JP4576150B2

JP4576150B2 - 走査型レーザ顕微鏡

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Description

本発明は、試料に刺激を与えるための刺激用レーザ光源と試料を励起してその反応光を観察するための観察用励起光源を備えた走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、走査型レーザ顕微鏡として、特許文献１および特許文献２に開示されるように、蛍光観察を行なうための観察用励起レーザ光を試料上の光軸に垂直な面内で走査させるための観察用励起レーザ光走査手段と、試料に刺激を与えるためのレーザ光を試料平面の任意の位置に照射するための刺激用レーザ光走査手段の２組の光走査手段を有するものが知られている。

これらの走査型レーザ顕微鏡は、蛍光観察に用いられるＣａｇｅｄ手法等に有効とされている。ここで、Ｃａｇｅｄ手法とは、試料内にケージド試薬とカルシウムイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬を注入し、試料のある部分に刺激用レーザ光を照射することで、ケージド試薬のケージド基を開裂させ、内部に包含された物質を放出させて、その時のカルシウムイオン濃度の経時変化を、観察用励起レーザ光を試料に照射することにより蛍光観察する方法である。

このようなＣａｇｅｄ手法を採用した走査型レーザ顕微鏡によれば、まず、最初に、観察用励起レーザ光を、観察用励起レーザ光走査手段を介して試料上で走査し、試料より発せられた蛍光の画像をプレビュー画像としてＰＣのモニタに表示し、その画像中で、刺激を与えたいポイントまたは領域を、マウスなどで指定する。そして、次に、刺激用レーザ光を刺激用レーザ走査手段を介してプレビュー画像上の指定したポイントまたは領域に正確に照射し、試料に刺激を与えながら、観察用励起レーザ光を観察用励起レーザ光走査手段を介して試料上に走査し、試料の経時変化を観察する。つまり、このような走査型レーザ顕微鏡によれば、試料の任意の部位に刺激光を与えながら、その影響により反応する試料の時間経過観察を、刺激用レーザ走査手段と観察用励起レーザ走査手段の２組の光走査手段により２種類のレーザ光を独立に走査制御することにより実現している。
特開平１０−２０６７４２号公報特開２００２−８２２８７号公報

ところで、近年、光刺激による観察手法が多様化してきており、光刺激に使うレーザ波長や蛍光を励起する観察用励起レーザ波長も、１種類ではなく複数種類必要とするものが実用化されている。

例えば、上述のＣａｇｅｄ手法の場合は、刺激用レーザ光として、ＵＶアルゴンレーザより発振される３５１ｎｍ、または、２光子励起を利用した光刺激として、７２０ｎｍを発振するＩＲパルスレーザが用いられ、また、観察用励起レーザ光として、蛍光指示薬Ｆｌｕｏ３を励起する為にアルゴンンレーザから発振される４８８ｎｍの波長が用いられている。

また、細胞内の特定の領域を刺激用レーザで繰り返し照射することにより槌色させ、その部位の外側領域の蛍光強度が蛋白質の拡散により減少する過程を時間経過観察するＦＬＩＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｏｓｓｉｎｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）により蛍光蛋白ＧＦＰを発現させた細胞を観察するような場合は、刺激用レーザ光として、アルゴンレーザより発振される４８８ｎｍ、または、２光子励起を用いた光刺激として、８００ｎｍを発振するＩＲパルスレーザが用いられ、また、観察用励起レーザ光として、アルゴンレーザから発振される４８８ｎｍの波長が用いられる。

さらに、蛍光蛋白Ｋａｅｄｅを発現させた細胞の赤色化を観察するような場合は、刺激用レーザ光として、半導体レーザから発振される４０５ｎｍが用いられ、観察用励起レーザ光として、アルゴンレーザから発振される４８８ｎｍとグリーンヘリウムネオンレーザから発振される５４３ｎｍの波長が用いられる。

このように多様化された光刺激による観察手法を採用しようとすると、光刺激に使うレーザ波長や蛍光を励起するための観察用励起レーザ波長として、さまざまな種類のものが用いられるようになり、これにともない、刺激用レーザ光や観察用励起レーザ光を始め、観察する蛍光の各波長に応じて光路上に配置する光学素子、例えば、刺激用レーザ光走査手段からの光路と観察用励起レーザ光走査手段からの光路を合成する光路合成用ダイクロイックビームスプリッタや、観察用励起レーザ光と蛍光を分離する励起ダイクロイックビームスブリッタ等についても、最適なものに切換え、または、交換する必要が生じる。

ところが、これら光学素子は、光路への切換え、または、交換の際に、反射角度や折返し位置の固体差により、光軸がずれることがある。このことは、光学素子を最適なものに取り換えたことによる刺激用レーザ光と観察用励起レーザ光の光路のずれにより、刺激用レーザ走査手段と観察用励起レーザ走査手段によるレーザ走査位置にもずれを生じることになる。この結果、試料内で狙った位置（ポイントまたは領域）に正確に刺激レーザ光を照射できなくなってしまうことになる。具体的には、例えば、図７に示すように、操作者があらかじめ取得した蛍光のプレビュー画像１０１上の細胞１０２に対して刺激を与えるポイント１０２ａを指定しても、光学素子を切換えたことによる光路のずれにより、実際は指定部位のポイント１０２ａからずれた位置、場合によっては細胞が存在しない位置（図７中の位置１０２ｂ）に刺激を与えてしまうことになり、光刺激に対する反応の経時変化を正確に観察することができないという問題があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、観察方法を切換えても、試料内の狙った位置に正確に刺激レーザ光を照射できる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一態様に係る走査型レーザ顕微鏡は、観察用励起レーザ光を発生する観察用励起レーザ光源と、前記観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、前記観察用励起レーザ光の前記標本上での走査により前記標本から発せられる検出光を検出する検出光学系と、前記検出光学系により検出された検出光に基づいて、前記標本のプレビュー画像を生成して表示するプレビュー手段と、前記プレビュー手段により表示された前記プレビュー画像上で、当該標本に刺激を与える位置を指定する指定手段と、刺激用レーザ光を発生する刺激用レーザ光源と、前記刺激用レーザ光を前記標本上で２次元走査する第２の走査手段と、前記観察用励起レーザ光源から前記標本までの光路又は前記刺激用レーザ光源から前記標本までの光路に光学素子を切換え挿入するための少なくとも1つの光学素子切換え手段と、前記光学素子切換え手段の切換えによって発生する前記第１および第２の走査手段の走査位置の相対位置ずれに関する補正情報を記憶する記憶手段を有し、該記憶手段に記憶された補正情報に基づいて、前記指定手段により指定された位置に、前記刺激用レーザ光を照射するように、前記第１および第２の走査手段の少なくとも一方の走査位置を補正制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。

本発明によれば、観察方法を切換えた場合も、標本内の狙った位置、つまり、蛍光プレビュー画像上で指定した位置に正確に刺激用レーザ光を照射して刺激を与えることができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。この場合、走査型レーザ顕微鏡として、蛍光蛋白Ｋａｅｄｅを用いた観察（刺激レーザ光として４０５ｎｍで、観察用励起レーザ光として４８８ｎｍと５４３ｎｍを用いる）と、ＦＬＩＰによる観察（刺激レーザ光として８００ｎｍを発振する２光子励起用のパルスレーザを用い、観察用励起レーザ光としては、４８８ｎｍを用いる）を任意に切換えて使用するものについて説明する。

図において、１は観察用励起レーザ光源として観察用励起レーザ光を発振する観察用励起レーザ光源ユニットで、この観察用励起レーザ光源ユニット１は、レーザ光源として４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と、５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ３を有している。ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、アルゴンレーザ２からのからのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。ここでのダイクロイックミラー５は、４８８ｎｍのレーザ光を透過し、５４３ｎｍのレーザ光を反射するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦとする）６が配置されている。ここでのＡＯＴＦ６は、レーザ波長の選択、調光を波長毎に独立に行うことが可能になっている。

ＡＯＴＦ６の出射端には、シングルモードファイバ７の入射端が接続されている。シングルモードファイバ７の出射端には、第１の走査ユニット８が接続されている。第１の走査ユニット８は、シングルモードファイバ７のの出射側に、ＡＯＴＦ６からのレーザ光を平行光にするコリメートレンズ９が配置されている。

コリメートレンズ９の平行光の光路上には、反射ミラー１０を介して第１の光学切換え手段として第１のビームスプリッタユニット１１が配置されている。第１のビームスプリッタユニット１１は、例えば回転ターレットからなるもので、図２に示すように光学素子として特性の異なる励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃが同心円状に配置されている。また、第１のビームスプリッタユニット１１は、モータ１１ｄによる回転駆動により、励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。この場合、これら励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃは、観察用励起レーザ光と蛍光を分離するような特性を有している。このうちの励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａは、Ｋａｅｄｅ観察に用いられるもので、例えば図４（ａ）に示すように、観察用励起レーザ光である４８８ｎｍおよび５４３ｎｍの波長を反射し、これら４８８ｎｍおよび５４３ｎｍの波長光を後述する標本１８に照射することにより、標本１８より発する蛍光の波長である５００〜５３０ｎｍおよび５７０〜６２０ｎｍの波長範囲を透過するような特性を有している。また、励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ｂは、ＦＬＩＰ観察に用いられるもので、例えば図４（ｂ）に示すように、観察用励起レーザ光である４８８ｎｍの波長を反射し、４８８ｎｍの波長光を標本１８に照射することにより、標本１８より発する蛍光の波長である５００〜６００ｎｍの波長範囲を透過するような特性を有している。

第１のビームスプリッタユニット１１の反射光路には、第１の走査手段として観察用励起レーザ光走査手段１２が配置されている。この観察用励起レーザ光走査手段１２は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１２ａ、１２ｂを有し、これらのミラー１２ａ、１２ｂにより標本１８上の観察用励起レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

観察用励起レーザ光走査手段１２により２次元走査されたレーザ光の光路上には、観察用励起レーザ光の走査光学系を構成する瞳投影レンズ１３、結像レンズ１４、反射ミラー１５、対物レンズ１６が配置されている。この場合、観察用励起レーザ光走査手段１２で２次元走査された観察用励起レーザ光は、瞳投影レンズ１３、結像レンズ１４、反射ミラー１５、対物レンズ１６を介してステージ１７に載置された標本１８の焦点位置に結像され、また、標本１８から発生された蛍光（検出光）は、観察用励起レーザ光と逆の光路をたどって対物レンズ１６、反射ミラー１５、結像レンズ１４、瞳投影レンズ１３、観察用励起レーザ光走査手段１２を介して第１のビームスプリッタユニット１１まで戻るようになっている。

第１のビームスプリッタユニット１１の透過光路上には、検出光学系を構成する共焦点レンズ２２、共焦点ピンホール２３、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４が配置されている。蛍光分光用ダイクロイックミラー２４は、Ｋａｅｄｅ観察の短波長側の蛍光波長を含む５００〜５５０ｎｍの波長域を反射し、長波長側の蛍光波長を含む５７０〜６５０ｎｍの波長域を透過するような特性を有している。

蛍光分光用ダイクロイックミラー２４の反射光路上には、バリアフィルタ２５ａ、光検出器２６ａが配置され、また、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４の透過光路上にはバリアフィルタ２５ｂ、光検出器２６ｂが配置されている。バリアフィルタ２５ａは、Ｋａｅｄｅ観察の短波長側の蛍光波長である５００〜５３０ｎｍの蛍光を透過し、その他の波長をカットするような特性を有し、また、バリアフィルタ２５ｂは、Ｋａｅｄｅ観察の長波側の蛍光波長である５７０〜６２０ｎｍの蛍光を透過し、その他の波長をカットするような特性を有している。

一方、３３は、刺激用レーザ光源として刺激用レーザ光を発生する半導体レーザユニットで、この半導体レーザユニット３３は、４０５ｎｍの波長のレーザ光を発振するものである。

半導体レーザユニット３３からのレーザ光の光路には、シングルモードファイバ３４の入射端が接続されている。シングルモードファイバ３４の出射端は、第２の走査ユニット２０の刺激用レーザ光導入ポート３１に接続されている。第２の走査ユニット２０は、刺激用レーザ光導入ポート３１を介して導入されるシングルモードファイバ３４からのレーザ光を平行光にするコリメートレンズ３７が配置されている。コリメートレンズ３７の平行光の光路上には、反射ミラー３８を介して合成ダイクロイックミラー３９が配置されている。

３５は、他の刺激用レーザ光源として刺激用レーザ光を発生する赤外パルスレーザユニットで、この赤外パルスレーザユニット３５は、８００ｎｍの波長のパルスレーザ光を発振するパルスレーザ発振器３５ａと、このパルスレーザ発振器３５ａからのレーザ光をＯＮ／ＯＦＦする電動シャッタ３５ｂにより構成されている。

赤外パルスレーザユニット３５からのパルスレーザ光の光路には、第２の走査ユニット２０の他の刺激用レーザ光導入ポート３２に接続されている。そして、この他の刺激用レーザ光導入ポート３２から出射されるパルスレーザ光の光路には、合成ダイクロイックミラー３９が配置されている。

合成ダイクロイックミラー３９は、半導体レーザユニット３３からの４０５ｎｍの波長のレーザ光を反射し、赤外パルスレーザユニット３５からの８００ｎｍの波長のパルスレーザ光を透過するような特性を有するもので、これらレーザ光を合成して同軸に導くようにしている。

合成ダイクロイックミラー３９により合成されたレーザ光の光路上には、反射ミラー４０を介して第２の走査手段としての刺激用レーザ光走査手段４１が配置されている。この刺激用レーザ光走査手段４１は、刺激用レーザ光を標本１８上の任意領域に２次元走査することや、標本１８上の任意のポイントで固定照射することを可能としたもので、２枚のミラー４１ａ、４１ｂで構成されている。これらのミラー４１ａ、４１ｂは、刺激用レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

刺激用レーザ光走査手段４１から出射される刺激用レーザ光の光路上には、刺激用レーザ光の走査光学系を構成する瞳投影レンズ４２、結像レンズ４３を介して第２の光学素子切換え手段としての第２のビームスプリッタユニット１９が配置されている。この第２のビームスプリッタユニット１９は、刺激用レーザ光走査手段４１からの刺激用レーザ光の光路と、観察用励起レーザ光走査手段１２からの観察用励起レーザ光の光路の交点上に配置され、これらレーザ光の光路を合成するものである。

第２のビームスプリッタユニット１９は、図３に示すように特性の異なる合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂと空穴１９ｃを直線状に配置している。また、第２のビームスプリッタユニット１９は、モータ１９ｄによる図示しないスライド切換え機構により図示矢印１９ｅ（直線）方向のスライド動作により、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂと空穴１９ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成になっている。この場合、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａは、Ｋａｅｄｅ観察に用いられるもので、図５（ａ）に示すように刺激用レーザ光として使用する４０５ｎｍの波長を反射し、観察用励起レーザ光の波長及び蛍光波長を含む４８８〜６２０ｎｍの波長範囲を透過するような特性を有している。また、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ｂは、ＦＬＩＰ観察に用いられるもので、図５（ｂ）に示すように刺激用レーザ光として使用する８００ｎｍの波長を反射し、観察用励起レーザ光の波長及び蛍光波長を含む４８８〜６００ｎｍの波長範囲を透過するような特性を有している。

観察用励起レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６、第１のビームスプリッタユニット１１のモータ１１ｄ、観察用励起レーザ光走査手段１２、第２のビームスプリッタユニット１９のモータ１９ｄ、半導体レーザユニット３３の不図示の発振のＯＮ／ＯＦＦ機能、赤外パルスレーザユニット３５の電動シャッタ３５ｂのＯＮ／ＯＦＦ機能、刺激用レーザ光走査手段４１には、制御手段としての制御部４４が接続されている。制御部４４は、これら観察用励起レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６、第１のビームスプリッタユニット１１のモータ１１ｄ、観察用励起レーザ光走査手段１２、第２のビームスプリッタユニット１９のモータ１９ｄ、半導体レーザユニット３３の不図示の発振のＯＮ／ＯＦＦ機能、赤外パルスレーザユニット３５の電動シャッタ３５ｂのＯＮ／ＯＦＦ機能、刺激用レーザ光走査手段４１に制御信号を出力するものである。また、制御部４４には、記憶手段としての記憶部４５と光検出器２６ａ、２６ｂで取得した蛍光画像を表示するための表示部４６が接続されている。

記憶部４５には、第１のビームスプリッタユニット１１の励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃと第２のビームスプリッタユニット１９の合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂの切換え時の位置決めのばらつきなどによる反射角度や折返し位置の固体差を原因とする刺激用レーザ光走査手段４１の走査位置のずれを補正するため補正量（補正情報）が、励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃと合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂの組合せに対応して記憶されている。

この場合、刺激用レーザ光走査手段４１の走査位置の補正量は、次のようにして求められる。

まず、基準となるビームスプリッタ（調整治具用のビームスプリッタまたは装置に備えられている光学素子の中から選んだもの）を用意し、この基準ビームスプリッタを光路上に配置して刺激用レーザ光走査手段４１による刺激用レーザ光の走査位置と観察用励起レーザ光走査手段１２による観察用励起レーザ光の走査位置が一致するように刺激用レーザ光走査手段４１を構成するミラー４１ａ、４１ｂの偏向角（位置）を調整する。

この状態から、実際に使用する可能性がある光学素子（励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃおよび合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂ）を光路上に順に配置し、観察用励起レーザ光走査手段１２による走査位置と刺激用レーザ光走査手段４１による走査位置の相対位置ずれをなくすような刺激用レーザ光走査手段４１のミラー４１ａ、４１ｂの偏向角オフセット量を求める。つまり、このような偏向角オフセット量は、実際に使用する可能性がある光学素子（励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃおよび合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂ）の全ての組合せについて求め、これら求められた偏向角オフセット量を補正情報として記憶部４５に記憶させる。この作業は、出荷時や、製造メーカーが現地で装置をセットアップする時に行うのが望ましい。

次に、このように構成した実施の形態の動作について説明する。

まず、Ｋａｅｄｅ観察を行なう場合を説明する。この場合、刺激用レーザ光としては、半導体レーザユニット３３から発振される波長４０５ｎｍのレーザ光を使用し、観察用励起レーザ光としては、アルゴンレーザ２から発振される波長４８８ｎｍのレーザ光とヘリウムネオンレーザ３から発振する波長５４３ｎｍのレーザ光を使用する。また、光学素子として、第１のビームスプリッタユニット１１では励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａが光路上に配置され、第２のビームスプリッタユニット１９では、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａが光路上に配置される。

この状態で、観察用励起レーザ光源ユニット１内のＡＯＴＦ６で選択された波長４８８ｎｍと５４３ｎｍの観察用励起レーザ光は、シングルモードファイバ７を介して第１の走査ユニット８に導かれ、コリメートレンズ９により平行光に変換され、反射ミラー１０で反射し、励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａに入射する。そして、この励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａで反射し、観察用励起レーザ光走査手段１２を通り、瞳投影レンズ１３、結像レンズ１４、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａを透過し、反射ミラー１５で反射し、対物レンズ１６により標本１８に集光される。この場合、標本１８に集光されるレーザスポットは、観察用励起レーザ光走査手段１２のミラー１２ａ、１２ｂにより２次元走査される。

標本１８から発した波長４８８ｎｍと５４３ｎｍの観察用励起レーザ光による蛍光は、対物レンズ１６、反射ミラー１５を介して合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａに入射し、さらに、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａを透過し、結像レンズ１４、瞳投影レンズ１３、観察用励起レーザ光走査手段１２を介して第１のビームスプリッタユニット１１を透過する。そして、共焦点レンズ２２、共焦点ピンホール２３を透過し、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４に入射する。

この場合、波長４８８ｎｍの観察用励起レーザ光により標本１８より発する蛍光（５００〜５３０ｎｍ）は、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４で反射し、波長５００〜５３０ｎｍを透過するバリアフィルタ２５ａを介して光検出器２６ａで検出される。また、５４３ｎｍの波長の観察用励起レーザ光により標本１８より発する蛍光（５７０〜６２０ｎｍ）は、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４を透過し、波長５７０〜６２０ｎｍを透過するバリアフィルタ２５ｂを介して光検出器２６ｂで検出される。

一方、刺激用レーザ光として、半導体レーザユニット３３から発振される波長４０５ｎｍの刺激用レーザ光は、シングルモードファイバ３４を透過して第２の走査ユニット２０の刺激用レーザ光導入ポート３１に導かれ、コリメートレンズ３７により平行光にされ、反射ミラー３８、合成ダイクロイックミラー３９を反射し、反射ミラー４０で反射する。そして、刺激用レーザ光走査手段４１を通り、瞳投影レンズ４２、結像レンズ４３を透過し、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａで反射し、さらに反射ミラー１５で反射し、対物レンズ１６により標本１８に集光される。

この場合、刺激用レーザ光は、表示部４６に表示された光検出器２６ａ、２６ｂで取得された蛍光のプレビュー画像上で、不図示のＰＣ（パーソナルコンピュータ）を介してマウスなどで指定されたポイントまたは領域を正確に走査するように、刺激用レーザ光走査手段４１により走査制御されている。

このとき、実際に光路上に配置されている光学素子、ここでは励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａと合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａの反射角度や折返し位置の固体差、つまり、上述した基準となるビームスプリッタとの角度差により、観察用励起レーザ光の走査位置と刺激用レーザ光の走査位置に相対的なずれが生じることがある。しかし、この場合、励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ａと合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａの組合せに対応させて、予め記憶部４５に記憶された補正情報、つまり走査位置の補正量が読み出され、この補正量に基づいて刺激用レーザ光走査手段４１による刺激用レーザ光の走査制御が補正される。これにより、観察用励起レーザ光の走査位置と刺激用レーザ光の走査位置の相対的なずれが解消され、プレビュー画像上で指定された位置に正確に刺激用レーザ光を照射することができる。

次に、観察状態をＫａｅｄｅ観察からＦＬＩＰ観察に変更する場合を説明する。この場合、刺激用レーザ光としては、赤外パルスレーザユニット３５のパルスレーザ発振器３５ａからの波長８００ｎｍのパルスレーザ光を使用し、観察用励起レーザ光としては、アルゴンレーザ２から発振される波長４８８ｎｍのレーザ光のみを使用する。また、光学素子として、第１のビームスプリッタユニット１１では、励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ｂが光路上に配置され、第２のビームスプリッタユニット１９では、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ｂが光路上に配置される。また、蛍光分光用ダイクロイックミラー２４を光路から取り外し、バリアフィルタ２５ｂとして５００〜６００ｎｍの波長域を透過させるバリアフィルタ２５ｃに交換する。

この状態で、観察用励起レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６で選択された波長４８８ｎｍのレーザ光は、上述したＫａｅｄｅ観察で説明したのと同じ経路を進み、標本１８に照射される。また、標本１８から発した波長４８８ｎｍの観察用励起レーザ光による蛍光も上述したＫａｅｄｅ観察で説明したのと同じ経路を進み、共焦点レンズ２２、共焦点ピンホール２３を透過し、バリアフィルタ２５ｃに直接入射する。

この場合、波長４８８ｎｍの観察用励起レーザ光により標本１８より発する蛍光（５００〜６００ｎｍ）は、バリアフィルタ２５ｃを透過して光検出器２６ｂで検出される。

一方、刺激用レーザ光として、赤外パルスレーザユニット３５から発振した波長８００ｎｍのパルスレーザ光は、反射ミラー３６を介して第２の走査ユニット２０の刺激用レーザ光導入ポート３２に導かれる。

そして、合成ダイクロイックミラー３９を透過し、観察用励起レーザ光源ユニット１からの波長４８８ｎｍのレーザ光と同軸に導かれ、反射ミラー１５で反射し、対物レンズ１６を介して標本１８に照射される。

このときも、光路上に配置されている光学素子、ここでは励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ｂと合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ｂの反射角度や折返し位置の固体差、つまり、上述した基準となるビームスプリッタとの角度差により、観察用励起レーザ光の走査位置と刺激用レーザ光の走査位置に相対的なずれが生じることがある。しかし、この場合も、励起ダイクロイックビームスプリッタ１１ｂと合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ｂの組合せに対応させて、予め記憶部４５に記憶された補正情報、つまり走査位置の補正量が読み出され、この補正量に基づいて刺激用レーザ光走査手段４１による刺激用レーザ光の走査制御が補正される。これにより、観察用励起レーザ光の走査位置と刺激用レーザ光の走査位置の相対的なずれが解消され、プレビュー画像上で指定された位置に正確に刺激用レーザ光を照射することができる。

従って、このようにすれば、観察用励起レーザ光を発生する観察用励起レーザ光源ユニット１から標本１８までの光路および刺激用レーザ光を発生する半導体レーザユニット３３または赤外パルスレーザユニット３５から標本１８までの光路にそれぞれ配置される第１のビームスプリッタユニット１１の励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃおよび第２のビームスプリッタユニット１９での合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂの切換えが原因して、観察用励起レーザ光の走査位置と刺激用レーザ光の走査位置に相対的なずれが生じることがあっても、予め記憶部４５に記憶された補正情報に基づいて刺激用レーザ光走査手段４１による刺激用レーザ光の走査制御を補正するようにしたので、観察用励起レーザ光走査手段１２による走査位置に対する刺激用レーザ光走査手段４１の走査位置の相対的なずれを解消でき、蛍光プレビュー画像上で指定した位置に対して、正確に刺激用レーザ光を照射して刺激を与えることができる。

また、記憶部４５に記憶された補正情報は、第１のビームスプリッタユニット１１の励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃと第２のビームスプリッタユニット１９の合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂの切換えによる組み合わせに対応して予め求められた補正情報が用いられているので、観察用励起レーザ光走査手段１２および刺激用レーザ光走査手段４１での走査位置の相互間の調整作業が一切不要となり、各種の観察方法を簡単に実行することが可能となる。

なお、上述の２種類の観察では、第１のビームスプリッタユニット１１と第２のビームスプリッタユニット１９の両方を切換えた時に、刺激用レーザ光走査手段４１での走査位置の補正を行っているが、走査位置の相対的な位置ずれは、とちらか一方を切換えても生じる。例えば、第２のビームスプリッタユニット１９のみを切換えた場合は、観察用励起レーザ光の走査位置はずれないが、合成ダイクロイックビームスプリッタ１９ａ、１９ｂ個々の反射角度の固体差により、刺激用レーザ光の走査位置がずれて、結果的に観察用励起レーザ光との相対的な位置ずれが生じる。また、第１のビームスプリッタユニット１１のみを切換えるた場合は、刺激用レーザ光の走査位置はずれないが、励起用ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ〜１１ｃ個々の反射角度の固体差により、観察用励起レーザ光の走査位置がずれて、結果的に刺激用レーザ光の走査位置との相対的な位置ずれは生じる。従って、観察方法や観察条件の変更のために第１のビームスプリッタユニット１１または第２のビームスプリッタユニット１９の少なくとも一方を切換えた時には、上述した走査位置の補正は必要となり、また、このときの補正量は、第１のビームスプリッタユニット１１および第２のビームスプリッタユニット１９のそれぞれの光学素子の組合せで決まるので、どちらか一方が切換えられたときのものも必要となる。また、本実施の形態のように各光学素子の切換えが電動であれば、切換えに連動して走査位置の補正を行うことが可能であることは言うまでもない。

（変形例１）
上述した実施の形態において、第１のビームスプリッタユニット１１および第２のビームスプリッタユニット１９のそれぞれ光路上に配置されている各光学素子の種類を認識するセンサなどの認識手段を設け、このセンサにより光学素子の切換えと種類を認識した状態から、制御部４４により光学素子の種類に対応する補正情報に基づいて走査位置の補正を行うようにしてもよい。この場合、光学素子の切換えが手動であっても、切換えを行なうと同時に、光路上の光学素子の種類の認識を電気的に行うことができるので、自動的に走査位置の補正をかけることができる。

（変形例２）
上述では、光学素子切換え時の走査位置の補正は、刺激用レーザ光走査手段４１の走査制御で行っていたが、観察用励起レーザ光走査手段１２の制御により行なうようにしてもよい。また、刺激用レーザ光走査手段４１と観察用励起レーザ光走査手段１２の両方で行ってもよい。結果的に、２つの光走査手段の走査位置に相対的なずれが生じないようにすればよく、例えば、観察用励起レーザ光の走査位置のみが変わる場合は観察用励起レーザ光の走査位置を補正するという考え方でもよい。

（変形例３）
上述の第１の実施の形態において、２つの刺激用レーザ導入ポート３１、３２の光路を合成する合成ダイクロイックミラー３９と反射ミラー４０の間に挿脱式のビームエクスパンダを設ける。このビームエクスパンダは、対物レンズ１６に入射するビーム径を対物レンズの瞳径に対して小さくするためのものであり、刺激用レーザ光のスポット径を大きくし、１回のスポット照射で刺激を与える範囲を広くする時に光路に入れる。このビームエクスパンダの挿脱により、ビームの角度がずれ、刺激用レーザの走査位置もずれる。このずれを補正するために、第１のビームスプリッタユニット１１及び第２のビームスプリッタユニット１９の組合せ及びビームエクスパンダの有無により決まる走査位置の補正量を記憶部４５に記憶させておく。これにより、刺激用レーザのスポット径を広げた場合でも、プレビュー蛍光画像で指定した位置に正確に光刺激を行なうことが可能となる。

（変形例４）
上述の第１の実施の形態において、観察用励起レーザ光路のコリメートレンズ９と反射ミラー１０の間に複数のビームエクスパンダを切換挿入できるようにする。この場合は、対物レンズ毎に異なる瞳径に適合させるビームエクスパンダを複数用意させておき、使用する対物レンズに応じて適切な倍率のビームエクスパンダを選択する。選択されるビームエクスパンダにより観察用励起レーザ光の角度がずれ、観察用励起レーザの走査位置もずれる。このずれを補正するために、第１のビームスプリッタユニット１１及び第２のビームスプリッタユニット１９及び観察用励起レーザ光の光路で選択されるビームエクスパンダの組合せで決まる走査位置の補正量を記億部４５に記憶させておく。これにより、対物レンズ毎に観察用励起レーザ光のビーム径を切換えても、プレビュー蛍光画像で指定した位置に正確に光刺激を行なうことが可能となる。

なお、本変形例では、ビームエクスパンダを挿脱式にしたが、ビーム径を可変するアフォーカルズームレンズを用いても良い。この場合は、ズームを行なうと光軸がずれるので、各ズームの各倍率において、そのずれを補正する補正量を記憶させておくことになる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

この場合、第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成については、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

第１の実施の形態では、第２のビームスプリッタユニット１９をスライド切換え機構により直線方向に移動するようにしたが、この第２の実施の形態では、着脱式にしたものが用いられる。

図６は、第２のビームスプリッタユニット１９に代わるビームスプリッタユニット部のみを取り出した斜視図である。図において、５１は基台で、この基台５１は、図１で述べた第１の走査ユニット８中の第
２のビームスプリッタユニット１９の配置された位置、つまり、観察用励起レーザ光と刺激用レーザ光の光路が合成される位置に図示しない螺子により固定されている。基台５１には、光路と直交する方向にメスアリガイド５１ａが設けられている。また、基台５１には、メスアリガイド５１ａに近接して認識センサ５１ｂが配置されている。

このような基台５１に対して単品からなるビームスプリッタユニット本体５２が着脱可能に設けられている。このビームスプリッタユニット本体５２は、前面に傾斜面５２ａを有し、この傾斜面５２ａに合成ダイクロイックビームスプリッタ５３が接着などで固定されている。また、ビームスプリッタユニット本体５２の底面には、アリ部５２ｂが形成され、このアリ部５２ｂを基台５１のメスアリガイド５１ａに嵌合して移動させることで、合成ダイクロイックビームスプリッタ５３を光路に対し挿脱可能にしている。この場合、ビームスプリッタユニット本体５２は、基台５１に装着された状態で、図示しないクランプ機構により位置決めされている。さらに、ビームスプリッタユニット本体５２には、合成ダイクロイックビームスプリッタ５３に近接して認識マーク５４が設けられている。この認識マーク５４は、装着される合成ダイクロイックビームスプリッタ５３の種類を認識するためのものである。

このように構成されたビームスプリッタユニット部は、合成ダイクロイックビームスプリッタ５３を有するビームスプリッタユニット本体５２を基台５１のメスアリガイド５１ａに沿って移動させることで、合成ダイクロイックビームスプリッタ５３を光路に対し挿脱する。そして、ビームスプリッタユニット本体５２を基台５１に装着すると、認識マーク５４の内容が認識センサ５１ｂにより読み出され、装着された合成ダイクロイックビームスプリッタ５３の種類を認識する。そして、この認識結果からビームスプリッタユニット本体５２に対応する刺激用レーザ光走査手段４１の走査位置の補正情報が読み出され、刺激用レーザ光の走査位置の補正が行われる。

従って、このようにしても、第１の実施の形態と同様な効果を得られる。また、合成ダイクロイックビームスプリッタ５３を有するビームスプリッタユニット本体５２をユニット化して光路に対して着脱可能な構成としたので、特性の異なる合成ダイクロイックビームスプリッタ５３を有するビームスプリッタユニット本体５２を多数用意しておくことにより、さらに多くの観察方法に対応することができる。また、後から新しい観察方法を追加するような場合にもビームスプリッタユニット本体５２を追加するのみで容易に対応することもできる。

上述した第２の実施の形態では、第２のビームスプリッタユニット１９に代わるものについて述べたが、第１のビームスプリッタユニット１１についても同様に適用することができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。第１の実施の形態に用いられる第１のビームスプリッタユニットの概略構成を示す図。第１の実施の形態に用いられる第２のビームスプリッタユニットの概略構成を示す図。第１の実施の形態に用いられる励起ダイクロイックビームスプリッタの特性を示す図。第１の実施の形態に用いられる合成ダイクロイックビームスプリッタの特性を示す図。本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の要部の概略構成を示す図。プレビュー画像上に表示される細胞に対して刺激を与えるポイントを指定する状態を説明する図。

符号の説明

１…観察用励起レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…ヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…ＡＯＴＦ
７…シングルモードファイバ、８…第１の走査ユニット
９…コリメートレンズ、１０…反射ミラー
１１…第１のビームスプリッタユニット、
１１ａ．１１ｂ、１１ｃ…励起用ダイクロイックビームスプリッタ
１１ｄ…モータ、１２…観察用励起レーザ光走査手段
１２ａ．１２ｂ…ミラー、１３…瞳投影レンズ、１４…結像レンズ
１５…反射ミラー、１６…対物レンズ、１７…ステージ
１８…標本、１９…第２のビームスプリッタユニット
１９ａ．１９ｂ…合成ダイクロイックビームスプリッタ
１９ｃ…空穴、１９ｄ…モータ、１９ｅ…図示矢印
２０…第２の走査ユニット、２２…共焦点レンズ
２３…共焦点ピンホール、２４…蛍光分光用ダイクロイックミラー
２４…ダイクロイックミラー、２５ａ…バリアフィルタ
２５ｂ…バリアフィルタ、２５ｃ…バリアフィルタ
２６ａ．２６ｂ…光検出器、３１、３２…刺激用レーザ光導入ポート
３３…半導体レーザユニット、３４…シングルモードファイバ
３５…赤外パルスレーザユニット、３５ａ…パルスレーザ発振器
３５ｂ…電動シャッタ、３６…反射ミラー、３７…コリメートレンズ
３８…反射ミラー、３９…合成ダイクロイックミラー
４０…反射ミラー、４１…刺激用レーザ光走査手段
４１ａ．４１ｂ…ミラー、４２…瞳投影レンズ
４３…結像レンズ、４４…制御部、４５…記憶部
４６…表示部、５１…基台、５１ａ…メスアリガイド
５１ｂ…認識センサ、５２…ビームスプリッタユニット本体
５２ａ…傾斜面、５２ｂ…アリ部、５３…合成ダイクロイックビームスプリッタ
５４…認識マーク

Claims

観察用励起レーザ光を発生する観察用励起レーザ光源と、
前記観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
前記観察用励起レーザ光の前記標本上での走査により前記標本から発せられる検出光を検出する検出光学系と、
前記検出光学系により検出された検出光に基づいて、前記標本のプレビュー画像を生成して表示するプレビュー手段と、
前記プレビュー手段により表示された前記プレビュー画像上で、当該標本に刺激を与える位置を指定する指定手段と、
刺激用レーザ光を発生する刺激用レーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を前記標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記観察用励起レーザ光源から前記標本までの光路又は前記刺激用レーザ光源から前記標本までの光路に光学素子を切換え挿入するための少なくとも1つの光学素子切換え手段と、
前記光学素子切換え手段の切換えによって発生する前記第１および第２の走査手段の走査位置の相対位置ずれに関する補正情報を記憶する記憶手段を有し、該記憶手段に記憶された補正情報に基づいて、前記指定手段により指定された位置に、前記刺激用レーザ光を照射するように、前記第１および第２の走査手段の少なくとも一方の走査位置を補正制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
前記制御手段は、前記少なくとも一つの光学素子切換え手段の切換えに連動して補正制御を行なうことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくとも一つの光学素子切換え手段は、複数の光学素子を同心円状に配置した回転ターレットからなり、該回転ターレットの回転により前記光学素子の切換えを可能にしたことを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくとも一つの切換え手段は、複数の光学素子を直線状に配置し、直線方向のスライド動作により前記光学素子の切換えを可能にしたことを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザ顕微鏡。
観察用励起レーザ光を発生する観察用励起レーザ光源と、
前記観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
前記観察用励起レーザ光の前記標本上での走査により前記標本から発せられる検出光を検出する検出光学系と、
前記検出光学系により検出された検出光に基づいて、前記標本のプレビュー画像を生成して表示するプレビュー手段と、
前記プレビュー手段により表示された前記プレビュー画像上で、当該標本に刺激を与える位置を指定する指定手段と、
刺激用レーザ光を発生する刺激用レーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を前記標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記観察用励起レーザ光源から前記標本までの光路又は前記刺激用レーザ光源から前記標本までの光路に配置される光学素子を着脱するための少なくとも1つの光学素子着脱手段と、
前記光学素子着脱手段を用いて異なる種類の光学素子に交換した場合に発生する前記第１および第２の走査手段の走査位置の相対位置ずれに関する補正情報を記憶する記憶手段を有し、該記憶手段に記憶された補正情報に基づいて、前記指定手段により指定された位置に、前記刺激用レーザ光を照射するように前記第１および第２の走査手段の少なくとも一方の走査位置を補正制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくとも一つの光学素子切換え手段または光学素子着脱手段によって切換え挿入または着脱される光学素子は、前記観察用励起レーザ光と前記検出光を分離する特性を有する励起用ダイクロイックビームスプリッタであることを特徴とする請求項1乃至５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくとも一つの光学素子切換え手段または光学素子着脱手段によって切換え挿入または着脱される光学素子は、前記観察用励起レーザ光と前記刺激用レーザ光を合成する合成ダイクロイックビームスプリッタであることを特徴とする請求項1乃至５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくとも一つの光学素子切換え手段によって切換え挿入される光学素子は、前記観察用励起レーザ光及び又は前記刺激用レーザ光の対物レンズに入射するビーム径を可変するビームエクスパンダであることを特徴とする請求項1乃至５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記少なくも１つの光学素子切換え手段により光路に挿入された光学素子の種類を認識する認識手段を有することを特徴とする請求項1乃至８のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記光学素子切換え手段または光学素子着脱手段は、複数であり、前記補正情報は複数の光学素子切換え手段または光学素子着脱手段にて光路上に配置されるそれぞれの光学素子の組合わせに対応して記憶されていることを特徴とする請求項1乃至９のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記第少なくとも一つの光学素子着脱手段は、前記光路において光学素子が配置される位置に設けられた基台と、この基台上に着脱可能に設けられる単品の光学素子ユニットを位置決めするクランプ手段を備えることを特徴とする請求項５記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記光学素子切換え手段または前記光学素子着脱手段が前記光路上の２箇所に備えられており、
第１の光学素子切換え手段または第１の光学素子着脱手段は、前記観察用励起レーザ光と前記検出光を分離する特性を有する励起用ダイクロイックビームスプリッタの切換え挿入または着脱を行い、
第２の光学素子切換え手段または第２の光学素子着脱手段は、前記観察用励起レーザ光と前記刺激用レーザ光を合成する合成ダイクロイックビームスプリッタの切換え挿入または着脱を行い、
前記記憶手段は前記励起用ダイクロイックビームスプリッタと前記合成ダイクロイックビームスプリッタとの組み合わせに対応して補正情報を記憶する
ことを特徴とする請求項７に記載の走査型レーザ顕微鏡。