JP4729269B2

JP4729269B2 - レーザ走査型顕微鏡

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Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関する。

走査型レーザ頭微鏡は、生きた細胞や組織などの試料を傷つけることなく、光学的にスライスして２次元断層像を得、複数の断層像から３次元画象を得ることを可能とする。

生物試料を観察する走査型レーザ顕微鏡は、試料に導入した蛍光試薬または蛍光蛋白にレーザ光を照射し、そこからの蛍光を測定し画像化する。このとき試料に蛍光試薬または蛍光蛋白を複数導入し、細胞内の複数の化学物質を観察することが可能となる。これら複数の蛍光物質を励起する為、複数の波長の励起レーザ光が必要となる。複数波長の励起レーザ光を出力するためのレーザ光源の例を図１７に示す。

一方蛍光物質からの蛍光量は、励起光の照射時間に伴い減少する退色現象を生じる。このため走査型レーザ顕微鏡には不要な励起光を遮断もしくは減光し、極力退色を防止する必要がある。

これら目的を達成するために、音響光学素子（ＡＯＴＦ、ＡＯＦ、ＡＯＭなど）や、又は電気光学素子（ＥＯＭ）を利用することが提案されている（例えば、非特許文献１の図２参照）。これらの原理は以下のとおりである。

超音波が固体や液体中を伝播する時、その媒質中には光弾性効果によって、音の進行方向と平行にそして音の波長を周期として、光に対する屈折率の周期的変動が生じる。この媒質中に光が入射すると、入射した光の一部は超音波によって回折する。この現象を音響光学効果という。この音響光学効果を利用した音響光学素子（ＡＯＭ、ＡＯＴＦ、ＡＯＤ等）の動作原理を図１８に示す。媒質としてＬｉＮｂＯ_３、ＰｂＭｏＯ_４、ＴｅＯ_２等の光学結晶に超音波（ＲＦ）を伝送する圧電体等のトランスデューサを取付けて高周波（ＲＦ）電圧をかけると、結晶内に高周波の音波が発生する．この音波による屈折率の周期的変化を利用して、透過光や反射光を制御することが可能である。

一方、物質に電圧を加えると、その物質の屈折率が変わる現象を電気光学効果という。この物質（ＬｉＮｂＯ_３、ＫＤＰ、ＡＤＰ等の結晶）中を通過する光の位相を電圧を加えることによって変化させ、振幅変調や位相変調を行うことが可能である。この様な電気光学効果を利用したものを電気光学素子（ＥＯＭ等）という。

図１９及び図２０にレーザ走査型顕微鏡における音響光学素子の使用例を示す。
図１９は、音響光学素子１３０が、レーザ波長の高速選択（切換え）手段、調光（出射パワー調整機構）手段、及びそのスイッチング機能を利用したパルス成形手段、シャッタ手段として使用された例を示す図である。この従来例に係るレーザ走査型顕微鏡の詳細については、特許文献１に示されている。ＡｒやＡｒＫｒ１１０ａ、ＨｅＮｅ１１０ｂ、１１０ｃの短波長レーザが複数設置され、それらレーザの出射ビームがダイクロイックミラー等により１本のビームに合成され音響光学素子１３０に入射する。音響光学素子１３０は、そのＲＦ周波数制御により波長選択が、ＲＦ振幅〈電圧〉制御により出射パワーが、ＲＦ−ＯＮ／ＯＦＦスイッチング制御により連続発振レーザのパルス成形が高速に可能である。

図２０は、レーザ光源に波長切換え可能なパルスレーザ（レーザ光源）１１０を用いた例を示す。音響光学素子１３０はレーザ光源の選択された波長に従い、ＲＦ周波数制御することで、選択された波長のレーザを出射すると共に、ＲＦ振幅（電圧）制御により出射ビームのパワー制御が可能である。

しかし、音響光学素子１３０に使用される結晶（ＬｉＮｂＯ_３、ＰｂＭｏＯ_４、ＴｅＯ_２）は非常に波長分散（群速度遅延の分散；ＧＤＤ）が大きく、音響光学素子１３０により出射後のビームのパルス幅が広げられてしまうという欠点がある。多光子励起レーザ走査型顕微鏡では蛍光発光強度が２光子励起の場合はパルス幅に、３光子励起の場合はパルス幅の２乗に反比例するため、非常に大きな影響を及ぼす。

この音響光学素子１３０の波長分散（ＧＤＤ）による出射ビームのパルス幅広がり対策として、特許文献２の手段を図２１に示す。これはパルスレーザ光源１１０と音響光学素子間にプレチャープ光学系を挿入し、音響光学素子、もしくはレーザ出射後観察標本に達するまでの全光学系の波長分散量（ＧＤＤ）分の逆分散（プレチャープ）行うことで、音響光学素子出射後、もしくは観察標本面でのパルス幅の広がりを相殺したものである。

図２２にプリズムを用いた代表的なプレチャープ光学系概略図を示す。図中の第１プリズム１６１で分光されたビームは、波長分散量（レーザ光帯域内の波長による媒質伝播速度ずれ）に応じた光路長差に設定された第２プリズム１６２により逆分散され第１プリズム１６１を再経由し、顕微鏡照明光学系内に戻されることにより、照明光学系内の波長分散を相殺することが出来る。

次に、特許文献３記載の音響光学素子の波長分散（ＧＤＤ）量を利用したパルス圧縮手段につき、図２３に基づき説明する。パルスレーザをレーザ光源１１０とし、光ファイバー１８５を顕微鏡への導入に用いた照明光学系を有するレーザ顕微鏡において、光ファイバー１８５の持つ線形及び非線形分散効果を避けるために、ファイバー入射側では先に示したプレチャープ光学系（逆分散）等のパルス伸長器１８０により、パルス幅を充分拡げると共にピークパワーを充分下げる必要がある。しかし、多光子励起レーザ顕微鏡では、先に示した様に必要な蛍光発光強度を得るためには、パルス幅が充分狭い必要があり、パルス伸長器、ファイバーを経てパルス幅の広がったビームでは標本面上の光子密度が低く、多光子励起が出来ない。そこでファイバー出射端に例えばＺｎＳｅといった波長分散量（ＧＤＤ）の大きな光学部材を設置し、パルス幅を圧縮することで必要なパルス幅を得ることが行われている。音響光学素子も先に述べた様に、波長分散量（ＧＤＤ）が充分大きいため、同様にパルス圧縮器としで用いることが出来る。ここで、音響光学素子を使用する利点は、波長選択手段、調光（パワー調整）手段、スイッチング手段としても利用できる点である。

以上従来技術として、主に音響光学素子について述べたが、電気光学素子についても同様にレーザ走査型顕微鏡への応用が考えられる。
特開２０００−２０６４１５号公報特表平１０−５１２９５９号公報特開２０００−２０６４１５号公報ＡＫＩＳＰ．ＧＯＵＴＺＯＵＬＩＳａｎｄＤＥＮＮＩＳＲ．ＰＡＰＥＤＥＳＩＧＮＡＮＤＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮＯＦＡＣＯＵＳＴＯ −ＯＰＴＩＣＤＥＶＩＣＥＳ、Ｐ．２４６−２５８（１９４４）

上記のように、音響光学素子又は電気光学素子はレーザ走査型顕微鏡において有用な素子であるが、以下のような問題点を有する。

使用するレーザに対する音響光学素子又は電気光学素子の開口部が小さい。このため、レーザ光をガウシアンビームであるものと想定しても、任意の位置でのビーム径はビームウエスト位置でのビーム径と広がり角により変化し、音響光学素子又は電気光学素子の開口部でケラレた分のパワーロスが生じる。

また、音響光学素子又は電気光学素子の入射光に対する出射光の角度分散により、光源となるレーザのガウシアンビームの広がり角により、出射ビームがより広がってしまう。

更に、レーザ光源内部構造により、出射レーザの縦横方向でのビームウエスト位置、広がり角に差が生じる。これにより、ビーム整形手段以前に、顕微鏡入射ビームの形状としても焦点座標や焦点面でのレーザ強度、光子密度的に誤差を生じる。

また、音響光学素子又は電気光学素子の開口部と顕微鏡入射第一瞳径〈レーザ光投影瞳共役面〉とが異なる場合に、投影されたレーザ光が顕微鏡瞳径より大きい場合は、ビームのケラレによるパワーロスが、瞳径より小さい場合はＮＡ不足による解像劣化等が生じる。

更に、パルスレーザ等の波長切換え可能なレーザ光源を用いた場合において、その波長切換え時ビーム位置等がずれる。これは音響光学素子又は電気光学素子が持つ入射ビームの角度に対する出射ビームパワー特性変化が大きなこと、また、瞳投影式のレーザ走査型顕微鏡の場合は視野のケラレ、ムラ、他のレーザによる観察像との位置ずれ等の問題がある。従って、顕微鏡等の光学的精度を求める部位に出力光を導入する場合には、波長ごとに素子への入力信号や素子前後の入出力光の最適化など、数多くの最適化調整を行う必要があり、使用する波長が増えるほど各部調整が困難となる。

本発明は、レーザ走査型顕微鏡のレーザ光源からのレーザ光を顕微鏡に導入する照明光学系内に、音響光学素子又は電気光学素子を備えたレーザ走査型顕微鏡において、レーザ光源からのレーザ光を有効かつ理想的に顕微鏡に導入するレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一局面に係る発明は、レーザ光源からレーザ光を顕微鏡に導入する照明光学系内に、音響光学素子又は電気光学素子を備えたレーザ走査型顕微鏡において、前記レーザ光源から出射された前記レーザ光の波長に起因する前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ及び前記レーザ光のビーム径のずれを補正、又は前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ及び前記レーザ光のビームの広がりずれを補正、又は前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ、前記ビーム径のずれ及び前記ビームの広がりずれを補正するための調整機構と、前記波長に対応した前記補正の補正値を記憶する記憶手段と、前記レーザ光の前記波長の切換えに伴い、前記記憶手段に記憶された、切換えられた前記波長に対応した前記補正値を用いて前記調整機構を自動的に調整する補正手段と、を具備することを特徴とする。

本発明によれば、レーザ走査型顕微鏡のレーザ光源からのレーザ光を顕微鏡に導入する照明光学系内に、音響光学素子又は電気光学素子を備えたレーザ走査型顕微鏡において、レーザ光源からのレーザ光を有効かつ理想的に顕微鏡に導入するレーザ走査型顕微鏡を提供することができる。

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明の実施形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。なお、以下の各実施形態において、レーザ顕微鏡の概略構成は図１と同様であるので、図１を援用するものとする。
走査型レーザ顕微鏡は、レーザ制御部１００と、レーザ走査部２００と、顕微鏡３００とを備えている。レーザ制御部１００は、レーザ光を出射するレーザ光源１１０と、レーザ光のＯＮ／ＯＦＦスイッチ・調光・波長選択を行う音響光学素子１３０と、レーザ顕微鏡の動作を制御するＰＣ１４０とからなっている。レーザ走査部２００は、レーザ光を走査させる機構であるガルバノメータミラー２１０と、標本３１０で発生した蛍光を電気信号に変換する光電変換器２２０とからなっている。顕微鏡３００は、標本３１０を観察するための対物レンズ３２０を備えている。また、モニタ４００は観察象を表示するために使用される。また、ＰＣ１４０は、音響光学素子１３０、ガルバノメータミラー２１０及び光電変換器２２０と信号線で接続されている。

上記の構成において、レーザ光源１１０から出射されたレーザ光は音響光学素子１３０に入射する。音響光学素子１３０はＰＣ１４０からの指令に基づいて、レーザ光をＯＮ／ＯＦＦ制御、調光、波長選択する。音響光学素子１３０を通過したレーザ光はレーザ走査部２００によって進行方向を偏向され２次元平面上を走査するように制御される。そして、レーザ光は顕微鏡３００に入射し対物レンズ３２０によって標本３１０上を２次元に走査される。走査された標本３１０は光励起され蛍光を発する。発生した蛍光は対物レンズ３２０を介してレーザ光とは逆の光路を進み、ガルバノメータミラー２１０によって偏向が解除された後、光電変換器２２０に入射する。光電変換器２２０で変換された信号は、ＰＣ１４０に入力される。ＰＣ１４０は、ガルバノメータミラー２１０の走査状態を表す信号と光電変換器２２０からの信号とを対応付けて、標本３１０の蛍光像を構成し、モニタ４００にその画像を表示する。

（第１の実施形態）
図２は、本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。図２において、レーザ走査部２００は省略しており、更に、顕微鏡３００も簡略化して示している。なお、以下の実施形態においても同様である。
第１の実施形態では、レーザ光源１１０と音響光学素子１３０（電気光学素子でも良い。なお、以下の説明では、説明の便宜上、音響光学素子と電気光学素子とを併せて、単に「音響光学素子」と称する）との間に、ビームエキスパンダー１２０が配置されている。このビームエキスパンダー１２０は、レーザ光源１１０より出射されたレーザ光を音響光学素子１３０の開口部の径内にコリメーションする。これにより、音響光学素子１３０の開口部によるレーザ光のケラレをなくしている。更に、ビームエキスパンダー１２０で、レーザ光を平行ビームに整形することで、音響光学素子１３０による角度分散を無くしている。このように、レーザ光源１１０を出射したレーザ光は、ビームエキスパンダー１２０で平行ビームに整形された後に音響光学素子１３０に入射する。音響光学素子１３０に入射したレーザ光は、所望の強度にされると共に、所望の波長のみが選択されて、顕微鏡３００に入射して、図示しない試料に照射される。

（第２の実施形態）
図３は、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。なお、図３において、図２と同じ部分には同じ符号を付している。本第２の実施形態では、第１の実施形態の構成にレーザ光整形器として凹面鏡整形器１５０を追加している。このように、本第２の実施形態はレーザ出力の後段（すなわち、レーザ光源とビームエキスパンダーとの間）にレーザ光整形器を配置したことを特徴とする。以下、レーザ光整形器の必要性について説明する。

まずレーザ光源からの通常の出力光の断面形状（すなわち、ビーム形状）について図４を参照して概略説明する。
レーザ発振器１１１から出射されたレーザ光は、集光ミラー１１２によりコリメーションされ、集光ミラー１１３と１１４によりレーザ結晶１１５に集光され、高反射ミラー１１６と出力結合ミラー１１７間を繰り返し共振することで図示しないレーザ筐体より出射される。このときレーザ結晶１１５に集光する凹面集光ミラー１１３及び１１４はＺ型に配置されているため、ビームの断面方向での曲率が異なる。このため、図４に示すような、楕円形の断面形状を有するビーム、すなわち、ビームウエスト位置、ビーム径、広がり角のずれたビームが出射されることとなる。ここで、レーザ光を音響光学素子に有効に入射させるためには、レーザ光の断面形状を楕円から円形にすることが好ましい。

本実施形態は、レーザ光源１１０出射後にレーザ筐体内部と逆の曲率方向に凹面鏡ビーム整形器１２５を追加したことを特徴としており、これにより、上記のようなレーザ光源１１０より出射されたビームの断面方向でのずれが解消できる。
この凹面鏡ビーム整形器１２５を経たビームは、その断面形状が円形の波面が均−な理想的なガウシアンビームになる。このため、上記第１の実施形態に示したビームエキスパンダー１２０や顕微鏡３００の内部光学系を通過したビームも、標本面上により正確に集光される。これは多光子励起レーザ走査型顕微鏡の様に対物レンズにより集光されたビームの光子密度により励起効率が左右され、かつ３次元効果を得る検鏡法では特に有効である。なお、この凹面鏡ビーム整形器１２５は、それ以降の光学系の影響を避けるため、レーザ筐体直後に配置することが望ましい。また、特定波長時の整形であればシリンドリカルレンズ等レンズ構成によっても可能である。しかし、パルスレーザの場合はレンズの波長分散（ＧＤＤ）による影響や、複数の波長を切換え、もしくは選択するレーザ光源１１０においては波長によるレンズ間隔調整等が発生するため、凹面鏡が最も好ましい。また、凹面鏡ビーム整形器１２５の使用は、音響光学素子１３０を用いないレーザ走査型顕微鏡の照明光学系にも当然有効である。

（第３の実施形態）
図５は、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。なお、図５において、図２及び図３と同じ部分には同じ符号を付している。本第３の実施形態は、音響光学素子１３０の後段にビームエキスパンダー１２０を設けたことを特徴とする。

音響光学素子１３０の後段に設置されたビームエキスパンダー１２０について述べる。音響光学素子１３０の開口部に対し必要な径にコリメートされたビーム径は、必ずしも顕微鏡の瞳径（レーザ光を投影する瞳共役位置での径）に一致するとは限らない。よって音響光学素子１３０出射後のビームを顕微鏡入射に適正な径にコリメートする手段が必要となり、これが図５の音響光学素子１３０後に配置されたビームエキスパンダー１２０である。仮にレーザ出射ビームが音響光学素子１３０開口部に対し充分小さな径のビームであったり、開口部によるビームのケラレがあっても、顕微鏡観察に充分なパワーがある場合、音響光学素子１３０前段のビームエキスパンダー１２０は不要になる場合もある。また、音響光学素子１３０の波長分散によるパルス幅補正用のプレチャープ光学系１６０を音響光学素子１３０後段に設置することで、レーザ光源１１０出射後、ビームが広がらないうちに音響光学素子１３０ヘビームを入射できれば、同様に音響光学素子１３０前段のビームエキスパンダー１２０は省略することが可能である。しかし、顕微鏡入射ビームに関しては、少なくとも瞳に対して適正な径に、かつ平行光にコリメートされなければ、焦点位置のずれや、分解能の劣化等標本観察に重大な支障をきたすこととなる。なお、図５において、プレチャープ光学系１６０は、音響光学素子１３０の後段に配置しても良い。

（第４の実施形態）
図６は、本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。なお、図６において、図２〜図５と同じ部分には同じ符号を付している。本第４の実施形態では、レーザ光源からのレーザ光の各波長における最適な変調入力信号を自動的に算出することを特徴とする。

ＰＣ１４０が波長選択の切替信号をレーザ光源１１０に送ることにより、レーザ光源１１０におけるレーザ発振波長が選択されて単一波長の光が出射される。レーザ光源１１０から出射されたレーザ光は音響光学素子１３０に入射する。音響光学素子１３０はドライバ１４１からの変調入力信号（ＲＦ信号）の周波数と振幅に基づいて、レーザ光をＯＮ／ＯＦＦ制御、調光、及び波長選択する。音響光学素子１３０を通過したレーザ光はビームスプリッタ１３５ｃで２つの光路に分岐され、それぞれ検出器１５０ｃと顕微鏡３００へ入射する。ここで、検出器１５０ｃに入射したレーザ光は光電変換されてＰＣ１４０に入力される。ＰＣ１４０は、ドライバ１４１に対して変調入力信号の振幅と周期を指定することができるように構成されており、常に検出器１５０ｃからの光電変換信号をモニタしながら変調入力信号の振幅を変化させていき、光電変換信号の値が最大となる変調入力信号の振幅を算出する。
これにより、選択した波長ごとの最適変調入力周波数（音響光学素子１３０からの強度が最大となる時のＲＦ周波数）を自動的に検出することができる。

（第５の実施形態）
図７は、本発明の第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。なお、図７において、図２〜図６と同じ部分には同じ符号を付している。本第５の実施形態では、レーザ光源の波長切換え時におけるビーム径と位置ずれを自動的に補正することを特徴とする。

第５の実施形態では、図７に示すように、第４の実施形態に、レーザ光のビーム径とビーム広がり角を可変にするビームエキスパンダー１２０と、レーザ光のビームを平行移動と角度変化させることができるビームシフター１４５と、レーザ光のＯＮ／ＯＦＦスイッチ・調光・波長選択を行う音響光学素子１３０へ光路を分岐する為のビームスプリッタ１３５ａと、レーザ光をビームの位置を検知するＣＣＤなどの位置検出器１５０ａとが追加されている。

ビームエキスパンダー１２０は回転することによりビーム径、ビームの広がり角が可変となる光学素子と、位置検出センサとモータを組み合わせたものである。

また、ビームシフター１４５の構成例を図８に示す。図８に示すように、ビームシフター１４５は２枚の平面ミラー１４５ａと１４５ｂと図示しない位置検出センサとモータを組み合わせたものである。

上記のように構成されたレーザ顕微鏡において、第４の実施形態と同様に、ＰＣ１４０から波長選択の切替信号レーザ光源１１０に送り、レーザ光源１１０からのレーザ発振波長を選択し単一波長の光が出射するようにする。レーザ光源１１０から出射されたレーザ光は、レーザ光のビーム径とビーム広がり角を可変にするビームエキスパンダー１２０と、レーザ光のビームを平行移動とビームの角度変化を可能とするビームシフター１４５を通過する。通過したレーザ光は、ビームスプリッタ１３５ａで分岐されて、それぞれ検出器１５０ａと音響光学素子１３０へ入射する。レーザ光が音響光学素子１３０の最適な位置に最適な径で入射する時に、図９に示すように、レーザ光が検出器１５０ａの素子１５１ａ上の中心６００にビームスポット６１０の中心が来るようにビームスプリッタ１３５ａと検出器１５０ａを設置する。検出器１５０ａに入射した光は光電変換され素子１５１ａの画素ごとの輝度情報がＰＣ１４０に入力される。ＰＣ１４０はビームエキスパンダー１２０と、ビームシフター１４５のミラー１４５ａ、１４５ｂを駆動するパルス信号を各駆動部に対して出力する。ビームシフター１４５は図８の破線１４６ａ、１４６ｂを軸にモータがそれぞれの軸でＸ軸Ｙ軸を駆動するようになっており、２枚のミラー１４５ａ、１４５ｂの面を同じ角度ずつ傾けるとビームは平行移動する。なお、音響光学素子１３０に入射後の動作は第４の実施形態と同様なので省略する。

図９を参照して、波長切換え後における最適化調整の手順を説明する。
１．ビームシフター１４５にて、理想のビームスポット６１０の中心と、実際のビームスポット６２０の中心とが一致するようにレーザ光を平行移動させる。
２．ビームエキスパンダー１２０にて、理想のビームスポット６１０の径と実際のビームスポット６２０の径が同じ大ききとなるように調整する。
３．第４の実施形態で記載した方法で変調入力信号の最適化調整を行う。
上記の手順により最適化を行うことができる。具体的な調整方法は以下のとおりである。

ビームシフター１４５を用いて、レーザ光を中心位置に平行移動させる方法は、以下のとおりである。ＰＣ１４０が常に検出器１５０ａからの光電変換信号をモニタしながら、素子１５１ａに照射されたビームスポット６２０の中心座標を中心６００に移動するようにミラー１４５ａ、１４５ｂの面が平行状態を常に保った状態で、モータでミラーの２軸５０４を中心にミラーを駆動する。なお、ビームスポット６２０の中心座標の求め方はビームがガウシアン型だと仮定し強度の最も高い座標を中心座標とする方法、もしくはビームが真円と仮定して例えばＸ座標Ｙ座標それぞれの最大値と最小値の中間の座標を中心座標とする方法など種々の方法がある。

ビームエキスパンダー１２０でレーザ光の径を調整する方法は、以下のとおりである。ＰＣ１４０が常に検出器１５０ａからの光電変換信号をモニタしながら、素子１５１ａに照射されたレーザのビームスポット６２０が理想のビームスポット６１０の径と同じになるようにビームエキスパンダー１２０を回転駆動させる。ビーム径の大ききの判断方法として、例えばビームスポットが真円であると仮定してＸ座標の最大値最小値の差とする方法がある。また、波長切換えにより、ビーム径の変化がない場合にはビームエキスパンダー１２０は一旦調整後はそのまま固定し、以降無調整としても良い。

第５の実施形態により、第４の実施形態に加えて、レーザの波長切換えなどによりビームの位置が平行移動したり、レーザ光径が変化した場合にでも自動的に最大の効率でレーザ光を顕微鏡まで導くことが可能である。

（第６の実施形態）
図１０は、本発明の第６の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図である。なお、図１０において、図２〜図７と同じ部分には同じ符号を付している。本第６の実施形態では、第４の実施形態と第５の実施形態に加えて、レーザ光源の波長切換え時におけるビームの広がりと角度ずれを自動的に補正することを特徴とする。

第６の実施形態に係るレーザ顕微鏡は、第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡に、ビームシフター１４５と音響光学素子１３０との間に設けられた２つのビームスプリッタ１３５ａと１３５ｂと、各ビームスプリッタ１３５ａ、１３５ｂの反射光路に設けられたビーム位置を検出するＣＣＤなどの検出器１５０ａ、１５０ｂとを追加している。以下、第６の実施形態に係るレーザ顕微鏡の動作を説明する。

第５の実施形態と同様に、レーザ光源１１０から出射されたレーザ光は、ビームエキスパンダー１２０と、ビームシフター１４５とを通過した後に、ビームスプリッタ１３５ａで分岐されて、それぞれ検出器１５０ａと音響光学素子１３０に入射する。レーザ光が音響光学素子１３０の最適な位置に最適な径で最適な角度で平行光として入射する時に、図１１に示すように、レーザ光が検出器１５０ａの素子１３５ａと検出器１５０ａの素子１５１ａ上の中心６００とビームスポット６２０の中心とが一致するようにビームスプリッタ１３５ａ、１３５ｂと検出器１５０ａ、１５０ｂを設置する。検出器１５０ａ、１５０ｂに入射した光は光電変換されて検出器１５０ａの素子１５１ａと検出器１５０ｂの素子１５１ｂの各画素ごとの輝度情報がＰＣ１４０に入力される。ＰＣ１４０はビームエキスパンダー１２０と、ビームシフター１４５のミラー１４５ａ、１４５ｂを駆動するパルス信号を各駆動部に対して出力する。ビームシフター１４５は前述した図８の破線１４６ａ、１４６ｂを軸にモータがそれぞれの軸でＸ軸Ｙ軸を駆動するようになっており、２枚のミラー１４５ａ、１４５ｂを同じ角度ずつ傾けるよう駆動するとビームは平行移動し、どちらか１方のミラーを駆動するとビーム角度を変える事ができる。なお、音響光学素子１３０に入射後の動作は第４の実施形態と同様なので省略する。

図１２〜図１６を参照して、波長切換え後における最適化調整の手順を説明する。
１．ビームシフター１４５にて素子１５１ａのビームスポット６２０の中心と、素子１５１ｂのビームスポットの中心６２５が一致するようにレーザ光の傾きを変化させる。（図１２参照）
２．第５の実施形態に記載した方法と同様の方法でビームシフター１４５にて素子１５１ａのビームスポット６２０の中心と、素子１５１ｂのビームスポットの中心６２５が素子１５１ｂの中心と一致するようにレーザ光を平行移動させる。（図１３参照）
３．ビームエキスパンダー１２０にて素子１５１ａのビームスポット６２０の径に、素子１５１ｂのビームスポット６２５の径が一致するようにレーザ光のビームの広がりを変化させる。（図１４参照）
４．第５の実施形態に記載した方法と同様の方法でで、ビームエキスパンダー１２０にて理想のビームスポット６１０の径と実際のビームスポット６２０、６２５の径が同じ大きさとなるようにビーム径を変化させる。（図１５参照）
５．第４の実施形態で記述した方法と同様の方法で変調入力信号の最適化調整を行う。
上記の手順により最適化を行うことができる。具体的な調整方法は以下のとおりである。

ビームシフター１４５を用いて素子１５１ａ上に照射されたビームスポット６２０の中心と、素子１５１ｂ上に照射されたビームスポットの中心６００とを一致させる方法は、以下のとおりである。ＰＣ１４０が常に検出器１５０ａと１３５ｂからの光電変換信号をモニタしながら、ビームスボツト６２０と６２５の中心座標が同じになるようにミラー１４５ａのみを、モータでミラーの２軸５０４を中心にミラーを駆動する。なお、ビームスポット６２０、６２５の中心座標の求め方は第５の実施形態に記載したとおりである。

ビームエキスパンダー１２０でレーザ光のビームの広がりを調整する方法は、以下のとおりである。ＰＣ１４０が常に検出器１５０ａからの光電変換信号をモニタしながら、素子１５１ｂ上に照射されたビームスポット６２５の径が素子１５１ａ上に照射されたビームスポット６２０の径と同じになるようにビームエキスパンダー１２０を回転駆動させる。なお、ビーム径の大ききの判断方法及びその他の調整は弟５の実施形態に記載したとおりである。また、波長切換えによりビーム径の変化、ビームの広がりがない場合はビームエキスパンダー１２０は一旦調整後はそのまま固定し、以降無調整としても良い。

第６の実施形態により、レーザの波長切換えなどによりビームの出射角度が変化したり、レーザ光の広がり角が変化した場合にでも自動的に最大の効率でレーザ光を顕微鏡まで導くことが可能である。それ以外の効果は第５の実施形態と同様である。

（第７の実施形態）
第７の実施形態は、レーザ光の波長ごとの各部の補正値や、最適値をＰＣ内に記憶させておき、記憶させた波長を再び使用する際には、記憶した補正値や、最適値を用いてにレーザ光の径など補正を行う機能を付加した。なお、本実施形態は、補正をする場合に、自動で各部調整を行わなわないで、手動で上記各部の調整を行った場合にも適用可能である。

第７の実施形態に係るレーザ顕微鏡の構成は、図１０と同様であるので、図示を省略する。なお、本実施形態においては、例えばＰＣ１４０用の図示しない記憶装置が、記憶用に使用される。

例えば、第４〜第６の実施形態に記載したとおりに各部の調整終了すると、ＰＣ１４０の記憶装置は、例えば、
・現在選択しているレーザ光の波長
・ビームエキスパンダー１２０の回転角度
・ビームシフター１４５のミラー１４５ａ、１４５ｂのＸＹ軸の回転角度
・ドライバ１４１が音響光学素子１３０に与える変調入力信号の周波数
を記憶する。この場合において、ビームエキスパンダー１２０やビームシフター１４５の駆動部角度は第５の実施形態に記載した位置検出センサにより現在位置を認識することができる。

上記のレーザ光の波長ごとのデータが、記憶装置に記憶されている場合に、レーザ波長を所望の波長に切換えた場合、選択したレーザ光の波長が記憶装置に記憶されているかどうか判断する。記憶装置に当該波長に係るデータがなければ、第４〜第６の実施形態記載の通り各部再調整を行う。なお、各部の調整は、自動調整でなく、手動で上記各部の調整を行い、調整後の各部のデータを調整データとして記憶しておき、当該データを調整データとして記憶しておいても良い。
もし選択したレーザ光の波長が記憶装置に記憶されていれば、当該波長に係る各部の調整データを記憶装置から読み出して、当該調整データを各部に対して与える。

上記のように、ある波長で一旦各部の調整しておいて、そのときの各部のデータを当該波長に対する調整データとして記憶しておくことにより、再度その波長を使用する際に、波長を切換えるごとに各部再調整を行わなくてすむので、波長を切換えてから素早く調整の必要な各部を最適化することができる。

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。

上記の実施形態では、レーザ光源１１０は、多光子レーザを想定したが、単色レーザを組み合わせて、シャッタで出力波長を切換えてもよい。
また、第４の実施形態から第６の実施形態において、第２の実施形態に示すようなレーザ光整形器としての凹面鏡整形器や第３の実施形態に示すようなプレチャープ光学系を設けても良い。なお、凹面鏡整形器やプレチャープ光学系を設ける場合には、レーザ光源１１０とビームエキスパンダー１２０との間に設けることが好ましい。
更に、第４の実施形態から第６の実施形態において、第３の実施形態に示すように、音響光学素子１３０の後段にビームエキスパンダー１２０ｂを設けても良い。ここで、音響光学素子１３０を出射したレーザ光は、その波長に関わらずビーム位置と角度のずれ及び光束径と光束の広がりが正しく調整されているので、音響光学素子１３０後段に設けるビームエキスパンダーはレーザ波長に応じた調整を行わなくても良い。

上記の各実施形態によれば、以下のような効果が得られる。
（１）音響光学素子前段にビームエキスパンダーを配置したので、音響光学素子の開口部によるケラレがなくレーザ光のパワーを効率的に使用可能である。また、音響光学素子の角度分散の影響を無くし、不要なビームの広がりを抑えることが出来る。
（２）レーザ出射直後に置かれた凹面鏡ビーム整形器でビーム断面及び波面を理想的形状にすることで、照明光学系のビームの伝播、標本面上での集光を理想的に整形出来る。
（３）音響光学素子の前段に置かれたビーム位置検出器、もしくは音響光学素子の前・後段に置かれたレーザパワー検出器、及び音響光学素子前段に置かれたビーム位置補正機構で音響光学素子入射ビーム位置を調整することで、音響光学素子出射ビームパワーを効率的（最大）に調整することが出来る。
（４）音響光学素子の波長分散によるパルス時の広がりを補正するプレチャープ光学系を音響光学素子後段に放置することにより、レーザ光源から音響光学素子間の光路長を短くし、入射ビームの不要な広がりを極小化することで、音響光学素子前段のビームエキスパンダーを省略し、照明光学系を簡素にすることが出来る。
（５）音響光学素子後段に置かれたビームエキスパンダーにより、顕微鏡入射ビームを適正な径にコリメート出来る。
（６）選択した波長ごとの最適変調入力周波数（音響光学素子からの強度が最大となる時のＲＦ周波数）を自動的に検出するようにしたので、最大の出力が得られる。
（７）各波長に対する最適値（補正値）を記憶するようにしたので、ある波長で１度調整すると、再度その波長を使用する時に、その度ごとに各部再調整を行わなくてすむので、波長を切換えてから素早く調整の必要な各部を最適化することができる。

上記のように本発明の実施形態によれば、レーザ光源より出射されたレーザ光を理想的に整形し顕微鏡に導入することで、顕微鏡の光学性能をより有効的に発揮させることが可能となる。

さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

本発明の実施形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図。本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図。本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図。レーザ光源からの通常の出力光の断面形状（すなわち、ビーム形状）について説明するための図。本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図。本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図。本発明の第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図ビームシフターの構成例を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。本発明の第６の実施形態に係るレーザ顕微鏡の要部構成を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。検出器の素子とビームスポットとの関係を示す図。複数波長の励起レーザ光を出力するためのレーザ光源の例を示す図。音響光学効果を利用した音響光学素子（ＡＯＭ、ＡＯＴＦ、ＡＯＤ等）の動作原理を示す図。レーザ走査型顕微鏡における音響光学素子の使用例を示す図。レーザ走査型顕微鏡における音響光学素子の使用例を示す図。従来の音響光学素子の波長分散（ＧＤＤ）による出射ビームのパルス幅広がり対策手段を示す図。プリズムを用いた代表的なプレチャープ光学系概略図。音響光学素子の波長分散（ＧＤＤ）量を利用したパルス圧縮手段を説明するための図。

符号の説明

１００…レーザ制御部、１１０…レーザ光源、１１１…レーザ発振器、１１２、１１３…集光ミラー、１１５…レーザ結晶、１１６…高反射ミラー、１１７…出力結合ミラー、１２０…ビームエキスパンダー、１２５…凹面鏡ビーム整形器、１３０…音響光学素子、１３５ａ、１３５ｂ、１３５ｃ…ビームスプリッタ、１４０…ＰＣ、１４１…ドライバ、１４５…ビームシフター、１４５ａ、１４５ｂ…ミラー、１５０…凹面鏡整形器、１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ…検出器、１５０ｂ…検出器、１５１ａ…素子、１５１ｂ…素子、１６０…プレチャープ光学系、１６１、１６２…プリズム、１６５…ビーム位置補正機構、１８０…パルス伸長器、１８５…光ファイバー、２００…レーザ走査部、２１０…ガルバノメータミラー、２２０…光電変換器、２２０…光電検出器、３００…顕微鏡、３１０…標本、３２０…対物レンズ、４００…モニタ。

Claims

レーザ光源からレーザ光を顕微鏡に導入する照明光学系内に、音響光学素子又は電気光学素子を備えたレーザ走査型顕微鏡において、
前記レーザ光源から出射された前記レーザ光の波長に起因する前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ及び前記レーザ光のビーム径のずれを補正、又は前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ及び前記レーザ光のビームの広がりずれを補正、又は前記レーザ光の位置ずれ、前記レーザ光の角度ずれ、前記ビーム径のずれ及び前記ビームの広がりずれを補正するための調整機構と、
前記波長に対応した前記補正の補正値を記憶する記憶手段と、
前記レーザ光の前記波長の切換えに伴い、前記記憶手段に記憶された、切換えられた前記波長に対応した前記補正値を用いて前記調整機構を自動的に調整する補正手段と、
を具備することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
前記音響光学素子又は前記電気光学素子から出射された前記レーザ光の出力を検知して、検知信号を出力する少なくとも１つの検出手段と、
前記検出手段からの前記検知信号に基づいて、前記音響光学素子又は前記電気光学素子を駆動する変調入力信号を出力する制御手段と、
前記レーザ光の前記波長における所定の最適な前記変調入力信号を自動的に算出する算出手段と、
を具備することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
前記調整機構は、前記レーザ光の前記位置ずれ及び前記角度ずれを補正するビーム位置補正機構と、
前記レーザ光の前記ビーム径のずれ及び前記ビームの広がりずれの少なくとも一方を補正するビームエキスパンダーと、
を具備することを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ走査型顕微鏡。