JP4874012B2 - レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型顕微鏡の画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、収差を補正可能にするとともに対物レンズの焦点位置を変更可能にしたレーザ走査型顕微鏡に関するものである。

最近、レーザ走査型顕微鏡は、ますます高画質の画像を取得できるものが要求される傾向にあり、このため、光源からの光を標本に集光する対物レンズ等に残存する収差を補正可能にしたものが用いられるようになっている。

対物レンズの収差を補正可能にした光学顕微鏡として、特許文献１に開示されるように顕微鏡の対物レンズ手前に波面変調器としての形状可変ミラーを配置し、この形状可変ミラーの表面を変形させ、光の波面を変調することにより、対物レンズの焦点位置を移動するとともに、収差を補正するようにしたものが知られている。

特開平１１−１０１９４２号公報

ところで、レーザ走査型顕微鏡においては、特に、蛍光標本を観察するような場合、蛍光標本を保持するカバーガラスの屈折率と蛍光標本自体の屈折率の違い、又は、これら屈折率と空気の屈折率の差等の要因によって収差が発生し、さらに、これらの収差によって、標本に対し照明光を理想的に照射できないことがあり、このため、理想的な蛍光標本の観察像を取得するには、蛍光標本を照明する照明光と蛍光標本からの蛍光のそれぞれに対して収差を効果的に補正する必要がある。

また、レーザ走査型顕微鏡において、形状可変ミラーを用いて対物レンズの焦点位置を移動させるような場合、対物レンズの実質ＮＡが変化し、微小ながらも共焦点ピンホール位置におけるビーム回折径も変化する。このため、Ｚ軸方向の分解能を確保し、高画質の画像を得るためには、共焦点ピンホールを最適に設定することが必要である。さらに、高画質の蛍光標本画像を取得するには、蛍光標本に適した吸収フィルタを最適に設定することも重要なことである。

しかし、特許文献１には、これらの要求に対する解決策は見当たらず、このため、高画質の標本画像を確保するのが難しいという問題がある。

一方、複数波長のレーザ光を切り換えて照射する場合、対物レンズ等の光学系の色収差によって、光軸方向の集光位置がレーザ波長ごとに微妙にずれるという問題がある。例えば励起光を切り換えながら多重染色蛍光標本を観察する場合、励起するレーザ波長によって集光位置、すなわち画像化する断面が微妙に異なってしまうという問題がある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、高画質の標本画像を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、レーザ光を発生する光源と、前記レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、前記レーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記標本上の第１集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させる第１の集光位置制御手段と、前記レーザ光とは波長が異なる光であって前記第１集光位置から発せられる観察光および前記第１集光位置からの反射光の少なくとも一方を前記レーザ光の光路から分岐させる分岐素子と、前記第１集光位置からの光を共焦点検出する共焦点ピンホールを有する共焦点検出手段と、前記分岐素子と前記共焦点ピンホールとの間の光路に設けられ、前記共焦点検出手段に対して集光される前記観察光の第２集光位置を前記共焦点ピンホールに一致させる第２の集光位置制御手段と、前記共焦点検出手段が検出する光を選択する光選択手段と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記第１集光位置からの光のうち該第１集光位置からの反射光に対し前記共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記第１の集光位置制御手段に前記第１集光位置を移動させる制御を行うとともに、前記第１集光位置からの光のうち前記観察光に対し前記共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記第２の集光位置制御手段に前記第２集光位置を移動させる制御を行う制御手段を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記光選択手段は、前記第１集光位置からの反射光を選択するハーフミラーと、前記観察光として所定波長のみの光を選択するダイクロイックミラーとを切換可能に備えることを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記第１及び第２の集光位置制御手段の少なくとも一方は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記制御手段は、前記波面変調器の反射面形状を記憶したデータベースを備え、該データベースから読み出した前記反射面形状に基づいて前記波面変調器を制御することを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記制御手段は、前記第１の集光位置制御手段による前記第１集光位置の移動に連動して前記共焦点ピンホールの径を変更する制御を行うことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記光選択手段は、さらに、特性の異なる複数の波長選択フィルタを有し、前記制御手段は、前記第２の集光位置制御手段による前記第２集光位置の移動に連動して、複数の前記波長選択フィルタのうち前記標本に適した特性の波長選択フィルタを光路上に配置する制御を行うことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、複数波長を含んだ多波長レーザ光を発生する光源と、前記多波長レーザ光の中から１以上の波長のレーザ光を抽出する波長抽出手段と、前記レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、前記レーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記標本上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させ、基準波長の前記レーザ光の前記集光位置に対する各波長の前記レーザ光の前記集光位置の前記光軸方向のずれを解消する第１の集光位置制御手段と、前記レーザ光とは波長が異なる光であって前記集光位置から発せられる観察光を前記レーザ光の光路から分岐させる分岐素子と、前記集光位置からの光を共焦点検出する共焦点ピンホールを有する共焦点検出手段と、前記共焦点検出手段が検出する光を選択する光選択手段と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記分岐素子と前記共焦点ピンホールとの間の光路に設けられ、前記共焦点検出手段に対して集光される前記観察光の検出集光位置を前記共焦点ピンホールに一致させる第２の集光位置制御手段を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記波長抽出手段に複数の波長の前記レーザを波長ごとに順次抽出させるとともに、この抽出した前記レーザ光の波長に応じて、前記第１集光位置制御手段に前記集光位置の前記光軸方向のずれを解消させる制御を行う制御手段を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記制御手段は、前記光走査手段が前記レーザ光を１ライン走査するごとに、前記波長抽出手段が抽出する前記レーザ光の波長を切り換える制御を行うことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記第１及び第２の集光位置制御手段の少なくとも一方は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記波面変調器の反射面形状を記憶したデータベースを有し、該データベースから読み出した前記反射面形状に基づいて前記波面変調器を制御する制御手段を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡は、上記の発明において、前記データベースは、前記レーザ光の波長および集光位置に応じた複数の反射面形状を記憶することを特徴とする。

また、本発明にかかるレーザ走査型顕微鏡の画像取得方法は、光源が発したレーザ光を対物レンズを介して標本上に集光させるレーザ光照射ステップと、前記レーザ光の前記標本上の第１集光位置を２次元走査させるとともに、該第１集光位置からの光を共焦点ピンホールを介して共焦点検出する共焦点検出ステップと、前記第１集光位置からの光のうち該第１集光位置で反射した前記レーザ光に対し、前記共焦点ピンホールを通過する光量が最大となるように前記第１集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させる第１集光位置移動ステップと、前記第１集光位置からの光のうち前記レーザ光とは波長が異なる光であって該第１集光位置から発せられる観察光に対し、前記共焦点ピンホールを通過する光量が最大となるように、前記共焦点検出ステップによって集光される前記観察光の第２集光位置を該観察光の光路方向に移動させる第２集光位置移動ステップと、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、高画質の標本画像を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。図１において、符号１０は光源としてのレーザ光源を示す。このレーザ光源１０は、後述する標本２０の蛍光色素を励起する波長のレーザ光を発生するものである。レーザ光源１０からのレーザ光の光路上には、コリメート光学系１１が配置されている。コリメート光学系１１は、レーザ光源１０が発したレーザ光を完全な平行光にするとともに、そのビーム径を変更するものである。

コリメート光学系１１からの平行光の光路上には、光選択手段としての光学素子切換え手段１０１が配置されている。この光学素子切換え手段１０１は、ハーフミラー１２及びダイクロイックミラー１３を有するもので、これらハーフミラー１２及びダイクロイックミラー１３を選択的に光路上に切換え可能にしている。この場合、光学素子切換え手段１０１は、後述する対物レンズ１９の焦点位置の移動や収差補正を行なうときは、ハーフミラー１２を光路上に配置し、標本２０の蛍光に対する収差補正を行なうときは、ダイクロイックミラー１３を光路上に配置するようになっている。ここで、ハーフミラー１２は、波長にかかわらず約５０％の透過率を有し、レーザ光源１０からのレーザ光を反射し、標本２０からの光を透過するような特性を有し、ダイクロイックミラー１３は、レーザ光源１０からのレーザ光を反射し、標本２０からの光のうち、所定波長の光、ここでは標本２０から発せられる蛍光波長の光を透過するような特性を有している。なお、図示例では、ハーフミラー１２が光路上に配置された状態を示している。

ハーフミラー１２（ダイクロイックミラー１３）のレーザ光源１０側から見た反射光路には、反射ミラー１４及び第１の集光位置制御手段としての波面変調器、ここでは第１の形状可変ミラー１５が配置されている。第１の形状可変ミラー１５は、対物レンズ１９の標本２０上での焦点位置を対物レンズ１９の光軸方向に可変制御するもので、反射面が平坦になっている場合は、光学的なパワーがなく、反射面を反射した光を平行光のまま出射し、不図示の電極に電圧が印加されると、反射面を変形（湾曲）し、反射面を反射した光を発散光もしくは収束光として出射するようになっている。

第１の形状可変ミラー１５の反射光路には、光走査手段として走査光学ユニット１６が配置されている。この走査光学ユニット１６は、例えば直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラーを有し、これらのミラーにより標本２０上に集光されるレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

走査光学ユニット１６により２次元走査されたレーザ光の光路上には、瞳投影レンズ１７、中間結像レンズ１８、対物レンズ１９が配置されている。瞳投影レンズ１７と中間結像レンズ１８により対物レンズ１９の瞳が走査光学ユニット１６へ投影される。これにより、走査光学ユニット１６で２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１７、中間結像レンズ１８、対物レンズ１９を介して不図示のステージに載置された標本２０の焦点位置に集光され、標本２０からの光は、上述したと逆の光路をたどって対物レンズ１９、中間結像レンズ１８、瞳投影レンズ１７、走査光学ユニット１６、第１の形状可変ミラー１５及び反射ミラー１４を介してハーフミラー１２（ダイクロイックミラー１３）まで戻るようになっている。

ハーフミラー１２（ダイクロイックミラー１３）の標本２０側から見た透過光路上には、第２の集光位置制御手段としての波面変調器、ここでは第２の形状可変ミラー２１が配置されている。また、第２の形状可変ミラー２１の反射光路には、結像レンズ２２、吸収フィルタ２３、共焦点ピンホール２４、光検出手段としてフォトマル２５が配置されている。共焦点ピンホール２４とフォトマル２５は、共焦点検出手段を構成する。

第２の形状可変ミラー２１は、結像レンズ２２の共焦点ピンホール２４上での焦点位置を結像レンズ２２の光軸方向に可変制御するもので、第１の形状可変ミラー１５と同様に、反射面が平坦になっている場合は、光学的なパワーがなく、反射面を反射した光を平行光のまま出射し、不図示の電極に電圧が印加されると、反射面を変形（湾曲）し、反射面を反射した光を発散光もしくは収束光として出射するようになっている。吸収フィルタ２３は、標本２０からの光から検出したい波長を選択するものである。共焦点ピンホール２４は、対物レンズ１９の焦点と光学的に共役な位置に配置され、標本２０からの光のうち合焦の成分を通過させ、非合焦の成分を遮断して高い空間分解能を得るためのものである。フォトマル２５は、共焦点ピンホール２４を通過した光の強度を検出し、電気信号に変換して出力するようにしている。

第１の形状可変ミラー１５、第２の形状可変ミラー２１及びフォトマル２５には、制御手段としての制御部２６が接続されている。制御部２６は、フォトマル２５からの電気信号を取り込み、このときの信号が最大、つまり共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように第１の形状可変ミラー１５および第２の形状可変ミラー２１の表面形状を制御するようにしている。この場合、制御部２６は、第１の形状可変ミラー１５および第２の形状可変ミラー２１の不図示の電極に対し電圧を印加することで、第１の形状可変ミラー１５および第２の形状可変ミラー２１の反射面を微小に変化させるようにしている。

次に、このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用を、図２−１および図２−２を参照して説明する。図２−１および図２−２は、この第1の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の操作手順を示すフローチャートである。

まず、第１のステップとして、対物レンズ１９の焦点位置の移動や収差補正を行なう場合を説明する。この場合、光学素子切換え手段１０１によりハーフミラー１２を光路上に配置し、吸収フィルタ２３を光路から退避させた後、レーザ光源１０からレーザ光を照射させる（ステップＳ１）。このとき、第２の形状可変ミラー２１は、変形制御されることなく、通常の反射ミラーとして用いられる。

レーザ光源１０から発せられたレーザ光は、ハーフミラー１２で反射し、反射ミラー１４、第１の形状可変ミラー１５で反射して走査光学ユニット１６に入射し、２個のミラーで２次元方向に走査され、瞳投影レンズ１７、中間結像レンズ１８を介して対物レンズ１９に入射し、標本２０上に集光される。このとき、第１の形状可変ミラー１５の不図示の電極に対して電圧を印加し、その反射面を所望の曲率の曲面に変形させることによって、標本２０に対する集光位置を光軸方向の所望位置へ移動させる（ステップＳ２）。ただし、この集光位置の移動を必要としない場合には、ステップＳ２を省略することができる。

標本２０からの反射光は、先の光とは逆に、対物レンズ１９を透過し、中間結像レンズ１８、瞳投影レンズ１７、走査光学ユニット１６、第１の形状可変ミラー１５及び反射ミラー１４を介してハーフミラー１２に入射する。そして、ハーフミラー１２を透過し、第２の形状可変ミラー２１で反射し、結像レンズ２２を介して共焦点ピンホール２４に結像される。さらに、フォトマル２５により共焦点ピンホール２４を通過した光の強度が検出され電気信号として出力される（ステップＳ３）。

この状態で、制御部２６は、第１の形状可変ミラー１５の不図示の電極に対し電圧を印加し、反射面を微小に変化させてその形状を微調整する（ステップＳ４）。

フォトマル２５から出力される電気信号は、制御部２６に入力される。制御部２６は、フォトマル２５からの電気信号が最大、つまり共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように第１の形状可変ミラー１５の不図示の電極に対する電圧を制御し、表面形状を変化させる。すなわち、制御部２６は、フォトマル２５の検出信号が最大値であるか否かを判断し（ステップＳ５）、最大値となっていない場合（ステップＳ５：Ｎｏ）、ステップＳ４からの処理を繰り返す。一方、フォトマル２５の検出信号が最大値となった場合（ステップＳ５：Ｙｅｓ）、第１の形状可変ミラー１５の表面形状を確定させる（ステップＳ６）。これにより、蛍光標本を保持するカバーガラスの屈折率と蛍光標本自体の屈折率の違いや、これら屈折率と空気の屈折率の差によって発生する収差や、レーザ光の集光位置を第１の形状可変ミラー１５を用いて光軸方向に変位させた場合に生じる収差が補正できるようになり、標本２０に対し照明光を理想的に照射することができる。

次に、第２のステップとして、標本２０の蛍光に対する収差補正を行なう場合を説明する。この場合、光学素子切換え手段１０１によりハーフミラー１２に代えてダイクロイックミラー１３を光路上に配置し、吸収フィルタ２３を光路上に配置させた後、レーザ光源１０からレーザ光を照射させる（ステップＳ７）。このとき、第１の形状可変ミラー１５は、ステップＳ６で確定した表面形状のまま用いられる。

この場合も、レーザ光源１０から発せられたレーザ光は、上述と同様に対物レンズ１９に入射し、標本２０上に集光される。また、標本２０からの光は、ダイクロイックミラー１３に入射する。ダイクロイックミラー１３は、標本２０からの光のうち、所定波長の光、ここでは標本２０から発せられる蛍光波長の光のみを透過する。ダイクロイックミラー１３を透過した光は、第２の形状可変ミラー２１で反射し、結像レンズ２２、吸収フィルタ２３を介して共焦点ピンホール２４に結像される。そして、フォトマル２５により共焦点ピンホール２４を通過した光の強度が検出され電気信号として出力される（ステップＳ８）。

この場合も、フォトマル２５から出力される電気信号は、制御部２６に入力される。制御部２６は、フォトマル２５からの電気信号が最大、つまり共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように、今度は、第２の形状可変ミラー２１の不図示の電極に対する電圧を制御し、表面形状を変化させる。すなわち、制御部２６は、第２の形状可変ミラー２１の表面形状を微調整した後（ステップＳ９）、フォトマル２５の検出信号が最大値であるか否かを判断し（ステップＳ１０）、最大値となっていない場合（ステップＳ１０：Ｎｏ）、ステップＳ９からの処理を繰り返す。一方、フォトマル２５の検出信号が最大値となった場合（ステップＳ１０：Ｙｅｓ）、第２の形状可変ミラー２１の表面形状を確定させる（ステップＳ１１）。これにより、標本２０からの蛍光に対する色収差を補正することができる。

したがって、このようにすれば、ハーフミラー１２及びダイクロイックミラー１３を選択的に光路上に配置可能とし、第１のステップとして、ハーフミラー１２を光路上に配置し、レーザ光源１０からのレーザ光をハーフミラー１２、第１の形状可変ミラー１５、対物レンズ１９より標本２０に照射するとともに、標本２０からの光をハーフミラー１２を介して共焦点ピンホール２４に集光し、この共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように第１の形状可変ミラー１５の表面形状を変化させ、対物レンズ１９の標本２０上での焦点位置を移動させるとともに収差を補正することで、標本２０を保持するカバーガラスの屈折率と蛍光標本自体の屈折率の違いや、これら屈折率と空気の屈折率の差などによって発生する収差を補正でき、標本２０に対して照明光を理想的に照射することができる。また、第２のステップとして、ダイクロイックミラー１３を光路上に配置し、標本２０からの光のうち、標本２０から発せられる蛍光波長の光のみをダイクロイックミラー１３、第２の形状可変ミラー２１を介して共焦点ピンホール２４に集光し、この共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように第２の形状可変ミラー２１の表面形状を変化させ、共焦点ピンホール２４上の集光位置を移動させることで、標本２０からの蛍光に対する色収差を補正することもできる。これにより、これら第１及び第２のステップを通じて、第１の形状可変ミラー１５と第２の形状可変ミラー２１の表面形状をそれぞれ標本２０の照明光と標本２０からの蛍光に対して最適に設定することにより、対物レンズの焦点位置を移動できるとともに、屈折率による収差や色収差を補正でき、高画質の標本画像を取得することができる。

形状可変ミラーの表面形状は、特定の波長に対して最適化される。よって、レーザ光（照明光）を標本に正しく集光させるための可変形状ミラーを、照明光と検出光の両方が通過する共通光路に配置すると、蛍光観察のようにレーザ光とは異なる波長の光を検出する場合、検出光は形状可変ミラーの影響を受けて共焦点ピンホールに正しく集光できなくなる。しかしながら、この第１の実施の形態によれば、検出光（蛍光）のみに作用する第２の形状可変ミラー２１を設けたので、蛍光の収差を補正して正しく集光させることができる。

（変形例）
第１の実施の形態では、制御部２６によりフォトマル２５からの電気信号が最大、つまり共焦点ピンホール２４を通る光量が最大になるように、第１の形状可変ミラー１５及び第２の形状可変ミラー２１の表面形状を制御するようにしたが、例えば、上述した第１のステップと第２のステップで取得された第１の形状可変ミラー１５と第２の形状可変ミラー２１のそれぞれの表面形状の情報をデータベース化して制御部２６に記憶しておき、その後、このデータベースの情報に基づいて第１の形状可変ミラー１５と第２の形状可変ミラー２１の表面形状を制御するようにしてもよい。この場合、データベースに記憶される内容は、例えば、対物レンズ１９の焦点位置、標本２０の種類、標本２０から発せられる蛍光波長域とともに、これらに対し最適状態に制御された第１の形状可変ミラー１５と第２の形状可変ミラー２１の表面形状の情報である。

このようにすれば、データベースに基づいて第１の形状可変ミラー１５と第２の形状可変ミラー２１の表面形状を最適に制御できるので、ダイクロイックミラー１３を光路上に配置したままで、連続的に対物レンズ１９の焦点位置を移動するとともに収差を補正することができるようになる。

なお、形状可変ミラー１５，２１の表面形状の制御として、ステップＳ５，Ｓ１０では共焦点ピンホール２４を通過する光量を最大化するように説明したが、フォトマル２５からの出力信号に対して所定の基準値を設定して、その基準値を超えた時点で表面形状を確定するようにしてもよい。

また、第１のステップにおいて、ステップＳ１では標本から反射したレーザ光を共焦点検出手段に導くために、光学素子切り換え手段１０１でハーフミラー１２を選択するようにした。しかし、蛍光検出用のダイクロイックミラー１３は、レーザ光を完全に遮断せずにわずかに透過させるような透過率特性をもつ場合が多い。その場合には、蛍光検出用のダイクロイックミラー１３を選択していても、吸収フィルタ２３を光路から外せば、検出器であるフォトマル２５は感度が非常に高いので、第１のステップ（ステップＳ１〜Ｓ６）の処理を実行できる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。図３は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、共焦点ピンホール２４は、制御部２６により、ピンホール径を第１の形状可変ミラー１５の表面形状と連動して変えられるようになっている。つまり、第１の形状可変ミラー１５の表面形状を変化させて対物レンズ１９の焦点位置を移動させた場合、中間結像レンズ１８から対物レンズ１９に入射される光が平行光でないため、対物レンズ１９のＮＡが変化し、微小ながらも共焦点ピンホール２４の位置におけるビーム回折径が変わることが知られている。この場合、理論計算により、対物レンズ１９の焦点位置から実質の対物レンズ１９のＮＡを計算でき、さらに、このときのＮＡから共焦点ピンホール２４の位置におけるビーム回折径を計算で求めることができる。

そこで、第１の形状可変ミラー１５の表面形状が変化され、対物レンズ１９の焦点位置が移動したような場合、制御部２６により、このときの対物レンズ１９の焦点位置から理想な共焦点ピンホール２４の大きさを演算により求め、この結果に基づいて共焦点ピンホール２４の径を調整するようにする。

このようにすれば、第１の形状可変ミラー１５による対物レンズ１９の焦点位置に対応して、常に最適な共焦点ピンホール２４の径を設定できるので、対物レンズ１９の焦点に合った光のみ共焦点ピンホール２４を通過させることができ、対物レンズ１９の光軸方向、つまりＺ軸方向の分解能を確保し、高画質の標本画像を取得することができる。

一方、吸収フィルタ２３は、異なる波長域の光に対応する特性の異なるものが複数個用意されている。これら複数の吸収フィルタ２３は、ターレット１０２に搭載され、選択的に光路上に配置可能になっている。この場合、ターレット１０２は、制御部２６の指示により第２の形状可変ミラー２１の表面形状の変化と連動して、標本２０に適した特性の吸収フィルタ２３を光路上に配置するようになっている。

このようにすれば、標本２０に最適な吸収フィルタ２３が光路上に配置できるようになるので、第２の形状可変ミラー２１によって色収差が補正された所望波長域の光のみを共焦点ピンホール２４に導くことができるようになり、さらに高画質の標本画像を取得することができる。

なお、第２の実施の形態では、共焦点ピンホール２４の径の設定と、最適な吸収フィルタ２３の光路上への配置をそれぞれ実行するようにしているが、少なくとも一方のみを用意し、これを実行することもできる。

また、例えば、第１の形状可変ミラー１５により対物レンズ１９の焦点位置を積極的に移動させることにより、Ｚ軸方向に観察位置が異なる複数枚の標本画像を取得することができるが、このような場合も、対物レンズ１９の焦点位置に対応させて、最適な共焦点ピンホール２４の径を設定するようにすれば、対物レンズ１９の焦点に合った光をのみ共焦点ピンホール２４を通過させることができ、Ｚ軸方向の分解能を確保し、高画質の標本画像を取得することができる。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。図４は、この第３の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。第１の実施の形態と同一の構成部分には同一符号を付して示している。

図４において、符号３０は、複数波長のレーザ光を発生する多波長レーザ光源を示している。なお、多波長レーザ光源としては、波長の異なる単一波長のレーザ光源を複数台配置して、それぞれのレーザ光をミラー等でひとつの光軸に合成するような構成であってもよい。多波長レーザ光源３０からの多波長レーザ光は、コリメート光学系１１を透過した後、例えば音響光学素子フィルタ（ＡＯＴＦ：Acousto-optical tunable filter）のような波長選択手段３１に入射するようになっている。波長選択手段３１により所望波長のレーザ光のみが選択されて出射する。選択されたレーザ光は、ハーフミラー１２またはダイクロイックミラー１３、集光位置制御手段である形状可変ミラー１５、走査光学ユニット１６を順に経由して対物レンズ１９に導入され、標本２０を照射するようになっている。

また、形状可変ミラー１５の面形状がデータベース２６ａとして制御部２６に記憶され、制御できるようになっている。データベース２６ａは、多波長レーザ光源３０からの各波長のレーザ光が標本２０上で光軸方向の同じ位置に集光するように、レーザ波長ごとに最適に設定された形状可変ミラー１５の面形状を記憶している。したがって、制御部２６は、波長選択手段３１において選択したレーザ光の波長に対応する形状可変ミラー１５の面形状を、このデータベース２６ａから読み出して、形状可変ミラー１５に設定する制御ができる。

また、検出手段において、共焦点ピンホール２４を通過した光を平行光に変換するコリメータレンズ２７と、平行光となった光を波長に応じて分岐させるダイクロイックミラー２８とを備えている。ダイクロイックミラー２８の透過光路と反射光路には、それぞれ吸収フィルタ２３ａ，２３ｂおよびフォトマル２５ａ，２５ｂが配置されている。ダイクロイックミラー２８、吸収フィルタ２３ａ，２３ｂの波長特性を適宜設定することにより、２種類の異なる波長の観察光を同時に検出できる。

例えば、多重染色された蛍光標本などの観察において、２種類のレーザ波長λ１，λ２を励起光として選択して光走査手段による走査を行い、各励起波長に対応して発生するそれぞれの蛍光を検出して画像生成することが行われる。この場合、ラスタースキャンの１ラインごとにレーザ波長を切り換えてシーケンシャルに異なる蛍光波長を取得したい場合、まずレーザ波長λ１のみを選択してＸ方向に１ライン走査して蛍光を検出し、つぎにレーザ波長λ２のみを選択して同じ１ラインを走査して蛍光検出する。つぎに、Ｙ方向に１画素分移動して、つぎのＸ方向ラインを同じようにレーザ波長λ１，λ２を順に切り換えて２回走査する、という手順を繰り返して、レーザ波長λ１，λ２のそれぞれに対して１画面分の画像を生成する。この場合には、レーザ走査に同期してレーザ光波長を速く切り換えることが要求される。一般的に形状可変ミラーではミラーの形状切換をミリ秒（ｍｓｅｃ）レベルでできるので、この第３の実施の形態の構成によれば速い波長切換に追従して第１の形状可変ミラー１５も切換動作を行い、各波長のレーザ光を標本２０上で光軸方向の同じ位置に集光させることが可能となる。

このように、この第３の実施の形態にかかるレーザ走査型顕微鏡を用いれば、多波長のレーザ光を使用しても、各波長のレーザ光が光軸方向の同じ位置で標本２０を走査できるようになる。つまり、シーケンシャルに異なるレーザ波長の光を照射して、それぞれに対応する蛍光を同一の観察断面に対して取得できるようになる。

また、この第３の実施の形態において、図５に示すように色収差を補正する第２の形状可変ミラー２１を検出光路に設けることによって、蛍光標本を走査する場合、検出する蛍光波長の色収差を補正できるので、検出精度を向上できる。この場合も形状可変ミラー２１の各蛍光波長ごとの最適形状をデータベース２６ａとして制御部２６に記憶させておき、波長切換と同期して形状可変ミラー２１の形状の切換制御を行うこととなる。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、光学素子切換え手段１０１は、ハーフミラー１２とダイクロイックミラー１３の光路への切換えを手動で行なうようにしたが、制御部２６により不図示のモータを駆動してハーフミラー１２とダイクロイックミラー１３の光路への切換えを自動的に行なうようにもできる。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。 図１に示した走査型レーザ顕微鏡の操作手順を示すフローチャートである。 図１に示した走査型レーザ顕微鏡の操作手順を示すフローチャートである。 本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。 本発明の第３の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。 本発明の第３の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の変形例の概略構成を示す図である。

符号の説明

１０ レーザ光原
１１ コリメート光学系
１２ ハーフミラー
１３ ダイクロイックミラー
１４ 反射ミラー
１５ 形状可変ミラー
１６ 走査光学ユニット
１７ 瞳投影レンズ
１８ 中間結像レンズ
１９ 対物レンズ
２０ 標本
２１ 形状可変ミラー
２２ 結像レンズ
２３，２３ａ，２３ｂ 吸収フィルタ
２４ 共焦点ピンホール
２５，２５ａ，２５ｂ フォトマル
２６ 制御部
２６ａ データベース
２７ コリメータレンズ
２８ ダイクロイックミラー
３０ 多波長レーザ光原
３１ 波長選択手段
１０２ ターレット

Claims (17)

1. レーザ光を発生する光源と、
   前記レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
   前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
   前記レーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記標本上の第１集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させる第１の集光位置制御手段と、
   前記レーザ光とは波長が異なる光であって前記第１集光位置から発せられる観察光および前記第１集光位置からの反射光の少なくとも一方を前記レーザ光の光路から分岐させる分岐素子と、
   前記第１集光位置からの光を共焦点検出する共焦点ピンホールを有する共焦点検出手段と、
   前記分岐素子と前記共焦点ピンホールとの間の光路に設けられ、前記共焦点検出手段に対して集光される前記観察光の第２集光位置を前記共焦点ピンホールに一致させる第２の集光位置制御手段と、
   前記共焦点検出手段が検出する光を選択する光選択手段と、
   を備えたことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記分岐素子は、前記光源と前記第１の集光位置制御手段との間の光路に設けられ、前記光源から出射した前記レーザ光を前記第１の集光位置制御手段に導くと共に、前記第１集光位置から前記第１の集光位置制御手段を経由して入射した光を、前記光路から分岐させて前記第２の集光位置制御手段へ向かう光路に導くことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記第１集光位置からの光のうち該第１集光位置からの反射光に対し前記共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記第１の集光位置制御手段に前記第１集光位置を移動させる制御を行うとともに、前記第１集光位置からの光のうち前記観察光に対し前記共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記第２の集光位置制御手段に前記第２集光位置を移動させる制御を行う制御手段を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記光選択手段は、前記第１集光位置からの反射光を選択するハーフミラーと、前記観察光として所定波長のみの光を選択するダイクロイックミラーとを切換可能に備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記第１及び第２の集光位置制御手段の少なくとも一方は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
6. 前記制御手段は、前記波面変調器の反射面形状を記憶したデータベースを備え、該データベースから読み出した前記反射面形状に基づいて前記波面変調器を制御することを特徴とする請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
7. 前記制御手段は、前記第１の集光位置制御手段による前記第１集光位置の移動に連動して前記共焦点ピンホールの径を変更する制御を行うことを特徴とする請求項３〜６のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
8. 前記光選択手段は、さらに、特性の異なる複数の波長選択フィルタを有し、
   前記制御手段は、前記第２の集光位置制御手段による前記第２集光位置の移動に連動して、複数の前記波長選択フィルタのうち前記標本に適した特性の波長選択フィルタを光路上に配置する制御を行うことを特徴とする請求項３〜７のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
9. 複数波長を含んだ多波長レーザ光を発生する光源と、
   前記多波長レーザ光の中から１以上の波長のレーザ光を抽出する波長抽出手段と、
   前記レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
   前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
   前記レーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記標本上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させ、基準波長の前記レーザ光の前記集光位置に対する各波長の前記レーザ光の前記集光位置の前記光軸方向のずれを解消する第１の集光位置制御手段と、
   前記レーザ光とは波長が異なる光であって前記集光位置から発せられる観察光を前記レーザ光の光路から分岐させる分岐素子と、
   前記集光位置からの光を共焦点検出する共焦点ピンホールを有する共焦点検出手段と、
   前記共焦点検出手段が検出する光を選択する光選択手段と、
   前記波長抽出手段に複数の波長の前記レーザ光を波長ごとに順次抽出させるとともに、この抽出した前記レーザ光の波長に応じて、前記第１の集光位置制御手段に前記集光位置の前記光軸方向のずれを解消させる制御を行う制御手段と、
   を備え、
   前記制御手段は、前記光走査手段が前記レーザ光を１ライン走査するごとに、前記波長抽出手段が抽出する前記レーザ光の波長を切り換える制御を行い、
   前記第１の集光位置制御手段は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
10. 前記分岐素子と前記共焦点ピンホールとの間の光路に設けられ、前記共焦点検出手段に対して集光される前記観察光の検出集光位置を前記共焦点ピンホールに一致させる第２の集光位置制御手段を備えたことを特徴とする請求項９に記載のレーザ走査型顕微鏡。
11. 複数波長を含んだ多波長レーザ光を発生する光源と、
    前記多波長レーザ光の中から１以上の波長のレーザ光を抽出する波長抽出手段と、
    前記レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
    前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
    前記レーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記標本上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させ、基準波長の前記レーザ光の前記集光位置に対する各波長の前記レーザ光の前記集光位置の前記光軸方向のずれを解消する第１の集光位置制御手段と、
    前記レーザ光とは波長が異なる光であって前記集光位置から発せられる観察光を前記レーザ光の光路から分岐させる分岐素子と、
    前記集光位置からの光を共焦点検出する共焦点ピンホールを有する共焦点検出手段と、
    前記共焦点検出手段が検出する光を選択する光選択手段と、
    前記分岐素子と前記共焦点ピンホールとの間の光路に設けられ、前記共焦点検出手段に対して集光される前記観察光の検出集光位置を前記共焦点ピンホールに一致させる第２の集光位置制御手段と、
    を備えたことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
12. 前記分岐素子は、前記光源と前記第１の集光位置制御手段との間の光路に設けられ、前記光源から出射した前記レーザ光を前記第１の集光位置制御手段に導くと共に、前記集光位置から前記第１の集光位置制御手段を経由して入射した光を、前記光路から分岐させて前記第２の集光位置制御手段へ向かう光路に導くことを特徴とする請求項１０又は１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
13. 前記第１の集光位置制御手段は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とする請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
14. 前記第２の集光位置制御手段は、印加電圧に応じて反射面を変形する波面変調器からなることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
15. 前記波面変調器の反射面形状を記憶したデータベースを有し、該データベースから読み出した前記反射面形状に基づいて前記波面変調器を制御する制御手段を備えたことを特徴とする請求項９、１３、及び１４のいずれか一つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
16. 前記データベースは、前記レーザ光の波長および集光位置に応じた複数の反射面形状を記憶することを特徴とする請求項６または１５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
17. 光源が発したレーザ光を対物レンズを介して標本上に集光させるレーザ光照射ステップと、
    前記レーザ光の前記標本上の第１集光位置を２次元走査させるとともに、該第１集光位置からの光を共焦点ピンホールを介して共焦点検出する共焦点検出ステップと、
    前記第１集光位置からの光のうち該第１集光位置で反射した前記レーザ光に対し、前記共焦点ピンホールを通過する光量が最大となるように前記第１集光位置を前記対物レンズの光軸方向に移動させる第１集光位置移動ステップと、
    前記第１集光位置からの光のうち前記レーザ光とは波長が異なる光であって該第１集光位置から発せられる観察光に対し、前記共焦点ピンホールを通過する光量が最大となるように、前記共焦点検出ステップによって集光される前記観察光の第２集光位置を該観察光の光路方向に移動させる第２集光位置移動ステップと、
    を含むことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡の画像取得方法。

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