JP4934281B2 - 全反射蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、全反射照明により発生するエバネッセント照明を用いて蛍光観察を行なう全反射蛍光顕微鏡に関する。

最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察する顕微鏡として、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）が注目されている。

この全反射蛍光顕微鏡は、カバーガラスと標本の境界面で照明光を全反射させた時に、標本側に数１００ｎｍ以下のわずかな範囲にしみ出すエバネッセント光と呼ばれる光を利用して蛍光物質を励起する。このため、カバーガラス近傍のわずかな範囲の蛍光だけが観察されるので、バックグランドが非常に暗く、コントラストの高い蛍光観察や微弱な蛍光の観察が可能である。

ところで、このような全反射蛍光顕微鏡を用いた生物研究の現場においては、境界面近傍のより浅い面内をコントラスト良く観察したい場合も有れば、或る程度の深さまで照明光を届かせて広範囲の観察をしたい場合も有る。このため、観察対象に応じてエバネッセント光のしみ出し深さが変えられるようになっているのが望ましい。

境界面からのエバネッセント光のしみ出し深さは、非特許文献１において開示されており、以下の公式が成り立つことが知られている。

ｄ＝λ／４π｛（ｎ_１ ^２ｓｉｎθ_１ ^２−ｎ_２ ^２）｝^１／２ （１）
ここで、ｄ：エバネッセント光のしみ出し深さ、λ：光の波長、ｎ_１：入射側（カバーガラス）屈折率、θ_１：入射角、ｎ_２：出射側（標本）屈折率である。
なお、標本照射角度ＮＡは、
ＮＡ＝ｓｉｎθ_１・ｎ_１
で求められる。

上式から明らかなように、全反射照明角度の境界面に対する照明光の入射角、すなわち境界面の垂線に対する照明光の傾射角が大きい程、エバネッセント光のしみ出し深さは浅くなる。

このような考え方を利用したものとして、特許文献１では、対物レンズの後側焦点面内における集光光の焦光点の位置を反射光学系の回転により調整することで、標本側に導入される光の入射角を調整可能にしている。
特開２００２−３１７６２号公報 Daniel Axelrod, "5. Total Internal Reflection Fluorescence at Biological Surfaces", Noninvasive Technics in Cell Biology: 93-127, 1990, Wiley-Liss, Inc., pp111-113

ところで、これまでの全反射蛍光顕微鏡は、１種類の蛍光色素で染色した標本に対し１種類の励起波長のレーザ光を使用し、このレーザ光の励起により発生した蛍光を観察するようなものがほとんどであった。しかし、最近になって、１つの標本を複数の蛍光色素で染色した多重染色標本に対し、複数種類の励起波長のレーザ光を使用し、それぞれの励起により発生した蛍光を観察するものが用いられるようになっている。この場合、標本に照射するレーザ光は、それぞれの蛍光色素に最適な波長である必要があり、しかもその蛍光を励起する複数波長のレーザ光はそれぞれ光強度が安定していることが必要である。また、蛍光色素の退色を極力防止するために複数のレーザ光照射のＯＮ／ＯＦＦ制御も同時に必要となる。

ところが、特許文献１に開示される全反射蛍光顕微鏡は、１種類の蛍光色素で染色した標本に対し１種類の励起波長のレーザ光を使用し、このレーザ光の励起によって発生した蛍光を観察するものであり、同時に２波長以上の波長のレーザ光の強度を安定に制御することはできない。さらに、多重染色された標本の蛍光観察に対応するものでない。

一方、多重染色された標本の全反射照明による蛍光観察では、（１）式からも明らかなように、それぞれの蛍光色素を励起するレーザ光の波長によってガラス表面から標本側にしみ出すエバネッセント光のしみ出し深さが変化する。このため、例えば、エバネッセント光のしみ出し深さを同じにして、各異なるレーザ光波長ごとの蛍光を観察したいような場合は、それぞれの波長ごとに入射角を設定する必要がある。特に、エバネッセント光のしみ出し深さは、標本のどの程度の深さまで観察したいかということであり、この要求は、検鏡者の観察目的によっても異なるものである。このため、レーザ光の波長を切り替えながらエバネッセント光のしみ出し深さを同じ量に設定したい場合は、検鏡者に対しレーザ光の波長ごとに入射角を調整するという面倒な作業を強いるという問題があった。

さらに、しみ出し光のしみ出し深さは直接観察し、または測定することはできない。しかし、しみ出し深さは光軸方向の観察範囲を決める要素であるので、その範囲を知り、その上で照明条件が変わっても同じ深さにすることは得られた画像やデータを解釈、分析するために重要な要素である。しみ出し深さは対物レンズの種類、照明光導入の位置、照明光の波長などのファクターで決まる。

また、設定された条件を入力し、または現在の条件を読み込んで求められた、しみ出し深さを表示すれば、容易にその深さを知ることができる。また、目的の深さを得るための各ファクターの値を表示すれば、その中から最適な組合せを選べばよい。各ファクターの組合せの種類は１つの場合、複数ある場合がある。もし、他に目的を満たすファクターの組合せがなければその旨を表示する。

本発明は、異なるレーザ光の波長に対してエバネッセント光のしみ出し深さを自由に設定できる全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。さらに、標本に照射する複数の波長からなるレーザ光強度を同時に安定に制御できる全反射顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の第１局面に係る全反射顕微鏡は、複数の波長のレーザ光を発生する光源と、前記光源からのレーザ光を標本に対し対物レンズを介して所定の入射角で照射し、エバネッセント照明を発生させる集光光学系と、前記エバネッセント照明により標本より発生する蛍光を観察する蛍光観察手段と、前記標本に照射されるレーザ光の入射角を調整可能にした入射角調整手段と、前記光源からのレーザ光の波長の切り替えに応じて前記エバネッセント光のしみ出し深さが同じ量になるように前記入射角調整手段を制御する制御手段とを具備した。

本発明の第２局面に係る全反射顕微鏡は、複数の波長のレーザ光を発生する光源と、前記光源からのレーザ光を標本に対し対物レンズを介して所定の入射角で照射し、エバネッセント照明を発生させる集光光学系と、前記エバネッセント照明により標本より発生する蛍光を観察する蛍光観察手段と、前記標本に照射されるレーザ光の入射角を調整可能にした入射角調整手段と、前記光源からのレーザ光の波長の切り替えに応じて前記エバネッセント光のしみ出し深さを自由に設定できるように前記入射角調整手段を制御する制御手段とを具備した。

本発明によれば、エバネッセント光のしみ出し深さを励起波長の切り替えに関係なく常に同じ量に設定できるので、これまで検鏡者に強いられていた励起波長の切り替えごとに入射角を調整するような面倒な作業を省くことができ、所望する蛍光観察を容易に実現できる。

複数の波長のレーザ光を安定に制御し、且つ検出系と同期させることにより、多重染色された標本からの蛍光を高速に選択的に取得することができ、モニタ（表示装置）上でそれぞれの蛍光画像を切替表示したり、複数の蛍光画像を重ねて表示することができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。
図１において、レーザ光源ユニット１は、エバネッセント照明に用いられる、例えば４８８ｎｍのレーザ光を発振するアルゴン（Ａｒ）レーザ２と５４３ｎｍのレーザ光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３を有している。他に、６３３ｎｍのレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザを有していても良い。

グリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射する。つまり、ここでのダイクロイックミラー５は、５４３ｎｍのレーザ光を反射し、４８８ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、波長選択用の音響光学素子(ＡＯＴＦ)６が配置されている。ここでの音響光学素子６は、４８８ｎｍと５４３ｎｍのレーザ光を選択し、それぞれの波長を切り替え可能にしている。なお、音響光学素子に代えて電気光学素子や、液晶シャッタで代用してもよい。

なお、別の波長選択手段として、異なる波長のレーザ光を発する複数のＬＤ光源を並べ、これらのＬＤ光源の電源に供給する電流値を可変してオンオフさせることで、所望する波長のレーザ光を選択するような方法もある。

音響光学素子６の出射端には、ファイバ７の入射端が配置され、ファイバ７を介してエバネッセント照明用のレーザ光を落射投光管としてのエバネッセント投光管８に導く。

エバネッセント投光管８は、直線状の投光管本体８０１と、投光管本体８０１に対し直交する方向に突出した導光管８０２を有し、投光管本体８０１の一端部が倒立顕微鏡本体９の落射投光管取付部に図示しないネジにより固定されている。

エバネッセント投光管８は、投光管本体８０１の他方端に、落射照明用光源１０が設けられている。落射照明用光源１０には、通常顕微鏡の落射蛍光照明用として、例えば、水銀ランプが用いられる。

エバネッセント投光管８の導光管８０２先端には、レーザ導入部８ａが設けられている。このレーザ導入部８ａには、ファイバ７の出射端が接続されている。

ファイバ７端から出射するレーザ光の光路上には、コリメートレンズ１１と入射角度調整手段としてのガルバノミラーユニット１２が配置されている。コリメートレンズ１１は、ファイバ７から発せられる発散光を平行光に変換する。ガルバノミラーユニット１２は、落射照明用光源１０の照明光の光路とファイバ７端からのレーザ光の光路との交点に配置される偏向ミラーとしてガルバノミラー１２ａを有するもので、図示しない電動機構により回転軸１２ｂを中心にガルバノミラー１２ａを回転させ、ファイバ７からのレーザ光（励起光）の偏向を可能としている。また、ガルバノミラーユニット１２は、図示しない切替機構により光路から挿脱可能になっている。つまり、ガルバノミラーユニット１２は、光路上からの挿脱によって、ファイバ７からのエバネッセント照明と落射照明用光源１０からの通常の落射蛍光照明との光路切換えを行っている。図示例では、ガルバノミラーユニット１２が光路に挿入された状態で、エバネッセント照明を行う状態に切換えられている。

ガルバノミラー１２ａの反射光路には、集光光学系を構成する集光レンズ１３が配置されている。集光レンズ１３は、ファイバ７の出射端面を、後述する対物レンズ１８の後側焦点位置となる瞳位置１８ａに集光させる。

集光レンズ１３より出射するレーザ光の光路には、キューブターレット１４が配置されている。このキューブターレット１４は、複数のキューブユニットを保持可能にしたもので、モータ１５により図示しないベアリングなどの摺動機構を介して回転切換え可能な構成になっている。図示例では、２種類のキューブユニット１６、１７が装着され、このうちのキューブユニット１６が集光レンズ１３からのレーザ光の光路上に位置決めされている。

キューブユニット１６は、波長選択光学素子として、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長の光を励起光として反射し、この励起波長により標本１９から発生される５００〜５４０ｎｍ、５６０ｎｍの波長の蛍光を透過する特性を有する励起ダイクロイックミラー１６ａを有している。また、キューブユニット１７は、波長選択光学素子として、落射照明用光源１０からの所定波長の光を反射し、この光により標本１９から発生される蛍光を透過する特性を有するダイクロイックミラー１７ａと、標本１９から発生される蛍光のうち、必要とする蛍光の波長のみを透過するバリアフィルタ１７ｂを有している。キューブユニット１６、１７は、他に観察したい蛍光がある場合は、キューブターレット１４から取り外して、別のキューブユニットに交換することも可能である。

キューブユニット１６の励起ダイクロイックミラー１６ａ（集光レンズ１３からのレーザ光の光路上に位置決めされている）の反射光路には、対物レンズ１８が配置されている。

対物レンズ１８の前側焦点位置には、蛍光色素で染色された標本１９が配置されている。標本１９は、倒立顕微鏡本体９のステージ２０上に配置され、カバーガラス２１を固着している。この場合、カバーガラス２１と対物レンズ１８の間には、高いＮＡを確保してエバネッセント照明による全反射を起こさせるようにするためのイマージョンオイルが充填されている。

キューブユニット１６の励起ダイクロイックミラー１６ａ（集光レンズ１３からのレーザ光の光路上に位置決めされている）の透過光路２２ａには、観察光学系を構成する結像レンズ２２、反射ミラー２３が配置されている。

反射ミラー２３は、図示しない切替機構により光路上から挿脱可能になっている。この場合、反射ミラー２３の光路上への挿脱は、単独でも、上述したガルバノミラーユニット１２の光路への挿脱と連動させてもよい。図示例では、反射ミラー２３が光路に挿入された状態を示している。

反射ミラー２３が光路上に挿入されている状態で、反射ミラー２３の反射光路には、蛍光観察手段を構成するフィルタホイール２４が配置されている。フィルタホイール２４は、複数（図示例では２個）のフィルタ２４ａ、２４ｂを保持にしたもので、モータ２５により図示しない摺動機構を介して光路上への切換えを可能にしている。この場合フィルタ２４ａは、４８８ｎｍの励起波長により発生した蛍光を、フィルタ２４ｂは、例えば５４３ｎｍの励起波長により発生した蛍光を透過させる。なお、図示例では、フィルタ２４ａが光路上に位置決めされている。

フィルタホイール２４を透過した光路上には、撮像手段としてのＣＣＤカメラ２６が配置されている。ＣＣＤカメラ２６には、結像レンズ２２を透過した標本１９からの蛍光が導かれ撮像面２６ａに結像される。

反射ミラー２３が光路から外れた状態で、目視観察光路２２ｂには、反射ミラー２７と目視観察用ユニット２８が配置されている。目視観察用ユニット２８では、標本１９からの蛍光のうちキューブユニット１７に設けられるバリアフィルタ１７ａにより選択された蛍光が結像レンズ２２を透過して目視観察される。

一方、音響光学素子６、キューブターレット１４を回転駆動するモータ１５、フィルタホイール２４を回転駆動するモータ２５およびＣＣＤカメラ２６には、制御手段としての制御部２９が接続されている。制御部２９は、これら音響光学素子６、モータ１５、２５およびＣＣＤカメラ２６に制御信号を出力するとともに、ＣＣＤカメラ２６で撮像した画像データを処理してモニタ３０に表示可能にしている。また、制御部２９には、記憶手段としての記憶部２９ａが設けられている。

この場合、制御部２９は、レーザ光源ユニット１のアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３のそれぞれの励起波長ごとに、エバネッセント光のしみ出し深さｄを同じ量にするための入射角θ_１を計算により求め、これら入射角θ_１を得るためのガルバノミラー１２ａの角度を制御情報として記憶部２９ａに記憶している。そして、エバネッセント光のしみ出し深さｄを同じ量にして蛍光観察を行なう場合は、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３によるレーザ波長の切替えに応じて記憶部２９ａより対応する制御情報を読み出し、ガルバノミラー１２ａの角度を制御するようにしている。

また、制御部２９は、レーザ光源ユニット１のアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３によるそれぞれのレーザ波長について、異なるエバネッセント光のしみ出し深さｄを得るための入射角θ_１を求め、これら入射角θ_１を得るためのガルバノミラー１２ａの角度情報を記憶部２９ａに記憶している。そして、エバネッセント光のしみ出し深さｄを変更しながら蛍光観察を行なう場合は、エバネッセント光のしみ出し深さｄを指定すると、記憶部２９ａよりアルゴンレーザ２またはグリーンヘリウムネオンレーザ３に対応する角度情報が読み出され、ガルバノミラー１２ａの角度を制御するようにしている。

上記のように構成した実施の形態の作用を説明する。

まず、制御部２９によりキューブユニット１６を光路上に切り換え、レーザ光源ユニット１の４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３のそれぞれのレーザ光を標本１９に照射し、標本１９から発生する蛍光を取得する場合を説明する。この場合、標本１９は、５２０ｎｍと５８０ｎｍにそれぞれ蛍光波長のピークを有するような蛍光色素で２重染色がなされているものとする。

この状態で制御部２９はＣＣＤカメラ２６に対し画像取り込み開始タイミング、画像取り込み終了タイミング（または、画像取り込みタイミングと画像取り込み時間）を示すトリガー信号と、音響光学素子６に対しレーザ光源ユニット１のアルゴンレーザ２から発振する波長４８８ｎｍのレーザ光を選択する指示信号と、照射開始タイミング、照射終了タイミング（または照射開始タイミングと照射時間）を示すトリガー信号を発し、音響光学素子６を駆動してレーザを出射している間、ＣＣＤカメラ２６を露光するように駆動する。

また、励起波長を切替えて全反射照明による蛍光観察を行う場合、励起波長が切り替わるとエバネッセント光のしみ出し深さが変化する。これを補正するためにガルバノミラー１２ａの角度を励起波長ごとに切替えて使用する場合もある。この場合制御部２９は前記ＣＣＤカメラ２６と、音響光学素子６に対する指示信号に加え、それに同期してガルバノミラー１２ａを駆動する信号を発し、音響光学素子６を駆動してレーザを出射している間、ガルバノミラー１２ａを所定の角度に固定するように駆動する。

続けて、モータ１５に指示してキューブユニット１６が光路上に位置するように、キューブターレット１４を駆動する。さらに、モータ２５にも指示し、フィルタホイール２４を回転させてフィルタ２４ａを光路に挿入させる。
この状態で、アルゴンレーザ２から発振したレーザ波長４８８ｎｍは、ダイクロイックミラー５、音響光学素子６を通過し、ファイバ７の入射端に導かれる。

ファイバ７から出射したレーザ光は、エバネッセント投光管８のコリメートレンズ１１を介してガルバノミラーユニット１２のガルバノミラー１２ａで反射される。この場合、予めエバネッセント光のしみ出し深さｄを指定すると、このしみ出し深さｄを得るためのガルバノミラー１２ａの角度情報（アルゴンレーザ２に対応するもの）が記憶部２９ａより読み出され、ガルバノミラー１２ａの角度が制御される。

ガルバノミラー１２ａで反射した光は、集光レンズ１３を通ってキューブユニット１６に導かれる。キューブユニット１６に搭載された励起ダイクロイックミラー１６ａは、４８８ｎｍを反射するので、レーザ光は、上方に反射され、対物レンズ１８の後側焦点位置の瞳位置１８ａの端に集光される。対物レンズ１８の瞳位置１８ａに集光したレーザ光は、所定角度で斜め方向からカバーガラス２１の標本側界面を照射する。この角度は、レーザ光が、全反射を起こす角度に設定されており、これによりレーザ光のごく一部がカバーガラス２１の標本側界面から標本１９側へしみ出し、標本１９の深さ方向へしみ出す光がエバネッセント光として発生する。

このようなエバネッセント光の照明により標本１９から蛍光が発せられると、この蛍光（５００〜５４０ｎｍ）は、対物レンズ１８を透過し、キューブユニット１６内の励起ダイクロイックミラー１６ａを透過し、結像レンズ２２に入射する。そして、蛍光は、反射ミラー２３で反射され、フィルタホイール２４のフィルタ２４ａを介してＣＣＤカメラ２６の撮像面２６ａに結像し、エバネッセント照明による蛍光観察像として撮像される。撮像された画像データはアルゴンレーザ２から発振したレーザ波長４８８ｎｍで標本１９を照射したときの蛍光（５００−５４０ｎｍ）画像として制御部２９の記憶部２９ａに記憶される。

次に、制御部２９は、ＣＣＤ２６に対して、画像取り込み開始タイミング、画像取り込み終了タイミング（または画像取り込みタイミングと画像取り込み時間）を示すトリガー信号と、音響光学素子６に対しレーザ光源ユニット１のグリーンヘリウムイオンレーザ３から発振する波長５４３ｎｍの選択を指示信号と、照射開始タイミング、照射終了タイミング（または照射開始タイミングと照射時間）を示すトリガー信号とを発し、音響光学素子６を駆動してレーザを出射している間、ＣＣＤカメラ２６を露光するように駆動する。

以下、４８８ｎｍレーザで励起した場合と同様にして、ＣＣＤカメラ２６でエバネッセント照明による蛍光観察として撮像される。

撮像された画像データはアルゴンレーザ３から発振したレーザ波長５４３ｎｍで標本１９を照射したときの蛍光（５８０ｎｍ）画像として制御部２９の記憶部２９ａに記憶される。

この状態で、ガルバノミラー１２ａで反射した光は、集光レンズ１３を通ってキューブユニット１６に導かれ、励起ダイクロイックミラー１６ａで反射され、対物レンズ１８の後側焦点位置の瞳位置１８ａの端に集光され、上述したと同様に標本１９の深さ方向へしみ出すエバネッセント光が発生する。

この場合、ガルバノミラー１２ａは、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３の切替えによっても、エバネッセント光のしみ出し深さｄを同じ量にするため記憶部２９ａに記憶された制御情報に基づいて角度が制御されているので、標本１９の深さ方向へしみ出すエバネッセント光のしみ出し深さｄは、レーザ光の波長の切り替えに関係なく一定に保持される。

このエバネッセント光の照明により標本１９から蛍光が発せられると、この蛍光は、対物レンズ１８を透過し、キューブユニット１６内の励起ダイクロイックミラー１６ａを透過し、結像レンズ２２を介して反射ミラー２３で反射され、フィルタ２４ｂを介してＣＣＤカメラ２６の撮像面２６ａに結像し、エバネッセント照明による蛍光観察像として撮像される。

従って、複数の蛍光色素で多重染色された標本１９に対して波長の異なるアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３を切り替えるような場合も、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３の切り替えに応じて、予め記憶部２９ａに記憶された制御情報に基づいてガルバノミラー１２ａの角度を制御するようにしたので、これらレーザ光の波長の切り替えによってもエバネッセント光のしみ出し深さｄを常に同じ量に設定することができる。つまり、エバネッセント光のしみ出し深さｄをレーザ光による励起波長に関係なく常に同じ量にできるので、これまで検鏡者が強いられていた励起波長ごとに入射角を調整するという面倒な作業を省くことができ、所望する蛍光観察を容易に実現することができる。

勿論、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３により、それぞれエバネッセント光のしみ出し深さｄを変更しながら観察を行ないたい場合は、所望するエバネッセント光のしみ出し深さｄを指定すると、予め記憶部２９ａに記憶された角度情報によりガルバノミラー１２ａの角度が制御され、それぞれの観察に簡単に対応することができる。

また、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３によるレーザ波長の切替に連動してフィルタホイール２４が駆動され、選択される励起波長に最適なフィルタ２４ａ、２４ｂが光路上に自動的に挿入されるので、励起波長に最適な蛍光画像を確実に取得することができる。この場合、これら蛍光画像は、励起波長の切替に連動して速やかに取得できるので、モニタ３０上でそれぞれの蛍光画像を瞬時に切換えて表示したり、複数の蛍光画像を重ねて表示することができる。

これまで説明してきた内容は、フィルタを切り替えて４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、それぞれの励起光を取得したが、前記フィルタ２４ａを４８８ｎｍ、５４３ｎｍで励起したときに発する蛍光を両方とも透過する特性にしておくと、フィルタを切り替えずに励起波長の切り替えのみで多重染色された標本から、それぞれの励起波長で励起された蛍光を異なる蛍光波長として認識することが出来る。これにより、高速に選択的に多重染色標本からの蛍光を取得することが出来る効果が得られる。

複数の波長のレーザ光を安定に制御し、且つ検出系と同期させることにより、多重染色された標本からの蛍光を高速に選択的に取得することができ、モニタ３０でそれぞれの蛍光画像を切替表示したり、複数の蛍光画像を重ねて表示することもできる。

（第１の実施の形態の変形例）
図２は、本発明の第１の実施の形態の変形例の概略構成を示す図で、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、反射ミラー２３の反射光路に配置されたフィルタホイール２４に代えて、蛍光検出部３１が配置されている。蛍光検出部３１では、反射ミラー２３の反射光路上に分光ダイクロイックミラー３２が配置されている。分光ダイクロイックミラー３２は、長波長側の蛍光を反射し、短波長側の蛍光を透過するような特性を有している。分光ダイクロイックミラー３２の反射側光路には、バリアフィルタ３３、検出器３４が配置され、透過光路側には、バリアフィルタ３５、検出器３６が配置されている。ここで、バリアフィルタ３３、３５は、検出したい蛍光波長領域のみを取出す。

検出器３４、３６は、検出した蛍光を電気信号に変換し、制御部２９に出力する。制御部２９は、これら検出器３４、３６からの信号により蛍光画像を生成し、蛍光画像をモニタ３０に表示する。

その他は、図１と同様である。

このようにすれば、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３によるレーザ波長の切り替えに応じて検出器３４、３６からの出力を選択的に制御部２９に取り込むことができるので、上述したフィルタホイール２４を機械的に駆動して、フィルタ２４ａ、２４ｂを光路上に挿入する場合と比べ、さらに速く多重蛍光画像を取得することができ、能率的な蛍光観察を行なうことができる。

さらに、第１の実施例の効果に加え、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３によるレーザ波長を切替えなくてもアルゴンレーザ２で励起した蛍光とグリーンヘリウムネオンレーザ３で励起した蛍光を同時に観察することができる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。
この第２の実施の形態では、エバネッセント照明を行なう全反射蛍光顕微鏡に対し、光走査ミラーによりレーザ光を偏向し、標本上にスポット光を２次元走査し、標本から発する蛍光を共焦点ピンホールを介して共焦点観察する走査ユニットを組み合わせている。

図３は、本発明の第２の実施形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、レーザ光源ユニット１は、エバネッセント照明用と共焦点観察用で共通に使用し、エバネッセント投光管は走査ユニット４１に置き換えられている。

そして、レーザ光源ユニット１の音響光学素子６の出射端は、ファイバ７を介して走査ユニット４１に接続されている。

走査ユニット４１は、ファイバ７から出射されるレーザ光を導入するレーザ光導入ポート４１ａが設けられている。また、レーザ光導入ポート４１ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ４２、励起ダイクロイックミラー４３が配置されている。

コリメートレンズ４２は、レーザ光導入ポート４１ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換する。励起ダイクロイックミラー４３は、レーザ光の波長(４８８ｎｍ、５４３ｎｍ)を反射し、標本１９から発する蛍光の波長領域を透過するような特性を有している。

励起ダイクロイックミラー４３の反射光路上には、光走査手段としての光偏向ミラーユニット４４が配置されている。光偏向ミラーユニット４４は紙面の上下方向と紙面に垂直な方向に光を偏向する２組のガルバノスキャナミラーを有し、これらのガルバノスキャナミラーによりレーザ光を２次元方向に走査する。

光偏向ミラーユニット４４より出射されるレーザ光の光路上には、瞳投影レンズ４５が配置されている。瞳投影レンズ４５から出射されるレーザ光の光路上には、集光レンズ４６が配置されている。集光レンズ４６は、瞳投影レンズ４５から出射されるレーザ光を平行光（点線で示す光路）に変換し、キューブターレット１４に装着された反射ミラー４７ａを取り付けたキューブユニット４７に入射するようにしている。

なお、４８はエバネッセント照明用のレンズユニットで、エバネッセント照明時のみ光路に挿入され、共焦点観察では、光路より外されている。つまり、エバネッセント照明では、対物レンズ１８の瞳位置１８ａにレーザ光を集光させる必要があり、このために瞳投影レンズ４５により集光される結像位置４５ａを対物レンズ１８の瞳位置１８ａに結像させるためレンズユニット４８を光路に挿入可能にしている。また、レンズユニット４８は、制御部２９の指示で駆動されるモータ４９により図示矢印方向に移動し、光路上に挿脱を可能になっている。

一方、励起ダイクロイックミラー４３の透過光路上には、共焦点観察手段を構成する反射ミラー５０、共焦点レンズ５１、共焦点ピンホール５２、励起レーザ光をカットし検出したい蛍光波長領域を取出すバリアフィルタ５３および光検出器５４が配置されている。ここでの光検出器５４には、例えばフォトマルチプライアが用いられる。

このような構成において、まず、共焦点観察について説明する。

この場合、レーザ光源ユニット１からのレーザ光は、音響光学素子６より出射し、ファイバ７を介して走査ユニット４１のレーザ光導入ポート４１ａに導入される。そして、コリメートレンズ４２により平行光に変換され、励起ダイクロイックミラー４３により励起レーザ光として下方に反射され、光偏向ミラーユニット４４に入射する。

光偏向ミラーユニット４４は、紙面の上下方向と紙面に垂直な方向に光を偏向する２組のガルバノスキャナミラーによりレーザ光を偏向する。そして、光偏向ミラーユニット４４で偏向されたレーザ光は、瞳投影レンズ４５を透過し、集光レンズ４６で平行光に変換される（点線で示す光路）。この時、エバネッセント照明用のレンズユニット４８は、光路から外されている。

集光レンズ４６で平行光に変換されたレーザ光は、キューブユニット４７の反射ミラー４７ａにより上方に反射され、対物レンズ１８に平行光で入射し、対物レンズ１８により集光され、標本１９に光スポットを結ぶ。この光スポットは、光偏向ミラーユニット４４の光偏向により標本１９上を２次元に走査される。

標本１９上での光スポットの２次元走査により、蛍光が発すると、この蛍光は、励起レーザ光と逆方向に進み、集光レンズ４６、瞳投影レンズ４５、光偏向ミラーユニット４４を介して励起ダイクロイックミラー４３に達する。励起ダイクロイックミラー４３に達した蛍光は、励起ダイクロイックミラー４３を透過し、反射ミラー５０で反射し、共焦点レンズ５１、共焦点ピンホール５２、バリアフィルタ５３を通過して光検出器５４で検出される。

次に、エバネッセント照明による蛍光観察の説明を行なう。

上述した共焦点観察では対物レンズ１８にレーザ光を平行光で入射させる必要があるのに対して、エバネッセント照明では対物レンズ１８の瞳位置１８ａにレーザ光を集光させる必要がある。このために瞳投影レンズ４５により集光される結像位置４５ａを対物レンズ１８の瞳位置１８ａに結像させるためのレンズユニット４８を光路に挿入する。

また、対物レンズ１８の瞳位置１８ａ上で結像させる位置を制御するには、２組のガルバノスキャナミラーからなる光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラー（紙面に対して上下方向に偏向するミラー）を利用し、このガルバノスキャナミラーを偏向させ、瞳投影レンズ４５による結像位置４５ａを変化させて、この結像位置４５ａと光学的に共役関係である対物レンズ１８の瞳位置１８ａでの集光位置を変化させることにより行う。

この場合も、制御部２９は、レーザ光源ユニット１のアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３のそれぞれのレーザ波長に対して、エバネッセント光のしみ出し深さｄを同じにするための入射角θ_１を計算により求め、これら入射角θ_１を得るための光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラーの角度を制御情報として記憶部２９ａに記憶している。そして、エバネッセント光のしみ出し深さｄを一定にして蛍光観察を行なう場合は、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３による励起波長の切替えに応じて記憶部２９ａより対応する制御情報を読み出し、光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラーの角度を制御し、瞳投影レンズ４５による結像位置４５ａを変化させ、結像位置４５ａと光学的に共役関係である対物レンズ１８の瞳位置１８ａでの集光位置を変化させるようにしている。

また、制御部２９は、エバネッセント照明による蛍光観察によりキューブターレット１４を回転させ、励起ダイクロイックミラー１６ａを搭載したキューブユニット１６を光路上に挿入する。

この状態から、レーザ光源ユニット１からのエバネッセント照明用のレーザ光は、瞳投影レンズ４５からレンズユニット４８、集光レンズ４６を介して、キューブユニット１６の励起ダイクロイックミラー１６ａに導かれ、さらに対物レンズ１８側に反射され、対物レンズ１８の瞳位置１８ａに集光し、対物レンズ１８を介して標本１９にエバネッセント照明を行なう。

この場合、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３の切替えが行われても、光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラーは、エバネッセント光のしみ出し深さｄを同じ量にするための記憶部２９ａに記憶された制御情報に基づいて角度が制御されているので、標本１９の深さ方向へしみ出すエバネッセント光のしみ出し深さｄは、レーザ波長の切り替えに関係なく一定に保持される。

また、エバネッセント照明により標本１９から発した蛍光は、上述した第１の実施形態と同様にＣＣＤカメラ２６により撮像される。

従って、このようにしても複数の蛍光色素で多重染色された標本１９に対して波長の異なるアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３を切り替えるような場合も、これらアルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３の切り替えに応じて、予め記憶部２９ａに記憶された制御情報に基づいて光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラーの角度を制御するようにしたので、これらレーザ光の波長の切り替えによってもエバネッセント光のしみ出し深さｄを常に一定に保持することができ、第１の実施の形態と同様な効果を得られる。

勿論、アルゴンレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３により、それぞれエバネッセント光のしみ出し深さｄを変更しながら観察を行ないたい場合は、所望するエバネッセント光のしみ出し深さｄを指定すると、予め記憶部２９ａに記憶された角度情報により光偏向ミラーユニット４４内の一方のガルバノスキャナミラーの角度が制御され、それぞれの観察に簡単に対応することができる。

さらに、レーザ光源ユニット１が共通で使用でき、制御部２９により光路上のレンズユニット４８の出し入れを制御することで、多重染色蛍光標本の全反射蛍光観察と走査型蛍光観察を容易に行うこともできる。

上記の第１と第２の実施の形態において、ＣＣＤ２６や検出器３４、３６が制御部２９からの制御信号を受け付けない場合（例えば、検出器がスタンドアロンの装置の場合）には、ＣＣＤ２６や検出器３４、３６は画像取得開始の同期信号と画像データを制御部２９に対して発信することができる。

この場合において、ＣＣＤ２６から制御部２９に画像取得開始の同期信号が送られると、それに同期して、制御部２９は音響光学素子６に対しレーザ光源ユニット１のアルゴンイオンレーザ２から発振する波長４８８ｎｍの選択を指示信号と、照射開始タイミングの信号とを出力し、ＣＣＤカメラ２６が露光している間、音響光学素子６を駆動してレーザを出射するように駆動する。また、ＣＣＤ２６からの信号でガルバノスキャナミラーも駆動する。

以下、第１及び第２の実施の形態と同様にして、ＣＣＤカメラ２６、検出器３４，３６でエバネッセント照明による蛍光観察として撮像される。

これにより、一般に市販されているＣＣＤなどの検出器ユニットを後から付け足したものでも第１及び第２の実施の形態のような効果が得られる。つまりユーザが改造して使用することができ、実験の自由度が広がる。

上記の実施の形態では、エバネッセント光のしみ出し深さを自由に調整したり、レーザ光の波長や、出力強度を可変制御する実施の形態を説明したが、照射角度からしみ出し深さを演算して、その演算結果を表示したりすると、しみ出し深さを調整するのに便利である。図４から図７を参照して、この実施の形態について説明する。なお、本実施の形態における構成は、図１から図３の構成と同様であるので、図示及び詳細な説明は省略する。

(第３の実施の形態)
図４を参照して、第３の実施の形態を説明する。図４は、第３の実施の形態に係る、例えば、図１のモニタ３０への表示例を示す図である。
観察者が、波長４８８ｎｍの標本の画像をＣＣＤカメラ２６で確認しながら、図示しない入力手段を用いてガルバノミラーユニット１２のガルバノミラー１２ａの角度（以下、「ガルバノ角度」と称する）を調整(指定)する。このとき指定されたガルバノ角度から試料への照射角度ＮＡを、図１の集光レンズ１３、対物レンズ１８の光学特性を用いて求める(図４の(ａ)の斜文字)。そして、この照射角度ＮＡから各波長毎のしみ出し深さを、式(１)を用いて計算し、その計算結果を、例えば図４の(ａ)に示すように表示する。図４の(ａ)の例では、照射角度ＮＡが１．４のときにおける、４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍの各波長に対して、それぞれ、１６５ｎｍ、１８３ｎｍ、２１４ｎｍのしみ出し深さの計算結果が一覧表示される。このとき、図４の（ｂ）に示すような、対物レンズの倍率と、カバーガラスの屈折率と、標本の屈折率が併せて表示される(以下の変形例において、図４の（ｂ）は同じであるので、変形例において同表示については省略する)。なお、対物レンズの倍率は対物レンズを切り替えたときに、現時点で光路上に配置された対物レンズの倍率を図示しないセンサが検知して、検知結果が表示される。また、カバーガラスと標本の屈折率については、それらの材質などを選択することによって、記憶部２９ａに記憶された屈折率を表示する。なお、図４の（ｂ）に記載の対物レンズの倍率やカバーガラスの屈折率や標本の屈折率は、当該数値を観察者が入力可能であっても良い。本実施の形態によれば、目的とするしみ出し深さを得る条件を求めることができ、また標本を観察しながら照明角度を調整する時などに現在のしみ出し深さを容易に認識できる。さらに、波長ごとのしみ出し深さを容易に認識できる。

(第３の実施の形態の第１の変形例)
図５は、第３の実施の形態の第１の変形例に係る表示例を示す図である。本変形例では、１つの波長で照射角度を設定すると、他の角度でも同じしみ出し深さにする照射角度ＮＡを表示するようにしている。
波長４８８ｎｍの標本の画像を目視観察用ユニット２８で確認しながら、図示しない入力手段を用いてガルバノ角度を指定する。次に、指定されたガルバノ角度から、標本照射角度ＮＡを計算して表示する(この場合、ＮＡ＝１．４と求まる)。そして、求められた照射角度ＮＡから波長４８８ｎｍのしみ出し深さを計算して、表示する(しみ出し深さ＝１６５ｎｍ)。そして、波長４８８ｎｍの場合のしみ出し深さ１６５ｎｍを維持する場合における、波長ごとの照射角度ＮＡを波長毎に計算して、表示する。この場合には、波長４８８ｎｍ、ＮＡ＝１．４でしみ出し深さ１６５ｎｍとなり、波長５４３ｎｍ、６３３ｎｍに対して、それぞれ、照射角度ＮＡが１．４０４７２、１．４１３４９と求まる。

本変形例では、例えば、多重染色標本の観察で、１つの波長で照射角度を設定すると、同じしみ出し深さにする照射角度を全ての波長について判断でき、かつ、波長毎のしみ出し深さを一定にする照射角度設定が容易にできる。

(第３の実施の形態の第２の変形例)
第３の実施の形態の第２の変形例に係る表示例は、図５と同じであるので、図示を省略する。本変形例では、しみ出し深さを設定した場合の照射角度ＮＡを表示するようにしている。第１の変形例との違いは、以下のとおりである。第１の変形例では、波長４８８ｎｍの画像を見ながらガルバノ角度を調整して、このガルバノ角度から照射角度ＮＡを計算し、この照射角度ＮＡからしみ出し深さを計算している。これに対し、本変形例では、観察者がしみ出し深さを入力して、該染み出し深さにおける、波長ごとの照射角度ＮＡを計算して、表示するようにしている。

上記のように本変形例では、所定のしみ出し深さを設定すると、それを実現する条件を知ることができる。さらに、例えば、多重染色標本の観察において１つの波長で照射角度を設定すると、同じしみ出し深さにする照射角度を全ての波長について判断でき、かつ、波長毎のしみ出し深さを一定にする照射角度設定が容易にできる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態では、入射角調整手段としてガルバノミラーユニット１２を用いた例を述べたが、ガルバノミラーユニット１２を反射ミラーに交換するとともに、ファイバ７によるエバネッセント投光管８へのレーザ光出射端を水平方向に移動可能とし、反射ミラーへのレーザ光の入射位置を変えることによっても標本に照射されるレーザ光の入射角を調整することができる。また、上記の各実施の形態は、それぞれ独立して説明したが、適宜組み合わせて適用することもできる。例えば、第１の実施形態と第３の実施の形態、第２の実施の形態と第３の実施の形態など、様々な組み合わせが適用可能である。更に、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明によれば、エバネッセント光のしみ出し深さを励起波長の切り替えに関係なく常に同じ量に設定できるので、これまで検鏡者に強いられていた励起波長の切り替えごとに入射角を調整するような面倒な作業を省くことができ、所望する蛍光観察を容易に実現できる。

複数の波長のレーザ光を安定に制御し、且つ検出系と同期させることにより、多重染色された標本からの蛍光を高速に選択的に取得することができ、モニタ（表示装置）上でそれぞれの蛍光画像を切替表示したり、複数の蛍光画像を重ねて表示することができる。

本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。 第３の実施の形態に係る表示例を示す図。 第３の実施の形態の第１及び第２の変形例に係る表示例を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…グリーンヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…音響光学素子
７…ファイバ、８…エバネッセント投光管、８０１…投光管本体
８０２…導光管、８ａ…レーザ導入部、９…倒立顕微鏡本体
１０…落射照明用光源、１１…コリメートレンズ
１２…ガルバノミラーユニット、１２ａ…ガルバノミラー
１２ｂ…回転軸、１３…集光レンズ
１４…キューブターレット、１５…モータ
１６．１７…キューブユニット、１６ａ…励起ダイクロイックミラー
１７ａ…ダイクロイックミラー、１７ｂ…バリアフィルタ
１８…対物レンズ、１８ａ…瞳位置、１９…標本
２０…ステージ、２１…カバーガラス、２２…結像レンズ
２２ａ…透過光路、２２ｂ…目視観察光路、２３…反射ミラー
２４…フィルタホイール、２４ａ．２４ｂ…フィルタ
２５…モータ、２６…ＣＣＤカメラ、２６ａ…撮像面
２７…反射ミラー、２８…目視観察用ユニット
２９…制御部、２９ａ…記憶部、３０…モニタ
３１…蛍光検出部、３２…分光ダイクロイックミラー
３３．３５…バリアフィルタ、３４．３６…検出器
４１…走査ユニット、４１ａ…レーザ光導入ポート
４２…コリメートレンズ、４３…励起ダイクロイックミラー
４４…光偏向ミラーユニット、４５…瞳投影レンズ
４５ａ…結像位置、４６…集光レンズ
４７…キューブユニット、４７ａ…反射ミラー
４８…レンズユニット、４９…モータ
５０…反射ミラー、５１…共焦点レンズ
５２…共焦点ピンホール、５３…バリアフィルタ、５４…光検出器

Claims (24)

1. 複数の波長のレーザ光を発生する光源と、
   前記光源からのレーザ光を標本に対し対物レンズを介して所定の入射角で照射し、エバネッセント照明を発生させる集光光学系と、
   前記エバネッセント照明により標本より発生する蛍光を観察する蛍光観察手段と、
   前記標本に照射されるレーザ光の入射角を調整可能にした入射角調整手段と、
   前記光源からのレーザ光の波長を切り替えた場合に、前記エバネッセント光のしみ出し深さが同じ量になるように前記入射角調整手段を制御する制御手段とを具備したことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
2. 複数の波長のレーザ光を発生する光源と、
   前記光源からのレーザ光を標本に対し対物レンズを介して所定の入射角で照射し、エバネッセント照明を発生させる集光光学系と、
   前記エバネッセント照明により標本より発生する蛍光を観察する蛍光観察手段と、
   前記標本に照射されるレーザ光の入射角を調整可能にした入射角調整手段と、
   前記光源からのレーザ光の波長を切り替えた場合に、前記エバネッセント光のしみ出し深さを所望の量に設定するように前記入射角調整手段を制御する制御手段とを具備したことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
3. 請求項１又は請求項２に記載の全反射蛍光顕微鏡において、前記制御手段は、前記光源からのレーザ光の波長に応じた前記入射角の制御情報を記憶する記憶手段を有し、前記レーザ光の波長の切り替えに対して、前記記憶手段に記憶された制御情報に基づいて前記入射角調整手段を制御することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、前記入射角調整手段は、偏向ミラーを有することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
5. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
   前記光源からのレーザ光を偏向する偏向ミラーを有し、該偏向ミラーを偏向することで、前記標本上を光スポットで２次元走査する共焦点観察機能をさらに具備し、
   前記集光光学系は、前記偏向ミラーで偏向されるレーザ光を前記標本上でスポット照明する第１の状態と、前記対物レンズを介して前記標本に対し所定の入射角で照射し、エバネッセント照明を発生させる第２の状態とを、切換え可能であることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
   前記蛍光観察手段は、前記標本から発生した蛍光を波長ごとに選択して透過する蛍光波長選択手段を有し、
   前記蛍光波長選択手段による蛍光の波長選択がレーザ光の波長の切り替えに連動していることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、前記蛍光観察手段は、前記標本から発生した蛍光を波長ごとに検出する蛍光検出手段を更に有することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
8. 請求項６又は請求項７に記載の全反射蛍光顕微鏡において、前記蛍光観察手段より検出された波長ごとの蛍光を画像化し、蛍光画像として表示する表示手段をさらに具備することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
   さらに、前記レーザ光の波長と、出力強度とを可変に制御する可変手段を具備したことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
10. 請求項９に記載の全反射顕微鏡において、
    前記可変手段と前記蛍光観察手段とを制御する制御手段を更に具備し、
    前記制御手段は、前記可変手段を制御して、複数のレーザ波長を時系列的に切替えて標本に対してレーザ光を照射することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
11. 請求項１０に記載の全反射顕微鏡において、前記制御手段は同期信号を出力し、該同期信号により前記可変手段と蛍光観察手段が駆動されることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
12. 請求項１０に記載の全反射顕微鏡において、蛍光観察手段は同期信号を出力し、該同期信号に同期して前記可変手段が駆動することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
13. 請求項１１又は請求項１２に記載の全反射顕微鏡において、前記可変手段が音響光学素子であることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
14. 請求項１１又は請求項１２に記載の全反射顕微鏡において、前記光源と前記可変手段がレーザダイオードで構成されていることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
15. 請求項１１又は請求項１２に記載の全反射顕微鏡において、前記可変手段が電気光学素子であることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
16. 請求項１１又は請求項１２に記載の全反射顕微鏡において、前記可変手段が液晶シャッタを含むことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
17. 請求項１、請求項２又は請求項９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    前記照射角度制御手段の制御値から全反射照明の標本へのしみ出し深さを演算するしみ出し深さ演算手段と、
    前記しみ出し深さ演算手段により演算されたしみ出し深さを表示する表示手段と、を更に備えたことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
18. 請求項１、請求項２又は請求項９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    全反射照明の標本へのしみ出し深さを入力する入力手段と、
    全反射照明の標本への染み出し深さを、前記入力されたしみ出し深さに設定するための前記照射角度を演算する条件照射角度演算手段と、
    前記条件照射角度演算手段により求められた条件照射角度を表示する表示手段と、を更に備えたことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
19. 請求項１、請求項２又は請求項９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    さらに、前記照射角度制御手段の制御値から全反射照明の標本へのしみ出し深さを演算するしみ出し深さ演算手段と、
    前記しみ出し深さ演算手段により演算されたしみ出し深さを表示する表示手段と、を備えたことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
20. 請求項１９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、前記光源は複数の波長の光を出力し
    前記しみ出し深さ演算手段は前記波長のそれぞれに対してしみ出し深さを演算し、
    前記表示手段は、算出された染み出し深さを波長毎に表示することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
21. 請求項１、請求項２又は請求項９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    さらに、全反射照明の標本へのしみ出し深さを入力する入力手段と、
    全反射照明の標本への染み出し深さを、前記入力されたしみ出し深さに設定するための条件前記照射角度を演算する条件照射角度演算手段と、
    前記条件照射角度演算手段により求められた照射角度条件を表示する表示手段と、を備えたことを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
22. 請求項１９に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    前記光源は複数の波長の光を出力し、
    前記複数の波長の光のうち選択された１つの波長に対して照射角度を設定すると、全ての波長において全反射照明のしみ出し深さを一定にするためのそれぞれの波長毎の照射角度を演算する照射角度演算手段と、
    前記照射角度演算手段により求められた照射角度を波長毎に表示する照射角度表示手段と、をさらに備え、
    前記照射角度制御手段は、実際に照射する波長に合わせて照射角度を制御することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
23. 請求項２１に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    前記光源は複数の波長の光を出力し、
    入力されたしみ出し深さに対応する照射角度を少なくとも２つの波長に対して演算する照射角度演算手段と、
    前記照射角度演算手段により求められた照射角度を波長毎に表示する表示手段と、をさらに備え、
    前記照射角度制御手段は、実際に照射する波長に合わせて照射角度を制御することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
24. 請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項に記載の全反射蛍光顕微鏡において、
    前記染み出し深さ演算手段又は前記照射角度演算手段は、前記演算のパラメータとしてカバーガラスの屈折率及び標本の屈折率の少なくとも一方を使用し、
    前記全反射蛍光顕微鏡は、カバーガラスの屈折率及び標本の屈折率の少なくとも一方について入力又は表示の少なくとも一方が可能であることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。

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