わせるために光路長を変更するプリズム４８の位置及び対物レンズの各倍率で同一の照射角度を得るために必要な光偏向ミラーユニット４４の偏向角度を記憶する。これにより、対物レンズが切り替わった場合にも、当該対物レンズの瞳位置に照明スポットの位置を合わせるためのプリズム４８の位置及び光偏向ミラーユニット４４の偏向角が記憶されているので、即座に照明スポットを対物レンズの瞳位置に合わせることができる。これにより、瞳位置や倍率が異なる対物レンズに切り替えても染み出し深さが一定にでき、かつ、常に平行光で標本を照射することができるので、正確な全反射照明を行うことができる。

なお、対物レンズを切り替えなくても、光源からのレーザ光の波長を変更した場合に、光学系の光軸方向の色収差により、照明スポットの位置が光軸方向に対して対物レンズの瞳位置からずれる場合がある。この場合にも、波長毎に、照明スポットの位置が対物レンズの瞳位置に合うようなプリズム４８の位置を記憶部２９ａに記憶しておく。これにより、対物レンズの瞳面に集光する照明光に光軸方向の色収差があっても、照明スポットの位置が対物レンズの瞳位置にくるので、励起波長を切り替えた時に常に平行光で標本を照射することができるため、正確な全反射照明を行うことができる。

なお、複数の波長から波長選択を行い、波長を切り替えながら順次標本に照射して、時分割で複数の励起波長による蛍光画像を取得する場合には、波長毎に設定された照射角度で標本に照射するように、波長切り替えに同期して前記照射角度制御手段の制御値（光偏向ミラーユニット４４の偏向角）及び光路長可変制御手段の制御値（プリズム４８の位置）を順次切り替えるように制御することが好ましい。これにより、光軸方向の色収差があっても、所望（一定）の染み出し深さにおける、各波長での多重染色標本のシーケンシャル画像を正確かつ極めて簡単に取得できる。

また、対物レンズを切り替えた場合以外の照明スポットの位置ずれとして、照射角度を変えたときに、対物レンズの瞳面付近に集光する照明光の像面湾曲によるものが考えられる。この場合にも、照明角度（光偏向ミラーユニット４４の偏向角）毎の照明スポットの位置が対物レンズの瞳位置に合うようなプリズム４８の位置を記憶部２９ａに記憶しておく。これにより、照射角度を変化させた場合であっても、照明スポットの位置が対物レンズの瞳位置にくるので、照射角度を切り替えた時に常に平行光で標本を照射することができるため、正確な全反射照明を行うことができる。

上記の実施形態では、集光位置を光軸方向に移動させる手段を「光路長可変手段」（実施形態では、可動プリズム）で説明している。光路長を可変させる方式を用いると、集光位置だけを調整し、他の光学的パラメータを変えないようにすることが比較的容易に実現可能であり、好ましい。しかしながら、レンズを移動させたり、ズーム光学系を用いて集光位置の光軸方向調整を行う方法も実施可能である。

本発明の実施形態によれば、対物レンズの切り替え、波長の切り替え及び照射角度の変化に応じて、光路長を調整するようにしたので、常に平行光で標本を照射することができるため、正確な全反射照明を行うことができる。

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。上記の実施形態では、照明スポットの位置ずれを対物レンズの切り替え、波長の切り替え及び照射角度の変化によるものに限って説明したが、これに限らず、照明スポットの位置が光軸方向にずれる場合には、どのようなものでも適用可能である。更に、上記の説明では、対物レンズの切り替え、波長の切り替え及び照射角度の変化に対する補正を、別々に説明したが、同時に適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

本発明の一実施の形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。対物レンズが切り替えられたときの照明スポットの位置ずれを説明するための図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ、３…グリーンヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー、５…ダイクロイックミラー、６…音響光学素子、７…ファイバ、９…倒立顕微鏡本体、１０…プリズム、１１、１２…リレーレンズ、１４…キューブターレット、１５…モータ、１６…キューブユニット、１６ａ…ダイクロイックミラー、１７…モータ、１８…対物レンズ、１８ａ…瞳位置、１９…標本、２０…ステージ、２１…カバーガラス、２２…結像レンズ、２２ａ…透過光路、２２ｂ…目視観察光路、２３…反射ミラー、２４…フィルタホイール、２４ａ、２４ｂ…フィルタ、２５…モータ、２６…ＣＣＤカメラ、２６ａ…撮像面、２７…反射ミラー、２８…目視観察用ユニット、２９…制御部、２９ａ…記憶部、３０…モニタ、４１…走査ユニット、４１ａ…レーザ光導入ポート、４２…コリメートレンズ、４３…励起ダイクロイックミラー、４４…光偏向ミラーユニット、４５…瞳投影レンズ、４５ａ…結像位置、４６…集光レンズ、４７…キューブユニット、４７ａ…ダイクロイックミラー、４８…プリズム、４９…モータ、５０…反射ミラー、５１…共焦点レンズ、５２…共焦点ピンホール、５３…バリアフィルタ、５４…光検出器。

Claims

光源と、
前記光源からの照明光を標本に照射する照射角度を制御する照射角度制御手段と、
倍率の異なる複数の対物レンズを切り替える対物レンズ切り替え手段と、
前記対物レンズが切り替えられた時に、標本への染み出し光の深さが切り替え前と同じになるように前記照射角制御手段を制御する制御手段と、を具備することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
前記照明光を対物レンズの瞳位置付近に集光する集光位置を光軸方向に可変する光路長可変制御手段と、
瞳位置が異なる対物レンズ毎に前記光路長可変制御手段の調整値を記憶する記憶手段と、を更に備え、
前記制御手段は、前記対物レンズが切り替えられた時に、前記調整値を基に前記光路長可変制御手段を制御することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。
光源と、
前記光源からの照明光が対物レンズの瞳位置付近に集光する集光位置を光軸方向に可変する光路長可変制御手段と、
前記照明光の波長毎に前記光路長可変制御手段の制御値を記憶する記憶手段と、
前記照明光の波長が切り替えられた時に、前記調整値を基に前記光路長可変制御手段を調整する制御手段を具備することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
前記制御手段は、複数の波長から波長選択を行い、波長を切り替えながら順次標本に照射して、時分割で複数の照明光の波長による蛍光画像を取得する時に、波長毎に設定された光路長で標本に照射するように、波長切り替えに同期して前記光路長可変制御手段の制御値を順次切り替えることを特徴とする請求項３記載の全反射蛍光顕微鏡。
前記制御手段からの照明光を標本に照射する照射角度を制御する照射角度制御手段を更に備え、
前記制御手段は、照明光の波長毎に設定された照射角度で標本に照射するように、波長切り替えに同期して前記照射角度制御手段の制御値を順次切り替えることを特徴とする請求項３記載の全反射蛍光顕微鏡。
少なくとも１つの波長を発振可能な光源と、
前記光源からの照明光を標本に照射する照射角度を制御する照射角度制御手段と、
前記照明光が対物レンズの瞳位置付近に集光する集光位置を光軸方向に可変する光路長可変制御手段と、
倍率及び又は瞳位置が異なる対物レンズ毎の前記照射角度制御手段及び前記光路長可変制御手段の制御値を記憶する記憶手段と、
前記記憶手段に記憶された制御値を用いて、対物レンズの切り替えに連動して照射角度制御手段及び又は光路長可変制御手段を制御する制御手段を具備することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
少なくとも２つの波長を発振する光源から照明光の波長を選択する波長選択手段を更に備え、
前記記憶手段は、光軸方向の色収差により生じる対物レンズの瞳位置付近の光軸方向集光位置ずれの補正値を波長毎に記憶し、
前記制御手段は、前記波長毎の補正値を用いて、前記照明光の波長の切り替えに連動して光路長可変制御手段を制御することを特徴とする請求項６記載の全反射蛍光顕微鏡。
前記記憶手段は、照明光の波長毎の照射角度制御値を記憶し、
前記制御手段は、前記波長毎の照射角度制御値を用いて、前記照明光の波長の切り替えに連動して前記照射角度制御手段を制御することにより、エバネッセント照明のしみ出し量を波長に無関係な一定値又は波長ごとの所望値に設定することを特徴とする請求項６記載の全反射蛍光顕微鏡。
前記全反射蛍光顕微鏡は、時分割で複数の照明光の波長毎の蛍光画像を取得することを特徴とする請求項７または請求項８に記載の全反射蛍光顕微鏡。
前記記憶手段は、対物レンズの瞳面付近に集光する照明光の像面湾曲により生じる光軸方向の集光位置ずれを補正する補正値を照射角度毎に記憶し、
前記制御手段は、前記照射角度毎の補正値を用いて、照射角度の変更に連動して光路長可変制御手段を制御することを特徴とする請求項６に記載の全反射蛍光顕微鏡。