JP5058624B2 - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、光軸ずれを自動調節するオートアライメント機構を有するレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このレーザ顕微鏡によれば、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長やレーザ光の光束径が変更されることに起因するレーザ光の光軸ずれを検出し、これを自動的に補正することができる。

特開２００５−３４５６１４号公報

しかしながら、特許文献１のレーザ顕微鏡は、光軸ずれを検出するセンサの位置において光軸ずれが発生しないように補正することはできるものの、センサから対物レンズまでの間において通過する光学素子によるレーザ光の光軸ずれについては補正することができないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、対物レンズから標本に向けて照射されるレーザ光の光軸を精度よく補正することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、２以上の波長のレーザ光を発振可能なレーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を２次元的に走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を標本上に集光する対物レンズと、前記レーザ光源から発せられるレーザ光の光軸ずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、前記対物レンズと前記光軸ずれ検出部との間に、前記レーザ光の波長に応じて切替可能に配置された光学素子と、該光学素子の切り替えによるレーザ光の光軸を補正するための補正情報を記憶する記憶部と、前記光軸ずれ検出部と前記レーザ光源との間に配置され、前記光軸ずれ検出部により検出された光軸ずれ量と、前記記憶部に記憶された補正情報とに基づいて、レーザ光の光軸を補正する光軸補正部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光は走査部により２次元的に走査され、対物レンズにより集光されて標本上に照射される。これにより、標本において発生した蛍光や反射光を観察することができる。この場合において、レーザ光源から発せられるレーザ光の波長が変更されると、レーザ光源から出射されるレーザ光に光軸ずれが発生するので、光軸ずれ検出部により光軸ずれ量を検出し、光軸補正部により補正することができる。

さらに、レーザ光の波長が変更されると、これに応じて光軸ずれ検出部と対物レンズとの間に配置されている光学素子が切り替えられる。光学素子が切り替えられると、その反射面等が変動するため、光学素子から標本に向かうレーザ光の光軸が変化するが、本発明によれば、その光学素子の切り替えによる補正情報を記憶部に記憶しておき、これを用いることで光軸補正部による光軸の補正に、光学素子の切替による光軸ずれを加味することができる。その結果、レーザ光の波長が切り替えられ、光学素子が切り替えられても、対物レンズから標本に照射されるレーザ光の光軸を変動させることなく維持することができる。

上記発明においては、前記レーザ光の照射により標本から発生し、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器を備え、前記光学素子が、前記レーザ光と蛍光とを分離するダイクロイックミラーであることとしてもよい。
このようにすることで、ダイクロイックミラーにおいて透過または反射して標本に向かうレーザ光の光軸が一定に維持されるとともに、標本から発生して光り検出器により検出される蛍光の光軸ずれも防止することができる。その結果、取得される蛍光画像が波長毎にずれることを防止することができる。

また、上記発明においては、前記レーザ光源、走査部、光軸ずれ検出部および光軸補正部が２組設けられ、前記光学素子が、２つのレーザ光源からのレーザ光を合成する合成ダイクロイックミラーであることとしてもよい。
このようにすることで、一方のレーザ光を観察用、他方のレーザ光を光刺激用に設定し、各レーザ光の波長変更に応じて合成ダイクロイックミラーを切り替えても、該合成ダイクロイックミラーから標本に向かう各レーザ光の光軸の変動を防止し、蛍光画像ずれを防止することができるとともに、光刺激位置のずれを防止することができる。これにより、標本に対して精度よく光刺激を与えながら、波長毎に蛍光画像ずれを生ずることなく観察を行うことができる。
また、上記発明においては、前記補正情報が、前記光学素子の切り替えによる該光学素子から前記標本に向かうレーザ光の光軸ずれ量及び光軸ずれ方向を含み、前記光軸補正部が、前記光軸ずれ検出部により検出された光軸ずれ量に基づいてレーザ光の光軸を補正すると共に、前記補正情報に基づいて、レーザ光の光軸を、前記光学素子の切り替えによる該光学素子から前記標本に向かうレーザ光の光軸ずれ方向とは逆の方向に当該レーザ光の光軸ずれ量だけずらすように補正することとしてもよい。

本発明によれば、対物レンズから標本に向けて照射されるレーザ光の光軸を精度よく補正することができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、複数の波長の超短パルスレーザ光を変更可能に出射するレーザ光源２と、該レーザ光源２から発せられるレーザ光の光軸を自動調節するオートアライメント装置３と、該オートアライメント装置３から出力されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ４と、該スキャナ４により走査されたレーザ光を集光して標本Ａに照射する一方、標本Ａにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光をレーザ光から分岐するダイクロイックミラー６と、該ダイクロイックミラー６により分岐された蛍光を検出する光検出器７とを備えている。図中、符号８はレーザ光を遮断するバリアフィルタである。

前記オートアライメント装置３は、レーザ光源２から出射されたレーザ光の光軸に直交する方向に沿うオフセット（光軸ずれ）および光軸の傾き（光軸ずれ）を検出する光軸ずれ検出部９と、該光軸ずれ検出部９による検出結果に応じて光軸を調節する光軸調節部１０と、該光軸調節部１０を制御する制御部１１と、ダイクロイックミラー６の切り替えに伴う光軸ずれの補正情報を記憶する記憶部１２とを備えている。

光軸ずれ検出部９は、例えば、光軸調節部１０の後段の光路からレーザ光の一部を分岐するビームスプリッタ１３，１４と、該ビームスプリッタ１３，１４により光路から分岐されたレーザ光を異なる光路長を介して検出する２つのセンサ１５，１６とを備えている。
各センサ１５，１６は、例えば、４分割フォトダイオードであり、受光するレーザ光のスポット位置に応じた４つのセンサ部分（図示略）の出力バランスにより、レーザ光の本来の光軸に対する該光軸に直交する方向に沿うオフセット量を検出することができるようになっている。また、異なる光路長を介した２つのセンサ１５，１６におけるオフセット量の差に応じて、レーザ光の本来の光軸に対する傾き量を検出することができるようになっている。

前記光軸調節部１０は、レーザ光源２から出射されたレーザ光の光軸に対して傾斜して配置されるミラー１７と、該ミラー１７を該ミラー１７への入射前のレーザ光の光軸に沿う方向に並進移動させるオフセット調節部１８と、前記ミラー１７の傾斜角度を変化させる傾き調節部１９とを備えている。オフセット調節部１８の作動により、ミラー１７を並進移動させることにより、ミラー１７により反射されて出射されるレーザ光の光軸を、該光軸に直交する方向にオフセットさせることができるようになっている。また、傾き調節部１９の作動により、ミラー１７をの傾斜角度を変化させることにより、ミラー１７により反射されて出射されるレーザ光の光軸の傾きを変化させることができるようになっている。

前記制御部１１の動作については後述する。
前記記憶部１２には、補正情報として、ダイクロイックミラー６が切り替えられることによるダイクロイックミラー６より後段側のレーザ光のオフセット量および傾き量が各ダイクロイックミラー６の識別情報と対応づけて記憶されている。

前記スキャナ４は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動可能に支持された２枚のガルバノミラー４ａ，４ｂを対向配置させたものである。このスキャナ４によれば、２つのガルバノミラー４ａ，４ｂを同期させて揺動させることにより、レーザ光を、例えば、ラスタスキャン方式に２次元的に走査させることができるようになっている。

前記ダイクロイックミラー６は、使用するレーザ光の波長帯域に応じて複数種類のものが切替機構２０によって切り替え可能に設けられている。切替機構２０は、ターレットにより回転させることにしてもよいし、カセットの挿脱により切り替えるものでもよい。このダイクロイックミラー６の切替機構２０は、現在光路上に配置されているダイクロイックミラー６を識別するための識別情報を制御部１１に対して出力するようになっている。

前記制御部１１は、前記２つのセンサ１５，１６からの出力を受けて、該センサ１５，１６の位置においてレーザ光の光軸のオフセットおよび傾きが解消されるための光軸調節部１０への指令信号を算出するとともに、切替機構２０から出力されてくる識別情報に応じて記憶部１２内を検索し、現在光路上に配置されているダイクロイックミラー６の補正情報を取得するようになっている。そして、制御部１１は、前記センサ１５，１６からの出力のみにより算出した指令信号にダイクロイックミラー６の切り替えに伴う補正情報を加味した新たな指令信号を算出するようになっている。

すなわち、センサ１５，１６からの出力のみによりセンサ１５，１６の位置において光軸ずれが解消するように光軸調節部１０を調節しても、切替機構２０によりダイクロイックミラー６を切り替えるだけで、ダイクロイックミラー６から標本Ａに向かうレーザ光の光軸に光軸ずれが発生するので、ダイクロイックミラー６の切り替えに伴う光軸ずれとは逆方向に予め光軸をずらした状態で、レーザ光がダイクロイックミラー６に入射されるように光軸調節部１０への指令信号を算出するようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、レーザ光源２から出射された超短パルスレーザ光をスキャナ４により２次元的に走査させて対物レンズ５を介して標本Ａに照射することにより、対物レンズ５の焦点面において多光子励起効果が発生し、蛍光物質が励起されて多光子蛍光が発生する。

発生した蛍光は、対物レンズ５により集光されダイクロイックミラー６を透過して、バリアフィルタ８によりレーザ光を除去された後に光検出器７により検出される。したがって、光検出器７により検出された蛍光の強度情報と、そのときのスキャナ４による２次元的な走査位置とを対応づけて記憶しておくことにより、２次元的な多光子蛍光画像を取得することができる。

この場合において、光路上に配置されるダイクロイックミラー６が設計通りに精度よく製造および位置決めされた標準ミラーであると仮定すると、レーザ光源２から出射されるレーザ光の波長が切り替えられても、オートアライメント装置３においては、センサ１５，１６の位置において光軸ずれが解消するように光軸調節部１０を作動させればよい。しかし、現実には、製造および位置決め誤差を完全にゼロにすることは困難である。

本実施形態によれば、各ダイクロイックミラー６毎に標準ミラーに対する光軸のオフセット量および傾き量からなる補正情報を識別情報とともに記憶部１２に記憶しているので、切替機構２０から送られてくる識別情報に基づいて、対応するダイクロイックミラー６の補正情報が記憶部１２から取得される。そして、制御部１１においては、取得された補正情報に基づいて、光軸調節部１０が駆動される。これにより、レーザ光が、予め逆方向に光軸をずらした状態でダイクロイックミラー６に入射されるので、ダイクロイックミラー６において反射され標本Ａに向かうレーザ光においては光軸ずれが完全に解消されていることになる。

すなわち、レーザ光の波長変更に伴い、ダイクロイックミラー６を切り替えても、標本Ａに入射させるレーザ光に光軸ずれが発生せず、波長毎に取得される蛍光画像のずれを解消することができるという利点がある。
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、スキャナ４とは別個に設けられたオートアライメント装置３により光軸ずれを補正するので、スキャナ４による走査範囲が制限される不都合を防止することができる。

なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１においては、記憶部１２に、各ダイクロイックミラー６の識別情報と対応づけて、オフセット量および傾き量からなる補正情報を記憶しておくこととしたが、補正情報としてはこれに限定されるものではなく、ダイクロイックミラー６の切り替えに伴う光軸のオフセットおよび傾きを解消できる任意の量を採用してもよい。

また、ダイクロイックミラー６の切替機構２０から出力される識別情報に基づいて、記憶部１２内の補正情報を取得することとしたが、ダイクロイックミラー６の切り替えが制御部１１からの指令により行われる場合には、制御部１１自体が現在光路上に配置されているダイクロイックミラー６を識別できるので、切替機構２０から識別情報を出力する必要はない。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡１′について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１′の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡１′は、図２に示されるように、観察用光学系３０に加えて光刺激用光学系３１を備えている点、および、多光子励起型ではなく共焦点型のレーザ顕微鏡１′である点において第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と相違している。また、波長に応じて切り替えられるダイクロイックミラー３２が、観察用のレーザ光と光刺激用のレーザ光とを同一光路に合成する合成ダイクロイックミラー３２である点においても相違している。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡１′においては、観察用光学系３０および光刺激用光学系３１に、それぞれ、レーザ光源２，２′、オートアライメント装置３，３′およびスキャナ４，４′が備えられている。観察用光学系３０には、スキャナ４を介して戻る蛍光をレーザ光から分岐する固定されたダイクロイックミラー３３と、分岐された蛍光を集光する集光レンズ３４と、バリアフィルタ８と、共焦点ピンホール３５と、該共焦点ピンホール３５を通過した蛍光を検出する光検出器７とが備えられている。

前記制御部１１は、各オートアライメント装置３，３′のセンサ１５，１６；１５′，１６′からの出力信号および識別情報に基づいて記憶部１２から取得した補正情報とに基づいて、各オートアライメント装置３，３′における光軸調節部１０，１０′への指令信号をそれぞれ算出するようになっている。
図中、符号３６はミラー、符号３７，３７′はビームスプリッタである。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１′によれば、観察用のレーザ光および／または光刺激用のレーザ光の波長を切り替えることに伴い、切替機構２０の作動により合成ダイクロイックミラー３２を切り替えても、合成ダイクロイックミラー３２に入射されるレーザ光が、該合成ダイクロイックミラー３２による光軸ずれとは逆方向に予め光軸をずらされる。したがって、光軸ずれのないレーザ光を標本Ａに照射して、正確な位置を刺激し、波長毎にずれのない共焦点画像を取得することができる。また、観察用のレーザ光による撮像位置と光刺激用のレーザ光による刺激位置とを一致させることができ、例えば、刺激している位置を観察できないような事態の発生を回避することができる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。

符号の説明

Ａ 標本
１，１′ レーザ顕微鏡。
２，２′ レーザ光源
４，４′ スキャナ（走査部）
５ 対物レンズ
６ ダイクロイックミラー（光学素子）
７ 光検出器
９，９′ 光軸ずれ検出部
１０，１０′ 光軸調節部（光軸補正部）
１２ 記憶部
３２ 合成ダイクロイックミラー（光学素子）

Claims (4)

1. ２以上の波長のレーザ光を発振可能なレーザ光源と、
   該レーザ光源からのレーザ光を２次元的に走査する走査部と、
   該走査部により走査されたレーザ光を標本上に集光する対物レンズと、
   前記レーザ光源から発せられるレーザ光の光軸ずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、
   前記対物レンズと前記光軸ずれ検出部との間に、前記レーザ光の波長に応じて切替可能に配置された光学素子と、
   該光学素子の切り替えによるレーザ光の光軸ずれを補正するための補正情報を記憶する記憶部と、
   前記光軸ずれ検出部と前記レーザ光源との間に配置され、前記光軸ずれ検出部により検出された光軸ずれ量と、前記記憶部に記憶された補正情報とに基づいて、レーザ光の光軸を補正する光軸補正部とを備えるレーザ顕微鏡。
2. 前記レーザ光の照射により標本から発生し、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器を備え、
   前記光学素子が、前記レーザ光と蛍光とを分離するダイクロイックミラーである請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
3. 前記レーザ光源、走査部、光軸ずれ検出部および光軸補正部が２組設けられ、
   前記光学素子が、２つのレーザ光源からのレーザ光を合成する合成ダイクロイックミラーである請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記補正情報が、前記光学素子の切り替えによる該光学素子から前記標本に向かうレーザ光の光軸ずれ量及び光軸ずれ方向を含み、
   前記光軸補正部が、前記光軸ずれ検出部により検出された光軸ずれ量に基づいてレーザ光の光軸を補正すると共に、前記補正情報に基づいて、レーザ光の光軸を、前記光学素子の切り替えによる該光学素子から前記標本に向かうレーザ光の光軸ずれ方向とは逆の方向に当該レーザ光の光軸ずれ量だけずらすように補正する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。

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